本發(fā)明屬于污染物環(huán)境評(píng)價(jià)領(lǐng)域，具體涉及一種用平行人工膜滲透模型(Parallel Artificial Membrane Permeability Assay,PAMPA)預(yù)測(cè)農(nóng)藥生物富集系數(shù)的方法。

背景技術(shù)：

農(nóng)藥的應(yīng)用是20世紀(jì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)取得快速發(fā)展的一個(gè)重要因素，但農(nóng)藥的不合理使用也會(huì)給人們帶來嚴(yán)重風(fēng)險(xiǎn)。農(nóng)藥的使用是一把雙刃劍，其一方面發(fā)揮除草、殺蟲、殺菌等作用，保障了農(nóng)業(yè)的豐收，確保了糧食的供應(yīng)；另一方面，農(nóng)藥在使用過程中會(huì)殘留在環(huán)境中，通過直接或間接的途徑進(jìn)入生物體對(duì)其產(chǎn)生危害。

農(nóng)藥殘留可通過多種途徑透過生物膜，被生物體吸收，產(chǎn)生毒害效應(yīng)。然而現(xiàn)在多數(shù)的農(nóng)藥膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估只是通過檢測(cè)食物中單個(gè)農(nóng)藥的殘留濃度來評(píng)價(jià)其風(fēng)險(xiǎn)，這種評(píng)估方法沒有考慮到農(nóng)藥真正的生物吸收，因此有必要將生物吸收考慮到膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型中，而生物富集系數(shù)(BCF)是評(píng)價(jià)生物吸收的重要指標(biāo)。傳統(tǒng)的BCF測(cè)定需要進(jìn)行生物體實(shí)驗(yàn)，但該方法周期長，實(shí)驗(yàn)操作麻煩且成本較大。因此，建立一種可以高通量快速預(yù)測(cè)農(nóng)藥生物富集系數(shù)的方法就顯得尤為重要。

平行人工膜滲透模型(Parallel Artificial Membrane Permeability Assay,PAMPA)，是一種比傳統(tǒng)生物學(xué)方法更經(jīng)濟(jì)、高效、便捷的方法。PAMPA模型是由96孔濾膜(孔徑為0.45μm)板和96孔板組成的“三明治”結(jié)構(gòu)，藥物溶液填充在下層供體池中，上層的受體池中是緩沖溶液，中間的疏水性膜支架上則是人工仿生生物膜，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-15h后，由儀器測(cè)試分開的接收池和供 體池中的溶液。其通過“三明治”結(jié)構(gòu)模擬不同的生物膜來測(cè)試不同生物組織的滲透率，從而評(píng)估化合物的生物富集系數(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明對(duì)于現(xiàn)有測(cè)定生物富集系數(shù)(BCF)技術(shù)的不足，建立一種用平行人工膜滲透模型(PAMPA)預(yù)測(cè)農(nóng)藥生物富集系數(shù)的方法，該方法通過模擬胃腸生物膜的滲透率，建立農(nóng)藥生物富集因子(BCF)與滲透率等基本理化性質(zhì)相關(guān)關(guān)系，進(jìn)而評(píng)估化合物的生物富集系數(shù)。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種用平行人工膜滲透模型預(yù)測(cè)農(nóng)藥生物富集系數(shù)的方法，步驟如下：

(1)確定胃及腸道PAMPA模型條件

建立PAMPA模型，膽固醇與蛋黃卵磷脂按照質(zhì)量比為1：10制備人工膜，人工膜用于模擬胃和腸的生物膜；人工膜置于緩沖溶液中，人工膜與緩沖溶液的質(zhì)量體積比為10％；所述的緩沖溶液為Na₂HPO₄和NaH₂PO₄混合溶液；

通過緩沖溶液調(diào)節(jié)pH＝2.7模擬胃的生物膜條件，即為胃生物膜體液；

通過緩沖溶液調(diào)節(jié)pH＝5.8模擬腸的生物膜條件，即為腸生物膜體液。

(2)農(nóng)藥的滲透率測(cè)定

供體池中加入0.05～1.0μg/mL農(nóng)藥溶液，在接收池中加入步驟(1)中得到的胃生物膜體液或腸生物膜體液，供體池中農(nóng)藥溶液和接收池中胃生物膜體液、腸生物膜體液二者的體積相同；然后將供體池放入接收池中，確保人工膜和接收池中的緩沖溶液完全接觸；37℃孵育16h后，分別移取供體池和接收池中的溶液，然后通過氣相色譜-質(zhì)譜連用(GC-MS)進(jìn)行分析得到農(nóng)藥的峰面積AU，測(cè)定農(nóng)藥的濃度C標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)濃度C標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)農(nóng)藥的濃度，并計(jì)算人工膜的表觀滲透率P_a和有效滲透率P_e。

通過人工膜的表觀滲透率P_a由方程計(jì)算，其公式如下

$P_a=C\·\lg (1-\frac{(V_D+V_A)C_A\left(t\right)}{V_D{C}_D\left(0\right)})$

$C=-2.303\left(\frac{V_A{V}_D}{(V_A+V_D)At}\right)$

其中，V_A為接收池的體積(cm³)；V_D為供體池的體積(cm³)；A為有效膜面積，為膜面積與膜孔隙率的乘積(0.24cm²)；t為樣品培養(yǎng)時(shí)間(s)，C_A(t)為接收池中農(nóng)藥培養(yǎng)后的濃度(mg/L)；C_D(0)為供體池最初的濃度(mg/L)。

化合物在滲透過程中會(huì)有小部分化合物停留在膜中，因此需要引進(jìn)化合物在人工膜中的截留系數(shù)R，則可得到P_e，計(jì)算公式如下：

$R=1-\frac{V_A{C}_A\left(t\right)}{V_D{C}_D\left(0\right)}-\frac{C_D\left(t\right)}{C_D\left(0\right)}$

$P_e=C\·\lg (1-\frac{(V_D+V_A)C_A\left(t\right)}{V_D{C}_D\left(0\right)(1-R)})$

其中，V_D為供體池的體積(cm³)；V_A為接收池的體積(cm³)；A為有效膜面積，為膜面積與膜孔隙率的乘積(0.24cm²)；t為樣品培養(yǎng)時(shí)間(s)，C_A(t)為接收池中化合物培養(yǎng)后的濃度(mg/L)；C_D(0)為供體池最初的濃度(mg/L)；C_D(t)為供體池培養(yǎng)后的濃度(mg/L)。

(3)農(nóng)藥生物富集系數(shù)(BCF)的預(yù)測(cè)

對(duì)生物富集系數(shù)(BCF)與人工膜的表觀滲透率P_a、有效滲透率P_e及其基本理化性質(zhì)(分子量、分子體積、分子極性、熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、溶解度、辛醇-水分配系數(shù))的相關(guān)性進(jìn)行分析，以BCF為因變量，將人工膜的表觀滲透率P_a、有效滲透率P_e分別納入自變量內(nèi)進(jìn)行回歸分析，得到BCF的預(yù)測(cè)模型方程，依據(jù)回歸分析結(jié)果計(jì)算得到BCF計(jì)算值，并分析該計(jì)算值與實(shí)測(cè)值的線性擬合結(jié)果。

胃、腸表觀滲透率P_a的BCF預(yù)測(cè)模型方程：

Log BCF＝0.23X1-0.416X2+0.088X8+0.193X9+2.669(R²＝0.755)

胃、腸有效滲透率P_e的BCF預(yù)測(cè)模型方程：

Log BCF＝0.166X1-0.41X2-0.523X10+0.671X11+2.222(R²＝0.760)

其中，X1為農(nóng)藥的辛醇-水分配系數(shù)取Log值；X2為農(nóng)藥的溶解度取Log值；X8為腸道表觀滲透率取Log值；X9為胃表觀滲透率取Log值；X10為腸道有效滲透率取Log值；X11為胃有效滲透率取Log值。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明采用PAMPA測(cè)試技術(shù)，通過GC-MS測(cè)定51種農(nóng)藥的滲透率，建立農(nóng)藥生物富集因子(BCF)與滲透率等基本理化性質(zhì)相關(guān)關(guān)系，用于預(yù)測(cè)農(nóng)藥的生物富集(BCF)。本發(fā)明是一種操作簡單、預(yù)測(cè)性好且適用性強(qiáng)的預(yù)測(cè)技術(shù)。

附圖說明

圖1(a)為表觀滲透率P_a條件下BCF的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值對(duì)比圖。

圖1(b)為有效滲透率P_e條件下BCF的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值對(duì)比圖。

圖2是PAMPA模型示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和技術(shù)方案，進(jìn)一步說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

實(shí)施例1 確定胃及腸道PAMPA模型條件

(1)人工膜的制備

準(zhǔn)確稱量0.1g蛋黃卵磷脂，0.01g膽固醇，混合后充分溶解在1.1ml正十二烷溶液中，超聲至呈黃色透明液體形成人工膜溶液。

(2)緩沖溶液的配制

胃和小腸是藥物和食物吸收的主要部位，其中胃液偏酸性，其pH值在2左右，小腸的pH為5～8。因此本發(fā)明設(shè)置胃的pH為2.7，腸道pH為5.8、6.5、7.4。

磷酸緩沖液的配制：將31.21g NaH₂PO₄和71.64g Na₂HPO₄分別溶于1L超純水中待用。

分別取上述配好的8mL Na₂HPO₄和92mL NaH₂PO₄溶液于燒杯中即得pH＝5.8的緩沖溶液；

分別取上述配好的Na₂HPO₄和NaH₂PO₄溶液32mL和68mL于燒杯中即得pH＝6.5的緩沖溶液；

分別取上述配好的Na₂HPO₄和NaH₂PO₄溶液81mL和19mL于燒杯中即得pH＝7.4的緩沖溶液。

醋酸緩沖液的配制(pH＝2.7)：取12mL醋酸超純水定容至1L即得。

本發(fā)明建立PAMPA模型，膽固醇與蛋黃卵磷脂按照質(zhì)量比為1：10制備人工膜，人工膜用于模擬胃和腸的生物膜；選取pH＝2.7緩沖溶液來模擬胃的條件，腸道分別選取pH＝5.8、6.5、7.4的緩沖溶液進(jìn)行模型驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果中腸道條件下pH＝5.8時(shí)相關(guān)性最好(R²＝0.806)，在胃的條件下pH＝2.7時(shí)相關(guān)性最好(R²＝0.807)，得到模型最優(yōu)結(jié)果(如表1)；選取擬合結(jié)果最優(yōu)的pH條件來進(jìn)行后續(xù)的腸道滲透性實(shí)驗(yàn)。

表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例2 農(nóng)藥的滲透率測(cè)定

供體池中加入0.05μg/mL～1.0μg/mL農(nóng)藥溶液，在接收池中加入步驟(1)中得到的胃、腸生物膜體液，供體池中農(nóng)藥溶液和接收池中胃、腸生物膜體液二者的體積相同，均為200μL；然后將供體池放入接收池中，確保人工膜和接收池中的緩沖溶液完全接觸；在培養(yǎng)箱中37℃孵育16h后，分別移取上層供體池 和下層接收池中的溶液，然后氣相色譜-質(zhì)譜連用(GC-MS)進(jìn)行分析得到農(nóng)藥的峰面積AU，進(jìn)而得到農(nóng)藥的濃度C標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)濃度C標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)農(nóng)藥的濃度，計(jì)算人工膜的表觀滲透率P_a和有效滲透率P_e。

農(nóng)藥測(cè)定采用氣相色譜-質(zhì)譜連用進(jìn)行測(cè)定，色譜柱為石英毛細(xì)管柱。具體測(cè)試條件見表2。

表2：GC-MS的測(cè)試條件

通過人工膜的表觀滲透率P_a由方程計(jì)算，其公式如下

$P_a=C\·\lg (1-\frac{(V_D+V_A)C_A\left(t\right)}{V_D{C}_D\left(0\right)})$

$C=-2.303\left(\frac{V_A{V}_D}{(V_A+V_D)At}\right)$

其中，V_A為接收池的體積(cm³)；V_D為供體池的體積(cm³)；A為有效膜面積，為膜面積與膜孔隙率的乘積(0.24cm²)；t為樣品培養(yǎng)時(shí)間(s)，C_A(t)為接收池中農(nóng)藥培養(yǎng)后的濃度(mg/L)；C_D(0)為供體池最初的濃度(mg/L)。

化合物在滲透過程中會(huì)有小部分化合物停留在膜中，因此需要引進(jìn)化合物在人工膜中的截留系數(shù)R，則可得到P_e，計(jì)算公式如下：

$R=1-\frac{V_A{C}_A\left(t\right)}{V_D{C}_D\left(0\right)}-\frac{C_D\left(t\right)}{C_D\left(0\right)}$

$P_e=C\·\lg (1-\frac{(V_D+V_A)C_A\left(t\right)}{V_D{C}_D\left(0\right)(1-R)})$

其中，V_D為供體池的體積(cm³)；V_A為接收池的體積(cm³)；A為有效膜面積，為膜面積與膜孔隙率的乘積(0.24cm²)；t為樣品培養(yǎng)時(shí)間(s)，C_A(t)為接收池中化合物培養(yǎng)后的濃度(mg/L)；C_D(0)為供體池最初的濃度(mg/L)；C_D(t)為供體池培養(yǎng)后的濃度(mg/L)。

通過實(shí)驗(yàn)測(cè)得農(nóng)藥的表觀滲透率(P_a)和有效滲透率(P_e)如下表3所示。

表3農(nóng)藥相關(guān)信息表

注：#表示滲透率值很小，不可定量計(jì)算

-表示滲透培養(yǎng)后接收池濃度高于1/2原始濃度

實(shí)施例3 農(nóng)藥生物富集系數(shù)(BCF)的預(yù)測(cè)

對(duì)表4中農(nóng)藥的生物富集系數(shù)(BCF)與測(cè)定的農(nóng)藥滲透率及其他基本性質(zhì)的相關(guān)性進(jìn)行分析。農(nóng)藥滲透率包括腸道表觀/有效滲透率、胃表觀/有效滲透率， 基本理化性質(zhì)包括分子量、分子體積、熔點(diǎn)、分子極性、沸點(diǎn)、溶解度、辛醇-水分配系數(shù)等(表4)，進(jìn)行逐步線性回歸分析，構(gòu)建多元線性回歸模型，以考察滲透性和理化性質(zhì)與BCF的關(guān)系。具體構(gòu)建模型代表符號(hào)如表5所示。

表4農(nóng)藥相關(guān)信息表

注：-表示準(zhǔn)確數(shù)據(jù)無法獲??；a來源于US EPA EPI SuiteTM(Version 4.1)的計(jì)算值；

b來源于US EPA EPI SuiteTM(Version 4.1)的實(shí)驗(yàn)值；c源于http://www.chemspider.com

表5方程中各項(xiàng)相關(guān)信息

構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型方程如下，依據(jù)回歸分析結(jié)果計(jì)算得到BCF計(jì)算值，并分析該計(jì)算值與實(shí)測(cè)值的線性擬合結(jié)果(圖1(a),圖1(b))，建立用平行人工膜滲透模型(PAMPA)預(yù)測(cè)農(nóng)藥生物富集系數(shù)的方法。

胃、腸表觀滲透率P_a的BCF預(yù)測(cè)模型方程：

Log BCF＝0.23X1-0.416X2+0.088X8+0.193X9+2.669(R²＝0.755)

胃、腸有效滲透率P_e的BCF預(yù)測(cè)模型方程：

Log BCF＝0.166X1-0.41X2-0.523X10+0.671X11+2.222(R²＝0.76)

其中，X1為農(nóng)藥辛醇-水分配系數(shù)取Log值；X2為農(nóng)藥溶解度取Log值；X8為腸道表觀滲透率取Log值；X9為胃表觀滲透率取Log值；X10為腸道有效滲透率取Log值；X11為胃有效滲透率取Log值。