本發(fā)明屬于醫(yī)用診斷技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于DNA水凝膠的葡萄糖檢測(cè)方法，用于體外肉眼檢測(cè)血清等生物樣品中的葡萄糖。

背景技術(shù)：
：

葡萄糖是自然界分布最廣泛且最重要的一種多羥基醛類單糖，具有多元醇和醛的性質(zhì)，易溶于水，在水溶液中旋光向右，所以又稱為右旋糖。它是活細(xì)胞的能量來源和新陳代謝的中間產(chǎn)物，即生物體內(nèi)主要的供能物質(zhì)。

正常情況下人體中糖的分解和合成代謝處于動(dòng)態(tài)平衡，保持相對(duì)恒定。血清葡萄糖是指血液中葡萄糖的濃度，正常參考值：成人為3.9～6.1mmol/L，足月新生兒為2.8～4.5mmol/L。葡萄糖的測(cè)定對(duì)于診斷和治療高血糖癥和低血糖癥十分重要。

目前檢測(cè)葡萄糖的方法主要有酶法和非酶法兩大類。酶法主要包括葡萄糖氧化酶(GOD)法、葡萄糖己糖激酶(HK)法、葡萄糖脫氫酶(GDH)法。非酶法主要包括：近紅外光譜法、脈沖電極法、氧化物電極法、光散射法等。由于靈敏度和選擇性不夠非酶法不能夠直接用于人體血液中葡萄糖的測(cè)定，并且這些非酶法都需要借助相應(yīng)的儀器設(shè)備實(shí)施，使用起來不便?，F(xiàn)在市場(chǎng)上銷售的血糖檢測(cè)儀主要分為電化學(xué)法和光反射技術(shù)兩大類，檢測(cè)體系復(fù)雜、所需儀器昂貴不利于隨身攜帶。相比較于非酶法，酶法利用了酶本身的高效性、專一性，在進(jìn)行生物樣本中檢測(cè)葡萄糖時(shí)，不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)分離的處理，并且很容易將酶固定在試劑盒中便于隨身攜帶。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是利用葡萄糖氧化酶(GOD)法通過一種DNAzyme交聯(lián)型的DNA水凝膠對(duì)于微量葡萄糖的肉眼可見檢測(cè)、對(duì)葡萄糖選擇性檢測(cè)、對(duì)血清中葡萄糖的檢測(cè)。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案檢測(cè)溶液中的葡萄糖：

(一)葡萄糖肉眼檢測(cè)限的測(cè)定：

將不同濃度的葡萄糖置于100–300μL磷酸鹽緩沖液(pH＝6.5–8.0)中，然后向其中分別加入1–20μL的1mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOD)，將反應(yīng)液置于恒溫器中，在37℃有氧條件下反應(yīng)10min。之后在室溫下分別加入1–10mg的DNA水凝膠、2–50μL的10mM的3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，室溫下反應(yīng)20–90min后觀察并記錄膠塊顏色變化。反應(yīng)結(jié)束后將膠塊取出置于60–1000μL的緩沖液A(0.1M檸檬酸，0.2M磷酸氫二鈉，100mM氯化鉀，pH4.4)中，在75℃恒溫保持3–30min后取出溶液，并檢測(cè)652nm處的吸光度值。

(二)對(duì)葡萄糖選擇性的檢測(cè)

將相同濃度的葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖溶液置于100–300μL磷酸鹽緩沖液(pH＝7.0)中，然后向其中分別各加入1–20μL的1mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOD)，將反應(yīng)液置于恒溫器中，在37℃有氧條件下反應(yīng)10–60min。之后在室溫下分別加入1–10mg的DNA水凝膠、2–50μL的10mM的3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，室溫下反應(yīng)20–90min后觀察并記錄膠塊顏色變化。反應(yīng)結(jié)束后將膠塊取出置于60–1000μL的緩沖液A(0.1M檸檬酸，0.2M磷酸氫二鈉，100mM氯化鉀，pH 4.4)中，在75℃恒溫保持3–30min后取出溶液，并檢測(cè)652nm處的吸光度值。

(三)對(duì)血清中葡萄糖的檢測(cè)

取10–500μL含葡萄糖樣品液(包括血清樣品和其他血液樣品，及汗液，唾液等體液樣品)，向其中加入1–20μL的1mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOD)，將反應(yīng)液置于恒溫器中，在37℃有氧條件下反應(yīng)10–60min。之后在室溫下分別加入1–10mg的DNA水凝膠、2–50μL的10mM的3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，室溫下反應(yīng)20–90min后觀察并記錄膠塊顏色變化。

所述的DNA水凝膠是以具有過氧化酶活性的DNAzyme作為交聯(lián)劑，聚丙烯酰胺為骨架的新型DNA水凝膠。其結(jié)構(gòu)由含有DNA的聚丙烯酰胺高分子，T-DNAzyme-T，及血紅素通過分子間作用力(主要包括氫鍵,靜電引力,疏水性相互作用等)結(jié)合形成。其中T-DNAzyme-T的兩端或一端的序列可與DNA的序列互補(bǔ)雜交形成氫鍵。T-DNAzyme-T內(nèi)部的序列為已報(bào)道的可結(jié)合血紅素分子的具有過氧化酶活性的DNAzyme序列。T-DNAzyme-T與血紅素以1:1或2:1或4：1的比例結(jié)合。DNA:T-DNAzyme-T可以是2:1或1:1。水凝膠中丙烯酰胺單體的質(zhì)量百分比為3％～20％。m與n的比為2000:1至10:1。

所述DNA水凝膠的制備參考ZL 201310711003.1。

附圖說明

圖1為基于DNA水凝膠的葡萄糖的肉眼可見檢測(cè)。

圖2為DNA水凝膠對(duì)葡萄糖溶液的選擇性。

圖3為DNA水凝膠對(duì)血清中葡萄糖的檢測(cè)。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1：

DNAzyme交聯(lián)型的DNA水凝膠的制備：

①DNAzyme的制備：量取2.75μL、5mM的T-4c15s-T置于200μL的離心管中，向其中加入1μL緩沖液B(50mM嗎啉乙磺酸(MES)pH 6.5；100mM三羥甲基氨基甲烷-醋酸鹽緩沖液pH 6.5；40mM醋酸鉀；1％DMSO；0.05％Triton X-100)，95℃恒溫5min，之后緩慢降溫60min至室溫，將至室溫后向其中加入2.3μL、1.5mM的Hemin溶液，25℃恒溫30min。T-DNAzyme-T(序列2：5'-TTTTTTTTTTTTTTTTAGGTGGGGAGGAGCGGGGTGCTTTTTTTTTTTTTTTT-3')。

②DNA雜合聚丙烯酰胺高分子溶液的制備：向離心管中依次加入1.6μL 50％的丙烯酰胺、6.9μL 4mM的Acrydite-DNA、1.2μL 2％的APS、1.2μL 2％的TEMED，立刻抽真空15min得粘稠狀的高分子溶液。③將DNAzyme交聯(lián)劑加入到丙酰胺高分子溶液中，得到DNAzyme交聯(lián)型的DNA水凝膠。Acrydite-DNA(序列1：AAA AAA AAA AAA AAAA，DNA合成儀將3-氰乙基-二異丙基-6-甲基丙烯酰胺基亞磷酰胺(Acrydite)接入到DNA的5'端)。

實(shí)施例2

利用DNA水凝膠對(duì)葡萄糖肉眼檢測(cè)限的測(cè)定步驟如下：

1)葡萄糖反應(yīng)液的制備

葡萄糖反應(yīng)液的制備：取6個(gè)編號(hào)分別為1、2、3、4、5、6的離心管，分別加入275μL、287μL、285μL、288.5μL、289.5μL、290μL的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.0)，并分別依次加入15μL 10mM、3μL 10mM、5μL 1mM、1.5μL 1mM、0.5μL 1mM、0μL的葡萄糖溶液。最后向六個(gè)離心管中分別加入10μL、1mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOD)。將上述6組葡萄糖反應(yīng)液置于恒溫器中，在37℃有氧條件下反應(yīng)30min。

2)基于DNA水凝膠的葡萄糖肉眼可見檢測(cè)：

取6塊質(zhì)量約為2mg的水凝膠，在緩沖液B中浸泡30min后，取出膠塊分別放入6個(gè)離心管中，然后再分別加入190μL的緩沖液A(0.1M檸檬酸，0.2M磷酸氫二鈉，100mM氯化鉀，pH 4.4)、10μL 10mM的TMB溶液。最后將上述6組葡萄糖反應(yīng)液分別加入上述的離心管中，靜置1小時(shí)后，記錄膠塊變色情況(如圖1a)。將反應(yīng)完成后的膠塊取出置于60μL的緩沖液A(0.1M檸檬酸，0.2M磷酸氫二鈉，100mM氯化鉀，pH 4.4)中，75℃、5min后取出溶液，并檢測(cè)652nm處的吸光度值。(如圖1b)

從圖1中可以看出隨著葡萄糖濃度的增加，膠塊的顏色不斷加深，最低的肉眼檢測(cè)限可以達(dá)到10μM。

實(shí)施例3：

利用DNA水凝膠對(duì)葡萄糖選擇性實(shí)驗(yàn)步驟如下:

1)不同糖的反應(yīng)液的制備：取5個(gè)命名分別為空白組、果糖組、蔗糖組、麥芽糖組、葡糖糖組的離心管，并分別向其中加入290μL、275μL、275μL、275μL、275μL的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.0)，然后分別向果糖組、蔗糖組、麥芽糖組、葡糖糖組依次加入15μL 10mM果糖、15μL 10mM蔗糖、15μL 10mM麥芽糖、15μL 10mM葡糖糖。最后分別加入10μL、1mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOD)。將上述各反應(yīng)液置于恒溫器中，在37℃有氧條件下反應(yīng)30min。

2)用TMB和DNA水凝膠對(duì)300μM不同糖的檢測(cè)

取6塊質(zhì)量約為2.5mg的水凝膠，浸泡30min，分別放入6個(gè)離心管中，然后再分別向6個(gè)離心管中加入190μL的緩沖液A(0.1M檸檬酸，0.2M磷酸氫二鈉，100mM氯化鉀，pH 4.4)、10μL 10mM的TMB溶液，30min后拍照觀察。(如圖2a)將反應(yīng)完成后的膠塊取出置于60μL的緩沖液A(0.1M檸檬酸，0.2M磷酸氫二鈉，100mM氯化鉀，pH 4.4)中，75℃、5min后取出溶液，并檢測(cè)652nm處的紫外吸光度值(如圖2b)。

從圖2a、2b可以看出DNA水凝膠只對(duì)葡萄糖響應(yīng)，對(duì)其他糖基本不響應(yīng)，具有很高的選擇性。

實(shí)施例4：

利用DNA水凝膠對(duì)胎牛血清中葡萄糖的檢測(cè)

1)取300μL血清，加入10μL的1mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOD)，并將反應(yīng)液將反應(yīng)液置于恒溫器中，在37℃有氧條件下反應(yīng)30min，得到血清氧化液。取兩個(gè)離心管分別編號(hào)1、2，向1中分別加入25μL的血清氧化液、24μL的緩沖液A(0.1M檸檬酸，0.2M磷酸氫二鈉，100mM氯化鉀，pH 4.4)、1μL、10mM的TMB，向2中分別加入35μL的血清氧化也液、14μL的緩沖液A(0.1M檸檬酸，0.2M磷酸氫二鈉，100mM氯化鉀，pH 4.4)、1μL、10mM的TMB，反應(yīng)30min后觀察并記錄膠塊顏色變化(如圖3)。

從(圖3)測(cè)試結(jié)果中可以看出在檢測(cè)液中，血清的含量為50％、75％時(shí)膠塊變藍(lán)，說明膠塊在緩沖液A(0.1M檸檬酸，0.2M磷酸氫二鈉，100mM氯化鉀，pH 4.4)中能夠檢測(cè)血清中的葡萄糖。本方法能夠檢測(cè)20％–90％(v/v)的血清樣品。