政府支持申明

本發(fā)明由美國(guó)政府支持通過國(guó)家癌癥研究所(National Cancer Institute)的基金第1U54CA119367號(hào)以及國(guó)家科學(xué)基金會(huì)(National Science Foundation)的基金第ECCS-0801385-000號(hào)完成。所述政府在本發(fā)明中享有特定權(quán)益。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種定量地測(cè)定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法。

背景技術(shù)：

生物過程決定于第一和第二分子的分子對(duì)之間的分子相互作用。這些分子相互作用的實(shí)例包括核酸雜交相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-核酸相互作用、酶-底物相互作用以及受體-配體相互作用，例如，抗體-抗原相互作用和受體-激動(dòng)劑或拮抗劑相互作用。

對(duì)DNA雜交、抗原-抗體結(jié)合以及DNA-蛋白質(zhì)相互作用的基于親和性的感應(yīng)均已表明在基礎(chǔ)科研、臨床診斷、生物分子工程和藥物設(shè)計(jì)中發(fā)揮重要作用。隨著該領(lǐng)域進(jìn)展?fàn)顩r，對(duì)用于測(cè)定分子身份和反應(yīng)細(xì)節(jié)的精確、敏感、高通量和迅速的方法的需求在分析方法的演化中造成持續(xù)的壓力。為滿足這些迫切需要，研究者已經(jīng)轉(zhuǎn)向于分子標(biāo)記物以期改善對(duì)稀少分子檢測(cè)的敏感度。然而，這些標(biāo)記物可能會(huì)改變擴(kuò)散以及空間排布現(xiàn)象。此外，高通量或速度的要求通常不允許經(jīng)典的平衡方法的使用，因而詳細(xì)了解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、擴(kuò)散現(xiàn)象以及表面固定化的含義對(duì)于獲取有意義的反應(yīng)參數(shù)而言變得至關(guān)重要。

當(dāng)評(píng)價(jià)給定分子相互作用的動(dòng)力學(xué)時(shí)，多種定量動(dòng)力學(xué)參數(shù)可能成為目標(biāo)。一種目標(biāo)定量動(dòng)力學(xué)參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)。結(jié)合速率常數(shù)(即，k_a、k_on)是描述兩種分子在平衡中的結(jié)合親和性的數(shù)學(xué)常數(shù)，諸如抗體和抗原的結(jié)合親和性。另一種目標(biāo)定量動(dòng)力學(xué)參數(shù)是解離速率常數(shù)(即，k_d、k_off)。所述解離速率常數(shù)是描述較大物體可逆地分離(解離)成為較小組分的傾向的數(shù)學(xué)常數(shù)，如當(dāng)受體/配體復(fù)合體解離成為其組分分子的時(shí)候。第三種目標(biāo)動(dòng)力學(xué)參數(shù)是擴(kuò)散速率常數(shù)k_M，該常數(shù)是描述標(biāo)記的分子向傳感器進(jìn)行擴(kuò)散的速率的數(shù)學(xué)常數(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

提供了對(duì)分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行定量地測(cè)定的方法。本方法的實(shí)施方案的方面包括：制備磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器裝置包含與分析混合物接觸的磁性傳感器，所述分析混合物包含磁性標(biāo)記的分子以產(chǎn)生可檢測(cè)的分子結(jié)合相互作用；從所述磁性傳感器中獲取實(shí)時(shí)信號(hào)；以及由所述實(shí)時(shí)信號(hào)定量地確定所述分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)。還提供了被配置為用于所述方法的系統(tǒng)和試劑盒。

本發(fā)明的方面包括定量測(cè)定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法。所述方法包括：制備磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器裝置包括與分析混合物接觸的磁性傳感器，所述分析混合物具有磁性標(biāo)記的分子以產(chǎn)生可檢測(cè)的分子結(jié)合相互作用；從所述磁性傳感器中獲取實(shí)時(shí)信號(hào)；以及由所述實(shí)時(shí)信號(hào)定量地確定所述分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)(k_a)。在一些情況下，所述結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)是解離速率常數(shù)(k_d)。在某些情況下，所述結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)是擴(kuò)散限制速率常數(shù)(k_M)。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)為結(jié)合速率常數(shù)(k_a)、解離速率常數(shù)(k_d)和擴(kuò)散限制速率常數(shù)(k_M)中的至少一種。

在某些實(shí)施方案中，所述磁性傳感器包括與所述磁性標(biāo)記的分子特異地結(jié)合的分子，并且所述接觸包括將所述磁性標(biāo)記的分子涂覆于所述磁性傳感器。

在某些實(shí)施方案中，所述磁性傳感器包括捕獲探針，所述捕獲探針特異地結(jié)合于與所述磁性標(biāo)記的分子特異地結(jié)合的分子，并且所述接觸包括將與所述磁性標(biāo)記的分子特異地結(jié)合的分子和所述磁性標(biāo)記的分子相繼地涂覆于所述磁性傳感器。

在一些情況下，所述磁性傳感器包括捕獲探針，所述捕獲探針特異地結(jié)合于與所述磁性標(biāo)記的分子特異地結(jié)合的分子，并且所述接觸包括制備具有與所述磁性標(biāo)記的分子特異地結(jié)合的分子和所述磁性標(biāo)記的分子的反應(yīng)混合物，并且隨后將所述反應(yīng)混合物涂覆于所述磁性傳感器。

在某些實(shí)施方案中，所述磁性傳感器是自旋閥傳感器。在一些情況下，所述磁性傳感器是磁性隧道結(jié)傳感器。

在某些情況下，所述分子結(jié)合相互作用是諸如核酸雜交相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、受體-配體相互作用、酶-底物相互作用或蛋白質(zhì)-核酸相互作用的結(jié)合相互作用。

在一些情況下，定量測(cè)定的步驟包括用擬合算法處理所述實(shí)時(shí)信號(hào)。在某些情況下，所述擬合算法是二室擬合算法(two-compartment fitting algorithm)。在一些實(shí)施方案中，所述二室擬合算法包括主體區(qū)室(bulk compartment)和表面區(qū)室(surface compartment)。

本發(fā)明的方面還包括定量測(cè)定兩種或更多種不同分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法，其中各個(gè)不同分子結(jié)合相互作用包括不同磁性標(biāo)記的分子。所述方法包括：制備包括兩個(gè)或更多個(gè)不同的磁性傳感器的磁性傳感器裝置，各個(gè)磁性傳感器接觸具有磁性標(biāo)記的分子的分析混合物從而產(chǎn)生兩種或更多種不同的分子結(jié)合相互作用；從各個(gè)磁性傳感器中獲取實(shí)時(shí)信號(hào)；以及從所述實(shí)時(shí)信號(hào)中定量測(cè)定針對(duì)所述兩種或更多種不同的分子結(jié)合相互作用中的每種的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)(k_a)。在一些情況下，所述結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)是解離速率常數(shù)(k_d)。在某些情況下，所述結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)是擴(kuò)散限制速率常數(shù)(k_M)。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)(k_a)、解離速率常數(shù)(k_d)和擴(kuò)散限制速率常數(shù)(k_M)中的至少一種。

在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)合相互作用是諸如核酸雜交相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、受體-配體相互作用、酶-底物相互作用或蛋白質(zhì)-核酸相互作用的結(jié)合相互作用。

本發(fā)明的方面還包括磁性傳感器裝置。所述磁性傳感器裝置包括：磁性傳感器，所述磁性傳感器被配置為檢測(cè)磁性標(biāo)記的分子；以及處理器，所述處理器被配置為從所述磁性傳感器中獲取實(shí)時(shí)信號(hào)和由所述實(shí)時(shí)信號(hào)定量地確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)(k_a)。在一些情況下，所述結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)是解離速率常數(shù)(k_d)。在某些情況下，所述結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)是擴(kuò)散限制速率常數(shù)(k_M)。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)(k_a)、解離速率常數(shù)(k_d)和擴(kuò)散限制速率常數(shù)(k_M)中的至少一種。

在某些情況下，所述磁性傳感器是自旋閥傳感器。在一些情況下，所述磁性傳感器是磁性隧道結(jié)傳感器。

在某些實(shí)施方案中，所述磁性傳感器包括兩個(gè)或更多個(gè)感應(yīng)區(qū)。在一些情況下，所述磁性傳感器包括四個(gè)或更多個(gè)感應(yīng)區(qū)。在一些情況下，所述感應(yīng)區(qū)以串聯(lián)和并聯(lián)的方式連接。

在某些情況下，所述裝置包括兩個(gè)或更多個(gè)不同的磁性傳感器。在一些情況下，所述裝置包括100個(gè)或更多個(gè)不同的磁性傳感器。在一些情況下，所述裝置包括1000個(gè)或更多個(gè)不同的磁性傳感器。

在某些實(shí)施方案中，所述裝置還包括所述磁性標(biāo)記的分子和與所述磁性標(biāo)記的分子特異地結(jié)合的分子。

本發(fā)明的方面還包括試劑盒，該試劑盒包括：(a)磁性標(biāo)記物；以及(b)以下物質(zhì)中的至少一種：(i)計(jì)算機(jī)可讀的媒介，其上儲(chǔ)存有計(jì)算機(jī)程序，當(dāng)計(jì)算機(jī)執(zhí)行該程序時(shí)，該程序操控計(jì)算機(jī)由獲自磁性傳感器的實(shí)時(shí)信號(hào)定量地確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)；以及(ii)具有用于獲得所述計(jì)算機(jī)程序的地址的物理基板。

附圖說明

圖1(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的使用與磁性傳感器結(jié)合的捕獲抗體、與所述捕獲抗體結(jié)合的分析物和與磁性標(biāo)簽連接的檢測(cè)抗體進(jìn)行的夾心分析法的示意圖。圖1(b)示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的使用與磁性傳感器結(jié)合的捕獲DNA、與所述捕獲DNA結(jié)合的靶DNA和與磁性標(biāo)簽連接的檢測(cè)DNA進(jìn)行的DNA夾心分析法的示意圖。

圖2提供了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的二室反應(yīng)擴(kuò)散模型的示意圖。標(biāo)記的抗體通過運(yùn)輸過程移向傳感器表面并且隨后通過結(jié)合流動(dòng)(conjugation flux)進(jìn)行結(jié)合和釋放。

圖3示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的鏈霉親和素-生物素結(jié)合相互作用的(a)和EpCAM抗體對(duì)EpCAM抗原的(b)的動(dòng)力學(xué)模型與實(shí)時(shí)結(jié)合數(shù)據(jù)之間的比較圖。一旦所述模型與所述結(jié)合數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬合，由所述擬合計(jì)算所述結(jié)合速率常數(shù)、解離速率常數(shù)和擴(kuò)散限制速率常數(shù)。圖3(c)和3(d)所示的實(shí)時(shí)結(jié)合曲線示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的以平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的CEA抗體對(duì)CEA抗原的結(jié)合動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)從而比較磁性納米傳感器與表面等離子體共振(SPR)系統(tǒng)。所述GMR生物傳感器具有5.0×10⁴M^-1s^-1的k_a計(jì)算值以及4.4×10^-4s^-1的k_d計(jì)算值，而SPR實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了4.44×10⁴M^-1s^-1的k_a以及1.17×10^-4s^-1的k_d。

圖4(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的抗體-抗原結(jié)合(并非按比例繪制)的示意圖。在左側(cè)，用磁性標(biāo)簽標(biāo)記的抗體在濃度為C_s的溶液中靠近所述GMR傳感器表面。當(dāng)未結(jié)合時(shí)，擴(kuò)散磁性標(biāo)記的抗體距離所述GMR傳感器過遠(yuǎn)以致不能被檢測(cè)到。在所述傳感器表面的是抗原，其以n_max的初始表面濃度被固定。正如右側(cè)所描述，一旦所述磁性標(biāo)記的抗體與所述抗原結(jié)合，來(lái)自所述磁性標(biāo)簽的磁場(chǎng)就被下方的基于接近度的GMR傳感器檢出。所述捕獲的抗體-抗原復(fù)合體以n表示。圖4(b)示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的按比例繪制的磁性標(biāo)記的抗體的示意圖。所述磁性標(biāo)簽包括包埋于葡聚糖聚合物內(nèi)的若干個(gè)氧化鐵核并且其隨后使用抗體或受體進(jìn)行功能化。圖4(c)示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的包括1,008個(gè)磁性傳感器的1mm²芯片的照片。圖4(d)示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的經(jīng)完全加工的芯片的光學(xué)顯微照片和掃描電子顯微鏡(SEM)圖像。1,008個(gè)GMR生物傳感器被分成16個(gè)亞陣列，并且各亞陣列占90μm×90μm的面積。

圖5(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的通過方程M.6中的分析模型(虛線)所預(yù)測(cè)的抗-EpCAM抗體對(duì)表面固定化的EpCAM抗原的結(jié)合曲線圖以及所測(cè)得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(實(shí)線)的結(jié)合曲線圖，其中EpCAM蛋白的表面濃度以2×的系列稀釋度從5阿摩爾(n_max)被稀釋至20仄摩爾(zeptomole)(n_max/256)。本實(shí)驗(yàn)中的全部曲線對(duì)通過所述模型所預(yù)測(cè)曲線的擬合誤差為R²＝0.98。圖5(b)示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的分析模型所預(yù)測(cè)的(虛線)MNP-抗-EpCAM抗體對(duì)固定化于所述傳感器表面的833仄摩爾(n_max/6)的EpCAM抗原的結(jié)合曲線圖以及所測(cè)得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(實(shí)線)的結(jié)合曲線圖，其中MNP-抗-EpCAM蛋白的溶液濃度為未經(jīng)稀釋、2×稀釋和8×稀釋。全部曲線對(duì)通過所述模型的擬合誤差為R²＝0.96。y-軸以百萬(wàn)分比(ppm)顯示了對(duì)初始MR進(jìn)行歸一化的MR變化。

圖6(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的在12組重復(fù)傳感器上的抗CEA抗體對(duì)抗原的多元?jiǎng)恿W(xué)分析以及在3組重復(fù)傳感器上的抗VEGF抗體對(duì)抗原的多重動(dòng)力學(xué)分析圖。圖6(b)示出了監(jiān)測(cè)生物素對(duì)鏈霉親和素結(jié)合動(dòng)力學(xué)的25組重復(fù)傳感器示圖。圖6(c)示出了SPR圖并且圖6(d)示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的基于磁性納米傳感器的平臺(tái)的結(jié)果圖，當(dāng)在平行實(shí)驗(yàn)中對(duì)CEA抗體結(jié)合CEA抗原進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)所述圖提供了類似的實(shí)時(shí)結(jié)合曲線。

圖7示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的每傳感器的磁性標(biāo)簽數(shù)量隨時(shí)間變化的圖。獲得了各個(gè)加載團(tuán)塊的SEM圖像(示于圖7右側(cè))用以對(duì)所述實(shí)驗(yàn)中結(jié)合的MNP數(shù)量與所述模型預(yù)測(cè)的數(shù)量進(jìn)行比較。

圖8示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的不同固定化抗原加載量隨時(shí)間的傳感器信號(hào)圖。

圖9(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的針對(duì)表位分布和交叉反應(yīng)因素的選擇性蛋白質(zhì)定向的示意圖。圖9(b)示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的用抗-EGFR捕獲抗體(作為對(duì)照)功能化的抗-EGFR Ab傳感器的圖，其可捕獲EGFR并且當(dāng)所述抗EGFR抗體-MNP復(fù)合體結(jié)合之時(shí)被檢出。圖9(c)示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的證實(shí)了被監(jiān)測(cè)的動(dòng)力學(xué)與結(jié)合EGFR的抗-EGFR抗體-MNP復(fù)合體相關(guān)的圖。y-軸以百萬(wàn)分比(ppm)顯示了對(duì)初始MR進(jìn)行歸一化的MR變化。

圖10示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的使用高密度GMR傳感器陣列產(chǎn)生的2D空間內(nèi)不同時(shí)間下蛋白質(zhì)擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)的可視化效果。y-軸單位以百萬(wàn)分比(ppm)顯示了對(duì)初始MR進(jìn)行歸一化的MR變化。

圖11(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的用于監(jiān)測(cè)穿過使用磁性傳感器組的芯片陣列的蛋白質(zhì)擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)裝置照片。在圖11(a)中，使用捕獲抗體將四個(gè)四傳感器組選擇性地固定于CEA。在圖11(a)中被圈示的各個(gè)傳感器組對(duì)應(yīng)于圖11(b)內(nèi)圖中的匹配曲線。在將所述未反應(yīng)捕獲抗體洗去之后，將以MNP標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記的檢測(cè)抗體在反應(yīng)孔內(nèi)進(jìn)行孵育。圖11(b)示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的信號(hào)隨時(shí)間的變化圖。在向左上角的孔加入可溶的CEA抗原時(shí)，有可能在空間和時(shí)間上將CEA蛋白經(jīng)過所述孔的移動(dòng)可視化。

圖12示出了包含并聯(lián)和串聯(lián)的72組傳感器條GMR傳感器結(jié)構(gòu)的光學(xué)顯微圖像。圖12中的插圖示出了GME傳感器的一個(gè)磁性傳感器條的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像，其上具有多個(gè)結(jié)合的磁性納米顆粒標(biāo)簽。

圖13示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的描述方程M.6中各項(xiàng)貢獻(xiàn)的對(duì)數(shù)圖，方程M.6是結(jié)合于所述傳感器表面的磁性標(biāo)記抗體數(shù)量的函數(shù)。

圖14示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的由Langmuir吸附模型所預(yù)測(cè)的(虛線)和實(shí)驗(yàn)測(cè)得的(實(shí)線)抗-EpCAM抗體對(duì)表面固定化的EpCAM抗原的結(jié)合曲線圖。

具體實(shí)施方式

提供了對(duì)分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行定量地測(cè)定的方法。本方法的實(shí)施方案的方面包括：制備磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器包含與分析混合物進(jìn)行接觸的磁性傳感器，所述分析混合物包含磁性標(biāo)記的分子以產(chǎn)生可檢測(cè)的分子結(jié)合相互作用；從所述磁性傳感器中獲取實(shí)時(shí)信號(hào)；以及由所述實(shí)時(shí)信號(hào)定量地確定所述分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參。還提供了被配制為用于所述方法的系統(tǒng)和試劑盒。

在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳盡的描述之前，應(yīng)當(dāng)了解本發(fā)明并不限于所描述的特定實(shí)施方案，因此本發(fā)明當(dāng)然可以變化。還應(yīng)了解，本文所使用的術(shù)語(yǔ)僅出于描述特定實(shí)施方案的目的并且并非意在進(jìn)行限定，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍應(yīng)僅由所附的權(quán)利要求進(jìn)行限定。

在提供數(shù)值范圍的情況下，應(yīng)當(dāng)了解本發(fā)明涵蓋了處于所述范圍的上限和下限之間的各中間數(shù)值以及該規(guī)定范圍中的任意所述或中間數(shù)值，除非上下文進(jìn)行清楚地另行指明否則下限精確到十分位。這些較小范圍的上限和下限可被獨(dú)立地包含于所述較小范圍內(nèi)并且亦被涵蓋于本發(fā)明之內(nèi)，除在規(guī)定范圍被明確排除的任何范圍限制。在所規(guī)定范圍包含這些范圍限制的之一或全部的情況下，不包括這些被包含的范圍限制之一或全部的范圍也包含于本發(fā)明之內(nèi)。

特定范圍限制在本文中以數(shù)值方式給出，其前具有術(shù)語(yǔ)“約”。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“約”在本文中被用于為其后的精確數(shù)字以及接近或近似所述術(shù)語(yǔ)之后的數(shù)字的數(shù)字提供文字上的支持。在確定數(shù)字是否接近或近似明確提及的數(shù)字時(shí)，所述接近或近似的未提及數(shù)字可以是在其所處的上下文中提供了所述明確提及的數(shù)字的實(shí)質(zhì)等價(jià)物的實(shí)質(zhì)等效數(shù)字。

除非另行定義，否則本文所使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的含義。盡管與本文所述類似或等價(jià)的任意方法和材料也可被用于本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試，在此描述了代表性的說明性方法和材料。

本說明所引用的全部出版物和專利以引用的方式并入本文，正如各個(gè)出版物或?qū)＠惶囟ㄇ覀€(gè)別地表明通過引用的方式并入，并且其以引用的方式并入本文用以公開和描述與所述出版物通過引用而進(jìn)行關(guān)聯(lián)的方法和/或材料。任意出版物的引用是對(duì)所述出版物在本申報(bào)日期之前的公開內(nèi)容的引用并且不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明無(wú)權(quán)通過以在先發(fā)明的方式從而先于這些出版物。此外，所提供的出版的日期可與實(shí)際出版日期不同，所述實(shí)際出版日期可能需要進(jìn)行獨(dú)立證實(shí)。

應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本文以及所附的權(quán)利要求書中所使用單數(shù)形式的“一個(gè)”、“一種”和“所述”包含了復(fù)數(shù)個(gè)指示物，除非上下文明確地另行指明。進(jìn)一步應(yīng)認(rèn)識(shí)到，所述權(quán)利要求書可被撰寫為排除任意可選的要素。同樣地，本申明意在用作為與權(quán)利要求要素有關(guān)的諸如“唯獨(dú)”、“僅”等等這些排它性術(shù)語(yǔ)的使用或“否定”限定的使用的前提基礎(chǔ)。

應(yīng)當(dāng)了解，出于明了澄清的目的而在不同獨(dú)立實(shí)施方案內(nèi)所描述的本發(fā)明的特定特征也可以結(jié)合形式提供于單一實(shí)施方案之中。反過來(lái)，出于簡(jiǎn)要的目的而在單一實(shí)施方案內(nèi)所描述本發(fā)明的多種特征也可以分別提供或以任何適當(dāng)?shù)姆纸M進(jìn)行提供。所述實(shí)施方案的所有組合被明確地包含于本發(fā)明內(nèi)并且在本文公開的方式正如各自每一組合被單獨(dú)和明確地進(jìn)行公開，其程度使這些組合包含了可操作的加工和/或裝置/系統(tǒng)/試劑盒。此外，描述這些可變因素的實(shí)施方案中所列的所有亞組合也被本發(fā)明明確地包含并且在本文公開的方式正如各自每一化學(xué)群體亞組合被單獨(dú)和明確地在本文中被公開。

正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明后所明了，本文所描述和說明的各個(gè)單獨(dú)實(shí)施方案具有分立的組分和特征，其在不脫離本發(fā)明的范圍或精神的情況下可容易地同任意其它多個(gè)實(shí)施方案的特征進(jìn)行拆分和組合。任何提及的方法均可以所提及的事件為順序或以邏輯上可行的任何其它順序進(jìn)行實(shí)施。

為進(jìn)一步描述本發(fā)明的實(shí)施方案，首先將對(duì)本方法的實(shí)施方案的方面進(jìn)行更為詳盡的描述。隨后討論了可用于實(shí)施本發(fā)明的方法的系統(tǒng)和試劑盒的實(shí)施方案。

方法

根據(jù)上文所總結(jié)，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及對(duì)目標(biāo)分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行定量測(cè)定的方法。在某些實(shí)施方案中，所述目標(biāo)結(jié)合相互作用是第一種和第二種分子之間的相互作用，例如第一種和第二種生物分子之間的相互作用。例如，所述第一種和第二種分子之一可以是磁性標(biāo)記的分子，并且所述第一種和第二種分子之一可以是與所述磁性標(biāo)記分子特異性結(jié)合的分子?！岸繙y(cè)定”意指以數(shù)量方式例如以數(shù)值的方式表達(dá)目標(biāo)結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)?！敖Y(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)”意指可測(cè)量的結(jié)合動(dòng)力學(xué)因子，其至少部分地定義給定分子相互作用并且可被用于定義其行為。目標(biāo)結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)包括但不限于，結(jié)合速率常數(shù)(即，k_a、k_on)、解離速率常數(shù)(即，k_d、k_off)、擴(kuò)散限制速率常數(shù)(即，k_M)、活化能(即，E_A)、傳輸參數(shù)如擴(kuò)散率，等等。

根據(jù)上文所總結(jié)，本發(fā)明的方法可包含下列步驟：

制備與包含磁性標(biāo)記的分子的分析混合物進(jìn)行接觸的磁性傳感器裝置；

從磁性傳感器裝置中獲取實(shí)時(shí)信號(hào)；并且

由所述實(shí)時(shí)信號(hào)定量地確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

這些步驟均各自進(jìn)行更為詳盡地描述。

制備與包含磁性標(biāo)記的分子的分析混合物進(jìn)行接觸的磁性傳感器裝置

所述方法的方面包括制備與包含磁性標(biāo)記的分子的分析混合物進(jìn)行接觸的磁性傳感器裝置。所述方法包括，制備磁性傳感器與包含目標(biāo)結(jié)合相互作用的構(gòu)件分子(即，所述目標(biāo)結(jié)合相互作用的結(jié)合對(duì)構(gòu)件)和磁性標(biāo)記物的組合物(如，分析混合物)接觸的裝置或結(jié)構(gòu)，其中所述磁性標(biāo)記物可以是所述目標(biāo)結(jié)合相互作用的構(gòu)件分子之一的部分或結(jié)構(gòu)域，或是不同分子的組分，如，與所述目標(biāo)結(jié)合相互作用的兩種構(gòu)件分子之一特異結(jié)合的第三種分子。在與所述磁性傳感器進(jìn)行接觸的組合物或分析混合物中，所述磁性標(biāo)記物可以與所述結(jié)合對(duì)構(gòu)件之一穩(wěn)定地結(jié)合例如共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合以產(chǎn)生磁性標(biāo)記的分子。如將下文進(jìn)一步所描述的，例如在所述結(jié)合對(duì)構(gòu)件彼此何時(shí)接觸方面和或所述磁性傳感器方面、與裝置相關(guān)的所述結(jié)合對(duì)構(gòu)件的配置方面，制備與包含磁性標(biāo)記的分子的分析混合物進(jìn)行接觸的磁性傳感器裝置的步驟可包含多種不同的過程亞組合。

結(jié)合對(duì)

根據(jù)本文所述的方法，用于進(jìn)行定量動(dòng)力學(xué)分析的給定結(jié)合相互作用可由分子的結(jié)合對(duì)組成，諸如第一種和第二種生物分子。分子結(jié)合對(duì)可根據(jù)所述目標(biāo)結(jié)合相互作用而廣為變動(dòng)。目標(biāo)結(jié)合相互作用包括所述結(jié)合對(duì)分子之間的任意相互作用，其中所述結(jié)合相互作用以所述分子結(jié)合對(duì)在所述結(jié)合相互作用的環(huán)境條件下所具有的特異性而進(jìn)行。目標(biāo)結(jié)合相互作用的實(shí)例包括但不限于：核酸雜交相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-核酸相互作用、酶-底物相互作用以及受體-配體相互作用如抗體-抗原相互作用和受體-激動(dòng)劑或拮抗劑相互作用。

具有目標(biāo)分子結(jié)合相互作用的分子的實(shí)例包括但不限于：生物聚合物和小分子，所述小分子可以是有機(jī)或無(wú)機(jī)小分子?！吧锞酆衔铩笔且环N或多種類型的重復(fù)單元的聚合物。生物聚合物可見于生物系統(tǒng)中(盡管它們可以通過合成而制備)并且可包含肽、聚核苷酸和多糖，以及這樣一些化合物，其包含氨基酸類似物或非氨基酸基團(tuán)，或核苷酸類似物或非核苷酸基團(tuán)或由以上這些所構(gòu)成。同樣，生物聚合物包括常規(guī)骨架被非天然存在的或合成的骨架所取代的聚核苷酸，并且包括一個(gè)或多個(gè)常規(guī)堿基被能夠參與沃森－克里克(Watson-Crick)型氫鍵相互作用的基團(tuán)(天然的或合成的)所取代的核酸(或合成的或天然存在的類似物)。例如，“生物聚合物”可包括DNA(包括cDNA)、RNA、寡核苷酸和PNA以及根據(jù)美國(guó)專利第5,948,902號(hào)及其引用參考中的描述其它聚核苷酸?！吧飭误w”指能夠與相同的或其它生物單體連接以形成生物聚合物的單一單元(例如，具有兩個(gè)連接基團(tuán)的單一氨基酸或核苷酸，所述連接基團(tuán)中的一個(gè)或兩個(gè)可具有可去除的保護(hù)基團(tuán))。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“肽”在本文中指通過一個(gè)氨基酸的α-羧基基團(tuán)與另一個(gè)基團(tuán)的α-氨基基團(tuán)之間的酰胺形成而產(chǎn)生的任意聚合物化合物。所述術(shù)語(yǔ)“寡肽”在本文中指具有少于約10個(gè)至20個(gè)殘基即氨基酸單體單元的肽。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”在本文中指具有多于約10個(gè)至20個(gè)殘基的肽。本文使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”指具有多于約50個(gè)殘基的特定序列的多肽并且包括D和L形式、經(jīng)修飾的形式等等。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“核酸”在本文中指由核苷酸構(gòu)成的聚合物，所述核苷酸的例子如脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或可與天然存在的核酸以序列特異性的方式雜交的合成制備的化合物(如，美國(guó)專利第5,948,902號(hào)及其引用參考中所述的PNA)，所述雜交方式類似于兩種天然存在的核酸的雜交，例如，可參與沃森－克里克堿基配對(duì)相互作用。核酸可為任意長(zhǎng)度，如2個(gè)堿基或更長(zhǎng)、10個(gè)堿基或更長(zhǎng)、100個(gè)堿基或更長(zhǎng)、500個(gè)堿基或更長(zhǎng)、1000個(gè)堿基或更長(zhǎng)，包括10,000個(gè)堿基或更長(zhǎng)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“聚核苷酸”指由長(zhǎng)度一般多于約100個(gè)核苷酸的核苷酸單體構(gòu)成的單鏈或雙鏈聚合物。聚核苷酸包含單鏈或多鏈結(jié)構(gòu)，其中所述鏈中的一個(gè)或多個(gè)可以完全或可以不完全與另一個(gè)對(duì)齊。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“核糖核酸”和“RNA”在本文中指由核糖核苷酸構(gòu)成的聚合物。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“脫氧核糖核酸”和“DNA”在本文中指由脫氧核糖核苷酸構(gòu)成的聚合物。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”在本文中表示單鏈核苷酸多聚體，其長(zhǎng)約10個(gè)至約200個(gè)核苷酸，諸如長(zhǎng)約25個(gè)至約175個(gè)核苷酸，包括長(zhǎng)約50個(gè)至約160個(gè)核苷酸，如長(zhǎng)度為150個(gè)核苷酸。

在一些情況下，所述分子結(jié)合對(duì)是配體和受體，其中給定的受體或配體可以是或可以不是生物聚合物。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“配體”在本文中指能夠與目標(biāo)化合物共價(jià)地或以其它化學(xué)方式進(jìn)行結(jié)合的部分。配體可以是天然存在的或人造的。配體的實(shí)例包括但不限于，細(xì)胞膜受體的激動(dòng)劑和拮抗劑、毒素和毒液、病毒表位、激素、阿片劑、甾體類、肽、酶底物、輔因子、藥物、血凝素、糖類、寡核苷酸、核酸、寡糖、蛋白質(zhì)等等。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“受體”在本文中指對(duì)配體具有親和性的部分。受體可以是天然存在的或人造的。它們可以其未改變的狀態(tài)或作為與其它物種的聚集體形式被使用。受體可共價(jià)地或非共價(jià)地、直接地或通過特異性結(jié)合物質(zhì)連接于結(jié)合構(gòu)件。受體的實(shí)例包括但不限于，抗體、細(xì)胞膜受體、與特異性抗原決定基具有反應(yīng)性的單克隆抗體和抗血清、病毒、細(xì)胞、藥物、聚核苷酸、核酸、肽、輔因子、血凝素、糖類、多糖、細(xì)胞膜、細(xì)胞器等等。受體在本領(lǐng)域中有時(shí)被稱為抗配體。在本文使用術(shù)語(yǔ)受體時(shí)在含義上無(wú)差別。當(dāng)兩個(gè)分子通過分子識(shí)別進(jìn)行結(jié)合以形成復(fù)合體時(shí)，形成了“配體受體對(duì)”。

磁性傳感器裝置

目標(biāo)磁性傳感器裝置是響應(yīng)于與所述傳感器表面結(jié)合的磁性標(biāo)記而產(chǎn)生電信號(hào)的裝置。目標(biāo)磁性傳感器裝置包括但不限于磁阻傳感器裝置，包括巨磁阻(GMR)裝置。目標(biāo)GMR裝置包括但不限于自旋閥檢測(cè)器，以及磁性隧道結(jié)(MTJ)檢測(cè)器。

自旋閥檢測(cè)器

在一些情況下，所述磁性傳感器是自旋閥檢測(cè)器。自旋閥檢測(cè)器是由非磁性層如銅間隔開的兩個(gè)鐵磁層的金屬多層薄膜結(jié)構(gòu)。一個(gè)鐵磁層稱為扎層，其磁化被釘扎于固定方向，而另一鐵磁層被稱為自由層，其磁化可在外加磁場(chǎng)下自由轉(zhuǎn)動(dòng)。自旋閥的電阻取決于所述自由層的磁化對(duì)于所述扎層的磁化的相對(duì)取向。當(dāng)所述兩個(gè)磁化方向平行時(shí)，所述電阻最低，當(dāng)反向平行時(shí)，所述電阻最高。電阻的相對(duì)變化被稱為磁阻(MR)比率。在一些情況下，自旋閥的MR比率可在小磁場(chǎng)例如約100Oe中達(dá)到高于約10％。因此，自旋閥可以用作檢測(cè)結(jié)合于所述傳感器表面的磁性標(biāo)記的分子的感應(yīng)元件。

在某些實(shí)施方案中，自旋閥磁阻(MR)比率為約1％至約20％，諸如約3％至約15％，包括約5％至約12％。因此，在某些實(shí)施方案中，自旋閥可以以窄帶寬(即，約1Hz或更低)或使用鎖定檢測(cè)(lock-in detection)對(duì)約10nm大小的單一磁性標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。在這些情況下，通過狹化所述噪音帶寬甚至可為單納米顆粒檢測(cè)獲得充分的信噪比(SNR)。

自旋閥檢測(cè)器可使用面內(nèi)模式實(shí)施(參見，例如Li等,J.Appl.Phys.,93卷(10):7557(2003))。在其它實(shí)施方案中，當(dāng)在所述檢測(cè)系統(tǒng)中可檢測(cè)到AC擾動(dòng)場(chǎng)(tickling field)導(dǎo)致的電磁干擾(EMI)時(shí)可使用垂直模式。所述EMI信號(hào)傾向于以所述AC擾動(dòng)場(chǎng)的頻率f為中心，因此其可通過在頻率2f下進(jìn)行的鎖定檢測(cè)而基本被消除或降低。此外，在一些情況下，可以使用2橋電路(2-bridge circuit)來(lái)基本去除殘余EMI?？梢允褂镁哂刑幱趦蓚€(gè)不同頻率下的AC調(diào)制傳感電流和AC擾動(dòng)場(chǎng)的其它信號(hào)采集和處理方法(例如S-J Han,H.Yu,B.Murmann,N.Pourmand和S.X.Wang,IEEE International Solid-State Circuits Conference(ISSCC)Dig.Tech.Papers,San Francisco Marriott,CA,USA，2007年2月11-15)。

在某些實(shí)施方案中，除所述自旋閥自身的幾何特征和偏置磁場(chǎng)之外，來(lái)自所述自旋閥檢測(cè)器的由所述磁性標(biāo)記物所引起的信號(hào)還依賴于所述磁性標(biāo)記物和所述自旋閥的自由層之間的距離。由單磁性標(biāo)記物產(chǎn)生的檢測(cè)器電壓信號(hào)隨著所述顆粒中心與所述自旋閥自由層的中平面之間的距離的增加而降低。

在某些實(shí)施方案中，自旋閥的自由層位于扎層的頂部從而為磁性標(biāo)記物的檢測(cè)提供便利，這是因?yàn)閬?lái)自磁性顆粒的感應(yīng)磁場(chǎng)隨著所述傳感器和該顆粒之間的距離而單調(diào)遞減。對(duì)包括保護(hù)所述自旋閥的保護(hù)層的厚度在內(nèi)的所述磁性標(biāo)記物和所述自由層的頂面之間距離的最小化可以為磁性顆粒的檢測(cè)提供便利。

在某些實(shí)施方案中，自旋閥傳感器可以包括在一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)器表面上的鈍化層。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)器結(jié)合了鈍化薄(例如，60nm或更薄，諸如50nm或更薄，包括40nm或更薄、30nm或更薄、20nm或更薄或者10nm或更薄)層(例如，在檢測(cè)器被用于具有50nm或更低的平均直徑的磁性納米顆粒標(biāo)簽的實(shí)施方案中)。在某些實(shí)施方案中，可使用較大的微米尺度的磁性顆粒。在一些情況下，適用于本文公開的檢測(cè)器的鈍化薄層可具有介于約1nm與約10nm之間的厚度，諸如介于約1nm與約5nm之間的厚度，包括介于約1nm與約3nm之間的厚度。在某些實(shí)施方案中，適用于本文公開的檢測(cè)器的鈍化薄層可具有介于約10nm與約50nm之間的厚度，諸如介于約20nm與約40nm之間的厚度，包括介于約25nm與約35nm之間的厚度。鈍化層可包括但不限于，Ta、Au或它們的氧化物、它們的組合，等等。

涉及自旋閥檢測(cè)器及它們的應(yīng)用的方案的進(jìn)一步細(xì)節(jié)被提供于美國(guó)專利公開號(hào)第2005/0100930號(hào)和第2009/0104707號(hào)；其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

磁性隧道結(jié)檢測(cè)器

在某些實(shí)施方案中，所述磁性傳感器是磁性隧道結(jié)(MTJ)檢測(cè)器。MTJ檢測(cè)器以類似于自旋閥檢測(cè)器的方式構(gòu)建，區(qū)別在于磁性間隔層被替換成絕緣層(如，絕緣隧道阻擋層)如氧化鋁或MgO，通過該絕緣層所述感應(yīng)電流垂直于薄膜平面流動(dòng)。兩鐵磁電極之間的電子隧穿由兩鐵磁電極的相對(duì)磁化控制，即在其平行之時(shí)隧穿電流高并且在其反向平行時(shí)隧穿電流低。在某些實(shí)施方案中，MTJ檢測(cè)器包含底電極、布置在隧道阻擋層任一側(cè)的磁性多層以及頂電極。在一些情況下，MTJ檢測(cè)器具有超過200％的磁阻比率(S.Ikeda,J.Hayakawa,Y.M.Lee,F.Matsukura,Y.Ohno,T.Hanyu和H.Ohno,IEEE Transactions on Electron Devices,卷54,第5期,991-1001(2007))和大裝置磁阻，其產(chǎn)生了較高的輸出電壓信號(hào)。

在某些實(shí)施方案中，MTJ檢測(cè)器具有雙層頂電極。第一層可以是金屬層(如，金層)，其中該層可在某些情況下具有60nm或更低的厚度，諸如50nm或更低，包括40nm或更低、30nm或更低、20nm或更低或者10nm或更低。第二層可以是導(dǎo)電金屬，例如銅、鋁、鈀、鈀合金、鈀氧化物、鉑、鉑合金、鉑氧化物、釕、釕合金、氧化釕、銀、銀合金、銀氧化物、錫、錫合金、錫氧化物、鈦、鈦合金、鈦氧化物、這些物質(zhì)的組合，等等。在一些情況下，第二層的孔略小于MTJ的大小。在某些實(shí)施方案中，所述傳感器被配置為在使用期間使結(jié)合的磁性標(biāo)記物與所述自由磁性層的頂表面之間的距離介于5nm與100nm之間，諸如介于5nm與50nm之間，包括介于5nm與30nm之間，諸如介于5nm與20nm之間，包括介于5nm與10nm之間。在一些情況下，這種布置為降低或基本防止頂電極中的電流聚集提供便利(參見，例如van de Veerdonk,R.J.M.等,Appl.Phys.Lett.,71:2839(1997))，該現(xiàn)象可在僅使用薄金電極的情況下出現(xiàn)。

除所述感應(yīng)電流垂直于所述薄膜平面流動(dòng)之外，MTJ檢測(cè)器可與自旋閥檢測(cè)器類似地運(yùn)行，以所述外加調(diào)制場(chǎng)的面內(nèi)模式或垂直模式均可。根據(jù)上文涉及自旋閥檢測(cè)器的討論，在某些實(shí)施方案中，外加調(diào)制場(chǎng)的垂直模式可被用于降低EMI，并且類似地，薄鈍化層也適用于MTJ檢測(cè)器。此外，MTJ檢測(cè)器上的薄金第一頂電極還可為電導(dǎo)、鈍化以及特定生物分子探針的吸附提供便利。

在某些實(shí)施方案中，在相同的檢測(cè)器寬度和顆粒-檢測(cè)器距離下，MTJ檢測(cè)器可給出比自旋閥檢測(cè)器更大的信號(hào)。例如，對(duì)于具有0.2μm乘0.2μm結(jié)面積和1kOhm-μm²的電阻-面積乘積，以250％的MR在250mV的偏壓和H_b＝35Oe，H_t＝100Oe rms下運(yùn)行的MTJ檢測(cè)器，來(lái)自直徑11nm的中心距離所述自由層面心為35nm的單Co納米顆粒的電壓信號(hào)可為約200μV。在一些情況下，該電壓比類似大小的自旋閥檢測(cè)器的電壓高出一個(gè)或更多的數(shù)量級(jí)。

涉及MTJ檢測(cè)器及它們的應(yīng)用的方案的進(jìn)一步細(xì)節(jié)被提供于美國(guó)專利公開號(hào)第2005/0100930號(hào)和第2009/0104707號(hào)；其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

磁性傳感器裝置設(shè)置

磁性傳感器裝置可具有多種不同的設(shè)置，例如對(duì)傳感器的設(shè)置，無(wú)論傳感器被設(shè)置用于分批還是穿流應(yīng)用等等。同樣，提供所述裝置的磁性傳感器以與目標(biāo)分子結(jié)合相互作用的結(jié)合構(gòu)件和磁性標(biāo)記物的混合物任何設(shè)置均可被使用。因此，磁性傳感器裝置的設(shè)置可包括但不限于：井設(shè)置(其中所述傳感器與諸如井這樣的液體盛容結(jié)構(gòu)的底部或壁連接)；穿流設(shè)置，例如，其中所述傳感器與具有流體輸入和輸出的液流池(flow cell)的壁連接；等等。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的磁性傳感器裝置包含基板表面，其在所述基板表面上顯示兩種或更多種不同磁性傳感器。在某些實(shí)施方案中，所述磁性傳感器包含具有磁性傳感器陣列的基板表面。

“陣列”包含可尋址區(qū)域例如空間可尋址區(qū)域的任何二維或基本上二維(以及三維)的布置。當(dāng)在所述陣列上具有定位于特定預(yù)設(shè)位置(即，地址)的多個(gè)傳感器時(shí)，陣列是“可尋址的”。陣列特征(即，傳感器)可通過中間間隔而隔離。任意給定的基板可攜帶設(shè)置于所述基板前表面的一個(gè)、兩個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)陣列。根據(jù)用途，任何或全部所述陣列可感應(yīng)相同或彼此不同的目標(biāo)并且各陣列可包含多個(gè)不同的磁性傳感器。陣列可包含一個(gè)或多個(gè)，包括兩個(gè)或更多個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)、8個(gè)或更多個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)、50個(gè)或更多個(gè)，或者100個(gè)或更多個(gè)、1000個(gè)或更多個(gè)、10,000個(gè)或更多個(gè)或者100,000個(gè)或更多個(gè)磁性傳感器。例如，64個(gè)磁性傳感器可被布置到8×8的陣列中。在某些實(shí)施方案中，所述磁性傳感器可被布置到陣列中，所述陣列具有10cm²或更小的面積，或者5cm²或更小的面積，例如1cm²或更小的面積，包括50mm²或更小的面積、20mm²或更小的面積，諸如10mm²或更小的面積，或者甚至更小的面積。例如，磁性傳感器可具有介于10μm×10μm與200μm×200μm之間的面積，包括100μm×100μm或更低的面積，諸如90μm×910μm或更低，例如50μm×50μm或更低。

在某些實(shí)施方案中，磁性傳感器可包括多個(gè)線性磁阻段。例如，磁性傳感器可包括4個(gè)或更多個(gè)，例如8個(gè)或更多個(gè)，包括12個(gè)或更多個(gè)，或者16個(gè)或更多個(gè)，例如32個(gè)或更多個(gè)，例如64個(gè)或更多個(gè)，或者72個(gè)或更多個(gè)，或者128個(gè)或更多個(gè)線性磁阻段。所述磁阻段可各自寬度為1000nm或更低，例如寬度為750nm或更低，或者寬度為500nm或更低，例如寬度為250nm或更低。在一些情況下，所述磁阻段可各自厚度為50nm或更低，例如厚度為40nm或更低，包括厚度為30nm或更低，或者厚度為20nm或更低，例如厚度為10nm或更低。所述磁阻段可各自長(zhǎng)度為1000nm或更低，或者長(zhǎng)度為750nm或更低，或者長(zhǎng)度為500nm或更低，或者長(zhǎng)度為250nm或更低，例如長(zhǎng)度為100nm或更低，或者長(zhǎng)度為50nm或更低。

所述磁阻段可以串聯(lián)方式連在一起，或者所述磁阻段可以并聯(lián)方式連在一起。在一些情況下，所述磁阻段以串聯(lián)和并聯(lián)的方式連接。在這些情況下，兩個(gè)或更多個(gè)磁阻段可以并聯(lián)方式連在一起，并且兩組或更多組這些并聯(lián)連接的磁阻段可以串聯(lián)方式連在一起。圖12中示出了包含以串聯(lián)和并聯(lián)方式連接的磁阻段的磁性傳感器的實(shí)例。

在某些實(shí)施方案中，給定裝置的磁性傳感器中的至少一些或全部具有在與傳感器表面穩(wěn)定結(jié)合的結(jié)合對(duì)構(gòu)件。所述結(jié)合對(duì)構(gòu)件可根據(jù)所實(shí)施的特定分析的性質(zhì)而有所不同。同樣，所述結(jié)合對(duì)構(gòu)件可以是與目標(biāo)分子結(jié)合相互作用中的分子特異性地結(jié)合的捕獲探針，或是參與目標(biāo)分子結(jié)合相互作用的分子，例如與所述磁性標(biāo)記的分子特異地結(jié)合的分子?！胺€(wěn)定結(jié)合”指的是在應(yīng)用條件下所述結(jié)合對(duì)構(gòu)件和傳感器表面以超過瞬時(shí)的時(shí)間保持相對(duì)于彼此的空間位置，所述應(yīng)用條件的例子如所述分析條件。同樣，所述結(jié)合對(duì)構(gòu)件和傳感器表面可非共價(jià)或共價(jià)地彼此穩(wěn)定結(jié)合。非共價(jià)結(jié)合的實(shí)例包括非特異性吸附、基于靜電(如，離子、離子對(duì)相互作用)、疏水相互作用、氫鍵相互作用的結(jié)合、通過與所述支持物表面共價(jià)連接的特異性結(jié)合對(duì)構(gòu)件所進(jìn)行的特異性結(jié)合，等等。共價(jià)結(jié)合的實(shí)例包括結(jié)合對(duì)構(gòu)件與存在于所述傳感器表面的官能團(tuán)如-OH之間所形成的共價(jià)鍵，其中所述官能團(tuán)可以是天然存在的或是作為被引入的連接群體中的一員而存在。因此，所述結(jié)合對(duì)構(gòu)件可被吸附、物理吸附、化學(xué)吸附或共價(jià)連接于所述磁性傳感器表面。

在給定裝置包含兩個(gè)或更多個(gè)磁性傳感器的情況下，各傳感器可具有與其表面結(jié)合的相同或不同的結(jié)合對(duì)構(gòu)件。因此，這些裝置的傳感器表面可存在與所述磁性標(biāo)記的分子結(jié)合的不同的捕獲探針或分子，從而使各個(gè)磁性傳感器特異性地結(jié)合于不同的分子。這類裝置還可包含不具有任何結(jié)合對(duì)構(gòu)件的傳感器(例如，在這些空白傳感器可作為參比或?qū)φ针娦盘?hào)來(lái)源的情況下)。

在多傳感器裝置中，所述磁性傳感器之間可存在不攜帶任何分析物特異性探針的區(qū)域。當(dāng)這些傳感器間區(qū)域存在時(shí)，其可具有各種大小和設(shè)置。在一些情況下，這些傳感器間區(qū)域可被配置為降低或防止不同傳感器間的流體運(yùn)動(dòng)，例如在所述傳感器間區(qū)域包含疏水材料和/或流體屏障(諸如屏壁)的情況下。

在某些實(shí)施方案中，所述裝置的基板，例如可攜帶不同傳感器的一個(gè)或多個(gè)陣列的基板，一般被成形為矩形固體(盡管可能是其它形狀)，其長(zhǎng)度為1mm或更大和150mm或更小，諸如1mm或更大和100mm或更小，例如50mm或更小、10mm或更??；寬度為1mm或更大和150mm或更小，諸如100mm或更小，包括50mm或更小，或者10mm或更??；以及厚度為0.01mm或更大和5.0mm或更小，例如0.1mm或更大和2mm或更小，包括0.2mm或更大和1.5mm或更小，例如0.5mm或更大和1.5mm或更小。

可存在電子通訊元件，例如導(dǎo)電體，其被配置為將傳感器與“芯片外”組件電耦接，所述“芯片外”組件諸如裝置組件，例如處理器、顯示器，等等。

根據(jù)下文更為詳盡的描述，給定的磁性傳感器裝置除如上文所述的傳感器結(jié)構(gòu)(如，陣列)外可包含多種組件。另外的裝置組件可包括但不限于，信號(hào)處理組件、數(shù)據(jù)顯示組件(如，圖形用戶界面)；數(shù)據(jù)輸入和輸出裝置、電源、流體處理組件等等。

磁性標(biāo)記物

在所述方法的實(shí)施方案中，可使用任意便利的磁性標(biāo)記物。磁性標(biāo)記物是在與磁性傳感器充分結(jié)合時(shí)可通過所述磁性傳感器檢測(cè)出并且導(dǎo)致所述磁性傳感器輸出信號(hào)的標(biāo)記部分。在標(biāo)記物的中心與所述傳感器的表面之間的距離為200nm或更近，諸如100nm或更近，包括50nm或更近的情況下，目標(biāo)磁性標(biāo)記物可充分地結(jié)合于磁性傳感器。

在某些實(shí)施方案中，所述磁性標(biāo)記物是納米顆粒。在特定實(shí)施方案的實(shí)施中有用的納米顆粒是磁性(如，鐵磁性)膠體材料和顆粒。所述磁性納米顆?？梢允浅槾鸥叽啪卮判约{米顆粒，或者包含兩層或更多層反鐵磁性偶聯(lián)的高磁矩鐵磁物的合成反鐵磁納米顆粒。這兩種類型的納米顆粒均在缺乏磁場(chǎng)的情況下表現(xiàn)出“非磁性”并且基本不聚團(tuán)。根據(jù)某些實(shí)施方案，適用的可磁化納米顆粒包含一種或多種材料，例如但不限于，順磁、超順磁、鐵磁和亞鐵磁材料，以及它們的組合。

在某些實(shí)施方案中，所述磁性納米顆粒(本文亦稱為磁性標(biāo)簽)具有低殘磁以使其在溶液中不聚團(tuán)。具有低殘磁的磁性納米顆粒的實(shí)例包括超順磁顆粒和反鐵磁顆粒。在某些情況下，所述磁性標(biāo)簽在約100Oe的磁場(chǎng)下具有可檢測(cè)的磁矩。在一些情況下，所述磁性標(biāo)簽的大小與所述靶生物分子的大小是可比較的，從而使所述磁性標(biāo)簽不干擾目標(biāo)分子間的結(jié)合相互作用。在某些實(shí)施方案中，所述磁性標(biāo)簽在形狀上是基本均一的并且在生物環(huán)境中具有化學(xué)穩(wěn)定性，其可輔助它們?cè)诜治鰲l件下的應(yīng)用。在一些情況下，所述磁性標(biāo)簽是生物相容的，即水可溶并且經(jīng)功能化從而使它們易于結(jié)合于目標(biāo)生物分子，例如特異性結(jié)合于靶分析物的受體。

在某些實(shí)施方案中，所述磁性納米顆粒是高磁矩磁性納米顆粒，諸如Co、Fe或CoFe納米晶體，其在室溫下可以是超順磁的。所述磁性納米顆粒可通過化學(xué)方法進(jìn)行制備，例如但不限于，適當(dāng)溶液中的鹽還原或化合物分解。這些磁性納米顆粒的實(shí)例包括但不限于S.Sun和C.B.Murray,J.Appl.Phys.,85:4325(1999)；C.B.Murray等,MRS Bulletin,26:985(2001)；以及S.Sun,H.Zeng,D.B.Robinson,S.Raoux,P.M.Rice,S.X.Wang和G.Li,J.Am.Chem.Soc.,126,273-279(2004)所描述的納米顆粒。在某些實(shí)施方案中，所述磁性納米顆粒可以受控的大小(如，約5-12nm)被合成，具有單分散性并且使用油酸進(jìn)行穩(wěn)定化。適用于本文的磁性納米顆粒包括但不限于，Co、Co合金、鐵氧體、氮化鈷、氧化鈷、Co-Pd、Co-Pt、鐵、鐵合金、Fe-Au、Fe-Cr、Fe-N、Fe₃O₄、Fe-Pd、Fe-Pt、Fe-Zr-Nb-B、Mn-N、Nd-Fe-B、Nd-Fe-B-Nb-Cu、Ni、Ni合金，等等。在一些實(shí)施方案中，金薄層被鍍?cè)诖判院诵局?，或者聚L-賴氨酸包埋的玻璃表面可被連接于磁性核芯。適當(dāng)?shù)募{米顆粒可購(gòu)自，例如Nanoprobes,Inc.(Northbrook,IL)和Reade Advanced Materials(Providence,RI)。

在一些情況下，磁性納米標(biāo)簽可通過物理方法而不是化學(xué)方法來(lái)制備(參見，例如W.Hu,R.J.Wilson,A.Koh,A.Fu,A.Z.Faranesh,C.M.Earhart,S.J.Osterfeld,S.-J.Han,L.Xu,S.Guccione,R.Sinclair和S.X.Wang,Advanced Materials,20,1479–1483(2008))，并且其適用于對(duì)待檢測(cè)的所述靶生物分子進(jìn)行標(biāo)記。所述磁性標(biāo)簽可包含兩個(gè)或更多個(gè)鐵磁層，諸如Fe_xCo_1-x，其中x介于0.5與0.7之間，或者如基于Fe_xCo_1-x的合金。在一些情況下，F(xiàn)e_xCo_1-x具有24.5k高斯的飽和磁化。這些鐵磁層可被非磁性間隔層所隔離，所述非磁性間隔層諸如Ru、Cr、Au或其合金。在某些情況下，所述間隔層包含以反鐵磁方式耦接的鐵磁層，從而使所產(chǎn)生的顆粒的凈殘磁為零或接近于零。在某些實(shí)施方案中，所述反鐵磁結(jié)合可通過RKKY交換相互作用(參見，例如S.S.P.Parkin等,Phys.Rev.Lett.,64(19):2304(1990))和靜磁相互作用(J.C.Slonczewski等,IEEE Trans.Magn.,24(3):2045(1988))而實(shí)現(xiàn)。在一些情況下，所述反鐵磁耦合強(qiáng)度使得所述顆?？杀?00Oe的外部磁場(chǎng)飽和(所有層的磁化變成平行)。在一些情況下，所述反鐵磁耦合強(qiáng)度依賴于所述間隔層的層厚和合金組成。

在某些實(shí)施方案中，為促進(jìn)所述納米顆粒的生物偶聯(lián)，金覆蓋(或功能類似物或等同材料的覆蓋)被層疊于反鐵磁材料層之上從而使所述納米顆粒可以通過金-巰基或其它便利的連接而被偶聯(lián)于生物分子。表面活性劑可被用于所述納米顆粒，從而使所述納米顆?？梢猿蔀樗苄缘摹＞突瘜W(xué)穩(wěn)定性而言，所述納米顆粒的邊緣還可以用Au或其它惰性層鈍化。

任何便利的方案均可被用于制備本文所述的納米顆粒。例如，所述納米顆粒的層可包括沉積在具有基本光滑表面的基板或釋放層上的納米尺度的鐵磁層和間隔層。在一些情況下，通過壓印(imprinting)、蝕刻、自組裝等等可形成遮蔽層(mask layer)。隨后，可將所述遮蔽層和其它的不需要的層去除并完全清除掉。隨后可去除所述釋放層，升出為所述遮蔽層的負(fù)像(negative image)的納米顆粒。所述顆粒可隨后與表面活性劑和生物分子接觸。在一些情況下，所述基板可在完全清除和進(jìn)行化學(xué)機(jī)械拋光(CMP)后重復(fù)使用。

在其它的實(shí)施方案中，所述納米顆?？梢允褂孟麥p制備法(substractive fabrication method)進(jìn)行制備。在該情況下，所述層被直接沉積在釋放層之上并隨后沉積遮蔽層。通過所述遮蔽層蝕刻所述層并且最終從所述基板上釋放。這些納米顆粒產(chǎn)生于所述遮蔽層的正像(positive image)，其與在所述添加制備法中情況相反。

在某些實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的磁性納米顆粒的大小與目標(biāo)分子結(jié)合相互作用的生物分子的大小是可比較的，從而使所述納米顆粒不干擾目標(biāo)結(jié)合相互作用。因此，在一些實(shí)施方案中所述磁性納米顆粒的大小為亞微米尺度，例如介于5nm與250nm之間(平均直徑)，諸如介于5nm與150nm之間，包括介于5nm與20nm之間。例如，具有5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm和300nm的平均直徑的磁性納米顆粒以及具有介于這些數(shù)值任意二者之間的平均直徑的納米顆粒適用于本文。此外，除球形外，適用于本文的磁性納米顆?？梢员怀尚螢槠瑺?、棒狀、線圈、纖維等等。

在一些實(shí)施方案中，所述磁性標(biāo)記物具膠體穩(wěn)定性，例如，納米顆粒組合物可以穩(wěn)定膠體的形式存在。膠體穩(wěn)定指的是所述納米顆粒被均勻分散于溶液之中從而使所述納米顆粒基本不聚團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，為防止聚簇，所述納米顆粒在零外加場(chǎng)下可不具有凈磁矩(或具極小磁矩)。所有大小的反鐵磁顆粒在零場(chǎng)下均可具零磁矩。與之相反，對(duì)于鐵磁顆粒，其大小可低于“超順磁極限”，其在某些情況下是約20nm或更低，諸如約15nm或更低，包括約10nm或更低。

在某些實(shí)施方案中，可使用大晶圓(wafer)和標(biāo)準(zhǔn)真空薄膜沉積工藝而大量制備所述合成納米顆粒。例如，使用6英寸晶圓，假定各顆粒在所述晶圓上占據(jù)60nm乘60nm的方形的情況下，可在約5×10¹²顆粒每次運(yùn)行的速度下制備30-nm直徑的納米顆粒。

在一些情況下，給定的目標(biāo)結(jié)合相互作用的分子和磁性標(biāo)記物被穩(wěn)定地結(jié)合于彼此。“穩(wěn)定結(jié)合”指的是在應(yīng)用條件如分析條件下所述生物分子和磁性標(biāo)記物以超過瞬時(shí)的時(shí)間保持將相對(duì)于彼此的空間位置。同樣，所述生物分子和磁性標(biāo)記物可非共價(jià)或共價(jià)地彼此穩(wěn)定結(jié)合。非共價(jià)結(jié)合的實(shí)例包括非特異性吸附、基于靜電(如，離子、離子對(duì)相互作用)、疏水相互作用、氫鍵相互作用的結(jié)合、通過與所述支持物表面共價(jià)連接的特異性結(jié)合對(duì)構(gòu)件所進(jìn)行的特異性結(jié)合，等等。共價(jià)結(jié)合的實(shí)例包括所述生物分子與存在于所述標(biāo)記物表面的功能基團(tuán)如-OH之間所形成的共價(jià)鍵，其中所述功能基團(tuán)可以是天然存在的或是以引入的連接基團(tuán)的構(gòu)件的形式存在。

分析混合物制備

可使用任意數(shù)量的不同方案制造包含與分析混合物接觸的磁性傳感器的磁性傳感器裝置，所述分析混合物包含磁性標(biāo)記的分子。例如，與所述磁性標(biāo)記的分子特異性結(jié)合的第一種分子可被結(jié)合于所述傳感器表面的捕獲探針，并且隨后與磁性標(biāo)記的分子(如，可被磁性標(biāo)記的第二種分子)接觸。在這些情況下的方法可包括提供具有磁性傳感器的磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器展示出與所述第一種分子特異結(jié)合的捕獲探針，所述第一種分析還與所述磁性標(biāo)記的分子特異地結(jié)合；并且隨后使所述磁性傳感器與所述第一種分子和所述磁性標(biāo)記的分子接觸。所述接觸可包含依次地向所述磁性傳感器涂覆第一種分子，所述第一種分子與表面結(jié)合并且能夠與所述磁性標(biāo)記的分子特異地結(jié)合，并且隨后涂覆所述磁性標(biāo)記的分子。

或者，可以在與傳感器接觸之前將與所述磁性標(biāo)記的分子特異地結(jié)合的第一種分子和所述磁性標(biāo)記的分子合并以形成復(fù)合體，并且可使所產(chǎn)生的復(fù)合體與所述傳感器上的捕獲探針結(jié)合(如，在所述第一種分子和所述捕獲探針之間的結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)是研究目標(biāo)的情況下)。在這些情況下，所述接觸包含制備反應(yīng)混合物，所述混合物包含與所述磁性標(biāo)記的分子特異性結(jié)合的第一種分子以及所述磁性標(biāo)記的分子，并且隨后將所述反應(yīng)混合物涂覆于所述磁性傳感器。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，與所述磁性標(biāo)記的分子特異地結(jié)合的第一種分子被首先定位于所述傳感器上，并且隨后與磁性標(biāo)記的第二種分子接觸。在這些情況下，所述方法包括提供具有磁性傳感器的磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器展示出所述第一種分子(無(wú)中間捕獲探針)，并且隨后使所述磁性傳感器與磁性標(biāo)記的分子接觸。

圖1(a)和1(b)提供了可分別被應(yīng)用于對(duì)抗體/分析物相互作用和核酸雜交相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析的分析方案的示意圖。在圖1(a)中，所用的方案是夾心分析方案，該方案中與GMR傳感器表面穩(wěn)定結(jié)合的捕獲抗體被結(jié)合于分析物，所述分析物隨后被結(jié)合于與磁性標(biāo)簽相連接的檢測(cè)抗體。在圖1(b)中，所用的方案是DNA夾心分析，該方案中捕獲DNA被結(jié)合于GMR傳感器表面，靶DNA與所述捕獲DNA雜交，并且結(jié)合于磁性標(biāo)簽的檢測(cè)DNA與所述靶DNA雜交。在制備根據(jù)圖1(a)和1(b)所示的方案的裝置中，所關(guān)注的可以是所述捕獲結(jié)合構(gòu)件(如，捕獲抗體或捕獲DNA)和所述靶構(gòu)件(如，分析物或靶DNA)之間的相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。在這些實(shí)施方案中，所述靶和標(biāo)記的構(gòu)件被首先在結(jié)合條件下彼此接觸，并且所產(chǎn)生的復(fù)合體與所述傳感器表面接觸?；蛘?，在制備根據(jù)圖1(a)和1(b)所示的方案的裝置中，所關(guān)注的可以是標(biāo)記的結(jié)合構(gòu)件(如，標(biāo)記的抗體或標(biāo)記的DNA)和所述靶構(gòu)件(如，分析物或靶DNA)之間的相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。在這些實(shí)施方案中，所述靶和捕獲構(gòu)件首先在結(jié)合條件下彼此接觸，并且所產(chǎn)生的結(jié)合于傳感器表面的復(fù)合體與標(biāo)記的構(gòu)件接觸。

上述接觸(包括涂覆)步驟在可發(fā)生目標(biāo)結(jié)合相互作用的條件下進(jìn)行。盡管接觸的溫度可有所變化，但在一些情況下所述溫度在1℃至95℃的范圍，諸如5℃至60℃的范圍，并且包括20℃至40℃的范圍。所述分析的各種組分可存在與水性介質(zhì)中，所述介質(zhì)可包含或不包含其它的組分，諸如鹽、緩沖劑，等等。在一些情況下，接觸在嚴(yán)苛條件下進(jìn)行。嚴(yán)苛條件特征可在于比所述探針靶二聯(lián)體的融解溫度低15℃至35℃如20℃至30℃的溫度范圍，所述融解溫度取決于多種參數(shù)，例如，溫度、緩沖組合物、探針和靶的大小、探針和靶的濃度，等等。同樣地，所述雜交的溫度可在約55℃至70℃的范圍，通常在約60℃至68℃的范圍。在變性劑存在的情況下，所述溫度可在約35℃至約45℃的范圍，通常在37℃至42℃的范圍。嚴(yán)苛雜交條件特征可在于存在雜交緩沖液，其中所述緩沖液特征在于以下的特征中的一個(gè)或多個(gè)：(a)具有高鹽濃度，如3至6×SSC(或具有類似濃度的其它鹽類)；(b)去污劑的存在，諸如SDS(0.1至20％)、Triton×100(0.01至1％)、monidet NP40(0.01至5％)等等；(c)其它添加劑，如EDTA(如，0.1至1μM)、四甲基氯化銨；(d)加速劑，如PEG、硫酸葡聚糖(5至10％)、CTAB、SDS等等；(e)變性劑，如甲酰胺、脲等；等等。嚴(yán)苛條件是在其中嚴(yán)苛性與上文所述的特定條件至少相同的條件。

與傳感器表面接觸的樣品可以是簡(jiǎn)單樣品或復(fù)雜樣品?！皢螛悠贰敝傅氖前鼋Y(jié)合相互作用的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)件的樣品并且除所述溶劑之外的其它分子種類即使有也是少數(shù)的。“復(fù)雜樣品”指的是包含目標(biāo)結(jié)合相互作用的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)件并且還包含眾多不感興趣的不同蛋白質(zhì)或其它分子的樣品。在某些實(shí)施方案中，所述復(fù)雜樣品是血樣，其為血液或其級(jí)分，例如血清。在某些實(shí)施方案中，所述復(fù)雜樣品是血清樣品。在某些實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中進(jìn)行分析的復(fù)雜樣品是包含10種或更多種，諸如20種或更多種，包括100種或更多種，例如10³種或更多種、10⁴種或更多種(諸如15,000種；20,000種甚或25,000種或更多)相區(qū)分的(即，不同的)分子實(shí)體的復(fù)合樣品，所述分子實(shí)體在分子結(jié)構(gòu)方面相互不同。

從所述磁性傳感器中獲取實(shí)時(shí)信號(hào)

在制備包含與分析混合物(所述分析混合物包含目標(biāo)結(jié)合相互作用的結(jié)合構(gòu)件和磁性標(biāo)記物，例如根據(jù)上文所述)接觸的磁性傳感器的裝置之后，所述方法的方面包括通過所述磁性傳感器獲取實(shí)時(shí)信號(hào)。同樣地，某些實(shí)施方案包括通過所述裝置獲取實(shí)時(shí)信號(hào)。因此，可觀測(cè)到與目標(biāo)結(jié)合相互作用的發(fā)生相關(guān)聯(lián)的信號(hào)的實(shí)時(shí)演化。所述實(shí)時(shí)信號(hào)由給定的目標(biāo)時(shí)間期間所獲得的兩個(gè)或更多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)組成，其中在某些實(shí)施方案中所獲得的信號(hào)是在給定的目標(biāo)時(shí)間期間連續(xù)地獲得的數(shù)據(jù)點(diǎn)的連續(xù)集合(例如，以軌跡的形式)。目標(biāo)時(shí)間期間可變動(dòng)，其在一些情況下在1秒至10小時(shí)的范圍，諸如在10秒至1小時(shí)的范圍并且包括1分鐘至15分鐘的范圍。所述信號(hào)中的數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)量也可變動(dòng)，其中在一些情況下，數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)量足以在所述實(shí)時(shí)信號(hào)的時(shí)間段上提供數(shù)據(jù)的連續(xù)延伸(continuous stretch)。

在一些實(shí)施方案中，當(dāng)所述分析系統(tǒng)處于所述“濕”條件下時(shí)觀測(cè)所述信號(hào)，即，在包含分析成分(例如，所述結(jié)合構(gòu)件和磁性標(biāo)記物)的溶液仍處于與所述傳感器表面的接觸的情況下。由此，無(wú)須洗去全部非結(jié)合或無(wú)關(guān)分子。該“濕”檢測(cè)是可行的，這是因?yàn)樗龃判詷?biāo)簽納米顆粒(例如，如本文它處所述的具有150nm或更小的直徑)所產(chǎn)生的磁場(chǎng)隨著與所述納米顆粒的距離的增加而迅速降低。因此，與所捕獲的結(jié)合構(gòu)件結(jié)合的標(biāo)記物的傳感器處的磁場(chǎng)超過了來(lái)自溶液中的未結(jié)合的磁性標(biāo)記物的磁場(chǎng)，所述非結(jié)合磁性標(biāo)記物不僅與所述檢測(cè)器的距離較遠(yuǎn)而且處于布朗運(yùn)動(dòng)之中。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“鄰近檢測(cè)”指的是所結(jié)合的納米顆粒的傳感器的主導(dǎo)性。根據(jù)所述“鄰近檢測(cè)”設(shè)計(jì)，處于所述傳感器表面的特異結(jié)合的磁性標(biāo)記的偶聯(lián)物可在不洗去溶液中的非特異磁性納米標(biāo)簽的情況下被定量。

對(duì)于給定的目標(biāo)結(jié)合相互作用，分析可包含獲得單結(jié)合對(duì)構(gòu)件濃度或多個(gè)結(jié)合對(duì)濃度的實(shí)時(shí)信號(hào)，諸如2個(gè)或更多個(gè)、3個(gè)或更多個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)、100個(gè)或更多個(gè)、甚或1,000個(gè)或更多個(gè)不同的濃度。根據(jù)需要，給定的分析可使具有相同捕獲探針濃度的相同傳感器與多個(gè)不同的結(jié)合對(duì)構(gòu)件濃度接觸，或以相反的方式進(jìn)行接觸，或以捕獲探針和結(jié)合對(duì)構(gòu)件的不同濃度組合進(jìn)行接觸。

通過所述實(shí)時(shí)信號(hào)定量確定結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)

根據(jù)上文所總結(jié)，在獲得所述實(shí)時(shí)信號(hào)之后，所述方法可包括通過所述實(shí)時(shí)信號(hào)定量確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)。換言之，所述實(shí)時(shí)信號(hào)被用于定量確定所述目標(biāo)結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)，從而目標(biāo)結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)獲得自所述實(shí)時(shí)信號(hào)。

在一些情況下，所述目標(biāo)結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)通過使用擬合算法處理所述實(shí)時(shí)信號(hào)而進(jìn)行定量確定。擬合算法指的是一套法則，其通過將方程與實(shí)時(shí)信號(hào)或獲自給定分析信號(hào)擬合，所述給定分析例如上文所述分析，從而確定目標(biāo)結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)?？墒褂萌我獗憷臄M合算法。

在一些實(shí)施方案中，二室模型被用于擬合所述實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)。所關(guān)注的二室模型假定溶液中的磁性標(biāo)記的結(jié)合分子通過傳輸過程(擴(kuò)散或流動(dòng))接近表面結(jié)合的結(jié)合配對(duì)物如被捕獲的第一種生物分子，并且隨后通過結(jié)合和解離的化學(xué)過程與表面結(jié)合的結(jié)合配對(duì)物結(jié)合。在這些情況下，模型中的二室是主體區(qū)室和表面區(qū)室。圖2提供了一些實(shí)施方案中使用的二室反應(yīng)-擴(kuò)散模型的示意圖，其中標(biāo)記的分子(以標(biāo)記的抗體演示)通過傳輸過程向所述傳感器表面移動(dòng)并且隨后通過結(jié)合流動(dòng)而結(jié)合和釋放。在一些情況下，磁性標(biāo)記分子的濃度被假定在各個(gè)區(qū)室中是均一的并且僅僅處于所述表面區(qū)室(C_s)中的磁性標(biāo)記的分子將與所述傳感器表面的結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)并且處于所述主體區(qū)室(C₀)中的磁性標(biāo)記的分子將向所述表面進(jìn)行擴(kuò)散。在一些情況下，所使用的二室模型并不假定發(fā)生“快速混合”。

該系統(tǒng)的支配方程寫作：

$\frac{{\mathrm{dC}}_s}{dt}=k_M(C_0-C_s)-k_a{C}_s(B_{max}-B)+k_{d}B---\left(1\right)$

$\frac{dB}{dt}=k_a{C}_s(B_{\max }-B)-k_{d}B---\left(2\right)$

其邊界條件為：

C_s|_t＝0＝C₀ (3)

B|_t＝0＝0 (4)

其中B是傳感器表面上所結(jié)合的第一/第二生物分子偶聯(lián)物的濃度，B_max是初始有效受體濃度，k_a(＝k_on)是結(jié)合速率常數(shù)，k_d(＝k_off)是解離速率常數(shù)，并且k_M是擴(kuò)散限制的速率常數(shù)。由于對(duì)此常微分方程組無(wú)解析解，因此使用了數(shù)值擬合算法。

上述第一個(gè)方程被用于描述所述表面區(qū)室中標(biāo)記的第二種分子的濃度C_s。該方程假定標(biāo)記的第二種分子通過來(lái)自所述主體區(qū)室的擴(kuò)散向所述表面區(qū)室的入流減去第二種分子通過與所述受體的結(jié)合和解離的凈出流等于C_s增加的速度。在這些實(shí)施方案中擴(kuò)散是唯一的物質(zhì)傳輸機(jī)制，其中在結(jié)合過程期間整個(gè)體系被靜置。

第二個(gè)方式被用于描述傳感器表面結(jié)合的第一/第二生物分子偶聯(lián)物濃度B。該方程假定標(biāo)記的第二種生物分子通過結(jié)合而產(chǎn)生的入流減去解離等于B增加的速度。

最后，所述實(shí)時(shí)信號(hào)被假定與B成正比，即

V＝gB，V_max＝gB_max. (5)

存在五個(gè)未知參數(shù)，其將是擬合參數(shù)k_a、k_d、k_M、g和V_max。在這五個(gè)擬合參數(shù)中，k_a、k_d、k_M和g被假定對(duì)于在一個(gè)分析中具有相同捕獲、第一和第二生物分子的所有傳感器是相同的，并且因此被稱為全局?jǐn)M合參數(shù)；V_max對(duì)于各個(gè)傳感器是不同的，這是因?yàn)楸砻娼Y(jié)合的結(jié)合配對(duì)物如固定化于所述傳感器表面的捕獲分子、第一種生物分子的濃度是難以被精確地控制的。即使在所有傳感器均位于相同的芯片并且受到相同處理的分析中，在B_max中都會(huì)存在某些差別，并且因此在V_max中會(huì)存在某些差別。

在一些情況下，所述二室模型是描述于D.Myszka等,Anal.Biochem.(1998)265:326-330中的二室模型的修正，例如其中所述模型被修改以適合于上述參數(shù)。

在需要的情況下，固定化的結(jié)合配對(duì)物的濃度可在不同傳感器中被特意地變動(dòng)，因此可獲得并分析具有不同形狀的信號(hào)曲線，例如，在被稱為全局分析或全局?jǐn)M合的方案中進(jìn)行。在這些情況下，所述二室結(jié)合模型(如，根據(jù)上文所述的模型)被同時(shí)擬合于使用不同分析物濃度C(和/或不同水平的表面衍生化B_max)而獲得的多種實(shí)時(shí)信號(hào)。本領(lǐng)域中被稱為“全局?jǐn)M合”并且基于所述實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，這種全局?jǐn)M合確定了單全局k_a或k_d是否將提供對(duì)全部數(shù)據(jù)的良好擬合。完成的擬合的結(jié)果可以圖形的方式被提供給以操作人員(operator)，其將所擬合的曲線重疊于所述原始實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)曲線之上進(jìn)行顯示。

在需要的情況下，所述擬合的接近度還可通過卡方(X²)值的方式給出，其為一種標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)度量。在一些情況下，當(dāng)所述卡方值與實(shí)驗(yàn)中的噪音處于相同的量級(jí)之下被認(rèn)為給出了良好的擬合?？杀环Q為R²的測(cè)定系數(shù)，也可被用作為擬合良好度的指標(biāo)。R²可被如下定義：如果所述信號(hào)曲線為s_i并且所述擬合曲線為f_i,i＝1，2，……n，當(dāng)信號(hào)曲線中具有n個(gè)點(diǎn)時(shí)，則

$R^2=1-\frac{{\mathrm{SS}}_{err}}{{\mathrm{SS}}_{tot}}---\left(6\right)$

其中是所述擬合的方差之和，并且是所述信號(hào)的總變差(total variations)。

如果存在來(lái)自一個(gè)分析的N條信號(hào)曲線，則各個(gè)信號(hào)曲線將具有R²值，應(yīng)對(duì)1-R²的平均值進(jìn)行最小化以獲得對(duì)全部N條曲線的最佳擬合。

在一些情況下，還可提供“殘差圖”，所述殘差圖給出了所述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏離被擬合的曲線的程度的圖示，其顯示了各條曲線的實(shí)驗(yàn)和擬合數(shù)據(jù)之間的差異。操作人員可隨后確定所述擬合是否足夠有效。如果不夠有效，則可排除表現(xiàn)出最差擬合的實(shí)時(shí)信號(hào)并且使用消減的實(shí)時(shí)信號(hào)集合重新運(yùn)行所述擬合程序?？芍貜?fù)該程序直至所述擬合達(dá)到滿意程度。

所關(guān)注的另一種擬合算法包括特異性擬合算法，其公開于下文的實(shí)驗(yàn)部分。

在需要的情況下，以上定量測(cè)定方案可在被配置為執(zhí)行上述方案的軟件和/或硬件的輔助下進(jìn)行。

多元分析

本發(fā)明方面包括使用同一傳感器對(duì)兩種或更多種不同的結(jié)合相互作用進(jìn)行的多元分析。“多元分析”指的是不同組結(jié)合分子之間的兩種或更多種不同結(jié)合相互作用被定量分析，其中結(jié)合分子和/或磁性標(biāo)記的分子彼此不同，例如區(qū)別于不同的序列。在一些情況下，所述組數(shù)量是2個(gè)或更多個(gè)，諸如4個(gè)或更多個(gè)、6個(gè)或更多個(gè)、8個(gè)或更多個(gè)等等，多達(dá)20個(gè)或更多個(gè)，例如50個(gè)或更多個(gè)，包括100個(gè)或更多個(gè)或者1000個(gè)或更多個(gè)不同組。同樣地，在一些情況下，所述磁性傳感器裝置可包含兩種或更多種不同的磁性傳感器，諸如2種或更多種、4種或更多種、6種或更多種、8種或更多種等等，多達(dá)20種或更多種，例如50種或更多種，包括100種或更多種或者1000種或更多種不同的磁性傳感器，各傳感器特異地檢測(cè)不同的結(jié)合相互作用。在某些實(shí)施方案中，所關(guān)注的是2至1000種不同結(jié)合相互作用的多元分析，諸如2至50種，或者2至20種不同的結(jié)合相互作用。因此，在這些實(shí)施方案中，所述磁性傳感器裝置可包含2至1000個(gè)不同的磁性傳感器，諸如4至1000個(gè)不同的磁性傳感器，其各自特異地分析不同的結(jié)合相互作用。在其它情況下，所述磁性傳感器裝置可包含20個(gè)或更少的不同磁性傳感器，諸如10個(gè)或更少，包括4個(gè)或更少的不同磁性傳感器，其各自特異地分析不同的結(jié)合相互作用。

裝置和系統(tǒng)

本發(fā)明的方面進(jìn)一步包括磁性傳感器裝置和系統(tǒng)，其被配置為對(duì)目標(biāo)分子結(jié)合相互作用的一種或多種結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行定量測(cè)定。所述裝置和系統(tǒng)一般包括磁性傳感器；以及定量分析模塊(如，處理器)，所述定量分析模塊被配置為從所述磁性傳感器中接收實(shí)時(shí)信號(hào)并由所述實(shí)時(shí)信號(hào)定量地確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)。這兩個(gè)組件可作為單一裝置被整合進(jìn)入同一產(chǎn)品中，或分置入兩個(gè)或更多個(gè)不同裝置中(如，作為系統(tǒng))，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)不同裝置彼此進(jìn)行通訊，例如，通過有線或無(wú)線通訊協(xié)議。

因此，本發(fā)明的方面進(jìn)一步包括系統(tǒng)，例如，基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)，其被配置為定量評(píng)價(jià)根據(jù)上文所述的結(jié)合相互作用?！盎谟?jì)算機(jī)的系統(tǒng)”指的是被用于分析本發(fā)明的信息的硬件裝置、軟件裝置和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)裝置。所述基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)的實(shí)施方案的最低硬件包括中央處理器(CPU)(如，處理器)、輸入裝置、輸出裝置和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)裝置。任意一種當(dāng)前存在的基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)均可適用于本文公布的實(shí)施方案。所述數(shù)據(jù)存儲(chǔ)裝置可包括任意產(chǎn)品，其包含如上所述的本發(fā)明信息的記錄品，或者可訪問這種產(chǎn)品的存儲(chǔ)器訪問裝置。

在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上“記錄”數(shù)據(jù)、編程或其它信息是指使用本領(lǐng)域已知的任何方法存儲(chǔ)信息的過程。根據(jù)所使用的訪問所存儲(chǔ)的信息的裝置，可選用任意便利的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)結(jié)構(gòu)。多種數(shù)據(jù)處理器程序和格式可被用于存儲(chǔ)，例如，文字處理文本文件，數(shù)據(jù)庫(kù)格式，等等。

“處理器”指的是執(zhí)行其所需的功能的任何硬件和/或軟件組合。例如，本文的任何處理器可以是可編程的數(shù)字微處理器，諸如以電子控制器、大型機(jī)、服務(wù)器或個(gè)人計(jì)算機(jī)(例如，桌面或便攜式)形式可用的微處理器。在所述處理器是可編程的情況下，適當(dāng)?shù)某绦蚩蓮倪h(yuǎn)程位置通訊給所述處理器，或者以計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品的形式預(yù)先存儲(chǔ)(所述計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品諸如便攜式或固定化的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，無(wú)論是基于磁性、光學(xué)或固態(tài)裝置均可)。例如，磁性介質(zhì)或光盤可攜帶所述程序，并且可通過在對(duì)應(yīng)的站點(diǎn)與各處理器進(jìn)行通訊的適當(dāng)?shù)淖x取器讀取。

本系統(tǒng)的實(shí)施方案可包含下列組件：(a)通訊模塊，所述通訊模塊例如通過用戶計(jì)算機(jī)或工作站為所述系統(tǒng)與一位或多位用戶之間的信息傳遞提供便利；以及(b)處理模塊，所述處理模塊用于執(zhí)行包括在所公開的定量分析方法中的一個(gè)或多個(gè)任務(wù)。

在某些實(shí)施方案中，描述了包含計(jì)算機(jī)可用介質(zhì)的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，所述介質(zhì)具有存儲(chǔ)于其中的控制邏輯(control logic)(計(jì)算機(jī)軟件程序，包括程序代碼)。當(dāng)被所述計(jì)算機(jī)的處理器執(zhí)行的時(shí)候，所述控制邏輯使所述處理器執(zhí)行本文所述的功能。在其它的實(shí)施方案中，某些功能主要在使用例如硬件狀態(tài)機(jī)的硬件中實(shí)施。為執(zhí)行本文所述功能的硬件狀態(tài)機(jī)的實(shí)施可通過使用任何便利的方法和工藝而實(shí)現(xiàn)。

除所述傳感器裝置和定量分析模塊之外，本發(fā)明的系統(tǒng)和裝置還可包含大量的其它組件，諸如數(shù)據(jù)輸出裝置如監(jiān)視器、打印機(jī)和/或揚(yáng)聲器，數(shù)據(jù)輸入裝置如交互端口、鍵盤等等，液體處理組件，電源等等。

用途

本方法、系統(tǒng)和試劑盒在需要定量測(cè)定目標(biāo)結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)的多種不同應(yīng)用中顯現(xiàn)用途。在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)合相互作用例如但不限于，核酸雜交、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(例如在下文實(shí)驗(yàn)部分中被更為詳盡地描述的相互作用)、受體-配體相互作用、酶-底物相互作用、蛋白質(zhì)-核酸相互作用，等等。

在一些情況下，本方法、系統(tǒng)和試劑盒在需要實(shí)時(shí)觀測(cè)分子結(jié)合相互作用的藥物開發(fā)方案中展現(xiàn)用途。例如，藥物開發(fā)方案可使用本方法、系統(tǒng)和試劑盒來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)抗體與抗原之間的分子結(jié)合相互作用、或核酸之間的雜交相互作用、或蛋白質(zhì)之間的結(jié)合相互作用、或受體與配體之間的結(jié)合相互作用、或酶與底物之間的結(jié)合相互作用、或蛋白質(zhì)與核酸之間的結(jié)合相互作用，等等。例如，CEA和VEGF是腫瘤標(biāo)記物并且抗VEGF抗體藥物如貝伐單抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀(Avastin)；Genentech/Roche)是有效的抗癌癥藥物。另一個(gè)實(shí)例為抗EpCAM抗體，其被制劑化成為化療藥物依決洛單抗(edrecolomab)。對(duì)諸如此類的結(jié)合相互作用的監(jiān)測(cè)可為其它基于抗體的藥物的開發(fā)提供便利。

本方法、系統(tǒng)和試劑盒還在對(duì)包含在復(fù)雜樣品中的結(jié)合對(duì)之間的分子結(jié)合相互作用的分析中展現(xiàn)用途。在一些情況下，所述復(fù)雜樣品可被直接分析而不將目標(biāo)結(jié)合分子與其它可能處于所述樣品中的非感興趣的蛋白質(zhì)或分子進(jìn)行分離。在某些情況下，非感興趣的蛋白質(zhì)或分子的非特異性結(jié)合以及未結(jié)合的磁性納米顆粒在本方法、系統(tǒng)和試劑盒中基本不產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。因此，本方法、系統(tǒng)和試劑盒在可能使用復(fù)雜樣品并且在對(duì)于目標(biāo)結(jié)合相互作用的檢測(cè)無(wú)需洗滌所述傳感器的情況下可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)目標(biāo)結(jié)合相互作用而的分析方案中展現(xiàn)用途。

本文公開的實(shí)時(shí)結(jié)合分析和動(dòng)力學(xué)模型可在諸如表位定位的應(yīng)用中展現(xiàn)用途。例如，所述GMR傳感器陣列具有以高度并行方式實(shí)施表位定位的能力。使用捕獲抗體，可將抗原選擇性地固定化于所述傳感器表面上的特定分子內(nèi)結(jié)構(gòu)之中。所述被捕獲抗原上暴露的表位的動(dòng)力學(xué)相互作用可以針對(duì)多種受體或抗體的親和性而被探測(cè)。例如，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)能夠結(jié)合EGF自身以及包含EGF樣重復(fù)的蛋白質(zhì)如EpCAM。通過使用不同的單克隆抗體捕獲具有EGF樣重復(fù)的蛋白質(zhì)以及對(duì)EGFR與這些定向蛋白質(zhì)的結(jié)合進(jìn)行的檢測(cè)，可測(cè)定表位定位以評(píng)價(jià)EGFR對(duì)于包含EGF樣重復(fù)的多種配體的親和性。使用GMR傳感器以探測(cè)暴露出的表位具有從使用特定靶進(jìn)行的藥物相互作用的大規(guī)模篩選直至對(duì)蛋白質(zhì)組中的特定目標(biāo)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行的平行篩選的應(yīng)用。

本方法、系統(tǒng)和試劑盒還在對(duì)分子結(jié)合相互作用的空間上和時(shí)間上的監(jiān)測(cè)中展現(xiàn)用途。例如，本方法、系統(tǒng)和試劑盒可被用于通過細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分泌蛋白質(zhì)組(secretome)分析而監(jiān)測(cè)定位化的細(xì)胞-細(xì)胞通訊。通過監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分泌在空間和時(shí)間上的擴(kuò)散，可測(cè)定細(xì)胞-細(xì)胞通訊的機(jī)制。

本方法、系統(tǒng)和試劑盒還在了解參與細(xì)胞生物學(xué)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體-配體結(jié)合相互作用以及在完整蛋白質(zhì)組中對(duì)特定目標(biāo)化合物進(jìn)行特征化的基礎(chǔ)研究中展現(xiàn)用途。此外，對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用范圍之廣可從定向蛋白質(zhì)估測(cè)研究中的大規(guī)模篩選直至檢測(cè)藥物中靶(on-target)和離靶(off-target)交叉反應(yīng)結(jié)合動(dòng)力學(xué)。

計(jì)算機(jī)相關(guān)實(shí)施方案

特定實(shí)施方案的方面進(jìn)一步包括多種計(jì)算機(jī)相關(guān)的實(shí)施方案。具體地，可使用計(jì)算機(jī)實(shí)施先前部分中所描述數(shù)據(jù)分析方法。因此，實(shí)施方案提供了基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)以對(duì)使用上文方法所產(chǎn)生的分析數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而提供目標(biāo)結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)的定量測(cè)定。

在某些實(shí)施方案中，所述方法以“程序”的形式被編碼到計(jì)算機(jī)可讀的介質(zhì)中，其中本文所使用的術(shù)語(yǔ)“計(jì)算機(jī)可讀的介質(zhì)”指的是任何存儲(chǔ)或轉(zhuǎn)移介質(zhì)，其參與對(duì)計(jì)算機(jī)提供用于執(zhí)行和/或處理的指令和/或數(shù)據(jù)。存儲(chǔ)介質(zhì)的實(shí)例包括軟盤、磁帶、CD-ROM、DVD、Blu-Ray、硬盤驅(qū)動(dòng)器、ROM或集成電路、磁光盤或者計(jì)算機(jī)可讀卡如PCMICA卡或閃存卡，等等，無(wú)論這些裝置屬于所述計(jì)算機(jī)內(nèi)置或者外置均可。包含信息的文件可被“存儲(chǔ)”于計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中，其中“存儲(chǔ)”指的是記錄信息從而使其在隨后的時(shí)間可為計(jì)算機(jī)所訪問和檢索。所需介質(zhì)是非瞬時(shí)的介質(zhì)，即，所述程序被關(guān)聯(lián)以實(shí)體結(jié)構(gòu)的實(shí)體介質(zhì)，例如被記錄于其上。非瞬時(shí)介質(zhì)并不包含通過無(wú)線協(xié)議進(jìn)行轉(zhuǎn)送的電子線號(hào)。

對(duì)于計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，“永久性存儲(chǔ)器”指的是處于永久狀態(tài)的存儲(chǔ)器。永久性存儲(chǔ)器不會(huì)由于對(duì)計(jì)算機(jī)或處理器的供電終止而消除。計(jì)算機(jī)硬盤驅(qū)動(dòng)器、CD-ROM、Blu-Ray、軟盤和DVD是永久性存儲(chǔ)器的全部實(shí)例。隨機(jī)存取存儲(chǔ)器(RAM)是非永久性存儲(chǔ)器的一個(gè)實(shí)例。永久性存儲(chǔ)器中的文件是可編輯和重寫入的。

試劑盒

還提供了用于實(shí)施上述方法的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的試劑盒。本試劑盒可變動(dòng)并且可包含多種裝置和試劑。目標(biāo)試劑和裝置包括本文針對(duì)磁性傳感器裝置或其組件(諸如，磁性傳感器陣列或芯片)、磁性納米顆粒、結(jié)合試劑、緩沖液等等所描述的試劑和裝置。

在一些情況下，所述試劑盒至少包含在所述方法(如，上文所述的方法)中使用的試劑；以及存儲(chǔ)有計(jì)算機(jī)程序的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述計(jì)算機(jī)程序當(dāng)加載進(jìn)入計(jì)算機(jī)時(shí)操作所述計(jì)算機(jī)由獲自磁性傳感器的實(shí)時(shí)信號(hào)定量地確定第一種和第二種分子之間的結(jié)合相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)；以及具有用于獲得所述計(jì)算機(jī)程序的地址的物理基板。

除以上組件之外，本試劑盒可進(jìn)一步包含實(shí)施本方法的說明。這些說明可以各種形式存在于在本試劑盒中，所述試劑盒中可存在一種或多種所述形式。這些說明可存在的一種形式是在合適的介質(zhì)或基板上的印刷信息，例如，印有所述信息的紙件，處于所述試劑盒的包裝之中或在包裝插頁(yè)上等等。另一種方式為其上記錄有所述信息的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，例如，磁盤、CD、DVD、Blu-Ray等等?？纱嬖诘牧硪环N方式為網(wǎng)站地址，其可被用于通過國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)在遠(yuǎn)程站點(diǎn)獲取所述信息。本試劑盒中可存在任何便利的方式。

下列實(shí)施例通過說明的方式而非限制的方式提供。

實(shí)驗(yàn)

I.結(jié)合動(dòng)力學(xué)測(cè)定

A.材料與方法

描述于Osterfield等,Proc.Nat’l Acad.Sci USA(2008)150:20637-206340以及Xu等,Biosens.Bioelectron(2008)24:99-103的巨磁阻(GMR)傳感器陣列被用于以下一般方案：

1.表面功能化：傳感器表面被功能化以提供結(jié)合對(duì)構(gòu)件在所述傳感器表面的穩(wěn)定結(jié)合，結(jié)合對(duì)構(gòu)件的實(shí)例如，捕獲抗體、第一種生物分子，等等。諸如聚乙烯亞胺(PEI)這樣的陽(yáng)離子聚合物可被用于通過物理吸附將帶電的抗體非特異性結(jié)合于所述傳感器表面?；蛘?，可利用所述抗體上的自由氨基或自由巰基基團(tuán)使用共價(jià)化學(xué)反應(yīng)。涉及用于寡核苷酸的穩(wěn)定結(jié)合的表面功能化的另外細(xì)節(jié)提供于Xu等,Biosens.Bioelectron(2008)24:99-103并且對(duì)于抗體的穩(wěn)定結(jié)合的表面功能化的另外細(xì)節(jié)提供于Osterfield等,Proc.Nat'l Acad.Sci USA(2008)150:20637-206340。目標(biāo)結(jié)合對(duì)構(gòu)件隨后被接觸所述傳感器表面用以將所述結(jié)合構(gòu)件穩(wěn)定地結(jié)合于所述傳感器表面。

2.在進(jìn)行表面功能化和結(jié)合對(duì)結(jié)合之后，對(duì)所述傳感器表面進(jìn)行封閉以防止所述分析期間的非特異性結(jié)合。為封閉所述表面，包含1％BSA的PBS的封閉緩沖液被加入反應(yīng)孔內(nèi)一小時(shí)?？捎玫钠渌忾]方案被描述于Xu等,Biosens.Bioelectron(2008)24:99-103以及Osterfield等,Proc.Nat'l Acad.Sci USA(2008)150:20637-206340。

3.在封閉之后，使所述傳感器表面與第一種目標(biāo)生物分子的溶液如所述第一種生物分子的純化溶液或包含所述第一種生物分子的復(fù)合樣品接觸。對(duì)于本步驟，使用包含～1nL-100μL溶液的反應(yīng)孔并且根據(jù)應(yīng)用孵育時(shí)間在5分鐘至2小時(shí)的范圍。

4.在孵育之后，使包含經(jīng)目標(biāo)標(biāo)簽(如，磁性納米顆粒)進(jìn)行預(yù)標(biāo)記的第二種生物分子的溶液與所述傳感器表面接觸。

5.隨后，檢測(cè)所述第二種生物分子與所述第一種生物分子的結(jié)合動(dòng)力學(xué)并且用于根據(jù)結(jié)合軌跡而計(jì)算結(jié)合速率常數(shù)。

B.結(jié)果與討論

來(lái)自GMR生物傳感器的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)被用于計(jì)算生物素-鏈霉親和素相互作用的結(jié)合和解離速度(圖3(a))。生物素化雙鏈DNA被固定于所述傳感器表面并且經(jīng)鏈霉親和素標(biāo)記的磁性標(biāo)簽被加入所述系統(tǒng)。結(jié)合速度經(jīng)計(jì)算為4.45×10⁶M^-1s^-1，擬合誤差為3.2％并且k_M為4.4×10^-4s^-1。當(dāng)使用BIAcore 3000表面等離子共振(SPR)儀器時(shí)進(jìn)行了相同的生物素-鏈霉親和素結(jié)合實(shí)驗(yàn)并且測(cè)得結(jié)合速度為5.5×10⁶M^-1s^-1，接近于所述GMR傳感器分析。

隨后，論證了使用GMR傳感器陣列進(jìn)行抗體抗原結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究的能力(圖2)。使用EpCAM蛋白在五至十組重復(fù)傳感器上以100μg/mL和10μg/mL的濃度對(duì)所述陣列中的傳感器進(jìn)行功能化。使用該模型可以模擬經(jīng)磁性標(biāo)記的抗體與多種濃度的固定化抗原的結(jié)合過程。通過擬合數(shù)據(jù)(圖3(b))，根據(jù)測(cè)定，對(duì)于選定的EpCAM抗體-抗原相互作用k_a為2.93×10⁵M^-1s^-1，k_d為2.83×10^-3s^-1，總擬合誤差為3.4％并且k_M為4.2×10^-4s^-1。

進(jìn)行了類似的實(shí)時(shí)實(shí)驗(yàn)以對(duì)高親和性CEA抗原-抗體結(jié)合動(dòng)力學(xué)進(jìn)行定量。1μg/mL和10μg/mL CEA被固定于所述GMR傳感器表面并且通過SPR分析對(duì)20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL和1.2μg/mL進(jìn)行測(cè)試。在各個(gè)平臺(tái)上監(jiān)測(cè)了結(jié)合和解離速率常數(shù)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較(圖3(c)和3(d))。再一次，GMR傳感器陣列和SPR產(chǎn)生了類似的動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)。對(duì)于所述GMR生物傳感器，k_a被測(cè)定為5.0×10⁴M^-1s^-1并且k_d為4.4×10^-4s^-1，而SPR實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了4.44×10⁴M^-1s^-1的k_a和1.17×10^-4s^-1的k_d。因此，這些結(jié)果顯示磁響應(yīng)性生物傳感器可被用于精確測(cè)量結(jié)合速率常數(shù)。

II.用于抗體開發(fā)和藥物篩選的蛋白質(zhì)相互作用高通量分析和動(dòng)力學(xué)模型

A.材料與方法

1.傳感器

本實(shí)驗(yàn)中所使用的巨磁阻(GMR)傳感器具有以下類型的底部自旋閥結(jié)構(gòu)：Si/Ta(5)/晶種層/IrMn(8)/CoFe(2)/Ru/(0.8)/CoFe(2)/Cu(2.3)/CoFe(1.5)/Ta(3)，括號(hào)內(nèi)所有數(shù)字單位為納米。各個(gè)芯片均包含GMR傳感器陣列，所述陣列通過300nm厚的Ta/Au/Ta導(dǎo)線(lead)被連接于周邊結(jié)合墊(peripheral bonding pad)。為保護(hù)所述傳感器和導(dǎo)線免于腐蝕，通過離子束濺射法沉積兩個(gè)鈍化層：首先，SiO₂(10nm)/Si₃N₄(20nm)/SiO₂(10nm)的薄鈍化層被沉積于所有的傳感器和導(dǎo)線之上，僅暴露結(jié)合墊區(qū)域；其次，SiO₂(100nm)/Si₃N₄(150nm)/SiO₂(100nm)的厚保護(hù)層被沉積于參比傳感器和導(dǎo)線之上，暴露出活性傳感器和結(jié)合墊區(qū)域。在圖案化之后的磁阻比率約為12％。所述自旋閥的釘扎方向(pinning direction)在平面內(nèi)并且垂直于所述傳感器條。通過形狀各向異性將所述自由層的易磁化軸設(shè)定為平行于所述傳感器條。這種結(jié)構(gòu)允許所述GMR傳感器在其MR轉(zhuǎn)移曲線的最為敏感區(qū)域工作。

由于所述GMR效應(yīng)，所述傳感器的電阻隨兩個(gè)磁性層的磁化取向而變化，所述兩個(gè)磁性層由銅間隔層進(jìn)行分隔：

$R\left(\mathrm{\θ}\right)=R_0-\frac{1}{2}{\mathrm{\δR}}_{max}cos\mathrm{\θ}---\left(M.1\right)$

此處，R₀是零磁場(chǎng)下的電阻，δR_max是最大電阻變化并且θ是所述兩磁性層之間的磁化方向間夾角。在所述底部自旋閥結(jié)構(gòu)中，底部磁性層(扎層)的磁化被釘扎于固定方向，而頂磁性層(自由層)的磁場(chǎng)取向能夠隨外部磁場(chǎng)自由轉(zhuǎn)動(dòng)。因此，所述磁性標(biāo)記物的雜散場(chǎng)(stray field)可改變所述自由層的磁化并且因此改變所述傳感器的電阻。

2.磁性標(biāo)記物

所述磁性標(biāo)記物獲自Miltenyi Biotech Inc.，其稱為“MACS”顆粒。各MACS顆粒是10nm的Fe₂O₃納米顆粒的團(tuán)簇，其通過葡聚糖基質(zhì)相互結(jié)合。由于Fe₂O₃納米顆粒的細(xì)小尺寸，MACS顆粒具超順磁性，其總體直徑為50nm并且包含10％的磁性物質(zhì)(重量/重量)。使用對(duì)應(yīng)的要研究的分析物對(duì)MACS顆粒進(jìn)行功能化，如對(duì)于EpCAM(CEA，VEGF)實(shí)驗(yàn)，使用EpCam(CEA，VEGF)抗體對(duì)MACS顆粒進(jìn)行功能化；對(duì)于生物素-鏈霉親和素實(shí)驗(yàn)，使用鏈霉親和素對(duì)MACS顆粒進(jìn)行功能化。

3.表面化學(xué)

首先使用丙酮、甲醇和異丙醇洗滌所述傳感器表面。隨后，所述傳感器被暴露于氧等離子體三分鐘。將2％(w/v)的聚烯丙基胺去離子水溶液涂覆于所述傳感器5分鐘。根據(jù)需要可使用其它溶液，例如但不限于，包括酐類、聚羧酸烯丙酯等在內(nèi)的溶液。隨后使用去離子水洗滌芯片并且在150℃下烘烤45分鐘。對(duì)于羧化表面，隨后在室溫下將10％(w/v)的EDC溶液和10％(w/v)的NHS溶液加至所述傳感器表面1小時(shí)。捕獲蛋白(EpCAM(來(lái)自RD Systems的960-EP-050)、CEA(來(lái)自RD Systems的4128-CM-050)或VEGF(來(lái)自RD Systems的293-VE165))，或捕獲抗體(EpCAM的抗體(來(lái)自Abcam的ab20160或來(lái)自R&D的960)、CEA(來(lái)自BiosPacific的5910)或VEGF(來(lái)自Abcam的ab69479))以360皮升的液滴通過機(jī)器人加至各個(gè)傳感器上三次(總體積1鈉升)。為監(jiān)測(cè)重現(xiàn)性，使用相同的捕獲蛋白對(duì)隨機(jī)分布于所述GMR傳感器陣列中的3至8個(gè)傳感器進(jìn)行孵育。以類似的方式使用1mg/mL的BSA或非互補(bǔ)性抗體(一般為500μg/mL的抗生存素(survivin)抗體(H00000332-P01，來(lái)自Novus Biologicals,LLC))對(duì)對(duì)照傳感器進(jìn)行固定化。使用1mg/mL的BSA的PBS溶液對(duì)所述傳感器陣列的整個(gè)表面進(jìn)行30分鐘的封閉。

4.動(dòng)力學(xué)分析

或者，所述動(dòng)力學(xué)分析可如下進(jìn)行建模：

在使用適當(dāng)?shù)牟东@蛋白對(duì)所述傳感器表面進(jìn)行功能化之后，將GMR傳感器陣列置于測(cè)試器(test station)內(nèi)并進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。洗去BSA封閉緩沖劑并將50μL的磁性標(biāo)記的檢測(cè)抗體溶液(根據(jù)上文制備)加至反應(yīng)孔內(nèi)。在磁性標(biāo)記的檢測(cè)抗體與對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)結(jié)合的時(shí)間里對(duì)所述GMR傳感器陣列進(jìn)行監(jiān)測(cè)。可隨后對(duì)各個(gè)蛋白質(zhì)所特有的結(jié)合曲線進(jìn)行作圖并且可測(cè)定結(jié)合速率常數(shù)。所述分析進(jìn)行5分鐘。

5.模型和擬合

兩分子相互作用以產(chǎn)生一種產(chǎn)物的過程可歸納為：

其中C_S是溶液中處于所述表面附近的反應(yīng)物濃度，L是處于所述表面上的配體或受體濃度，n是所述相互作用的產(chǎn)物的表面濃度。在簡(jiǎn)單模型中，假定所述反應(yīng)物中的至少一種是過量。但是，在本文所述的模型中，處于所述傳感器表面上的反應(yīng)物受體并未受到補(bǔ)充。因此，L與n之和應(yīng)等于L的原始濃度。

對(duì)于模型[L]₀＝[n_max]，其中n_max受限于緊密堆積的MNP的最大濃度而非處于所述表面的分析物的最大濃度。使用GMR生物傳感器陣列監(jiān)測(cè)在給定的時(shí)間與其目標(biāo)結(jié)合的磁性標(biāo)記的抗體數(shù)量n(t)。為對(duì)該相互作用的結(jié)合速率常數(shù)進(jìn)行定量，通過假定反應(yīng)物在體積V內(nèi)和反應(yīng)傳感器表面A內(nèi)保持質(zhì)量不變來(lái)導(dǎo)出分析模型。下文方程M1.1表達(dá)了所述溶液中被標(biāo)記的抗體的變化速度，而方程M1.2表達(dá)了所述標(biāo)記的抗體對(duì)所述傳感器表面的結(jié)合速度：

$V\frac{{\mathrm{dC}}_S}{ht}=-{\mathrm{Ak}}_{on}{C}_S(n_{max}-n)+{\mathrm{Ak}}_{off}n---\left(M1.1\right)$

$A\frac{dn}{dt}={\mathrm{Ak}}_{on}{C}_S(n_{max}-n)-{\mathrm{Ak}}_{off}n---\left(M1.2\right)$

其中C_s是所述傳感器表面的磁性標(biāo)簽化的抗體的濃度，C₀是磁性標(biāo)簽化抗體的本體濃度(bulk concentration)，n_max是所述傳感器表面單位面積內(nèi)的潛在結(jié)合位點(diǎn)的最大摩爾數(shù)，并且n是已經(jīng)形成在所述傳感器上的被結(jié)合的MNP-抗體-抗原復(fù)合體的表面濃度。V是所述傳感器上的溶液體積，A是反應(yīng)面積(在這種情況下是各傳感器的表面積)。此外，k_on是結(jié)合速率常數(shù)，k_off是解離速率常數(shù)。

該方程組可通過假定k_off為零而進(jìn)行簡(jiǎn)化，這是因?yàn)榭贵w-抗原解離在本實(shí)驗(yàn)的時(shí)間尺度內(nèi)可忽略不計(jì)。因此，通過將簡(jiǎn)化的方程M1.1和M1.2相加，所述守恒表達(dá)式如下：

$V\frac{{\mathrm{dC}}_S}{dt}+A\frac{dn}{dt}=0---\left(M1.3\right)$

假設(shè)邊界條件為t＝0、n＝0和C_s＝C₀，得C_s＝C₀-nA/V，因此

$\frac{dn}{dt}=k_{on}(C_0-n*\frac{A}{V})(n_{max}-n)---\left(M1.4\right)$

括號(hào)內(nèi)的項(xiàng)分別表示本體反應(yīng)物和有效表面位點(diǎn)的消耗。該方程具有方程M1.5的解析解，其精確地對(duì)觀察所得的結(jié)合動(dòng)力學(xué)建立了模型。

$n=C_0\frac{V}{A}\[\frac{1-e^{-k_{on}(A/V)\left(C_0\right(V/A)-n_{\max })t}}{\frac{C_{0}V}{n_{\max }A}-e^{-k_{on}(A/V)\left(C_0\right(V/A)-n_{\max })t}}\]---\left(M1.5\right)$

C_s是傳感器表面的磁性標(biāo)簽化的抗體的濃度，C₀是磁性標(biāo)簽化抗體的本體濃度(bulk concentration)，n_max是單位面積內(nèi)的表面結(jié)合位點(diǎn)的最大摩爾數(shù)，并且n是已經(jīng)形成在傳感器上的被結(jié)合的MNP-抗體-抗原復(fù)合體的表面濃度。V是傳感器上的溶液體積，并且A是所述反應(yīng)面積(在這種情況下是各傳感器的表面積)。所述溶液具有V/A的比率，其被認(rèn)為特征性擴(kuò)散高度。超過該特征化高度之上的溶液中的任何物質(zhì)應(yīng)不會(huì)在所述實(shí)驗(yàn)的時(shí)間范圍內(nèi)結(jié)合所述傳感器。此外，k_on是結(jié)合速率常數(shù)，k_off是解離速率常數(shù)。

由于在體積和表面的動(dòng)力學(xué)均被討論，不同的維度；因此n和n_max被表達(dá)為摩爾/cm²，而C_s和C_o被表達(dá)為摩爾/cm³。通過以體積乘以所述溶液速度和以面積乘以所述表面速度，可在各個(gè)方程中以相同的單位表示結(jié)合速率常數(shù)(單位時(shí)間的摩爾數(shù))。

存在四種擬合參數(shù)k_on、C₀、n_max和V/A(其為所述溶液的反應(yīng)部分的有效厚度)。其中，k_on和V/A是“全局?jǐn)M合參數(shù)(global fitting parameter)”，其對(duì)于來(lái)自相同受體-分析物組對(duì)的所有的信號(hào)曲線是相同的；而n_max和C₀是“局部擬合參數(shù)(local fitting parameter)”，其對(duì)于不同的信號(hào)曲線會(huì)有所不同，這是因?yàn)榉治鑫锏谋砻鏉舛然蚩贵w-MNP復(fù)合體的溶液濃度在所有實(shí)驗(yàn)中可能不是均勻的。

當(dāng)C₀V/A>＞n_max時(shí)，所述分析模型化簡(jiǎn)至所述Langmuir模型。

$n=n_{\max }(1-e^{-k_{on}{C}_{0}t})---\left(M1.6\right)$

當(dāng)假定在本實(shí)驗(yàn)的時(shí)間尺度內(nèi)k_off可忽略不計(jì)時(shí)，該方程匹配所述Langmuir模型的解。上述方程與下文所述的方程M.25相同。

6.擬合誤差

擬合誤差如下進(jìn)行定義：如果從一個(gè)芯片上測(cè)量了N個(gè)信號(hào)曲線，并且曲線j具有n_j個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，并且如果設(shè)D_i,j為曲線j中的第i個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，并且設(shè)S_i,j為模擬曲線j的第i個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，則對(duì)于信號(hào)曲線j的擬合誤差為

$E_j=\sqrt{\underset{i=1}{\overset{n_j}{\Σ}}{\left(\frac{S_{i,j}-D_{i,j}}{D_{\max ,j}}\right)}^2}---\left(M.2\right)$

其中D_max,j是信號(hào)曲線的最大信號(hào)。通過該方式，將傳感器陣列中的各個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)合曲線與由該模型所預(yù)測(cè)的結(jié)合曲線進(jìn)行了比較。隨后對(duì)該誤差進(jìn)行最小化以獲得最佳擬合并計(jì)算k_on。絕對(duì)誤差通過所述信號(hào)曲線的最大信號(hào)進(jìn)行計(jì)量，因此所述擬合誤差是信號(hào)水平的百分比。因此，大信號(hào)曲線的基于百分比的相對(duì)擬合誤差與小信號(hào)曲線類似?？倲M合誤差為：

$E=\sqrt{\underset{j=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{E}_j^2}---\left(M.3\right)$

該總擬合誤差在本文所提供的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的擬合中進(jìn)行最小化。

7.傳統(tǒng)的二室模型

溶液中的配體與表面上的捕獲劑的結(jié)合動(dòng)力學(xué)可以?；癁槎曳磻?yīng)。這使反應(yīng)和傳輸動(dòng)力學(xué)均得以被并入模型，其中所述表面區(qū)室中的可溶配體與所述表面通過結(jié)合和解離的化學(xué)過程進(jìn)行反應(yīng)(參見圖2)，并且通過來(lái)自本體區(qū)室的擴(kuò)散、流動(dòng)和對(duì)流(convection)而逐步受到補(bǔ)充。在各區(qū)室之中，所述濃度被假定在空間內(nèi)是均一的，但是可隨時(shí)間而變化。本體區(qū)室中的配體濃度C₀被假定為恒定不變，而處于表面區(qū)室中的配體濃度C_s由于所述結(jié)合反應(yīng)而被消耗,但是通過本體中的配體的擴(kuò)散和表面結(jié)合復(fù)合體的解離而得到補(bǔ)充。該二室反應(yīng)可被如下描述：

$C_0\stackrel{k_M}{\→}{C}_s---\left(M.4\right)$

其中C_S和C₀是處于所述表面區(qū)室和本體區(qū)室中的磁性標(biāo)簽化抗體的溶液濃度，R是固定化于所述表面的配體和受體的表面濃度(即，有效結(jié)合位點(diǎn)的表面密度)，n是結(jié)合的MNP-抗體-抗原復(fù)合體的表面濃度，k_M是擴(kuò)散限制速率常數(shù)，k_on和k_off分別是結(jié)合和解離速率常數(shù)。C_S和n的凈反應(yīng)速度可通過以下方程組合進(jìn)行定義：

$V\frac{{\mathrm{dC}}_S}{dt}={\mathrm{Vk}}_M(C_0-C_S)-{\mathrm{Ak}}_{om}{C}_{S}R+{\mathrm{Ak}}_{off}n---\left(M.6\right)$

$\frac{dn}{dt}=k_{on}{C}_{S}R-k_{off}n---\left(M.7\right)$

由于在體積中和表面上均進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析，因此R、n和n_max被表達(dá)為摩爾m^-2，而C_S和C₀被表達(dá)為摩爾m^-3。通過以表面區(qū)室體積V乘以溶液速度，并且以傳感器的面積A乘以表面速度，各個(gè)方程可以以相同的單位進(jìn)行表示(摩爾/s)。處于時(shí)間t＝0的起始條件為C_S＝C₀和n＝0。在釋放測(cè)量中，所有反應(yīng)物被洗去，所以C₀＝0。

數(shù)值解法可被用于解方程M.6。表面等離子共振(SPR)的實(shí)驗(yàn)設(shè)置限制了所述二室模型的簡(jiǎn)化。使用SPR，所述可溶配體是非標(biāo)記的(其導(dǎo)致快速擴(kuò)散)并且其以高流速被引入所述反應(yīng)表面。因此，所述物質(zhì)傳輸限制的速率常數(shù)k_M可在所觀測(cè)到的動(dòng)力學(xué)相互作用中發(fā)揮主要作用。

8.具有解析解的經(jīng)修正的二室模型

與SPR儀器運(yùn)行呈對(duì)比，單孔GMR傳感器系統(tǒng)的實(shí)施方案利用了標(biāo)記物以增強(qiáng)分子結(jié)合事件的信號(hào)并且在測(cè)量中無(wú)人為的流動(dòng)(deliberate flow)。所述標(biāo)記物的大小(如，46nm)和流動(dòng)的缺乏顯著地降低了所述可溶配體在本體區(qū)室和表面區(qū)室之間擴(kuò)散和對(duì)流的速度。如果擴(kuò)散速度顯著地低于反應(yīng)速度，傳統(tǒng)的二室模型有可能被化簡(jiǎn)成為可進(jìn)行解析求解的修正形式。

為驗(yàn)證這一假設(shè)，使用數(shù)值解法對(duì)方程M.6和M.7進(jìn)行求解以擬合EpCAM的實(shí)時(shí)結(jié)合數(shù)據(jù)(示于圖5(a))。我們的磁性標(biāo)記抗體所得的k_M為約1.0×10^-4s^-1。因此，根據(jù)圖13所示以及下段的解釋，可對(duì)結(jié)合速度、解離速度(假設(shè)k_off對(duì)于大多數(shù)抗體處于1.0×10^-6s^-1的數(shù)量級(jí))和擴(kuò)散速度的貢獻(xiàn)進(jìn)行作圖以確立方程M.6中各個(gè)組分的相對(duì)重要性。

通過速度方程M.6，所述方程右側(cè)各項(xiàng)被作為表面結(jié)合的EpCAM抗體-抗原復(fù)合體的數(shù)量n的函數(shù)進(jìn)行作圖(圖13)。根據(jù)150個(gè)表面結(jié)合的MNP產(chǎn)生1ppm的MR信號(hào)的關(guān)系將歸一化的MR信號(hào)(單位是ppm)轉(zhuǎn)化成為n(單位是摩爾/μm²)(參見圖7)。在整個(gè)結(jié)合反應(yīng)過程中，所述結(jié)合速度項(xiàng)與所述解離速度和擴(kuò)散速度項(xiàng)相比均保持高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，所述磁性納米顆粒標(biāo)記物大到足夠顯著地減緩所述磁性標(biāo)記的抗體向所述表面區(qū)室中的擴(kuò)散。這暗示可溶抗體-MNP進(jìn)入所述表面區(qū)室的再生過程可忽略不計(jì)(即，k_M～0)。此外，圖13顯示在這些結(jié)合實(shí)驗(yàn)中對(duì)k_off可忽略不計(jì)的假設(shè)是有效的。但是，正如下文即將表明，k_off在釋放動(dòng)力學(xué)的測(cè)量中并非可忽略不計(jì)。

圖13示出了描述方程M.6中各項(xiàng)貢獻(xiàn)的對(duì)數(shù)圖，該方程是結(jié)合于所述傳感器表面的磁性標(biāo)記抗體數(shù)量的函數(shù)。圖5(a)中所示的EpCAM結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)被用于對(duì)該圖的k_on、k_off和k_M進(jìn)行數(shù)值計(jì)算。x-軸表示在結(jié)合反應(yīng)過程中結(jié)合于所述傳感器表面的磁性標(biāo)記的抗體的表面濃度(圖中n值來(lái)自于實(shí)際實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù))。在n＝0時(shí)所述實(shí)驗(yàn)開始，并且在n～120摩爾/μm²時(shí)信號(hào)接近達(dá)到飽和或所述結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)束。在整個(gè)結(jié)合反應(yīng)過程中，所述結(jié)合速度項(xiàng)與所述解離速度和擴(kuò)散速度項(xiàng)相比均保持高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，對(duì)k_off可忽略不計(jì)的假設(shè)是有效的(因?yàn)閗_off曲線遠(yuǎn)低于k_on曲線)。此外，所述磁性納米顆粒標(biāo)記物大到足以僅僅允許磁性標(biāo)記的抗體向所述反應(yīng)區(qū)室的緩慢擴(kuò)散(因?yàn)樗鰇_M曲線遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于所述k_on曲線)。這暗示可溶抗體-MNP進(jìn)入所述表面區(qū)室的遞送可忽略不計(jì)(即，k_M約為零)。

由于所述表面區(qū)室中的MNP抗體并而受到來(lái)自主體區(qū)室的緩慢擴(kuò)散的充分補(bǔ)充，因此質(zhì)量平衡需要處于所述表面的溶液中未反應(yīng)抗體-MNP濃度C_S等于初始濃度C₀減去產(chǎn)物形成所消耗的量nA與體積V的商，如：

$C_S=C_0-n\frac{A}{V}---\left(M.8\right)$

類似地，質(zhì)量平衡需要自由結(jié)合位點(diǎn)的表面濃度R等于其初始表面濃度R₀與MNP-抗體-抗原復(fù)合體形成中所消耗的量之差。R₀的量級(jí)必須略低于處于所述表面之上的緊密堆積的MNP的最大濃度，從而避免“親合力效應(yīng)(avidity effect)”，在該效應(yīng)中一個(gè)MNP與多個(gè)抗原結(jié)合。因此，R₀被替代為抗原的最大沉積表面濃度n_max，如下所示：

R＝R₀-n＝n_max-n (M.9)

因此，方程M.7化簡(jiǎn)為：

$\frac{dn}{dt}=k_{on}(C_0-n\frac{A}{V})(n_{\max }-n)---\left(M.10\right)$

此處括號(hào)內(nèi)的兩項(xiàng)分別代表標(biāo)簽化抗體在所述表面區(qū)室中的消耗以及有效表面結(jié)合位點(diǎn)的降低。方程M.7在此具有以下的分析解：

$n=n_{\max }\[\frac{1-e^{-k_{on}(C_0-n_{max}A/V)t}}{1-\frac{n_{\max }A}{C_{0}V}{e}^{-k_{on}(C_0-n_{\max }A/V)t}}\]---\left(M.11\right)$

眾多可進(jìn)行分析求解的動(dòng)力學(xué)模型需要所述相互作用中的反應(yīng)物之一保持過量以產(chǎn)生分析解。但是，根據(jù)方程M.11中的模型，兩種反應(yīng)物在所述結(jié)合過程中可被顯著地耗盡。該模型的靈活性實(shí)現(xiàn)了更為一般化的實(shí)驗(yàn)組合在不違背嚴(yán)格反應(yīng)條件的情況下的實(shí)施。此外，多數(shù)動(dòng)力學(xué)模型需要所述系統(tǒng)達(dá)到平衡以測(cè)定結(jié)合速率常數(shù)。但是，使用本文所示的模型，不是必須達(dá)到平衡并且所述結(jié)合速率常數(shù)可在5分鐘或更短時(shí)間內(nèi)被測(cè)定，其遠(yuǎn)在飽和之前。

所述分析模型中存在五個(gè)參數(shù)，k_on、C₀、n_max、V和A。在其中，k_on、V和A對(duì)于所有曲線被固定為相同值，而在分析物表面濃度或抗體-MNP復(fù)合體的溶液濃度被改變的情況下n_max和C₀會(huì)有所不同。

9.分析模型可化簡(jiǎn)為L(zhǎng)angmuir吸附

當(dāng)C₀V/A>＞n_max時(shí)，對(duì)應(yīng)于所述表面區(qū)室中可忽略的反應(yīng)物損耗，方程M.10化簡(jiǎn)為：

$\frac{dn}{dt}=k_{on}{C}_0(n_{\max }-n)---\left(M.12\right)$

并且該分析模型化簡(jiǎn)為L(zhǎng)angmuir模型。因此，方程M.11化簡(jiǎn)為：

$n=n_{\max }(1-e^{-k_{on}{C}_{0}t})---\left(M.13\right)$

結(jié)合k_off可忽略不計(jì)的附加假設(shè)，該結(jié)果符合Langmuir結(jié)合動(dòng)力學(xué)。我們的結(jié)合數(shù)據(jù)與Langmuir模型之間的比較示于圖14。分析模型的這一化簡(jiǎn)形式方程M.13與下文所導(dǎo)出(方程M.14-25)并示于方程M.25中的Langmuir等溫線相同。

圖14示出了根據(jù)Langmuir吸附模型所預(yù)測(cè)的(虛線)和實(shí)驗(yàn)測(cè)得的(實(shí)線)抗EpCAM抗體對(duì)表面固定化的EpCAM抗原的結(jié)合曲線。以2×的系列稀釋度將EpCAM蛋白的表面覆蓋從5阿摩爾(對(duì)應(yīng)于n_max)稀釋降至19.5仄摩爾(對(duì)應(yīng)于n_max/256)。根據(jù)所述疊置圖，所述Langmuir吸附模型并未充分描述所述GMR傳感器對(duì)于測(cè)試的濃度組所觀察到的實(shí)時(shí)結(jié)合動(dòng)力學(xué)。因此，產(chǎn)生了新的模型從而對(duì)觀察到的所述結(jié)合動(dòng)力學(xué)進(jìn)行更好地描述。本文所示的分析模型包含用于解釋信號(hào)的快速開始和較緩慢持續(xù)升高的附加項(xiàng)。

所述Langmuir等溫線在固定的溫度下使固體表面的分子覆蓋或吸附關(guān)聯(lián)于所述表面上方的介質(zhì)濃度?？赏ㄟ^考慮表面配體L、懸浮于所述介質(zhì)中的標(biāo)記分子C以及吸附分子復(fù)合體CL而導(dǎo)出所述Langmuir方程，隨后所述吸附過程可被表示為

所述結(jié)合速度R_a和解離速度R_d分別為，

R_a＝k_on[C][L] (M.15)

R_d＝k_off[CL] (M.16)

其中k_on和k_off是結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)，并且方括號(hào)表示濃度。

如果總有效配體濃度為[L_max]，并且吸附分子的歸一化表面覆蓋為θ，則

[L]+[CL]＝[L_max] (M.17)

θ＝[CL]/[L_max] (M.18)

因此，[L]如下：

[L]＝(1-θ)[L_max] (M.19)

將方程M.19和M.18分別代入方程M.15和M.16，可得如下：

R_a＝k_on(1-θ)[L_max][C] (M.20)

R_d＝k_offθ[L_max] (M.21)

假定k_off在本實(shí)驗(yàn)的時(shí)間尺度內(nèi)可忽略不計(jì)，并對(duì)R_a求解，得出：

$R_a=\frac{d\[CL\]}{dt}=k_{on}(1-\mathrm{\θ})\[L_{max}\]\[C\]---\left(M.22\right)$

$\frac{d\[CL\]}{dt}=k_{on}(\[L_{max}\]-\[CL\])\[C\]---\left(M.23\right)$

$\∫\frac{d\[CL\]}{\[L_{\max }\]-\[CL\]}=\∫k_{on}\[C\]dt---\left(M.24\right)$

假定[C]不依賴于于時(shí)間并且[L_max]不依賴于[CL]，并且通過分部積分進(jìn)行求解，其解如下：

$\[CL\]=\[L_{\max }\](1-e^{-k_{on}\[C\]t})---\left(M.25\right)$

10.釋放動(dòng)力學(xué)模型：

抗體以極高的親和性結(jié)合其目標(biāo)。因此，所述解離速率常數(shù)一般較小，其需要更長(zhǎng)的時(shí)間(如，分鐘)以觀測(cè)到這種釋放現(xiàn)象。此外，由于抗體的活動(dòng)性，使用競(jìng)爭(zhēng)抑制來(lái)監(jiān)測(cè)釋放動(dòng)力學(xué)。通過在溶液中置入高濃度的目標(biāo)，可觀測(cè)到所述釋放動(dòng)力學(xué)更為精確的測(cè)量。

抗體釋放速度的速度方程可如下列出：

$\frac{dn}{dt}=-k_{off}n---\left(M.27\right)$

因此，加入所述釋放溶液之后在時(shí)間t的表面結(jié)合MNP-抗體濃度為：

n_Release(t)＝n_{max e}-k_offt (M.28)

其中是n₀為傳感器表面的初始吸附MNP-抗體濃度。

B.結(jié)果與討論

提供了測(cè)量結(jié)合動(dòng)力學(xué)方法，所述方法使用可各自獨(dú)立尋址的磁性響應(yīng)的納米傳感器同時(shí)地監(jiān)測(cè)多種不同蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)，所述不同蛋白質(zhì)與固定化于傳感器表面的標(biāo)靶結(jié)合。這些磁性納米傳感器被成功地?cái)U(kuò)展至每1mm²芯片面積超過1,000個(gè)傳感器。展示了分析物的表位分布并且對(duì)溶液中的蛋白質(zhì)擴(kuò)散的空間動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了可視化。結(jié)合這些實(shí)驗(yàn)，可產(chǎn)生對(duì)標(biāo)記的蛋白質(zhì)與表面固定化的蛋白質(zhì)的實(shí)時(shí)結(jié)合進(jìn)行精確描述的分析動(dòng)力學(xué)模型。所述分析模型與使用表面等離子共振進(jìn)行的類似實(shí)驗(yàn)以及來(lái)自文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)具有緊密的一致性。該模型可以20仄摩爾(20×10^-21)或更低溶質(zhì)的敏感度應(yīng)用于抗體-抗原結(jié)合。

1.GMR傳感器

使用磁性納米顆粒(MNP)對(duì)可溶配體進(jìn)行預(yù)標(biāo)記以監(jiān)測(cè)配體與固定于所述傳感器表面的抗原的復(fù)合體的實(shí)時(shí)結(jié)合動(dòng)力學(xué)(圖4(a))。在所述復(fù)合體被捕獲的實(shí)時(shí)過程中，來(lái)自所述抗體-MNP復(fù)合體的磁場(chǎng)誘導(dǎo)其下的GMR傳感器的電阻變化。由于所述GMR傳感器陣列的快速實(shí)時(shí)讀出，所述結(jié)合動(dòng)力學(xué)被監(jiān)測(cè)并且定量以測(cè)定結(jié)合速率常數(shù)。

根據(jù)TEM分析所測(cè)定，對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)或抗體進(jìn)行標(biāo)記的MNP是包埋于葡聚糖聚合物中的12個(gè)10nm的氧化鐵核(圖4(b))。整個(gè)納米顆粒平均直徑46±13nm(根據(jù)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量的數(shù)值)。根據(jù)斯托克斯-愛因斯坦關(guān)系(Stokes-Einstein relation)，這些顆粒具有約8.56×10^-12m²s^-1的平動(dòng)擴(kuò)散系數(shù)。所述MNP具有-11mV的電動(dòng)電位。這些顆粒是超順磁性的并且是膠體穩(wěn)定的，因此它們?cè)谒龇磻?yīng)期間并不聚集或沉淀。此外，所述GMR傳感器以來(lái)自所述磁性標(biāo)簽的偶極場(chǎng)的基于接近度的檢測(cè)器的形式運(yùn)行；因此僅檢測(cè)傳感器表面的150nm以內(nèi)的標(biāo)簽。因此，未結(jié)合的MNP標(biāo)簽在缺乏結(jié)合的情況下貢獻(xiàn)可忽略的信號(hào)。僅僅被結(jié)合的磁性標(biāo)記的抗體可被其下的GMR傳感器測(cè)出，這使得這種MNP-GMR納米傳感器可用于實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)分析。

GMR傳感器陣列被制造成在1mm²芯片表面積上有1,008個(gè)傳感器(圖4(c))。所計(jì)算出的特征密度為每cm²超過100,000個(gè)GMR傳感器。所述傳感器陣列被設(shè)計(jì)為亞陣列組的形式，其中各亞陣列占據(jù)90μm×90μm的面積(圖4(d))。所述傳感器陣列適配于自動(dòng)點(diǎn)樣儀(robotic spotters)。亞陣列中的各個(gè)傳感器通過行列解碼器經(jīng)由使用VLSI技術(shù)制造的共享6-位控制總線進(jìn)行可各自獨(dú)立地尋址。所述GMR傳感器陣列允許蛋白質(zhì)結(jié)合動(dòng)力學(xué)的平行多元監(jiān)測(cè)。

圖12中示出了所述GMR傳感器的另一個(gè)實(shí)施方案。在圖12中，12個(gè)延伸的線性磁性傳感器段被以并聯(lián)的方式連接在一起，并且6組這樣的并聯(lián)段被以串聯(lián)的方連接在一起，其給出了具有總計(jì)72個(gè)磁性傳感器段的磁性傳感器。所述磁性傳感器為100μm×100μm。各個(gè)磁性傳感器段為750nm寬，20nm厚和100μm長(zhǎng)。圖12中的插圖示出了與磁性傳感器段結(jié)合的納米顆粒的SEM圖像。

2.結(jié)合動(dòng)力學(xué)模型：

根據(jù)上文描述，產(chǎn)生了能夠擬合實(shí)施結(jié)合動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)從而使技術(shù)人員能夠計(jì)算結(jié)合速率常數(shù)(k_on)和解離速率常數(shù)(k_off)的分析模型。

所述結(jié)合反應(yīng)是二步過程，其中本體溶液中的抗體首先通過擴(kuò)散和流動(dòng)接近被表面捕獲的抗原，并且隨后通過結(jié)合與解離的化學(xué)過程與表面結(jié)合的標(biāo)靶結(jié)合或從其上逃逸。如果本體體溶液中的抗體濃度在空間上是均一的，則

$C_S=C_0-n\frac{A}{V}---\left(1\right)$

其中C_s是位于所述傳感器表面的磁性標(biāo)記的抗體的濃度，C₀是磁性標(biāo)簽化的抗體的初始本體濃度，并且n是被結(jié)合的MNP-抗體-抗原復(fù)合體的表面濃度。V是參與所述結(jié)合反應(yīng)之中的傳感器上的溶液體積，A是所述反應(yīng)面積(在本情況下是一個(gè)傳感器的表面積)。根據(jù)簡(jiǎn)單動(dòng)力學(xué)，所述表面反應(yīng)被描述如下：

$\frac{dn}{dt}=k_{on}(C_0-n\frac{A}{V})(n_{max}-n)-k_{off}n---\left(2\right)$

括號(hào)內(nèi)的兩項(xiàng)分別對(duì)應(yīng)本體反應(yīng)物和有效的表面位點(diǎn)，n_max是傳感器表面的潛在結(jié)合位點(diǎn)的濃度，k_on是結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合速率常數(shù)，并且k_off是結(jié)合反應(yīng)的解離速率常數(shù)。在討論體積和表面濃度之時(shí)，n和n_max被表達(dá)為摩爾m^-2，而C_s和C₀被表達(dá)為摩爾m^-3。注意n_max由緊密堆積的MNP最大濃度限定，而不是由表面上的分析物的最大濃度限定。因此，為排除與MNP在所述傳感器表面的聚集相關(guān)的空間效應(yīng)，受測(cè)的最高分析物表面濃度至多為緊密堆積的抗體-MNP復(fù)合體表面濃度的十分之一。

該方程可通過假定k_off為零而進(jìn)行簡(jiǎn)化，這是因?yàn)榭贵w-抗原解離在本實(shí)驗(yàn)的時(shí)間尺度內(nèi)可忽略不計(jì)。方程2在此具有以下的分析解：

$n=n_{\max }\[\frac{1-e^{-k_{on}(C_0-n_{max}A/V)t}}{1-\frac{n_{\max }A}{C_{0}V}{e}^{-k_{on}(C_0-n_{\max }A/V)t}}\]---\left(3\right)$

如果C₀V>＞n_maxA，這暗示超過有效表面位點(diǎn)的過量溶液分子，則所述動(dòng)力學(xué)遵循Langmuir吸附。然而，當(dāng)不處于該情況之時(shí)，所述溶液的反應(yīng)物被顯著消耗，尤其是接近所述傳感器表面，因此反應(yīng)速度將由于后續(xù)反應(yīng)物在反應(yīng)前需要進(jìn)行跨宏觀距離(～V/A)的擴(kuò)散而被減緩(特別是對(duì)于標(biāo)記的分子)。通過定義參與所述結(jié)合反應(yīng)的流體厚度，即可用于結(jié)合所述表面的溶液區(qū)室，而將這一特征擴(kuò)散距離V/A計(jì)入該動(dòng)力學(xué)模型之中。超過所述特征V/A高度的任何溶質(zhì)在相關(guān)時(shí)間范圍內(nèi)可能未在所述結(jié)合反應(yīng)中有所貢獻(xiàn)。

C.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為檢驗(yàn)該解析解，使用上述模型測(cè)定了上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)抗體-抗原結(jié)合動(dòng)力學(xué)并將所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)進(jìn)行了比較。

結(jié)合于傳感器的分子的改變濃度

在圖5所示的第一組實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行了MNP標(biāo)記的抗EpCAM抗體與表面結(jié)合的EpCAM蛋白質(zhì)的結(jié)合分析。所述模型中的是C₀、n_max和V/A是根據(jù)尺寸和濃度所確定的固定值，并且通過以所述動(dòng)力學(xué)模型所預(yù)測(cè)的結(jié)合曲線對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行的最佳擬合來(lái)確定k_on。進(jìn)行了固定濃度的MNP-抗EpCAM抗體對(duì)改變濃度的表面結(jié)合EpCAM蛋白的結(jié)合分析。使用二倍稀釋以制備一系列的傳感器表面；其起始于5阿摩爾EpCAM蛋白的加載量(例如，結(jié)合于所述傳感器表面并且具功能的蛋白質(zhì)的量)并且進(jìn)行依次稀釋低至20仄摩爾。在結(jié)合曲線間變化的唯一參數(shù)是n_max，所有其它參數(shù)都是不變的。當(dāng)使這一參數(shù)在所述模型中變化時(shí)，各實(shí)驗(yàn)結(jié)合曲線被精確地?cái)M合(圖5(a))。所述參數(shù)的數(shù)值為(未經(jīng)稀釋)n_max＝9.5×10^-10mol m^-2，C₀＝6.8×10^-7M，A＝5.4×10^-9m²以及V＝5.5×10^-12m³。因此，k_on＝2.5×10⁴M^-1s^-1對(duì)所述數(shù)據(jù)進(jìn)行了最佳擬合。本實(shí)驗(yàn)中的全部曲線對(duì)通過所述模型所預(yù)測(cè)的曲線的擬合誤差為R²＝0.98。此外，在將所述MNP-抗體溶液洗去并用抗原加載緩沖液替換之后，通過將隨后的數(shù)據(jù)對(duì)基本指數(shù)衰減模型進(jìn)行擬合而計(jì)算解離速率常數(shù)，n_Release(t)＝n_maxe^-koff(t)，其中n₀是結(jié)合MNP在洗滌時(shí)的表面濃度。因此，所述抗EpCAM抗體-抗原解離速率常數(shù)k_off被測(cè)定為2.0×10^-6s^-1。這證實(shí)了上文對(duì)于k_off與k_on相比較時(shí)可忽略不計(jì)的假設(shè)。

分析混合物中的改變濃度的分析物

在圖5(b)所示的第二組實(shí)驗(yàn)中，使用833仄摩爾的EpCAM蛋白的恒定加載量((圖5a)所使用的最大量的1/6)對(duì)各個(gè)傳感器進(jìn)行固定化。涂覆于所述傳感器的抗體-MNP復(fù)合體的濃度在未稀釋、兩倍稀釋和八倍稀釋的抗體-MNP復(fù)合體溶液之間變動(dòng)(對(duì)應(yīng)于所述模型中的C₀、C₀/2和C₀/8)。由于無(wú)論C₀被改變還是n_max被改變，抗體-抗原相互作用均保持相同，描述以上相互作用的速率常數(shù)在這些實(shí)驗(yàn)中保持相同。在對(duì)模型的擬合之中，獲得了2.5×10⁴M^-1s^-1的相同k_on，這支持了所述分析模型的有效性。全部曲線對(duì)通過所述模型的擬合誤差為R²＝0.96。這些結(jié)果處于文獻(xiàn)所報(bào)道的正常范圍之內(nèi)，這證實(shí)了所述動(dòng)力學(xué)模型對(duì)于預(yù)測(cè)結(jié)合的有效性以及所產(chǎn)生的結(jié)果的精確度(參見表1)

為對(duì)MNP-抗癌胚抗原(CEA)抗體與CEA的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，MNP-抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抗體與VEGF的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，以及MNP-鏈霉親和素與生物素的結(jié)合動(dòng)力學(xué)進(jìn)行定量而進(jìn)行了類似的實(shí)時(shí)實(shí)驗(yàn)(圖6(a)和6(d))。對(duì)于抗-CEA抗體，在GMR傳感器和SPR儀器上均使用相同的試劑對(duì)結(jié)合和解離速率常數(shù)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了比較(圖6(c)和6(d))。

圖6(a)所示為在12組重復(fù)傳感器上的抗CEA抗體對(duì)抗原的多元?jiǎng)恿W(xué)分析以及在3組重復(fù)傳感器上的抗VEGF抗體對(duì)抗原的多種動(dòng)力學(xué)分析圖。CEA抗體-抗原的k_on為3.3×10⁴M^-1s^-1，其平均擬合誤差為2.8％，并且VEGF抗體-抗原的k_on為1.6×10⁴M^-1s^-1，其平均擬合誤差為8.2％。圖6(b)示出了監(jiān)測(cè)生物素對(duì)鏈霉親和素的結(jié)合動(dòng)力學(xué)的25組重復(fù)傳感器示圖。k_on為4.67×10⁶M^-1s^-1，其平均擬合誤差為1.6％。還是用競(jìng)爭(zhēng)生物素分析監(jiān)測(cè)了釋放動(dòng)力學(xué)。圖6(c)示出了SPR圖并且圖6(d)示出了基于磁納米傳感器的平臺(tái)，當(dāng)在平行實(shí)驗(yàn)中監(jiān)測(cè)CEA抗體與CEA抗原結(jié)合的動(dòng)力學(xué)時(shí)所述平臺(tái)提供了類似的實(shí)時(shí)結(jié)合曲線。GMR生物傳感器提供了5.0×10⁴M^-1s^-1的k_on以及4.4×10^-4s^-1的k_off，而SPR實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了5.2×10⁴M^-1s^-1的k_on以及3.03×10^-4s^-1的k_off。SPR的動(dòng)態(tài)范圍低于兩個(gè)數(shù)量級(jí)，而所述GMR傳感器具有4個(gè)數(shù)量級(jí)或更大的動(dòng)態(tài)范圍。GMR傳感器的動(dòng)態(tài)范圍可使用更高的溶質(zhì)濃度而進(jìn)一步提高。在圖6(d)中，所述結(jié)合曲線的最初1000秒被用于獲得根據(jù)所述分析模型的k_on值。

所述GMR傳感器陣列和SPR測(cè)量產(chǎn)生了相互一致的動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)并且一致于文獻(xiàn)所報(bào)道的數(shù)值(表1)，這表明當(dāng)使用本文給出的分析模型之時(shí)所述MNP標(biāo)記對(duì)于所測(cè)得的速率常數(shù)基本無(wú)影響。

表1

表1示出了當(dāng)使用所述GMR傳感器陣列和SPR之時(shí)，對(duì)生物素與鏈霉親和素結(jié)合的結(jié)合速率常數(shù)、EpCAM抗原與EpCAM抗體的結(jié)合速率常數(shù)、CEA抗原與CEA抗體的結(jié)合速率常數(shù)以及VEGF抗原與VEGF抗體的結(jié)合速率常數(shù)的比較。對(duì)于SPR和GMR傳感器實(shí)驗(yàn)均使用了相同的抗體對(duì)。動(dòng)力學(xué)分析的兩種方法均與文獻(xiàn)相一致。

與傳感器結(jié)合的磁性標(biāo)簽數(shù)量的定量

掃描電子顯微鏡(SEM)證實(shí)，所述分析系統(tǒng)能夠?qū)Ω鱾€(gè)傳感器之上所捕獲的蛋白質(zhì)數(shù)量進(jìn)行定量。因此，通過將所述GMR信號(hào)對(duì)結(jié)合于所述傳感器表面的磁性標(biāo)簽的絕對(duì)數(shù)量進(jìn)行校準(zhǔn)而獲得了所結(jié)合的蛋白質(zhì)的量和每MNP所產(chǎn)生的信號(hào)。例如，在三至八組重復(fù)傳感器上，EpCAM蛋白從2.5阿摩爾開始被以兩倍的降幅進(jìn)行系列稀釋直至78仄摩爾。向全部傳感器添加20倍稀釋度的MNP-抗體復(fù)合體并監(jiān)測(cè)所述結(jié)合動(dòng)力學(xué)。在20分鐘的孵育時(shí)間之后，洗去磁性標(biāo)記的抗體的溶液以終止所述結(jié)合反應(yīng)，在該點(diǎn)通過SEM對(duì)具有各個(gè)表面濃度的傳感器進(jìn)行成像(圖7)。通過對(duì)所述實(shí)時(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化并且將其對(duì)所述模型進(jìn)行擬合，以對(duì)所述初始MR(ΔMR/MR₀)進(jìn)行歸一化的MR形式測(cè)得的傳感器信號(hào)被轉(zhuǎn)換成為與各傳感器結(jié)合的磁性標(biāo)簽的數(shù)量。例如，使用2.5阿摩爾的EpCAM蛋白進(jìn)行功能化的傳感器在所述實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)捕獲了192,000個(gè)磁性標(biāo)簽。SEM成像顯示所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合所述動(dòng)力學(xué)模型。因此，所述動(dòng)力學(xué)模型可被用于對(duì)各傳感器所結(jié)合的標(biāo)簽數(shù)量以及給定反應(yīng)期間結(jié)合的蛋白質(zhì)數(shù)量進(jìn)行定量。

使用該模型，每150個(gè)MNP產(chǎn)生1ppm的信號(hào)。所述傳感器的檢測(cè)下限(LOD)約為20ppm(通過經(jīng)非互補(bǔ)抗體包埋的傳感器的平均背景信號(hào)加上兩倍標(biāo)準(zhǔn)差所定義)。因此，可檢測(cè)0.6顆粒/μm²或者更低。

此外，所述模型能夠解釋所述傳感器表面將在何時(shí)發(fā)生飽和。隨著提高分析物的加載量以使蛋白質(zhì)的表面濃度接近所述傳感器表面的最大MACS濃度，可在所述信號(hào)中觀察到飽和。該飽和在5阿摩爾或更高的加載量下發(fā)生。所述加載量通過將已知濃度和體積的蛋白質(zhì)沉積于所述傳感器表面而進(jìn)行計(jì)算。在洗去所述未反應(yīng)蛋白質(zhì)之后，使用納米顆粒對(duì)結(jié)合蛋白質(zhì)的量進(jìn)行標(biāo)記。通過掃描電子顯微鏡對(duì)具活性的并且被結(jié)合的蛋白質(zhì)的數(shù)量進(jìn)行定量。在5阿摩爾或更高的加載量下，納米顆粒間的空間效應(yīng)變得明顯。在全部實(shí)驗(yàn)中使用了5阿摩爾或更低的加載量。當(dāng)在傳感器表面沉積低蛋白質(zhì)濃度時(shí)，所述傳感器表面的結(jié)合蛋白質(zhì)的距離將超過1個(gè)MNP直徑，由此防止了各個(gè)納米顆粒結(jié)合超過一個(gè)抗原。例如，在所檢測(cè)的最高加載量5阿摩爾下，所述傳感器表面的平均距離約為60nm。由于所述MNP直徑僅為46nm，單一MNP結(jié)合極不可能同時(shí)結(jié)合超過一個(gè)被結(jié)合蛋白。因此，親合力(例如，兩個(gè)或更多個(gè)分子之間的多重結(jié)合相互作用的組合強(qiáng)度)基本可忽略不計(jì)。例如，當(dāng)在傳感器表面沉積10阿摩爾蛋白質(zhì)時(shí)，實(shí)驗(yàn)中顯現(xiàn)當(dāng)與5阿摩爾和更低量的信號(hào)相比所述傳感器表面接近飽和(圖8)。通過所述模型，10阿摩爾的加載量據(jù)描述相當(dāng)于n_max等于1.95×10^-9mol m^-2。當(dāng)將所述模型預(yù)測(cè)的這一飽和值與所述傳感器的物理限制和緊密堆積的MNP幾何形狀進(jìn)行比較時(shí)，這些數(shù)據(jù)緊密吻合。單層中受限于MNP大小的蛋白質(zhì)最大表面濃度為1.0×10^-9摩爾m^-2。

表位定位

使用本文所述的實(shí)時(shí)結(jié)合分析和動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行表位定位實(shí)驗(yàn)。將一組不同的抗EpCAM單克隆抗體固定于所述GMR傳感器。使用抗EGFR抗體進(jìn)行功能化的傳感器作為內(nèi)部對(duì)照被包含在內(nèi)。隨后將EpCAM加入溶液中并且對(duì)以獨(dú)特的結(jié)構(gòu)在各個(gè)捕獲抗體上被捕獲。隨后加入EGFR蛋白。如果所述捕獲的EpCAM暴露出EGF樣重復(fù)，則EGFR能夠進(jìn)行結(jié)合。然而，如果所述捕獲的EpCAM蛋白以遮蔽所述EGF樣重復(fù)的方式取向，則EGFR不能進(jìn)行結(jié)合(圖9(a))。

圖9(b)顯示，抗EpCAM抗體#1結(jié)合EpCAM蛋白以暴露所述EGF樣結(jié)構(gòu)域；然而，EpCAM-抗-EpCAM抗體#2復(fù)合體遮藏了所述EGF樣結(jié)構(gòu)域。使用特異于EpCAM的獨(dú)特表位的單克隆抗EpCAM抗體對(duì)抗EpCAM Ab#1傳感器和抗EpCAM Ab#2傳感器進(jìn)行功能化。當(dāng)EpCAM結(jié)合抗EpCAM抗體#1時(shí)，EGF樣結(jié)構(gòu)域被暴露并且抗EGFR抗體-MNP復(fù)合體能夠進(jìn)行結(jié)合。然而，當(dāng)被捕獲的EpCAM蛋白結(jié)合于抗EpCAM抗體#2時(shí)，EGF樣結(jié)構(gòu)域未被暴露并且不發(fā)生結(jié)合。

當(dāng)將所述抗EGFR抗體-MNP復(fù)合體與由EpCAM或由EGFR捕獲抗體所捕獲的EGFR蛋白的結(jié)合曲線進(jìn)行歸一化時(shí)，所述歸一化結(jié)合曲線顯示結(jié)合的動(dòng)力學(xué)相同(圖9(c))。即使各個(gè)傳感器上的大分子結(jié)構(gòu)配制有所不同，所述動(dòng)力學(xué)相互作用仍然相同。在圖9(c)中所述結(jié)合曲線被歸一化。由于兩曲線遵循相同的結(jié)合軌跡，這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)所涉及的動(dòng)力學(xué)相互作用相同。

分子結(jié)合相互作用的空間和時(shí)間監(jiān)測(cè)

使用所述實(shí)時(shí)結(jié)合分析進(jìn)行的另一個(gè)實(shí)驗(yàn)是在空間(由于所述陣列結(jié)構(gòu)的高密度)和時(shí)間(由于迅速和實(shí)時(shí)的讀出)上對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合事件進(jìn)行監(jiān)測(cè)。單克隆抗CEA捕獲抗體被結(jié)合于傳感器陣列。在遞送所述CEA抗原蛋白質(zhì)之前，將溶液中以抗CEA抗體標(biāo)記的磁性標(biāo)簽在所述傳感器陣列之上進(jìn)行孵育。將CEA抗原注入所述陣列，并且當(dāng)?shù)拇判詷?biāo)記的檢測(cè)抗原與被捕獲的CEA抗原蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，對(duì)CEA抗原在所述陣列上的擴(kuò)散進(jìn)行監(jiān)測(cè)。CEA抗原蛋白與所述傳感器表面的結(jié)合以及隨后磁性標(biāo)記的抗體的結(jié)合沿著空間分布的傳感器產(chǎn)生MR信號(hào)的變化。通過觀測(cè)所述MNP-抗-CEA抗體與所述結(jié)合于傳感器的CEA抗原的結(jié)合動(dòng)力學(xué)而對(duì)CEA抗原與所述傳感器的結(jié)合進(jìn)行了可視化(圖10和圖11(a)和11(b))。對(duì)四個(gè)四磁性傳感器組檢測(cè)了所述信號(hào)隨時(shí)間的變化(圖11(a)和11(b))。以高空間和時(shí)間分辨率對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合事件、蛋白質(zhì)擴(kuò)散和蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了分析。可通過使用蛋白質(zhì)擴(kuò)散模型擬合不同傳感器位點(diǎn)的MR信號(hào)的時(shí)間過程而產(chǎn)生傳輸參數(shù)，諸如被注入蛋白質(zhì)的擴(kuò)散率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本文公開的實(shí)時(shí)磁性傳感器裝置是用于檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的高通量、高敏感度、實(shí)時(shí)的結(jié)合分析。以上產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)模型提供了參與標(biāo)記蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的主要過程的分析模型。所述實(shí)時(shí)分析結(jié)合分析和分析模型被用于測(cè)量蛋白質(zhì)結(jié)合速率常數(shù)以及對(duì)結(jié)合于給定傳感器的蛋白質(zhì)數(shù)量進(jìn)行精確定量。還進(jìn)行了蛋白質(zhì)表位定位實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)。

盡管通過說明和實(shí)施例已經(jīng)對(duì)前述發(fā)明進(jìn)行了以明確和了解為目的的一定細(xì)節(jié)的描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過本發(fā)明的指導(dǎo)易于了解，在不背離由附屬權(quán)利要求書精神和范圍的前提下可以作出特定改變和修改。

因此，前文僅僅是對(duì)本發(fā)明的原理的說明。應(yīng)當(dāng)了解，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能夠設(shè)計(jì)多種裝置，盡管未在本文明確描述或展示，所述裝置具體實(shí)施了本發(fā)明的原理并且被包含于本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。此外，本文描述的全部實(shí)施例和和條件性語(yǔ)言主要意在用于幫助讀者理解本發(fā)明的原理以及發(fā)明人在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上作出的構(gòu)思，并且不應(yīng)解釋為對(duì)具體描述的實(shí)施例和條件的限制。進(jìn)一步，描述本發(fā)明原理、方面和實(shí)施方案的本文全部申明及其具體的實(shí)施例被用于涵蓋其結(jié)構(gòu)上的和功能上的等價(jià)物。此外，這些等價(jià)物被預(yù)期包含當(dāng)前已知的等價(jià)物和未來(lái)所開發(fā)出的等價(jià)物，即，被開發(fā)的實(shí)施相同功能的任意元件，無(wú)論其結(jié)構(gòu)如何。因此，本發(fā)明的范圍并不意在受限于本文所展示和描述的示例性的實(shí)施方案。更確切而言，本發(fā)明的范圍和精神由附屬權(quán)利要求書所具體規(guī)定。