本發(fā)明涉及煙草有益活性成分的提取和測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種同時(shí)提取并測(cè)定煙草西柏三烯二醇、維生素E、植物甾醇的方法。

背景技術(shù)：

西柏三烯二醇(CBT-二醇)是煙草腺毛分泌物的主要化學(xué)成分，也是影響卷煙香氣品質(zhì)的重要前體物質(zhì)。國(guó)內(nèi)外研究表明，CBT-二醇還具有抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)劑、殺蟲等多種生物活性。維生素E和甾醇均是在醫(yī)藥、保健品、食品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用的植物天然活性成分，也是影響煙草品質(zhì)和安全性的重要化學(xué)成分。對(duì)于傳統(tǒng)卷煙，在煙支燃吸過(guò)程中，維生素E、甾醇僅有少部分直接轉(zhuǎn)移到煙氣中，大部分裂解合成苯、苯并芘等煙氣有害成分，是煙草安全性的不利因素。但對(duì)于無(wú)煙氣煙草制品，由于其通過(guò)口含消費(fèi)，煙草中的維生素E、甾醇就成為了對(duì)人體有益的化學(xué)成分。因此，準(zhǔn)確而快速測(cè)定煙草CBT-二醇、維生素E、甾醇含量，不論對(duì)于傳統(tǒng)煙草制品還是正在迅猛發(fā)展的無(wú)煙氣煙草制品原料的篩選和品質(zhì)評(píng)價(jià)都具有重要支撐作用。

陳開波等(2005)研究了毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定煙草維生素E的技術(shù)，劉悍等(2010)、馬戎等(2013)分別探索了液相色譜測(cè)定煙草維生素E的條件。張峻松等(2007)、劉宇欣等(2010)分別研究了氣相色譜法測(cè)定煙草不同甾醇的方法，薛芳等(2012)、戚大偉等(2013)、許燕娟(2006)等分別建立了采用氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定煙草不同甾醇的實(shí)驗(yàn)條件。

根據(jù)國(guó)內(nèi)外資料報(bào)道，目前煙草CBT-二醇、維生素E、植物甾醇測(cè)定均是獨(dú)立進(jìn)行的，且測(cè)定過(guò)程中存在前處理方法繁瑣，有機(jī)溶劑消耗較多的缺點(diǎn)。目前還未見有關(guān)同時(shí)提取、測(cè)定CBT-二醇、維生素E、甾醇的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的煙草有益活性成分測(cè)定均是獨(dú)立進(jìn)行且前處理方法繁瑣，有機(jī)溶劑消耗較多的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)提取并測(cè)定煙草CBT-二醇、維生素E、植物甾醇的方法。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種同時(shí)提取并測(cè)定煙草西柏三烯二醇、維生素E、植物甾醇的方法，具體包括如下步驟：

(1)提取、皂化目標(biāo)化合物：稱取粉碎后的煙草樣品，置于具塞離心玻璃管中，加入維生素C作為抗氧化劑，加入95％乙醇，放入恒溫超聲提取儀中，初次超聲提取，使維生素C溶解，取出離心管，再加入含氫氧化鉀的95％乙醇溶液作為提取劑、皂化劑，放入恒溫超聲提取儀中，在恒溫超聲條件下二次超聲提取、皂化目標(biāo)化合物；

(2)萃?。禾崛⊥瓿珊螅尤胝和樽鳛檩腿?，振蕩、混勻，再加入8倍皂化劑體積的去離子水，震蕩、離心后，溶液分層，CBT-二醇、維生素E、植物甾醇就轉(zhuǎn)移到上層正己烷溶液中，皂化劑及水溶性雜質(zhì)就轉(zhuǎn)移到下層水溶液中；

(3)過(guò)濾：取正己烷層加入無(wú)水硫酸鈉，過(guò)有機(jī)濾膜，注入氣相進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

進(jìn)一步的，所述步驟(1)煙草樣品為干燥粉碎后煙草樣品，烤煙、曬煙、香料煙、雪茄煙、白肋煙、野生煙的煙草葉片、花組織或器官樣品，其中煙草葉片又包括調(diào)制后葉片及煙草不同生長(zhǎng)時(shí)期鮮煙葉葉片。

進(jìn)一步的，所述步驟(1)中初次超聲提取的恒溫超聲條件為50-60℃超聲提取10-15mim。

進(jìn)一步的，所述步驟(1)中維生素C加入量(g)與稱樣量的比值為1.5:1。

進(jìn)一步的，所述步驟(1)分別加入95％乙醇、95％乙醇-氫氧化鉀溶液的體積比為1:1，加入95％乙醇和95％乙醇-氫氧化鉀總體積與稱樣質(zhì)量按照ml/g的液料比比值為40:1。

進(jìn)一步的，所述步驟(1)95％乙醇-氫氧化鉀溶液的濃度為2mol/L。

進(jìn)一步的，所述步驟(1)中二次超聲提取的恒溫超聲條件為60℃超聲提取40mim。

進(jìn)一步的，所述步驟(3)過(guò)濾工藝中無(wú)水硫酸鈉和正己烷的質(zhì)量體積比為1g/50ml。

進(jìn)一步的，所述步驟(3)中有機(jī)濾膜的濾孔為0.22um。

一種檢測(cè)煙草西柏三烯二醇、維生素E、植物甾醇的方法，所采用的儀器條件如下：

氣相色譜條件：采用DB-5ms型30m*0.25mm*0.25um的毛細(xì)管柱；進(jìn)樣量1μL，分流比2:1；載氣：He；流速：1.2ml/min；進(jìn)樣口溫度：280℃；程序升溫條件：120℃，保持4min，30℃/min的速率升至230℃，保持1min，再以15℃/min的速率升至250℃保持1min，最后以30℃/min的速率升至290℃保持14min，后運(yùn)行5min；

質(zhì)譜條件：EI離子源溫度：230℃；接口溫度：280℃；四級(jí)桿溫度：230℃；EI能量：70eV；質(zhì)量數(shù)掃描范圍40–550amu；SIM離子檢測(cè)：CBT-二醇的特征碎片離子質(zhì)荷比為81、95、107；維生素E的特征碎片離子質(zhì)荷比為165、430、205；菜油甾醇的特征碎片離子質(zhì)荷比為289、382、400；豆甾醇的特征碎片離子質(zhì)荷比為255、271、412；谷甾醇的特征碎片離子質(zhì)荷比為303、329、414；外標(biāo)法定量。

本發(fā)明的有益效果：

該方法建立了超聲波輔助條件下，同時(shí)皂化、提取煙草CBT-二醇、維生素E、植物甾醇所需的溫度、試劑、料液比、時(shí)間條件，優(yōu)化了SIM法同時(shí)測(cè)定煙草CBT-二醇、維生素E、植物甾醇的氣相色譜和質(zhì)譜條件。選用弱極性毛細(xì)管柱分析，獲得的圖譜整體性好，峰數(shù)目多且分離度好，方法步驟簡(jiǎn)單，溶劑消耗少，適用于批量檢測(cè)。

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了煙草CBT-二醇、維生素E、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇的同時(shí)提取、檢測(cè)，檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單，溶劑消耗少，適用于煙草樣品活性成分的批量檢測(cè)，環(huán)保、安全，效率高，提高目標(biāo)物的檢出效率；檢測(cè)靈敏度高，同時(shí)可獲得更高的靈敏度和更低的檢出限，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好。

本發(fā)明使目標(biāo)化合物的提取、皂化以及與皂化劑和水溶性雜質(zhì)的分離在一根離心管中即可完成，提高了煙草活性成分的檢測(cè)效率。

附圖說(shuō)明

圖1為樣品測(cè)試液總離子流圖I；

圖中，2、CBT-二醇；4、維生素E；5、菜油甾醇；6、豆甾醇；7、谷甾醇。

具體實(shí)施方式

(1)目標(biāo)化合物提取

稱取粉碎后的煙草粉末樣品，置于具塞離心玻璃管中，加入維生素C作為抗氧化劑，加入氫氧化鉀的乙醇溶液作為提取、皂化劑，放入恒溫超聲提取儀中，在恒溫超聲條件下提取、皂化目標(biāo)化合物，提取完成后，加入正己烷作為萃取劑，振蕩、混勻，再加入8倍皂化劑體積的去離子水，震蕩、離心后，溶液分層，CBT-二醇、維生素E、植物甾醇就轉(zhuǎn)移到上層正己烷溶液中，皂化劑及水溶性雜質(zhì)就轉(zhuǎn)移到下層水溶液中。取正己烷層加入無(wú)水硫酸鈉，過(guò)0.22um有機(jī)濾膜，注入氣相進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

(2)儀器條件

氣相色譜條件：毛細(xì)管柱為DB-5ms(30m*0.25mm*0.25um)；進(jìn)樣量1μL，分流比2:1；載氣：He；流速：1.2ml/min；進(jìn)樣口溫度：280℃；程序升溫條件：120℃，保持4min，30℃/min的速率升至230℃，保持1min，再以15℃/min的速率升至250℃保持1min，最后以30℃/min的速率升至290℃保持14min，后運(yùn)行5min。

質(zhì)譜條件：EI離子源溫度：230℃；接口溫度：280℃；四級(jí)桿溫度：230℃；EI能量：70eV；質(zhì)量數(shù)掃描范圍40–550amu。SIM離子檢測(cè)：CBT-二醇(81、95、107)、維生素E(165、430、205)、菜油甾醇(289、382、400)、豆甾醇(255、271、412)、谷甾醇(303、329、414)，外標(biāo)法定量。

(3)工作曲線

準(zhǔn)確配制CBT-二醇、維生素E、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，各化合物工作曲線的濃度分別為：CBT-二醇13.31μg/mL、26.61μg/mL、53.24μg/mL、79.85μg/mL、106.5μg/mL、133.1μg/mL；維生素E2.08、4.16、6.24、8.32、10.4、12.48ug/mL；菜油甾醇6.4、12.8、19.2、25.6、32、38.4ug/mL；豆甾醇3.2576、6.5152、9.7728、13.0304、16.288、19.5456ug/mL；谷甾醇2.448、4.896、7.344、9.792、12.24、14.688ug/mL。

將以上標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣，分別獲得CBT-二醇、維生素E、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇濃度(Y)與響應(yīng)值(X)的線性回歸方程參數(shù)及決定系數(shù)見下表1，由下表看出，目標(biāo)化合物工作曲線決定系數(shù)均大于0.999，線性關(guān)系良好，符合定量分析要求。

表1為目標(biāo)化合物工作曲線參數(shù)及決定系數(shù)

(4)儀器檢出限、方法定量下限

將CBT-二醇、維生素E、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)工作溶液逐步稀釋檢測(cè)，獲得的各化合物以信噪比(S/N)為3計(jì)算儀器檢出限，以信噪比(S/N)為10計(jì)算的方法定量下限見下表2。

表2檢測(cè)指標(biāo)儀器檢出限、方法定量下限

(5)回收率及精密度試驗(yàn)

如表3所示，通過(guò)空白標(biāo)準(zhǔn)添加獲得的CBT-二醇、維生素E、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇的平均回收率分別為103％、88.7％、101％、101％、105％，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別2.29％、3.32％、3.09％、3.36％，為說(shuō)明方法準(zhǔn)確度、精密度均較高，符合定量分析要求。

表3為CBT-二醇、維生素E和植物甾醇加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

(6)實(shí)施例1

稱取0.1g調(diào)制后烤煙煙末樣品，置于具塞離心玻璃管中，加入0.2g維生素C，混勻，加入2mL95％乙醇，放入恒溫超聲提取儀中，60℃超聲提取10mim，使維生素C溶解，取出離心管，再加入2M的氫氧化鉀-95％乙醇溶液2mL，繼續(xù)放入恒溫超聲提取儀中，60℃超聲提取40mim，冷卻，加入5mL正己烷，16mL去離子水，震蕩、離心；取正己烷層加入0.1g無(wú)水硫酸鈉，過(guò)0.22um有機(jī)濾膜，注入氣相進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。如圖1，為樣品測(cè)定液的液相色譜圖。

(7)實(shí)施例2

稱取稱取0.1g調(diào)制后香料煙煙葉粉末樣品，置于具塞離心玻璃管中，以下操作步驟如實(shí)施實(shí)例1。

(8)實(shí)施例3

稱取稱取0.1g干燥后的香料煙煙花樣品，置于具塞離心玻璃管中，以下操作步驟如實(shí)施實(shí)例1。

以上所述并非是對(duì)本發(fā)明的限制，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)范圍的前提下，還可以做出若干變化、改型、添加或替換，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。