本發(fā)明涉及菊花雜交育種、生殖生物學(xué)領(lǐng)域，該方法采用蒸餾水、蔗糖溶液、氯化鈉溶液這三種不同滲透勢(shì)的溶液滴入菊花單個(gè)花藥之上，借助顯微鏡拍照、錄像的方法，通過(guò)計(jì)算不同區(qū)域的花粉數(shù)來(lái)精確計(jì)算菊花花藥的開(kāi)裂程度。

背景技術(shù)：

菊花(Chrysanthemum morifolium)是一種重要的觀賞植物，屬中國(guó)十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，其品種繁多，花色花形多變，觀賞價(jià)值高。切花菊尤其是切花小菊因?yàn)槠浠ㄉㄐ拓S富、著花繁密、開(kāi)花整齊及花期長(zhǎng)等特點(diǎn)在世界切花生產(chǎn)中占有重要地位。但是切花小菊品種大量散粉時(shí)造成的花粉污染卻降低了其觀賞品質(zhì)和觀賞壽命，并且可能影響觀賞者的呼吸道健康。在百合的商業(yè)化生產(chǎn)中，生產(chǎn)者會(huì)選擇人工去除百合花藥，此舉雖然費(fèi)時(shí)費(fèi)力且會(huì)增加成本，但總體看來(lái)利大于弊。究其根本原因，百合花藥去除較易且去除后不影響觀賞價(jià)值。然而，菊花花序含有幾十甚至上百個(gè)管狀花，其數(shù)量龐大，加之尺寸微小且人工去雄不僅嚴(yán)重影響其觀賞價(jià)值，而且操作起來(lái)非常困難，故人工去除菊花花藥的方法不可行。因此，通過(guò)育種手段培育不散粉菊花新品種是解決菊花花粉污染的根本途徑。菊花散粉量及花粉污染程度與其花藥開(kāi)裂程度密切相關(guān)，理論上花藥開(kāi)裂程度越大菊花散粉量就越大，花粉污染也就越嚴(yán)重。目前判斷菊花花藥開(kāi)裂程度主要是通過(guò)主觀觀察法判斷花藥表面的花粉量或者通過(guò)計(jì)算散粉后的花藥樣品空腔面積占花藥內(nèi)腔總面積的比值來(lái)衡量花藥開(kāi)裂程度，這兩種方法均存在一些不足之處。首先，對(duì)于第一種方法：主觀性太強(qiáng)，不同觀察者在觀察同一品種同一發(fā)育時(shí)期花藥表面花粉量時(shí)對(duì)花藥開(kāi)裂程度的判斷經(jīng)常存在差異。其次，菊花花藥含花粉量對(duì)花藥開(kāi)裂程度的判斷有較大影響，如兩個(gè)菊花品種同一發(fā)育時(shí)期可能花藥表面花粉量一樣，主觀觀察法則認(rèn)為這兩個(gè)品種花藥開(kāi)裂程度一樣；但如果這兩個(gè)品種花藥含花粉量不一樣，那么通過(guò)主觀觀察法判斷的結(jié)果則不正確。對(duì)于第二種方法：首先，各品種切花菊花藥內(nèi)花粉并非緊密地將花藥內(nèi)腔填充滿(mǎn)，即花粉發(fā)育完全但未開(kāi)裂的花藥內(nèi)本身就具有一定的空隙；其次，在不同品種的切花菊花藥內(nèi)，上述空隙面積也具有多態(tài)性，從而第二種方法所測(cè)值存在固有誤差，而且也無(wú)法用于切花菊品種間花藥開(kāi)裂程度差異的精確評(píng)判。因此，有必要發(fā)明一種精確測(cè)定菊花花藥開(kāi)裂程度的方法，以加快推動(dòng)不散粉菊花新品種培育的步伐。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種精確測(cè)定切花菊花藥開(kāi)裂程度的方法及其應(yīng)用。首先，該方法用數(shù)值精確地對(duì)花藥開(kāi)裂程度進(jìn)行量化，為進(jìn)一步探索菊花花藥開(kāi)裂機(jī)制和遺傳規(guī)律、及花藥開(kāi)裂關(guān)鍵基因的定位與挖掘奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。其次，該方法可以檢測(cè)到傳統(tǒng)方法無(wú)法鑒別到的花藥開(kāi)裂點(diǎn)，并且可以檢測(cè)到所有的開(kāi)裂處，為進(jìn)一步構(gòu)建花藥開(kāi)裂的數(shù)理模型提供了重要基礎(chǔ)。最后，該方法對(duì)花藥樣品不產(chǎn)生機(jī)械傷害，保證所測(cè)值的客觀準(zhǔn)確性。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種精確測(cè)定切花小菊花藥開(kāi)裂程度的方法，包括以下步驟：

(1)獲取待測(cè)樣品的管狀花，并對(duì)管狀花進(jìn)行解剖，獲得花藥鮮樣，置于載玻片上；

(2)將步驟(1)中的載玻片迅速置于顯微鏡下開(kāi)始拍照和錄像，然后滴加滲透液至花藥鮮樣上；

(3)對(duì)步驟2)中花粉粒從開(kāi)裂的花藥中散出過(guò)程進(jìn)行全程顯微錄像，達(dá)到穩(wěn)態(tài)后拍照；

(4)根據(jù)錄像及照片，統(tǒng)計(jì)達(dá)到穩(wěn)態(tài)后花藥外花粉粒數(shù)，然后通過(guò)公式(I)計(jì)算出花藥開(kāi)裂程度；

其中，Adl:花藥開(kāi)裂程度；Ot:花藥外花粉粒數(shù)；M:該品種平均花藥含粉量。

該方法所測(cè)量的范圍是取自發(fā)育成熟但頂部未破裂的管狀花的花藥，如附圖1中3的全部的全部管狀花的花藥，或4、5中內(nèi)輪未破裂的管狀花的花藥)花藥，只需統(tǒng)計(jì)“花藥外的花粉粒數(shù)”；對(duì)于取樣自已經(jīng)散粉或已經(jīng)完成散粉的管狀花(如：附圖1中4、5的外輪已經(jīng)破裂的管狀花，或6中全部管狀花)花藥，則不適用于此方法。

通過(guò)移液槍等精密微量液體轉(zhuǎn)移設(shè)備精確滴加定量滲透液于花藥鮮樣上，所述的滲透液為去離子水、7.2％的蔗糖溶液或7.2％的NaCl溶液。研究表明優(yōu)選去離子水為最佳滲透液。

步驟(1)中所述對(duì)管狀花進(jìn)行解剖的過(guò)程為：用鑷子輕輕夾著花藥，讓其固定住且鑷子未使得管狀花外壁發(fā)生凹陷變形；然后用解剖針在管狀花頭部縱切一刀，解剖針尖壓住被切開(kāi)的管狀花切口的一端，再用鑷子將被花藥包圍著的柱頭取出置于載玻片上，用解剖針將柱頭剔除，再將花藥彼此分離并置于干凈載玻片上，整個(gè)操作過(guò)程中不可撕裂花藥壁。

步驟(1)中每個(gè)載玻片上放置不超過(guò)5個(gè)花藥鮮樣。

步驟(2)為對(duì)即將滴加滲透液液滴的花藥鮮樣進(jìn)行顯微拍照，拍攝其處理前的特寫(xiě)，物鏡為10X/0.25；然后將物鏡換成低倍鏡(4X/0.10)，調(diào)節(jié)焦距及視野，使得相機(jī)獲取的圖像視野清晰明亮，花藥處于視野中央，開(kāi)始錄像；10s后，滴加15μL滲透液于花藥鮮樣上。

步驟(4)中達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，對(duì)液面區(qū)域進(jìn)行拍照(低倍物鏡4x/0.10)，由于整個(gè)液面區(qū)域面積較大，一般一個(gè)視野并不能包含整個(gè)液面區(qū)，因此要求拍攝多張照片且要求每張照片內(nèi)散布的花粉成像清晰，若個(gè)別區(qū)域花粉密集，則采用高倍物鏡(10X/0.25)進(jìn)行拍攝保證后續(xù)的花粉數(shù)目清點(diǎn)工作可以順利進(jìn)行；滴加液體前和達(dá)到穩(wěn)態(tài)后的花藥特寫(xiě)照片都采用高倍物鏡(10X/0.25)進(jìn)行拍攝。

步驟(4)中所述花粉粒的計(jì)數(shù)方法為：借助計(jì)算機(jī)或者具備觸控功能的平板電腦設(shè)備清點(diǎn)拍攝的照片中散布到花藥外的花粉粒數(shù)目得到Ot值。所述花粉粒計(jì)數(shù)方法的具體步驟為：同一花藥的多張視野照片導(dǎo)入電腦設(shè)備，選擇一張對(duì)焦清晰的照片，然后用鼠標(biāo)或者觸控筆對(duì)視野進(jìn)行區(qū)域劃分，分區(qū)域清點(diǎn)每個(gè)區(qū)域的花粉數(shù)目，計(jì)數(shù)過(guò)的花粉用鼠標(biāo)或者觸控筆點(diǎn)上一點(diǎn)以著色，以免混淆，最后累加所有區(qū)域花粉總數(shù)，得到該樣品的Ot值。

上述的方法在精確測(cè)定切花小菊花藥開(kāi)裂程度中的應(yīng)用。

本發(fā)明選擇選取3個(gè)花藥開(kāi)裂程度不同的切花菊品種進(jìn)行花藥開(kāi)裂程度的精確測(cè)定：a.以切花菊品種‘南農(nóng)紅橙’作為高散粉量、花藥開(kāi)裂程度高的品種樣本；b.以切花菊品種‘南農(nóng)紅點(diǎn)點(diǎn)’為散粉量中等、花藥開(kāi)裂程度中等的品種樣本；c.以切花菊品種‘Qx-115’為不散粉(花藥內(nèi)有花粉)、花藥不開(kāi)裂的品種樣本；證明該方法為菊花花藥開(kāi)裂程度提供了精確的度量，且使用范圍為高開(kāi)裂程度至未開(kāi)裂的花藥。

本發(fā)明精確測(cè)定切花小菊花藥開(kāi)裂程度的方法具體包括以下步驟：

(1)在室溫15℃，室內(nèi)相對(duì)濕度為45％的無(wú)風(fēng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，獲取新鮮切花菊的待測(cè)管狀花置于載玻片上，使用解剖針與鑷子對(duì)管狀花進(jìn)行解剖：用鑷子輕輕夾著花藥，讓其固定住即可，不可過(guò)分用力(不過(guò)分用力的標(biāo)準(zhǔn)是鑷子未使得管狀花外壁發(fā)生凹陷變形)；然后用解剖針在管狀花頭部縱切一刀，道口長(zhǎng)度約為整個(gè)管狀花長(zhǎng)度的2/3；然后解剖針尖壓住被切開(kāi)的管狀花切口的一端，再用鑷子將為花藥包圍著的柱頭取出置于載玻片上，用解剖針將柱頭剔除，再將花藥彼此分離并置于干凈載玻片上。注意整個(gè)操作過(guò)程中不要撕裂花藥壁。將單個(gè)花藥鮮樣均勻放置在干凈載玻片(一般規(guī)格：25.6mm×76mm×1.2mm)上，一個(gè)載玻片上放置不超過(guò)5個(gè)花藥。

(2)對(duì)即將滴加滲透液液滴的花藥鮮樣進(jìn)行顯微拍照，拍攝其處理前的特寫(xiě)，物鏡為10X/0.25。將物鏡換成低倍鏡(4X/0.10)，調(diào)節(jié)焦距及視野，使得相機(jī)獲取的圖像視野清晰明亮，花藥處于視野中央，此時(shí)開(kāi)始錄像；10s后，用移液槍滴加15μL去離子水于花藥鮮樣上。

(3)借助光學(xué)顯微鏡，用錄像的形式記錄花粉粒隨液流散出花藥的全過(guò)程，錄像過(guò)程中需要不斷調(diào)節(jié)焦距，確保大部分花粉粒成像清晰。達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，對(duì)液面區(qū)域進(jìn)行拍照(低倍物鏡4X/0.10)。體系穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)是花藥內(nèi)外的花粉粒不再發(fā)生移動(dòng)。由于整個(gè)液面區(qū)域面積較大，一般一個(gè)視野并不能包含整個(gè)液面區(qū)，因此要求拍攝多張照片且要求每張照片內(nèi)散布的花粉成像清晰，若個(gè)別區(qū)域花粉密集，則采用高倍物鏡(10X/0.25)進(jìn)行拍攝保證后續(xù)的花粉數(shù)目清點(diǎn)工作可以順利進(jìn)行。滴加液體前和達(dá)到穩(wěn)態(tài)后的花藥特寫(xiě)照片都采用高倍物鏡(10X/0.25)進(jìn)行拍攝。

(4)根據(jù)(3)中錄像及照片得到達(dá)到穩(wěn)態(tài)后花藥外花粉粒數(shù)；通過(guò)公式(注：Adl:花藥開(kāi)裂程度；Ot:花藥外花粉數(shù)；M:該品種平均花藥含粉量)計(jì)算出花藥開(kāi)裂程度Adl?；ǚ哿Ｓ?jì)數(shù)的方法為：借助計(jì)算機(jī)或者具備觸控功能的平板電腦設(shè)備清點(diǎn)拍攝的照片中散布到花藥外的花粉粒數(shù)目得到Ot值。具體步驟為：同一花藥的多張視野照片導(dǎo)入電腦設(shè)備，選擇一張對(duì)焦較為清晰的照片(標(biāo)準(zhǔn)為：該視野內(nèi)，成像清晰的花粉粒數(shù)目比例最高)，然后用鼠標(biāo)或者觸控筆對(duì)視野進(jìn)行區(qū)域劃分，分區(qū)域清點(diǎn)每個(gè)區(qū)域的花粉數(shù)目，計(jì)數(shù)過(guò)的花粉用鼠標(biāo)或者觸控筆點(diǎn)上一點(diǎn)以著色，以免混淆。最后累加所有區(qū)域花粉總數(shù)，得到該樣品的Ot值。

本研究通過(guò)移液槍精確滴加一定量的不同滲透勢(shì)的液體于單個(gè)花藥上，用顯微攝錄的方法對(duì)花粉從開(kāi)裂的花藥中散出的過(guò)程進(jìn)行全程高清錄像，待體系穩(wěn)定^[1]后，在對(duì)整個(gè)液面區(qū)域進(jìn)行顯微拍照，最終計(jì)算出散布至花藥外的花粉數(shù)量及花藥內(nèi)部殘余的花粉數(shù)量，通過(guò)公式計(jì)算出花藥開(kāi)裂程度值。該方法為菊花花藥開(kāi)裂程度提供了精確的度量，且使用范圍為高開(kāi)裂程度至未開(kāi)裂的花藥。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明針對(duì)品種間散粉量、散粉速度差異極大的切花菊，提供了一種精確測(cè)定菊花花藥開(kāi)裂程度的方法，為研究菊花花藥開(kāi)裂程度遺傳規(guī)律、發(fā)掘控制花藥開(kāi)裂程度的有關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，該發(fā)明還具有如下兩個(gè)重要特征：1)該方法可以將花藥開(kāi)裂程度量化，使得對(duì)花藥開(kāi)裂程度的衡量科學(xué)化；2)該方法在檢測(cè)過(guò)程中未對(duì)花藥樣品做任何預(yù)處理，而是直接對(duì)鮮樣進(jìn)行處理檢測(cè)；因此，使用該方法進(jìn)行檢測(cè)不會(huì)對(duì)樣品造成機(jī)械損傷，從而能夠客觀真實(shí)地測(cè)出樣品的開(kāi)裂程度；3)該方法可以形象直觀地檢測(cè)到花藥鮮樣的所有裂口。

附圖說(shuō)明

圖1為‘南農(nóng)紅橙’花序6個(gè)開(kāi)花階段

其中，階段1：花序邊花尚未展開(kāi)；階段2：花序邊花剛開(kāi)始展開(kāi)；階段3：花序剛開(kāi)早期，管狀花表面尚未散粉；階段4：花序盛開(kāi)中期，1-3倫管狀花表面有大量花粉；階段5：花序盛開(kāi)后期，一半以上管狀花表面有大量花粉；階段6：花序盛開(kāi)末期，幾乎所有管狀花表面有大量花粉。

圖2為頭狀花序管狀花排列模式的數(shù)學(xué)模型

其中，左圖：每個(gè)順逆時(shí)針螺旋線圍成的方格內(nèi)長(zhǎng)有一個(gè)管狀花；右圖：每個(gè)圓點(diǎn)(黑、白、灰色)代表一個(gè)管狀花，同一顏色并位于同一圓周上的屬于同一輪管狀花。

圖3為‘南農(nóng)紅橙’管狀花剝?nèi)∧Ｊ綀D

其中，同一圓周上的實(shí)心圓點(diǎn)代表同一輪管狀花；①代表1輪即最外輪管狀花，②代表2輪即次外輪管狀花，依次類(lèi)推。

圖4為同一液面區(qū)拍攝的多個(gè)視野圖(A、B、C)

圖5為花粉密集處的高倍率物鏡照片

其中，圈處花粉粒較為密集，采用高倍率物鏡(10X/0.25)進(jìn)行拍攝

圖6為滴加液體前花藥特寫(xiě)照片(物鏡為10X/0.25)

圖7為達(dá)到穩(wěn)態(tài)后花藥特寫(xiě)照片(物鏡為10X/0.25)

圖8為對(duì)屏幕進(jìn)行分區(qū)計(jì)算花藥外花粉數(shù)

其中，相鄰區(qū)域清點(diǎn)，筆記宜采用不同顏色以避免混淆；計(jì)數(shù)過(guò)的花粉粒可點(diǎn)上一點(diǎn)以著色

圖9為不同滲透液測(cè)定‘南農(nóng)紅橙’開(kāi)花階段3各輪管狀花花藥開(kāi)裂程度(％)

其中，①、②、③、④、⑤、⑥分別代表圖3中所標(biāo)注相應(yīng)位置的管狀花。同一折線拐點(diǎn)附近不同字母表示在95％水平上有顯著性差異。

圖10為不同滲透液測(cè)定‘南農(nóng)紅點(diǎn)點(diǎn)’開(kāi)花階段3各輪管狀花花藥開(kāi)裂程度(％)

其中，①、②、③、④分別代表圖3中所標(biāo)注相應(yīng)位置的管狀花。同一折線拐點(diǎn)附近不同字母表示在95％水平上有顯著性差異。

圖11為傳統(tǒng)方法檢測(cè)花藥開(kāi)裂程度

圖12為‘南農(nóng)紅橙’開(kāi)花階段3第2輪管狀花花藥花粉散出過(guò)程

其中，A～F分別代表滴加液滴后4s，8s，12s，16s，20s，24s的視頻截圖

圖13為‘南農(nóng)紅點(diǎn)點(diǎn)’開(kāi)花階段3第1輪管狀花花藥花粉散出過(guò)程

其中，A～F分別代表滴加液滴后10s，20s，30s，40s，50s，60s的視頻截圖

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明提供了利用液流檢測(cè)菊花花藥開(kāi)裂程度的方法，分別以‘南農(nóng)紅橙’、‘南農(nóng)紅點(diǎn)點(diǎn)’、‘Qx-115’開(kāi)花階段3為例，在室溫15℃，室內(nèi)相對(duì)濕度(RH)為45％的無(wú)風(fēng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，其具體實(shí)施示例如下：

1.管狀花的剝離

分別選取‘南農(nóng)紅橙’、‘南農(nóng)紅點(diǎn)點(diǎn)’和‘Qx-115’開(kāi)花階段3的2個(gè)花序?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料(圖1)。菊花為頭狀花序，其管狀花排列順序符合頭狀花序排列基本特征(圖2)。按圖3的模式對(duì)3個(gè)品種開(kāi)花階段3的花序進(jìn)行剝?nèi)」軤罨ǎ簩?duì)于每一個(gè)品種，最外輪(1輪)隨機(jī)取9個(gè)管狀花，次外輪(2輪)隨機(jī)取管狀花9個(gè)，次次外輪(3輪)隨機(jī)取管狀花9個(gè)，以此類(lèi)推直至中心管狀花。

2.管狀花的解剖與花藥切片的制作

2.1管狀花的解剖

使用解剖針與鑷子對(duì)管狀花進(jìn)行解剖：用鑷子輕輕夾著花藥，讓其固定住即可，不可過(guò)分用力(不過(guò)分用力的標(biāo)準(zhǔn)是鑷子未使得管狀花外壁發(fā)生凹陷變形)；然后用解剖針在管狀花頭部縱切一刀，道口長(zhǎng)度約為整個(gè)管狀花長(zhǎng)度的然后解剖針尖壓住被切開(kāi)的管狀花切口的一端，再用鑷子將為花藥包圍著的柱頭取出置于載玻片上，用解剖針將柱頭剔除，再將花藥彼此分離并置于干凈載玻片上。注意整個(gè)操作過(guò)程中不要撕裂花藥壁。

2.2花藥切片的制作

將單個(gè)花藥鮮樣均勻分布于在潔凈玻片(規(guī)格：25.6mm×76mm×1.2mm)上，一個(gè)載玻片上放置的花藥數(shù)目不宜超過(guò)5個(gè)，注意使得花藥平躺于載玻片上。

3.液體的滴加及顯微攝錄

3.1溶液配制

分別配置7.2％的蔗糖溶液和7.2％的NaCl溶液：用天平分別稱(chēng)量7.2g蔗糖和7.2g的NaCl，溶于去離子水中，分別配成100ml的溶液待用。

3.2滴加液體

對(duì)即將滴加滲透液液滴的花藥鮮樣進(jìn)行顯微拍照，拍攝其處理前的特寫(xiě)，物鏡為10X/0.25；然后將物鏡換成低倍鏡(4X/0.10)，調(diào)節(jié)焦距及視野，使得相機(jī)獲取的圖像視野清晰明亮，花藥處于視野中央，開(kāi)始錄像；10s后，滴加滲透液于花藥鮮樣上。

首先用移液槍吸取15μl去離子水，滴加于花藥鮮樣之上，在顯微鏡下觀察花粉粒隨著液流散出花藥的全過(guò)程，并對(duì)該過(guò)程進(jìn)行高清顯微錄像。注意不斷調(diào)節(jié)焦距與視野，力求整個(gè)過(guò)程中花藥始終處于最佳視野范圍且成像清晰。待體系穩(wěn)定后，結(jié)束錄像。注意，體系穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)是花藥內(nèi)外的花粉粒不再發(fā)生移動(dòng)。滴加7.2％蔗糖溶液和7.2％NaCl操作程序同滴加去離子水。

3.3穩(wěn)態(tài)拍照

顯微攝錄使用日本OLYMPUS CX41RF生物光學(xué)顯微鏡及日本Canon 5D Mark-iii數(shù)碼單反相機(jī)(相機(jī)機(jī)身通過(guò)轉(zhuǎn)接器連接在顯微鏡相機(jī)接口上)進(jìn)行：

達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，對(duì)整個(gè)液面區(qū)域進(jìn)行顯微拍照(目鏡始終為：WHB10X/20；物鏡：4X/0.10)。由于整個(gè)液面區(qū)域面積較大，一般一個(gè)視野并不能包含整個(gè)液面區(qū)，因此要求拍攝多張照片且要求每張照片內(nèi)散布的花粉成像清晰(圖4)，若個(gè)別區(qū)域花粉密集，則采用高倍物鏡(10X/0.25)進(jìn)行拍攝(圖5，圖中橢圓形圈處花粉粒較為密集)保證后續(xù)的花粉數(shù)目清點(diǎn)工作可以順利進(jìn)行。滴加液體前和達(dá)到穩(wěn)態(tài)后的花藥特寫(xiě)照片都采用高倍物鏡(10X/0.25)進(jìn)行拍攝(圖6、圖7)。

4.花藥開(kāi)裂程度的測(cè)定

花藥開(kāi)裂程度的計(jì)算公式為：

Adl(Anther Dehiscence Level):花藥開(kāi)裂程度；

Ot(Outer Pollen Quantity):花藥外花粉數(shù)；

M(Mean pollen quantity per anther):該品種平均花藥含粉量。

4.1各參數(shù)的測(cè)定

借助iPad Pro^[2]和Apple Pencil^[3]清點(diǎn)拍攝的照片中散布到花藥外的花粉粒數(shù)目得到Ot值(圖8)。具體步驟為：同一花藥的多張視野照片導(dǎo)入iPad Pro，選擇一張對(duì)焦較為清晰的照片(標(biāo)準(zhǔn)為：該視野內(nèi)，成像清晰的花粉粒數(shù)目比例最高)，然后用Apple Pencil對(duì)視野進(jìn)行區(qū)域劃分(圖8)，分區(qū)域清點(diǎn)每個(gè)區(qū)域的花粉數(shù)目，計(jì)數(shù)過(guò)的花粉用Apple Pencil點(diǎn)上一點(diǎn)以著色(圖8)，以免混淆。最后累加所有區(qū)域花粉總數(shù)，得到該樣品的Ot值。

4.2數(shù)據(jù)計(jì)算及分析

通過(guò)Microsoft Office Excel 2016及IMB SPSS Stastics 23分析計(jì)算所得Adl值。

5.結(jié)果分析

5.1使用不同滲透液分別測(cè)定‘南農(nóng)紅橙’、‘南農(nóng)紅點(diǎn)點(diǎn)’和‘Qx-115’開(kāi)花階段3各輪管狀花花藥開(kāi)裂程度

5.1.1‘南農(nóng)紅橙’(開(kāi)花階段3)

表1不同滲透液測(cè)定‘南農(nóng)紅橙’開(kāi)花階段3各輪管狀花花藥開(kāi)裂程度(％)

注：①、②、③、④、⑤、⑥分別代表圖3中所標(biāo)注相應(yīng)位置的管狀花。同一列數(shù)字后面相同字母表示在5％水平上沒(méi)有顯著性差異。

使用3種不同滲透勢(shì)的液體來(lái)處理鮮樣都可以顯著區(qū)別每一輪管狀花內(nèi)花藥的開(kāi)裂程度，如在使用去離子水時(shí)，①～⑥位置管狀花花藥開(kāi)裂程分別為84.8％、69.0％、48.6％、17.7％、10.9％、0(表1)。使用Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)得出：同一滲透液測(cè)量不同輪數(shù)(位置)的管狀花花藥開(kāi)裂程度值之間具有顯著差異(圖9)。此外，使用三種滲透液測(cè)定的結(jié)果Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)得出沒(méi)有顯著差異，如用去離子水、7.2％的蔗糖溶液和7.2％的NaCl溶液測(cè)定位置①管狀花花藥開(kāi)裂程度分別為84.8％、84.6％、85.0％，這說(shuō)明這三種方法均可以用來(lái)測(cè)定花藥開(kāi)裂程度(表1)。

5.1.2‘南農(nóng)紅點(diǎn)點(diǎn)’(開(kāi)花階段3)

表2不同滲透液測(cè)定‘南農(nóng)紅點(diǎn)點(diǎn)’開(kāi)花階段3各輪管狀花花藥開(kāi)裂程度(％)

注：①、②、③、④、⑤、⑥分別代表圖3中所標(biāo)注相應(yīng)位置的管狀花。同一列數(shù)字后面相同字母表示在5％水平上沒(méi)有顯著性差異。

使用3種不同滲透勢(shì)的液體來(lái)處理‘南農(nóng)紅點(diǎn)點(diǎn)’不同部位管狀花的花藥鮮樣也可以顯著區(qū)別每一輪管狀花內(nèi)花藥的開(kāi)裂程度，如在使用去離子水時(shí)，①～④位置管狀花花藥開(kāi)裂程分別為46.1％、10.9％、4.2％、0(表2)。使用Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)得出：同一滲透液測(cè)量不同輪數(shù)(位置)的管狀花花藥開(kāi)裂程度值之間具有顯著差異(圖10)。此外，使用三種滲透液測(cè)定的結(jié)果Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)得出沒(méi)有顯著差異，如用去離子水、7.2％的蔗糖溶液和7.2％的NaCl溶液測(cè)定位置①管狀花花藥開(kāi)裂程度分別為46.1％、46.9％和47.0％，這說(shuō)明這三種方法均可以用來(lái)測(cè)定花藥開(kāi)裂程度(表2)。

5.1.3‘Qx-115’(開(kāi)花階段3)

3種滲透液對(duì)‘Qx-115’(開(kāi)化階段3)①～⑥輪管狀花花藥的測(cè)定值均為0；說(shuō)明，‘Qx-115’在開(kāi)花階段3時(shí)期，各輪管狀花內(nèi)花藥均未發(fā)生開(kāi)裂。

對(duì)以上2個(gè)品種測(cè)量結(jié)果分析，去離子水方法測(cè)定結(jié)果的平均標(biāo)準(zhǔn)誤分別為1.6和1.7，均是三種滲透液中最小的，說(shuō)明用去離子水方法測(cè)定結(jié)果精確度要高于其他兩種滲透液。此外，與其他兩種方法相比，去離子水使用方便、成本更低，因此去離子水為最佳滲透液。

5.2去離子水方法與傳統(tǒng)觀察法結(jié)果比較

5.2.1傳統(tǒng)花藥開(kāi)裂程度測(cè)定方法概述

傳統(tǒng)花藥開(kāi)裂程度測(cè)定方法主要基于鏡檢，從已完成散粉的管狀花中剝?nèi)』ㄋ?，在光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)算花藥空腔的面積占整個(gè)花藥面積的比例(圖11)，以此來(lái)衡量花藥開(kāi)裂程度。

5.2.2本方法特的獨(dú)到之處

本方法可以將花藥開(kāi)裂程度精確量化；同時(shí)，在顯微鏡下清晰直觀地看出花粉粒經(jīng)花藥壁向外散出的過(guò)程(圖12、圖13)，從而可以確定花藥壁開(kāi)裂的具體位置，能為今后進(jìn)一步構(gòu)建花藥開(kāi)裂的數(shù)學(xué)模型打下基礎(chǔ)。

5.2.3本方法與傳統(tǒng)方法的比較

傳統(tǒng)方法的取樣要求較高，須采集已經(jīng)散粉完全的管狀花內(nèi)的花藥進(jìn)行測(cè)定。換言之，對(duì)于那些剛開(kāi)始散粉或者花藥壁已經(jīng)開(kāi)裂但尚未散粉的花藥無(wú)法測(cè)定其花藥開(kāi)裂程度。而該方法能夠測(cè)定出取樣自管狀花未破裂的花藥壁未開(kāi)裂至完全開(kāi)裂的所有花藥的開(kāi)裂程度，因此對(duì)測(cè)量對(duì)象的取樣要求比傳統(tǒng)方法低，且測(cè)量較傳統(tǒng)方法較快捷(無(wú)需等待至樣品花序散粉)，同時(shí)較傳統(tǒng)方法而言，也減少了諸如環(huán)境溫度、濕度對(duì)樣品花藥開(kāi)裂程度產(chǎn)生的影響。

綜上所述，本方法測(cè)得的開(kāi)裂程度值為該品種切花菊花序不同位置管狀花花藥的實(shí)時(shí)開(kāi)裂程度值，并能夠測(cè)定出花藥壁剛發(fā)生開(kāi)裂到花藥壁完全開(kāi)裂的花藥之間不同開(kāi)裂程度的花藥的開(kāi)裂程度。再者，本方法可避免傳統(tǒng)方法測(cè)量的不足。因此，本方法是一種較傳統(tǒng)方法有著諸多優(yōu)越特性的新方法。

總結(jié)

由以上實(shí)例可以看出：同一花序各輪管狀花花藥的開(kāi)裂程度由外輪向內(nèi)輪呈明顯的遞減趨勢(shì)。通過(guò)該方法可以精確確定同一花序不同輪數(shù)間管狀花內(nèi)花藥的開(kāi)裂程度。去離子水為最佳滲透液。

因此，該方法可以用于同一花序同一輪管狀花內(nèi)花藥開(kāi)裂程度的動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)測(cè)定。同樣，該方法可以明顯區(qū)分出花藥開(kāi)裂程度高、花藥開(kāi)裂程度中等/較低、花藥不開(kāi)裂的品種；同時(shí)，該方法也可以運(yùn)用于觀察同一品種不同開(kāi)花時(shí)期的花序不同部位管狀花花藥的開(kāi)裂程度。該方法將開(kāi)裂程度量化，為描述這一性狀提供了科學(xué)的依據(jù)，也為探究切花菊花藥開(kāi)裂程度的遺傳規(guī)律、發(fā)掘控制花藥開(kāi)裂程度的相關(guān)基因及蛋白提供了重要基礎(chǔ)，從而為培育觀賞價(jià)值高但不散粉的切花菊新品種奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。另一方面，該方法為進(jìn)一步構(gòu)建切花菊花藥開(kāi)裂的數(shù)理模型提供了基礎(chǔ)，從而使得用更為精確的數(shù)學(xué)模型來(lái)度量花藥開(kāi)裂過(guò)程奠定了基礎(chǔ)。最后，通過(guò)該法可以直觀地看出花藥壁破裂的具體位置，為進(jìn)一步闡明切花菊花藥開(kāi)裂機(jī)制提供一定基礎(chǔ)。

注解：

[1]：體系達(dá)到穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)是花藥內(nèi)的花粉粒不再發(fā)生移動(dòng)。

[2]、[3]：對(duì)顯微鏡下拍攝的照片中的花粉進(jìn)行計(jì)數(shù)推薦使用具備精確觸控功能的觸摸設(shè)備，其高精度觸摸屏使得操作過(guò)程中不易重復(fù)計(jì)數(shù)，且快速直觀。