本發(fā)明屬于中藥檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及杜仲藥材的多成分含量測定方法。
背景技術(shù)：
：杜仲為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥樹皮，又名思仙、思仲、木棉，為我國名貴滋補(bǔ)藥材。杜仲作為中藥在我國已有2000多年的藥用歷史，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、降血壓、抗腫瘤、安胎等諸多功效，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品。目前已知杜仲的主要化學(xué)成分有木質(zhì)素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類等幾十種化合物，研究表明其中部分活性成分桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、綠原酸、京尼平苷酸、京尼平苷具有抗腫瘤、降血壓、抗菌、抗血栓等藥理作用?！吨袊幍洹?010版中收錄用高效液相法測定松脂醇二葡萄糖苷單一成分，但并未給出杜仲中其它成分含量的測定方法，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定指標(biāo)單一，難以全面的評價杜仲藥材的內(nèi)在質(zhì)量。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是以UPLC作為分析手段建立多指標(biāo)定量分析方法，在同一色譜條件下同時對杜仲藥材中的桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷6個有效成分進(jìn)行含量測定，從而較為全面的覆蓋藥材中所含的木質(zhì)素類、環(huán)烯醚萜類及酚酸類成分，克服藥材質(zhì)量控制的片面性，進(jìn)一步提高了杜仲藥材的質(zhì)量控制研究、為杜仲藥材的開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：本發(fā)明的杜仲藥材的多成分含量測定方法，用于測定杜仲藥材中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷的含量，采用UPLC法，以WatersBETC18（2.1×150mm，1.7μm）為色譜柱，0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長為205nm，流速0.25mL/min，柱溫45℃。用甲醇作為杜仲藥材的提取溶劑，提取回流次數(shù)為2次。具體的，包括如下步驟：步驟1：制備對照品溶液和供試品溶液；對照品溶液的制備方法是：分別精密稱取桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷對照品適量至6個5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。獲得桃葉珊瑚苷（1.169mg/mL）、京尼平苷酸（1.205mg/mL）、綠原酸（1.253mg/mL）、京尼平苷（1.000mg/mL）、松脂醇二葡萄糖苷（1.190mg/mL）、松脂醇單葡萄糖苷（1.100mg/mL）的儲備液。分別精密量取上述6種對照品儲備液置同一個10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液（0.2221、0.1808、0.0376、0.1000、0.0595、0.0088mg/mL），于4℃保存?zhèn)溆谩９┰嚻啡芤旱闹苽浞椒ㄊ牵壕芊Q取粉碎的杜仲藥材2g，精密加入20mL甲醇回流提取2次，每次1.5h，冷卻，過濾，濃縮并用甲醇定容至25mL容量瓶，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，即得。步驟2：分別取混合對照品溶液和供試品溶液，用UPLC-PDA測定，得色譜圖，6種化合物與其他物質(zhì)峰分離完全；其中色譜條件為：流動相為0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液，色譜柱WatersBETC18（2.1×150mm，1.7μm），檢測波長205nm，流速0.25mL/min，柱溫45℃，進(jìn)樣量1μL。步驟3：分別進(jìn)行線性關(guān)系考察、精密度實驗、重復(fù)性試驗、穩(wěn)定性試驗和加樣回收率實驗。按照本發(fā)明的方法，杜仲中的六種有效成分能得到較好的分離，方法的加樣回收率為96.92%～101.01%，RSD﹤3%。該方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于杜仲中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷的含量測定，為杜仲的質(zhì)量控制研究提供依據(jù)。附圖說明圖1是系統(tǒng)適用性實驗UPLC圖，圖中，1桃葉珊瑚苷；2京尼平苷酸；3綠原酸；4京尼平苷；5松脂醇二葡萄糖苷；6松脂醇單葡萄糖苷）。具體實施方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實施例1：1儀器與材料AcquityUPLC-PDA系統(tǒng)（Waters公司，包含二元超高壓梯度泵、自動進(jìn)樣器、色譜柱溫箱、陣列二級管檢測器、Empower工作站）；AE240十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），DK-98-11恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）。京尼平苷酸對照品、京尼平苷對照品和桃葉珊瑚苷對照品購自四川省維克奇生物科技有限公司（批號120314、110722、110711），松脂醇二葡萄糖苷對照品購自上海順勃生物工程有限公司（批號201206），松脂醇單葡萄糖苷對照品購自江蘇弘惠醫(yī)藥有限公司（批號070801），綠原酸對照品購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司（批號MUST-11042802），對照品純度均大于98%。乙腈（上海振興化工一廠，色譜純），甲醇（上海振興化工一廠，分析純），甲酸（美國TEDIA有限公司，優(yōu)級純），實驗用杜仲藥材由貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥用植物與生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥樹皮，標(biāo)本存于貴州省中藥民族藥研究開發(fā)中心。2方法2.1色譜條件流動相為0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液，色譜柱WatersBETC18（2.1×150mm，1.7μm），檢測波長205nm，流速0.25mL/min，柱溫45℃，進(jìn)樣量1μL，梯度洗脫程序見表1。表1流動相梯度洗脫表時間（min）流速（mL/min）A（%）B（%）00.2549610.2549660.2510.589.5130.2510.589.5310.253070350.259552.2對照品溶液制備分別精密稱取桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷對照品適量至6個5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。獲得桃葉珊瑚苷（1.169mg/mL）、京尼平苷酸（1.205mg/mL）、綠原酸（1.253mg/mL）、京尼平苷（1.000mg/mL）、松脂醇二葡萄糖苷（1.190mg/mL）、松脂醇單葡萄糖苷（1.100mg/mL）的儲備液。分別精密量取上述6種對照品儲備液置同一個10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液（0.2221、0.1808、0.0376、0.1000、0.0595、0.0088mg/mL），于4℃保存?zhèn)溆谩?.3供試品溶液制備精密稱取粉碎的杜仲藥材2g，精密加入20mL甲醇回流提取2次，每次1.5h，冷卻，過濾，濃縮并用甲醇定容至25mL容量瓶，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，即得。2.4方法學(xué)考察2.4.1系統(tǒng)適應(yīng)性考察分別取混合對照品溶液和供試品溶液各1μL，在“2.1”項的色譜條件下，用UPLC-PDA測定，得色譜圖，6種化合物與其他物質(zhì)峰分離完全，見圖1。2.4.2線性關(guān)系考察精密量取“2.2”項下對照品儲備液1.25mL置10mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品稀釋液。分別精密吸取混合對照品稀釋液1，2，4μL和“2.2”項下對照品儲備液1，2，4，8μL，按“2.1”項下色譜條件測定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，結(jié)果見表2。表2回歸方程和線性范圍.2.4.3精密度實驗取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷峰面積的RSD分別為1.6%、2.1%、2.7%、2.8%、0.4%、1.9%，結(jié)果說明儀器精密度良好。2.4.4重復(fù)性實驗取同一批號杜仲藥材6份，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別測定。6份供試品溶液中6個成分含量結(jié)果RSD分別為2.0%、0.8%、2.3%、2.6%、0.9%、2.5%，表明重復(fù)性良好。2.4.5穩(wěn)定性實驗分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h分別進(jìn)樣，測定各指標(biāo)成分峰面積。桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷峰面積的RSD分別為1.7%、2.4%、1.6%、2.2%、0.9%、1.2%，表明供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.4.6加樣回收率實驗稱取已知含量的杜仲藥材6份，精密加入一定量6種被測成分混合對照品，室溫?fù)]干，其余按“2.3”項下方法制備加樣回收供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，結(jié)果見表3。結(jié)果表明6個待測成分回收率良好。表3回收率試驗結(jié)果（n=6）2.6樣品測定取收集的不同產(chǎn)地及采收期的杜仲藥材，按“2.3”項下方法操作，并按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，測定31批不同產(chǎn)地和8批不同采收期（龍里S32-S39分別為3、4、5、6、7、8、9、10月份采收）杜仲藥材中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄苷和松脂醇單葡萄糖苷的含量，含量測定結(jié)果見表4。表4不同產(chǎn)地和采收期杜仲藥材含量測定結(jié)果.3討論3.1測定波長的選擇由于所測杜仲中的木質(zhì)素類、環(huán)烯醚萜類、酚酸類成分均具有紫外吸收，所以實驗選擇紫外檢測器；并且利用二極管陣列檢測器（PDA）檢測，得到各波段的三維色譜及光譜圖，根據(jù)信息最大化原則及6個待測化合物的吸收波長，最終選定205nm為檢測波長，經(jīng)過方法學(xué)考察，證明本方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好。3.2提取方法的選擇取同批杜仲藥材以甲醇回流提取、索式提取及超聲提取，并以峰信息程度、藥材中各共有峰的單位質(zhì)量峰面積及含量測定中各指標(biāo)成分含量為指標(biāo)選擇相對較好的提取方法。實驗結(jié)果顯示，回流提取能有效的、充分的將杜仲藥材中的成分提取完全。2010年版《中國藥典》杜仲項下松脂醇二葡萄糖苷采用甲醇提取，本實驗涉及不同性質(zhì)的6個化合物，因此以甲醇、50%甲醇、乙醇、60%乙醇、水作為杜仲藥材的提取溶劑進(jìn)行考察。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇提取效率較高。因此實驗選用甲醇作為杜仲藥材的提取溶劑。對回流提取的提取次數(shù)進(jìn)行考察，結(jié)果表明甲醇回流提取2次后，指紋圖譜中各峰的峰面積及各指標(biāo)成分含量總體趨于穩(wěn)定，綜合考慮，提取回流次數(shù)定為2次。3.3結(jié)果分析本實驗采用UPLC為分析手段，對杜仲藥材中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄苷和松脂醇單葡萄糖苷進(jìn)行含量測定，該方法操作簡便，在此色譜條件下所測的多種成分分離度好，線性關(guān)系，精密度，穩(wěn)定性，回收率均較好，可應(yīng)用于杜仲質(zhì)量控制研究。從測定結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地和不同采收期杜仲藥材中6個被測成分的含量波動相對較大，它們的RSD值介于37.9%~96.0%之間，為此需要多指標(biāo)成分對藥材質(zhì)量進(jìn)行控制。其中環(huán)烯醚萜類的桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、京尼平苷含量差別較大，可能是產(chǎn)地對其有影響，也可能是由于環(huán)烯醚萜類化合物本身化學(xué)性質(zhì)不是很穩(wěn)定，在加工過程中易分解，從而導(dǎo)致含量差別大。松脂醇二葡萄糖苷和綠原酸對于不同產(chǎn)地或采收期的藥材時，含量差別較小，可能由于產(chǎn)地和采收期對其影響較小。3月份采收的杜仲皮中松脂醇二葡萄糖苷含量為0.0542%，不建議3月作為杜仲的采收期。當(dāng)然，以上只是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例，本發(fā)明還有其他的實施方式，凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3