專利名稱：：杜仲化學成分作為植物雌激素的新用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及傳統(tǒng)中藥材杜仲中的若干化學成分的新用途，特別A^土仲中的黃酮類、環(huán)烯醚萜和木質(zhì)素類化學成份作為植物雌激素的新的制藥用途。
背景技術：
：婦女到更年期后因為卵巢不斷衰竭，雌激素分泌減少，由雌激素介導的各種生理過程都受到影響，產(chǎn)生心悸、胸悶、憂慮、抑郁、易激動、失眠、記憶力減退等生理和心理癥狀，這些癥狀統(tǒng)稱為更年期綜合征；由于雌激素分泌減少的影響造成的骨質(zhì)疏松癥稱為退行性骨質(zhì)疏^癥。為了治療和/或預防上述病癥，一種有益的方法就是補充雌激素。但是，多年來的臨床實踐發(fā)現(xiàn)，長期服用雌激素會大大增加乳腺癌發(fā)病的風險。因此，尋找具有雌激素活性而又沒有雌激素副作用的植物雌激素，仍是本領域技術人員重點研究的方向。;f土仲為杜仲^F植物衫:仲Ei/ctf附w/flw/附wVfes0//V.的樹皮，又名思仙(《本經(jīng)》)，木綿、思仲(《別錄》)，石思仙(《本草衍義補遺》)。味甘孩吏辛，性溫入肝、腎經(jīng)。具有補肝腎，強筋骨，安胎的功效。用于治療腰脊酸疼，A^痿弱，小便余瀝，陰下濕癢，胎漏欲墮，胎動不安，高血壓。鑒于杜仲良好的效果，藥物學家對其化學成分進行了廣泛的研究。目前從杜仲中分離的生物活性成分主要有三類，木質(zhì)素類，環(huán)烯醚辟類和黃酮類等化學成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，杜仲的降壓作用與松脂醇二葡萄糖苷、生物堿、綠原酸、桃葉珊瑚普和糖類有關?？鼓[瘤作用與木質(zhì)素、苯丙素和環(huán)烯醚萜有關。其水煎液和醇提液均有補腎、增強免疫作用。杜仲藥材還有抗氧化、抗衰老、抗肌肉骨骼老化、抗菌、抗病毒的作用。CN101347418(中國專利申請?zhí)?00710044099.5，公開日2009年l月21日)研究了8-0-4，型木質(zhì)素在制備抗補體活性藥物中的用途，該發(fā)明據(jù){組中藥杜仲中分離提取得到化合物8-0-4'型木脂素，經(jīng)體外實驗4h^系統(tǒng)的經(jīng)典和旁i^徑激活有明顯抑制作用；'^理試驗結果證明，'具有顯著的抗#傳作用，且有效濃度低。CN101260131(中國專利申請?zhí)?00810031122.1，公開日2008年9月10日)公開了從杜仲中提取得到環(huán)烯醚辟活性部位及單體京尼平戒酸(geniposidicacid,GPA)、京尼平戒(geniposide,GP)及桃葉珊瑚戒(aucubin，AU)的方法，該方法以杜仲(皮、葉或籽)為原料，采用常規(guī)浸提法、超聲波提取法或微波提取法對原材料進行提取，以溶劑萃取、特種吸附劑吸附分離等方法對提取液進行初步純化，得到環(huán)烯醚辟活性部位(環(huán)烯醚辟總量不低于50%),再采用制備高效液相色語技術，以醇-水溶液為流動相，對GPA、GP和AU進行分離，低溫濃縮并冷凍干燥，得到以上三種單體，其含量均不低于90%?，F(xiàn)有技術尚未見有關于杜仲特別是其提取物，更特別地是其單體化學成分具有植物雌激素的作用。為了更好的利用杜仲，本發(fā)明AJit杜仲的藥效物質(zhì)基J出進行了進一步的研究。本發(fā)明人令人意外地發(fā)現(xiàn)，中藥材杜仲，特別是其提取物，更特別地是^M土仲中提取的單體化學成分具有有效的植物雌激素的作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明AJft杜仲進行系統(tǒng)植物化學分離，得到ll個化合物，用植物雌激素受體激活模型進行活性篩選，發(fā)現(xiàn)黃酮類、環(huán)烯醚萜類和木質(zhì)素類化學成分中多種成分都能明顯激活雌激素受體的表達，表明這些化合物具有雌激素活性，有望將中藥材杜仲，特別是其提取物，更特別地是^M土仲中提取的單體化學成分開發(fā)為例如雌激素受體激活劑，以用于治療和/或預防與雌激素分泌不足相關的疾病或病癥例如婦女更年期綜合征和退行性骨質(zhì)疏松癥的新型藥物。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)而得以完成。為此，本發(fā)明第一方面提供了杜仲在制備用于治療和/或預防與哺乳動物(特別是人)雌激素分泌不足相關的疾病的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的用途，其中所述的雌激素分泌不;u目關的疾病選自更年期綜^^征、骨質(zhì)疏爭^癥、退行性骨質(zhì)疏松癥、心腦血管疾病、乳腺癌。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的用途，其中所述的藥物的劑量為所述哺乳動物每天每kg體重相當于杜仲藥材l-40g，優(yōu)選2-20g，更優(yōu)選5-10g。本發(fā)明第二方面提供了杜仲提取物在制備用于治療和/或預防與哺乳動物(特別是人)雌激素分泌不足相關的疾病的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的用途，其中所述的雌激素分泌不;u目關的疾病選自更年期綜合征、骨質(zhì)疏松癥、退行性骨質(zhì)疏松癥、心腦血管疾病、乳腺癌。根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的用途，其中所述的杜仲提取物中包含至少一種選自以下的成分白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚普、爭>脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃芩素、和二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷。根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的用途，其中所述的杜仲提取物中包含以下的成分白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香月旨素二葡萄糖苦、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-0-P-D-葡萄糖苷。才艮據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的用途，其中所述白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃芩素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-O-p-D-葡萄糖苷的總量占所述提取物總重量的10-90。/o(w/w，即重量百分數(shù)，下同)，優(yōu)選2080。/o(w/w)，更優(yōu)選3060。/o(w/w)。根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的用途，其中所述的藥物的劑量為所述哺乳動物每天每kg體重相當于杜仲藥材l-40g，優(yōu)選2-20g，更優(yōu)選5-10g。根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的用途，其中所述的杜仲提取物是經(jīng)如下步驟制備的將杜仲用含水乙醇溶液提??；使所得醇提取物用石油醚萃取，棄醚層，將殘余物濃縮，千燥，得提取物；或者使所得醇提取物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，將各萃取物分別回收溶劑后得固形物，合并氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分的固形物，得提取物。才Mt本發(fā)明第二方面任一項的用途，其中所述的杜仲提取物是經(jīng)如下步驟制備的3)將杜仲用2~20倍量(優(yōu)選5~15倍量，更優(yōu)選8~12倍量，例如10倍量)的60~98%(優(yōu)選70~98%,更優(yōu)選8098%，例如80%、85%、卯％、95%或98%)乙醇浸泡5~24小時(優(yōu)選5~18小時，更優(yōu)選8~15小時)；1))回流提取0.5~10小時(優(yōu)選0.5~8小時，更優(yōu)選0.5~6小時，更優(yōu)選0.5~4小時，更優(yōu)選14小時，例如1小時、2小時、3小時、4小時)，傾出提取液；c)任選地使步驟b)的藥渣重復進行步驟a)和步驟b)13次(例如1次、2次、3次)；d)合并步驟b)和步驟c)的提取液，過濾，濾液回收乙醇至在室溫下的密度約為1.15-1.20的濃縮液；e)使步驟d)的濃縮液用石油醚萃取，棄醚層，將殘余物濃縮，千燥，得提取物；或者，e)使步驟d)的濃縮液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，將各萃取物分別回#劑后得固形物，合并氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分的固形物，得^€取物。上述方法所得的提取物可通過本發(fā)明下文所述的純化步驟知曉，或者直接進行色i瞽分析測得該提取物中包含至少一種選自以下的成分白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、*〉脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃芩素、和二氫查耳酮3-0-P-D-葡萄糖苷，優(yōu)選的是包含全部的上述ll種成分。本發(fā)明第三方面提供了選自下列成分的一種或多種的組合在制備用于治療和/或預防與哺乳動物(特別是人)雌激素分泌不;U目關的疾病的藥物中的用途白樺脂酸、京尼平、；^葉珊瑚苷、*>脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、+>脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃芩素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-0-P-D-葡萄糖苷。根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項的用途，其中所述的雌激素分泌不vM目關的疾病選自更年期綜合征、骨質(zhì)疏松癥、退行性骨質(zhì)疏松癥、心腦血管疾病、乳腺癌。根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項的用途，其為下列成分在制備用于治療和/或預防與哺乳動物(特別是人)雌激素分泌不足相關的疾病的藥物中的用途白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃芩素、和二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷。根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項的用途，以所述哺乳動物每天每kg體重計，其中所述各成分單獨或任意組合時的劑量可以相互獨立地分別為<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項的用途，其中下列成分的一種或多種的組合是^M土仲中提取得到白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-0-(5-D-葡萄糖苷。根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項的用途，其中從杜仲中提取白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃芩素、和二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷的步驟如下將杜仲用含水乙醇溶液提??；使所得醇提取物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，將各萃取物分別回收溶劑后得各萃取溶劑部分的固形物；氯仿部分經(jīng)過硅膠柱層析后，3336餾分經(jīng)反復硅膠柱層析后分別得到白樺脂酸和白樺脂醇，43~56餾分經(jīng)聚酰胺柱層析后分別得到漢黃茶素和千葉素A，8086餾分經(jīng)過^柱層析和葡聚糖皿柱層析后得到黃茶素；乙酸乙酯部分通過艦柱層析，采取氯仿:甲醇溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，19~27餾分再利用>^柱層析，通過石油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)梯度、^yt，得到白色粉末狀物質(zhì)為京尼平，49~55餾分再通過乙酸乙酯-曱醇、氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)反復硅膠柱層析后，得到黃色粉末狀物質(zhì)為二氫查耳酮3-0-P-D-葡萄糖苷；正丁醇部分經(jīng)itD101大孔吸附樹脂后，30%乙醇水溶劑洗脫部分過^柱層析，4052餾分經(jīng)過^柱層析和葡聚糖皿柱層析后得到桃葉珊瑚苷，6166餾分經(jīng)過^柱層析后得到松脂醇二葡萄糖苷，70~80鎦分經(jīng)過^柱層析后得到丁香脂素二葡萄糖苷；50%乙醇水溶劑部分，經(jīng)過皿柱層析，乙酸乙酯-甲醇溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，2327餾分再利用乙酸乙酯:甲醇:水、氯仿:甲醇溶劑系統(tǒng)進行^柱層析并結合凝膠柱層析后，得到黃色粉末狀物質(zhì)為松脂醇單葡萄糖苷；29~35餾分再通過氯仿甲醇1120溶劑系統(tǒng)進行^柱層析并結合皿柱層析和反相柱層析后，得到白色片狀物質(zhì)為丁香脂素單葡萄糖苷。本發(fā)明第四方面提供了杜仲在制備植物雌激素藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明第四方面任一項的用途，其中所述的藥物可用于治療和/或預防更年期綜合征、骨質(zhì)疏^癥、退行性骨質(zhì)疏松癥、心腦血管疾病、乳腺癌。才艮據(jù)本發(fā)明第四方面^f壬一項的用途，其中所述的藥物的劑量為所述哺乳動物每天每kg體重相當于杜仲藥材l-40g，優(yōu)選2-20g，更優(yōu)選5-10g。根據(jù)本發(fā)明第四方面任一項的用途，其中所述的藥物中包含至少一種選自以下的成分白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷。本發(fā)明第五方面提供了一種用于治療和/或預防與哺乳動物(特別是人)雌激素分泌不足相關的疾病的藥物組合物，其中包含治療和/或預防有效量的杜仲提取物以及任選的藥學可接受的賦形劑。根據(jù)本發(fā)明第五方面任一項的藥物組合物，其中所述的杜仲提取物中包含至少一種選自以下的成分白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚普、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、爭>脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃芩素、和二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷。根據(jù)本發(fā)明第五方面任一項的藥物組合物，其中所述的杜仲提取物中包含以下的成分白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、+>脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-0-IM)-葡萄糖苷。根據(jù)本發(fā)明第五方面任一項的藥物組合物，其中所述白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、+>脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷的總量占所述提取物總重量的10-90%(w/w，即重量百分數(shù)，下同)，優(yōu)選2080。/o(w/w)，更優(yōu)選30~60%(w/w)。根據(jù)本發(fā)明第五方面任一項的藥物組合物，其中所述的藥物組合物給予所述哺乳動物的劑量為所述哺乳動物每天每kg體重相當于杜仲藥材l-40g，優(yōu)選2-20g，更優(yōu)選5-10g。根據(jù)本發(fā)明第五方面任一項的藥物組合物，其中所述的杜仲提取物是經(jīng)如下步驟制備的將杜仲用含水乙醇溶液提?。皇顾么继崛∥镉檬兔演腿?，棄醚層，將殘余物濃縮，干燥，得提取物；或者使所得醇提取物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，將各萃取物分別回收溶劑后得固形物，合并氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分的固形物，得提取物。制備所述提取物的進一步優(yōu)選的步驟參見本發(fā)明第二方面所提及的。本發(fā)明第六方面提供了一種用于治療和/或預防與哺乳動物(特別是人)雌激素分泌不足相關的疾病的藥物組合物，其中包含治療和/或預防有效量的至少一種藥物活性成分以及任選的藥學可接受的賦形劑，所述的藥物活性成分選自白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松月旨醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、+>脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷。根據(jù)本發(fā)明第六方面任一項的藥物組合物，其中包含治療和/或預防有效量的白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃芩素、和二氫查耳酮3-0-(3-D-葡萄糖苷，以及任選的藥學可接受的賦形劑。根據(jù)本發(fā)明第六方面任一項的藥物組合物，其中包含治療和/或預防有效量的白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、；^脂醇二葡萄糖苷、丁香月旨素二葡萄糖苷、杠、脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-0-(i-D-葡萄糖苷，以及任選的藥學可接受的賦形劑下面對本發(fā)明作進一步的詳細說明。本發(fā)明所引述的所有文獻，它們的4^P內(nèi)^it過引用并入本文，并且如果這些文獻所表達的含義與本發(fā)明不一致時，以本發(fā)明的表述為準。此外，本發(fā)明使用的各種術語和短語具有本領域技術人員乂^P的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對這些術語和短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術語和短語如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準。本文中使用的術語"約"，例如在修飾制備產(chǎn)物的產(chǎn)率時，其通常是指本領域允許的誤差范圍，例如±10%，例如±5%，例如±2%。本文中使用的短語"雌激素分泌不足相關的疾病，，具有本領域技術人員公知的含義，并且通常是指雌性哺乳動物例如人特別是更年期的女病或癥狀包括但不限于更年期綜合征、骨質(zhì)疏松癥、退行性骨質(zhì)疏氺〉癥、心腦血管疾病、乳腺癌。盡管本發(fā)明對所涉及的活性成分作了詳細描述，本發(fā)明人仍然愿意在此強調(diào)，這些活性成分(其包括，但不限于，白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃芩素、千葉素A、黃芩素、和二氫查耳酮3-0-P-D-葡萄糖香)具有本領域技術人員已知的化學結構、物理化學性質(zhì)。通itXt杜仲藥材的植化分離，本發(fā)明4氯仿部分分離得到白樺脂酸、漢黃茶素、千葉素A、京尼平、黃茶素，乙酸乙酯部分分離得到京尼平、二氬查爾S同3-0-p-D葡萄糖苷，正丁醇萃取物上D101大孔吸附樹脂30%乙醇洗脫液部位中分離得到桃葉珊瑚苷、丁香脂素二葡萄糖苷和松脂醇二葡萄糖苷，50%乙醇洗脫液部位分離得到松脂醇單葡萄糖苷和丁香脂素單葡萄糖苷等化發(fā)合物。分離得到的一系列化合物做雌激素受體激活實驗，以雌二醇為陽性對照組，以下化合物均與雌激素受體激活有關，并且活性依次為白樺酯酸、京尼平、爭>脂醇單葡萄糖苷和丁香脂素單葡萄糖苷^^旨醇單葡萄糖苷和丁香脂素單葡萄糖苷、黃酮類成分?？刹捎弥苿╊I域中的常規(guī)技術，將杜仲的單一活性成分或其組合或者含有杜仲中具有雌激素活性成分的杜仲提取物與一種或多種藥學可接受的賦形劑混合，并形成所需的劑型，來制備本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明藥物組合物中使用的"藥學可接受的賦形劑，，可以是藥物制劑領域中任何常規(guī)的賦形劑。特定賦形劑的選擇將取決于用于治療特定患者的給藥方式或疾病類型和狀態(tài)。用于特定給藥模式的合適藥物組合物的制備方法完全在藥物領域技術人員的知識范圍內(nèi)。例如，可以作為藥學可接受的賦形劑包括藥學領域常規(guī)的稀釋劑、載體、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附栽體和潤滑劑等。必要時，還可以在藥物組合物中加入香味劑、防腐劑和餘未劑等。本發(fā)明的藥物組合物可以制成片劑、粉劑、顆粒劑、膠嚢、口服液、膏劑、霜劑、注射乳劑(注射用無菌粉4十)等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規(guī)方法制備。經(jīng)研究表明，本發(fā)明所得到的化^/具有不同程度的扣:^激素作用。因此，可以預期本發(fā)明的所得到的化合物或含有它的藥物組合物可以用于治療更年期綜合征、乳腺癌和/或心腦血管疾病?；蛘?，本發(fā)明所得到的可用于制備藥物，該藥物用于治療更年期綜合征、乳腺癌和/或心腦血管疾病。具體實施例方式下面通過具體的實施例和實驗例進一步說明本發(fā)明，但是，應當理解為，這些實施例和實驗例僅僅是用于更詳細具體地說明之用，而不應理解為用于以任何形式限制本發(fā)明。本發(fā)明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細描述。本領域技術人員清楚，在下文中，如果未特別說明，本發(fā)明所用材料和操作方法是本領域公知的。實施例i、活性成分單體的制備將31.5千克杜仲藥材(購自河南信陽藥材7>司)剪成小塊，加入315升95%乙醇浸泡過夜，回流提取2.5小時，傾出提取液，傾出提取液，藥渣再加入315升60。/。乙醇回流提取2小時，提取液合并后過濾，續(xù)濾液回收乙醇，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別回收溶劑后得固形物。結果石油醚部分固形物153g，氯仿部分固形物384g，乙酸乙酯部分固形物126g，正丁醇部分固形物520g。杜仲氯仿部分350g過皿柱層析后，33~36餾分經(jīng)反復,柱層析后分別得到白樺脂酸和白樺脂醇，43~56餾分經(jīng)聚酰胺柱層析后分別得到漢黃茶素和千葉素A，80~86餾分經(jīng)過^^柱層析和葡聚糖^y^柱層析后得到黃茶素。杜仲乙酸乙酯萃取部分，通過^柱層析，采取氯仿:曱醇溶劑系統(tǒng)梯度、^JL,19~27餾分再利用^柱層析，通it^油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，得到白色粉末狀物質(zhì)，經(jīng)鑒定為京尼平。49~55餾分再通過乙酸乙酯-曱醇、氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)反復^柱層析后，得到黃色粉末狀物質(zhì)，經(jīng)鑒定為二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷。杜仲正丁醇部分500g過D101大孔吸附樹脂后，30%部分得到130g過皿柱層析，40~52餾分經(jīng)it^柱層析和葡M皿柱層析后得到桃葉珊瑚苷，61~66餾分經(jīng)過硅膠柱層析后得到松脂醇二葡萄糖苷，7080餾分經(jīng)過皿柱層析后得到丁香脂素二葡萄糖苷。50。/。乙醇7jc溶劑洗脫部分，經(jīng)it^柱層析，乙酸乙酯-甲醇溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，23~27餾分再利用乙酸乙酯:曱醇:水、氯仿:甲醇溶劑系統(tǒng)進行反復皿柱層析并結合皿柱層析后，得到黃色粉末狀物質(zhì)，經(jīng)鑒定為松脂醇單葡萄糖苷。29~35餾分再通過氯仿:甲醇:1120溶劑系統(tǒng)進行,柱層析并結合^柱層析和反相柱層析后，得到白色片狀物質(zhì)，經(jīng)鑒定為丁丁香脂素單葡萄糖苷。實施例2、活性成分的結構確證對實施例l獲得的ll個化合物(即，白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、爭>脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、+>脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-O-P-D-葡萄糖苷)進行了結構確認(委托天津大學分析測試中心檢測，500MHz核磁)。分析結果顯示這些化合物的結構與文獻報道的結構一致，具體如下。白樺脂酸，白色針晶。1H-NMR(C5D5N，500MHz):S4.90(1H，s，H陽29a)，4.72(1H，s，H國29b),3.49(1H,m，H畫3)，1.74(3H，s,H-30)，1.18(3H,s，H-26)，1.02(3H，s，H-27)，1.01(3H，s，H國23)，0.96(3H，s，H畫25)，0.77(3H，s，H-24)。白樺脂醇，白色粉末。力-NMR(CDC13，500MHz):S4.68，4.58(2H，dd，J=11.5，4.5Hz，H-29)，3.80,3.33(2H，dd，J=11.5，4.5Hz，H-28),2.38(1H，m，H國19)，1.68(3H，s，H-30)，1.02(3H，s，H-26),0.98(3H,s，H-27)，0.97(3H,s，H-23),0.85(3H，s，H誦25)，0.76(3H,s,H誦24)。漢黃茶素，黃色粉末。iH-NMR(DMSO-d6，500MHz):812.50(s)，8.05(2H，m，H畫2'，6')，7.60(3H，m，H國3',4'，5')，6.99(1H，s，H畫6)，6.30(1H，s，H-3)，3.84(3H，s)。千葉素A,淡黃色粉末。！H-NMR(DMSO-d6，500MHz):812.92(s)，10.82(s)，8.06(2H，m，H-2'，6')，7.56(3H，m,H-3'，4'，5'),6.97(1H，s，H國8)，6.63(1H，s，H國3)，3.74(3H，s)。黃茶素，橙黃色粉末。iH畫NMR(DMSO-d6，500MHz):612.65(s)，10.57(s)，8.81(s)，8.05(2H，m，H-2'，6')，7.56(3H，m,H-3'，4'，5')，6.92(1H，s，H-8),6.61(1H，s，H-3)。京尼平，白色粉末。力隱NMR(CD30D，500MHz):64.18(lH，d,J=8.0Hz,H國l)，7.53(1H，s，H-3),3.14(1H，m，H國5),2.83(1H，m，H誦6)，2.03(1H，m，H畫6)，5.83(1H,s，H-7),2.47(1H，t，J=8.5Hz，H誦9),4.25(2H，dd，J=14.5Hz,H隱10)，3.71(3H,s,-OCH3)。二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷，黃色粉末。力-NMR(CD30D，500MHz):67.43(2H，d,J=9.0Hz，H-2，6)，7.14(2H，d,J=9.0Hz，H-3,5)，5.46(1H，dd，J=12.5，13Hz，a-H)，2.73(1H,m，p誦H)，3.04(1H，m,P-H)，6.37(1H，d,J=2.0Hz，H-3')，6.52(1H，dd，J=9.0，2.0Hz,H-5')，7.74(1H，d，J=9.0Hz，H-6')，4.95(1H,d，J=7.0Hz，H畫l"。桃葉珊瑚苷，白色粉末。'H-NMR(DMSO-d6，500MHz):S6.29(1H，dd,J=6.0，1.5Hz,H陽3),5.63(1H,s，H-7)，5.00(1H，dd，J=6.0，4.0Hz，H-4)，4.93(IH，d，J=6.5Hz，H-l)，4.82(IH，d，J=6.5Hz，H國r)，4.47(1H,m，H誦6)，4.12(1H，m，H-10a)，3.94(1H,dd，J=16.0,5.0Hz,H-lOb)，3.64(1H，dd，J=10.5，6.5Hz,H國6'a)，3.40(IH，m,H-6'b)。松脂醇二葡萄糖苷，白色粉末。^-NMR(DMSO-d6,500MHz):67.02(2H，d，J=8.5Hz，H-5，5')，6.94(2H,s，H-2，2')，6.84(2H,d,J=8.5Hz,H-6，6')，4.86(2H,d，J=7.0Hz，H-l〃，1〃')，4.66(2H，d,，dd，J=9.0，7.0Hz,H騰9,9')，3.75(6H，s)，3.04(2H，brs，H誦8，8')。丁香脂素二葡萄糖苷，白色粉末。iH-NMR(DMSO-d6,500MHz):66.65(4H，s，H-2,6，2',6')，4.89(2H，d，J=5.5Hz，H-l〃，r〃)，4.65(2H,d,J=3.5Hz,H-7，7')，4.19(2H,t，H-9a，9a'),3.81(2H，dd，J=9.0，3.0Hz，H-9b,9b')，3.58(2H，dd，J=11，5.5Hz，H誦6a〃,6a'〃)，3.39(2H，m，H國6b〃，6b'〃)，3.75(12H，s)，3.09(2H，brs,H-8，8')。松脂醇單葡萄糖苷，淡黃色粉末。iH-NMR(DMSO-d6，500MHz):S3.03(2H,m，H-8，8,),4.66(2H,d，J=4.0Hz,H誦7，7,),3.73(2H,m，H-9a，9b),4.13(2H,m，H誦9a',9b'),6.88(1H，s,H國2'),6.94(1H，s,H國2)，6.75(1H，d，J=8.0Hz，H-5'),6.85(1H,d，J=8.5Hz,H-5),6.72(1H，d,J=8.0Hz,H-6,)，7.04(1H,d，J=8.0Hz,H畫6)，3.74-3.75(6H，ss，-OCH3),4.87(1H，d,J=7.5Hz,H謙l，，)。丁香脂素單葡萄糖苷，白色片狀。tH-NMR(DMSO-d6,500MHz):83.08(1H,m，H-8)，3.06(1H，m，H誦8,),4.19(1H，m，H-9a)，3.79(1H，m,H-9b)，.4.17(1H，m,H-9a，)，3.79(1H,m,H-9b,)，4.66(1H,d，J=4.5Hz,H畫7)，4.61(1H，d，J=4.5Hz,H-7'),6.64(2H，s，H國2,6)，6.59(2H,s，H-2，，6，),3.75-3.76(6H，ss,-OCH3),4.88(1H，m，J=7.0Hz，H國l〃)。實施例3、本發(fā)明化合物對雌激素受體的激活作用采用細胞轉染的方法^見察白樺脂酸、京尼平、杉匕葉珊瑚苷、；^脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-0爺D-葡萄糖苷對雌激素受體的選擇性激活。實際上，雌激素正是通過調(diào)節(jié)雌激素反應基因轉錄來顯示其生物活性。將帶有報告基因的ERa或ERpDNA片段分別轉染于無ER表達的Hela細胞，在細胞培養(yǎng)液中加入被測物后，通it^報告基因轉錄激活的檢測觀察被測物是否可通過ERa或ERp發(fā),激素樣作用。白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃芩素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷樣品液的配制分別精密稱取白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、+〉脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷相應質(zhì)量后加入DMSO溶解，對應得補骨脂酚樣品液高劑量組(lnM)，稀釋一定倍數(shù)分別得到中劑量組(O.lfiM)和低劑量組(O.OljiM)。在37。C，5。/。C02的條件下，在細胞培養(yǎng)箱中使用含有10%小牛血清的無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)Hela細胞，至細胞密度90%左右時將細胞按60%密度鋪于96孑U1中，每孔中加入含10。/。血清的無酚紅DMEM培養(yǎng)液150ul，培養(yǎng)過夜。按96孑U1每孔100ul無血清DMEM培養(yǎng)基，0.4嗎質(zhì)粒(ptk-ERE-luc2照，tk畫Renilalfig,ERa或E邵l照)進行轉染。轉染6個小時后，每孑L加入150ul無血清無酚紅DMEM培養(yǎng)液。選取每組三個孔，加入10-8M雌二醇E2，以及不同濃度的受試物15uI/孔(樣品高、中、低三個濃度組)，37°C，5%0)2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24小時。24小時后每孑L加入80nl細胞裂解液，并凍融細胞一次以使其充分裂解。對每孔的細胞裂解液分別測定其對螢火蟲螢光素酶及Renila螢光素酶的活性。每孔均用螢火蟲螢光素酶/Renila螢光素^作為結果，分別以各組中未加雌激素處理的孑L作為對照，計算加雌激素或被測物組相對于對照組的比值，每組三個孑U^平均值。結果見表l:表l:補骨脂酚和本發(fā)明藥物組合物對雌激素受體的激活作用<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>研究結果顯示，本發(fā)明化合物可濃度依賴性地激活雌激素受體，陽)可i^J，J相似的效果。雌激素主要通過雌激素受體(ER)發(fā)揮其效應。研究已證實ER廣泛存在于心血管系統(tǒng)、成骨細胞、破骨細胞、乳腺及生殖系統(tǒng)等，雌激素對此有著廣泛的治療作用，而植物雌激素是一種天然的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，其4幾構與功能與雌激素相似，能與雌激素受體結合，具有雌激素樣的生物活性。我們研究證實杜仲中多成分能夠與ER結合，提高其轉錄活性，證實其具有雌激素樣作用。也就預示著杜仲中白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷可以用于更年期綜合征、骨質(zhì)疏松癥、退行性骨質(zhì)疏+>癥、心腦血管疾病、乳腺癌。本發(fā)明不僅^;限于以上實施例，本領域技術人員也可以根據(jù)本發(fā)明的精神和范圍獲得本發(fā)明的其它變型實施方案中，而不會脫離本發(fā)明的精神和范圍。權利要求1、杜仲提取物在制備用于治療和/或預防與哺乳動物(特別是人)雌激素分泌不足相關的疾病的藥物中的用途。2、根據(jù)權利要求i的用途，其中所述的雌激素分泌不;U目關的疾病選自更年期綜合征、骨質(zhì)疏松癥、退行性骨質(zhì)疏松癥、心腦血管疾病、乳腺癌。3、根據(jù)權利要求l的用途，其中所述的杜仲提取物中包含至少一種選自以下的成分白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、木>脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、術>脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃芩素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷；優(yōu)選包含4^上述各成分。4、根據(jù)權利要求3的用途，其中所述白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、；^脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、木>脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃芩素、和二氫查耳酮3-0-P-D-葡萄糖苷的總量占所述提取物總重量的10-90。/。(w/w，即重量百分數(shù)，下同)，優(yōu)選2080。/o(w/w)，更優(yōu)選3060。/o(w/w)。5、選自下列成分的一種或多種的組合在制備用于治療和/或預防與哺乳動物(特別是人)雌激素分泌不足相關的疾病的藥物中的用途白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松月旨醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷；優(yōu)選包含全部京尼平、+>脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷和桃葉珊瑚苷。6、根據(jù)權利要求5的用途，其中所述的雌激素分泌不;M目關的疾病選自更年期綜合征、骨質(zhì)疏松癥、退行性骨質(zhì)疏+〉癥、心腦血管疾病、乳腺癌。7、根據(jù)權利要求5或6的用途，其中下列成分的一種或多種的組合是^M土仲中提取得到的白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖香、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃茶素、和二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷。8、一種用于治療和/或預防與哺乳動物(特別是人)雌激素分泌不足相關的疾病的藥物組合物，其中包含治療和/或預防有效量的杜仲提取物以及任選的藥學可接受的賦形劑。9、根據(jù)權利要求8的藥物組合物，其中所述的杜仲提取物中包含至少一種選自以下的成分白樺脂酸、京尼平、杉匕葉珊瑚苷、+>脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、+>脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃芩素、和二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷。10、一種用于治療和/或預防與哺乳動物(特別^:人)雌激素分泌不足相關的疾病的藥物組合物，其中包含治療和/或預防有效量的至少一種藥物活性成分以及任選的藥學可接受的賦形劑，所述的藥物活性成分選自白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、；^脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃茶素、千葉素A、黃芩素、和二氫查耳酮3-0-p-D-葡萄糖苷。全文摘要本發(fā)明公開了杜仲化學成分作為植物雌激素的新用途。具體地說，本發(fā)明涉及杜仲提取物在制備用于治療和/或預防與哺乳動物(特別是人)雌激素分泌不足相關的疾病的藥物中的用途。還涉及選自下列成分的一種或多種的組合在制備用于治療和/或預防與哺乳動物(特別是人)雌激素分泌不足相關的疾病的藥物中的用途白樺脂酸、京尼平、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素單葡萄糖苷、漢黃芩素、千葉素A、黃芩素、和二氫查耳酮3-O-β-D-葡萄糖苷；以及涉及包含杜仲提取物或其中的活性成分的藥物組合物。杜仲提取物以及其中的單體化學成分具有有效的植物雌激素的作用。文檔編號A61K36/46GK101647850SQ20091007036公開日2010年2月17日申請日期2009年9月7日優(yōu)先權日2009年9月7日發(fā)明者劉二偉,樊官偉,濤王,虹王,蘇艷芳,高秀梅申請人:天津中醫(yī)藥大學