本發(fā)明涉及分析化學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域，更具體地講，涉及一種基于代謝組學(xué)手段判別不同耐逆潛力大豆的方法。

背景技術(shù)：
作物野生種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)、篩選是優(yōu)質(zhì)品種選育的基礎(chǔ)，根據(jù)作物育種方向有針對(duì)性地開(kāi)展農(nóng)藝性狀、品質(zhì)性狀的評(píng)價(jià)工作極為重要，合理有效的評(píng)價(jià)方法的采用可大大縮減優(yōu)質(zhì)品種選育的進(jìn)程。以抗田間霉變大豆及耐蔭性優(yōu)質(zhì)大豆品種的選育為例：1)南方夏大豆收獲期正值連陰雨高濕天氣，籽粒霉變嚴(yán)重，產(chǎn)量損失大，危害食品安全，抗田間霉變大豆品種的選育迫在眉睫；田間霉變抗性品種的評(píng)價(jià)、篩選往往要在大田范圍內(nèi)廣泛開(kāi)展，實(shí)施霉變誘導(dǎo)處理后，對(duì)霉變程度進(jìn)行等級(jí)劃分，并測(cè)定多個(gè)農(nóng)藝性狀及品質(zhì)性狀指標(biāo)，綜合上述信息才能達(dá)到大豆抗田間霉變能力評(píng)價(jià)的目的。2)西南華南間套種食用大豆產(chǎn)區(qū)是我國(guó)大豆三大優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)之一，而套作蔭蔽條件下，高稈作物的蔭蔽作用導(dǎo)致大豆?fàn)I養(yǎng)生長(zhǎng)受阻，光合產(chǎn)能不足，品質(zhì)形成受到影響，選育具有耐蔭特性，適合套作蔭蔽環(huán)境的大豆優(yōu)質(zhì)品種是解決這一瓶頸問(wèn)題的突破口之一，而耐蔭型大豆種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)、篩選需要多年的大田品比試驗(yàn)，通過(guò)監(jiān)測(cè)比較凈、套作大豆生長(zhǎng)過(guò)程中多個(gè)生理指標(biāo)、農(nóng)藝性狀的表現(xiàn)，從而達(dá)到耐蔭大豆種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、篩選的目的。上述兩例中，大豆資源評(píng)價(jià)的過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)工費(fèi)力，若評(píng)價(jià)對(duì)象的數(shù)量過(guò)于龐大時(shí)，操作將更加繁瑣；且可能因?yàn)樘厥鈿夂蛟驅(qū)е略u(píng)價(jià)不合理、不真實(shí)，或更難達(dá)到預(yù)期目的，實(shí)踐中亟需一種能夠快速、高效評(píng)價(jià)大豆耐逆潛力的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是基于高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行大豆種子代謝圖譜分析并對(duì)不同耐逆潛力的大豆種子代謝差異進(jìn)行研究和判別，進(jìn)而提供一種基于代謝組學(xué)手段判別不同耐逆潛力大豆的方法。本發(fā)明提供了一種基于代謝組學(xué)手段判別不同耐逆潛力大豆的方法，通過(guò)檢測(cè)大豆種子中多種大豆異黃酮的絕對(duì)含量并篩選出對(duì)大豆的耐逆潛力影響顯著的一種或多種大豆異黃酮，利用所述一種或多種對(duì)大豆的耐逆潛力影響顯著的大豆異黃酮及其絕對(duì)含量對(duì)所述大豆種子的耐逆潛力進(jìn)行判別，獲得具有耐逆潛力的大豆種質(zhì)資源。根據(jù)本發(fā)明基于代謝組學(xué)手段判別不同耐逆潛力大豆的方法的一個(gè)實(shí)施例，當(dāng)待測(cè)大豆種子樣本中的gl型異黃酮的絕對(duì)含量高于0.5mg/g時(shí)，所述待測(cè)大豆種子樣本具有較好的抗田間霉變潛力并且可作為抗霉型重點(diǎn)育種基礎(chǔ)材料加以利用，其中，所述gl型異黃酮包括黃豆黃素GLE、黃豆黃苷GLG、丙二酰黃豆黃苷MGL和乙酰黃豆黃苷AGL；當(dāng)待測(cè)大豆種子樣本中的E型異黃酮苷元的絕對(duì)含量高于90μg/g時(shí)，所述待測(cè)大豆種子樣本具有較好的耐蔭潛力并且可作為耐蔭型重點(diǎn)育種基礎(chǔ)材料加以利用，其中，所述E型異黃酮苷元包括大豆苷元DE、黃豆黃素GLE和染料木素GE。根據(jù)本發(fā)明基于代謝組學(xué)手段判別不同耐逆潛力大豆的方法的一個(gè)實(shí)施例，所述檢測(cè)大豆種子中多種大豆異黃酮的絕對(duì)含量的步驟包括采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)待測(cè)大豆種子樣本中的大豆異黃酮含量進(jìn)行分析并得到大豆異黃酮靶向代謝圖譜的步驟和利用所述大豆異黃酮靶向代謝圖譜計(jì)算得到各種大豆異黃酮的絕對(duì)含量的步驟。根據(jù)本發(fā)明基于代謝組學(xué)手段判別不同耐逆潛力大豆的方法的一個(gè)實(shí)施例，所述采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)待測(cè)大豆種子樣本中的大豆異黃酮含量進(jìn)行分析并得到大豆異黃酮靶向代謝圖譜的步驟包括以下子步驟：a、將待測(cè)大豆種子樣本粉碎后得到豆粉，將所述豆粉儲(chǔ)存于-80～-60℃的環(huán)境下備用；b、取所述豆粉置于真空干燥機(jī)干燥后冷卻至室溫，再稱取豆粉置于帶蓋離心管中，加入甲醇水溶液并控制料液比為40:1～20:1，密封震蕩后進(jìn)行超聲提取，離心后取上清液并將上清液經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣瓶，將所得樣品在-70～-20℃下保存待測(cè)；c、對(duì)樣品進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，獲得所述待測(cè)大豆種子樣本的提取離子流圖，即為所述大豆異黃酮靶向代謝圖譜。根據(jù)本發(fā)明基于代謝組學(xué)手段判別不同耐逆潛力大豆的方法的一個(gè)實(shí)施例，在子步驟c中，高效液相色譜系統(tǒng)的參數(shù)條件包括：采用反相C18色譜柱，其中，流動(dòng)相A為純乙腈，流動(dòng)相B為體積濃度0.1％乙酸水溶液，以A(V/V)：0min15％、0～30min20％、30～60min40％、60～70min40％的梯度洗脫；流速梯度為：0min1.0ml/min、0～30min0.8ml/min、30～60min0.8ml/min、60～70min1.0ml/min；洗脫延遲時(shí)間為5～10min，隨后起始梯度平衡5～10min，流速控制為0.8～1.2ml/min；柱后流出液不經(jīng)分流直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)；質(zhì)譜系統(tǒng)的參數(shù)條件包括：采用電噴霧離子源并采用正離子模式檢測(cè)，其中，使用高純N2輔助噴霧電離與脫溶劑，控制干燥氣流速為10～14L/min，霧化室壓力為30～42psig，干燥器溫度為340～360℃，毛細(xì)管電壓為3200～3800V，質(zhì)量掃描范圍為m/z100～700。根據(jù)本發(fā)明基于代謝組學(xué)手段判別不同耐逆潛力大豆的方法的一個(gè)實(shí)施例，進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)，選定m/z417、m/z447分別進(jìn)行大豆苷DG和黃豆黃苷GLG的采集并分別控制采集時(shí)間為12～20min；選定m/z433、m/z503、m/z533分別進(jìn)行染料木苷GEG、丙二酰大豆苷MD和丙二酰黃豆黃苷MGL的采集并分別控制采集時(shí)間為28～38min；選定m/z459、m/z489、m/z519分別進(jìn)行乙酰大豆苷AD、乙酰黃豆黃苷AGL和丙二酰染料木苷MG的采集并分別控制采集時(shí)間為40～48min)；選定m/z255、m/z475、m/z285分別進(jìn)行大豆苷元DE、乙酰染料木苷AG和黃豆黃素GLE的采集并分別控制采集時(shí)間為48～54min；選定m/z271進(jìn)行染料木素GE的采集并控制采集時(shí)間為60～65min。根據(jù)本發(fā)明基于代謝組學(xué)手段判別不同耐逆潛力大豆的方法的一個(gè)實(shí)施例，所述利用所述大豆異黃酮靶向代謝圖譜計(jì)算得到各種大豆異黃酮的絕對(duì)含量的步驟包括以下子步驟：i、分別精確稱量1.0mg大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)樣品，其中，所述大豆異黃酮包括大豆苷DG、黃豆黃苷GLG、染料木苷GEG、丙二酰大豆苷MD、丙二酰黃豆黃苷MGL、乙酰大豆苷AD、乙酰黃豆黃苷AGL、丙二酰染料木苷MG、大豆苷元DE、乙酰染料木苷AG、黃豆黃素GLE和染料木素GE；ii、將每種大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)樣品分別溶于10～20μLDMSO并以純乙腈定容至10ml，控制溶液中大豆異黃酮的濃度為100μg/ml；平衡20～30min后，以純乙腈分別稀釋為75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、4μg/ml的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述高效液相色譜系統(tǒng)和質(zhì)譜系統(tǒng)的參數(shù)條件由低到高進(jìn)樣，記錄各種大豆異黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；iii、根據(jù)所述大豆異黃酮靶向代謝圖譜中各種大豆異黃酮的峰面積參數(shù)并對(duì)照所述各種大豆異黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸分析，計(jì)算得到各種大豆異黃酮的絕對(duì)含量。根據(jù)本發(fā)明基于代謝組學(xué)手段判別不同耐逆潛力大豆的方法的一個(gè)實(shí)施例，所述篩選出對(duì)大豆的耐逆潛力影響顯著的一種或多種大豆異黃酮的步驟包括以下子步驟：Ⅰ、將檢測(cè)得到的大豆種子中多種大豆異黃酮的絕對(duì)含量形成一個(gè)數(shù)據(jù)矩陣，其中，所述大豆異黃酮包括大豆苷DG、黃豆黃苷GLG、染料木苷GEG、丙二酰大豆苷MD、丙二酰黃豆黃苷MGL、乙酰大豆苷AD、乙酰黃豆黃苷AGL、丙二酰染料木苷MG、大豆苷元DE、乙酰染料木苷AG、黃豆黃素GLE和染料木素GE；Ⅱ、將所述數(shù)據(jù)矩陣中的變量進(jìn)行標(biāo)度化后利用正交偏最小二乘-判別分析方法對(duì)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)大豆種子的代謝指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，根據(jù)模型中的變量重要性因子篩選對(duì)分類有重要貢獻(xiàn)的大豆異黃酮；Ⅲ、對(duì)篩選出的大豆異黃酮進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際檢測(cè)耐逆潛力表型選出含量差異顯著的大豆異黃酮，并將其作為對(duì)大豆的耐逆潛力影響顯著的一種或多種大豆異黃酮。根據(jù)本發(fā)明基于代謝組學(xué)手段判別不同耐逆潛力大豆的方法的一個(gè)實(shí)施例，根據(jù)現(xiàn)有的大豆種子樣本信息將所述對(duì)大豆的耐逆潛力影響顯著的一種或多種大豆異黃酮及其絕對(duì)含量與大豆種子的耐逆潛力建立關(guān)聯(lián)，形成判別標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)本發(fā)明基于代謝組學(xué)手段判別不同耐逆潛力大豆的方法的一個(gè)實(shí)施例，從多個(gè)大豆種子樣本中隨機(jī)抽取一個(gè)或多個(gè)樣品的混合物設(shè)為質(zhì)量控制樣本，在對(duì)大豆種子樣本獲得的樣品進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析的過(guò)程中，每分析5～10個(gè)樣本后，將所述質(zhì)量控制樣本進(jìn)樣一次并通過(guò)保證質(zhì)量控制樣本的提取離子流圖的重復(fù)性來(lái)確保分析過(guò)程中儀器的運(yùn)行穩(wěn)定性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用真實(shí)異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定測(cè)試樣本中大豆異黃酮的絕對(duì)含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線一旦建立，后續(xù)樣本前處理、分析測(cè)試工作均采用標(biāo)準(zhǔn)化程序處理，操作簡(jiǎn)單、誤差小，數(shù)據(jù)可靠。采用基于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)平臺(tái)的代謝組學(xué)研究平臺(tái)，尤其是提取離子模式(SIM)的應(yīng)用，可有效實(shí)現(xiàn)微量大豆異黃酮含量的準(zhǔn)確測(cè)定；新型多元回歸建模方法正交偏最小二乘-判別分析(O2PLS-DA)的應(yīng)用，與傳統(tǒng)方法相比，該方法不僅能去除光譜數(shù)據(jù)中的干擾信號(hào)，而且可以去除濃度數(shù)據(jù)中最大的有效信息，剔除了與樣品成分濃度含量無(wú)關(guān)的主成分，所提取的成分對(duì)濃度數(shù)據(jù)有較大的貢獻(xiàn)率，使得預(yù)測(cè)精度更高。此外，本發(fā)明操作簡(jiǎn)單便捷、結(jié)果準(zhǔn)確可靠且樣品用量少，適合于大量樣本的批量分析，可為大豆代謝特征分析及相關(guān)的代謝組學(xué)研究提供借鑒。附圖說(shuō)明圖1示出了利用大豆種子樣本的提取物獲得的典型大豆異黃酮靶向代謝圖譜。圖2A示出了示例1中針對(duì)9種大豆種子樣本構(gòu)建得到的模型的得分矩陣圖，其中，○為高度感菌大豆，■為中度感菌大豆，Δ為高抗菌大豆；每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)樣品，t表示樣本在主成分投影值。圖2B示出了示例1中針對(duì)9種大豆種子樣本構(gòu)建得到的模型的載荷矩陣圖。圖3A示出了示例2中針對(duì)8種大豆種子樣本構(gòu)建得到的模型的得分矩陣圖，其中，○為強(qiáng)耐蔭大豆，■為弱耐蔭大豆，Δ為中度耐蔭大豆；每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)樣品，t表示樣本在主成分投影值。圖3B示出了示例2中針對(duì)8種大豆種子樣本構(gòu)建得到的模型的載荷矩陣圖。具體實(shí)施方式本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的所有特征，或公開(kāi)的所有方法或過(guò)程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。本說(shuō)明書(shū)(包括任何附加權(quán)利要求、摘要和附圖)中公開(kāi)的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類似目的的替代特征加以替換。即，除非特別敘述，每個(gè)特征只是一系列等效或類似特征中的一個(gè)例子而已。下面將對(duì)本發(fā)明基于代謝組學(xué)手段判別不同耐逆潛力大豆的方法進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。總體地講，本發(fā)明是一種基于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行大豆種子代謝圖譜分析，然后用多變量統(tǒng)計(jì)方法區(qū)分不同抗逆性大豆數(shù)據(jù)并發(fā)現(xiàn)對(duì)代謝表型差異有重要貢獻(xiàn)的化合物，從而對(duì)不同抗逆性大豆種子代謝差異進(jìn)行研究的方法。該方法具有操作簡(jiǎn)單快速、結(jié)果可靠的優(yōu)點(diǎn)，可以為具有抗逆潛力的優(yōu)質(zhì)大豆種質(zhì)資源的判定、篩選提供參考，并為大豆抗逆性機(jī)理的深入研究提供依據(jù)。大豆異黃酮是大豆中含有的重要次生代謝產(chǎn)物，其除了具有抗癌、改善骨質(zhì)疏松、改善婦女更年期癥狀、防止心血管疾病、防止脂質(zhì)過(guò)氧化、預(yù)防糖尿病等多種生物活性以外，還在多種豆科植物抵抗逆境過(guò)程中發(fā)揮著重要的生態(tài)作用，如避免紫外輻射的傷害，抵抗植物病原微生物的侵襲，對(duì)草食性昆蟲(chóng)具有毒害作用和趨避作用，緩解鹽漬環(huán)境脅迫，誘導(dǎo)根瘤菌結(jié)瘤基因等重要生理抗性物質(zhì)。大豆異黃酮無(wú)疑在植物生理耐逆抗性中起到了重要作用。大豆主要含有12種異黃酮，按照異黃酮衍生化類型，可分為異黃酮苷元(E型)：大豆苷元(DE)、黃豆黃素(GLE)、染料木素(GE)；異黃酮葡萄糖苷(G型)：大豆苷(DG)、染料木苷(GEG)、黃豆黃苷(GLG))；乙酰異黃酮苷(A型)：乙酰大豆苷(AD)、乙酰染料木苷(AG)、乙酰黃豆黃苷(AGL)；丙二?；慄S酮苷(M型)：丙二酰大豆苷(MD)、丙二酰染料木苷(MG)、丙二酰黃豆黃苷(MGL)。按照異黃酮的基本結(jié)構(gòu)骨架，也可分為d型(DE、DG、AD、MD)；gl型(GLE、GLG、AGL、MGL)；g型(GE、GEG、AG、MG)。其中以丙二?；慄S酮苷(MD、MG、MGL)和異黃酮葡萄糖苷(DG、GEG、GLG)的含量最高，但不同化學(xué)結(jié)構(gòu)異黃酮的生理活性不同，黃酮母核、取代基、取代模式及數(shù)目都可能會(huì)對(duì)其活性產(chǎn)生影響。已有研究表明，天然黃酮類分子中的α、β不飽和吡喃酮是發(fā)揮各種生物活性的關(guān)鍵，C環(huán)C-2，3位雙鍵氫化及糖苷化均易導(dǎo)致其活性降低，絕大多數(shù)黃酮苷的活性低于其苷元；一般情況下母核上的羥基取代程度越大，活性越強(qiáng)，鄰位羥基取代往往對(duì)活性有利。根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例，所述基于代謝組學(xué)手段判別不同耐逆潛力大豆的方法是通過(guò)檢測(cè)大豆種子中多種大豆異黃酮的絕對(duì)含量并篩選出對(duì)大豆的耐逆潛力影響顯著的一種或多種大豆異黃酮，利用所述一種或多種對(duì)大豆的耐逆潛力影響顯著的大豆異黃酮及其絕對(duì)含量對(duì)所述大豆種子的耐逆潛力進(jìn)行判別，獲得具有耐逆潛力的大豆種質(zhì)資源。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，當(dāng)待測(cè)大豆種子樣本中的gl型異黃酮的絕對(duì)含量高于0.5mg/g時(shí)，所述待測(cè)大豆種子樣本具有較好的抗田間霉變潛力并且可作為抗霉型重點(diǎn)育種基礎(chǔ)材料加以利用，其中，所述gl型異黃酮包括黃豆黃素GLE、黃豆黃苷GLG、丙二酰黃豆黃苷MGL和乙酰黃豆黃苷AGL；當(dāng)待測(cè)大豆種子樣本中的E型異黃酮苷元的絕對(duì)含量高于90μg/g時(shí)，所述待測(cè)大豆種子樣本具有較好的耐蔭潛力并且可作為耐蔭型重點(diǎn)育種基礎(chǔ)材料加以利用，其中，所述E型異黃酮苷元包括大豆苷元DE、黃豆黃素GLE和染料木素GE。但是，本發(fā)明中不限于根據(jù)待測(cè)大豆種子樣本中g(shù)l型異黃酮的絕對(duì)含量判別其抗田間霉變潛力，也不限于根據(jù)大豆種子樣本中E型異黃酮苷元的絕對(duì)含量判別大豆耐蔭潛力。凡利用本發(fā)明所述方法并以其他異黃酮的絕對(duì)含量判別大豆其他耐逆性的方法均屬本發(fā)明權(quán)利保護(hù)之范圍。下面先對(duì)本發(fā)明檢測(cè)大豆種子中多種大豆異黃酮的絕對(duì)含量的具體步驟進(jìn)行說(shuō)明。根據(jù)本發(fā)明，所述檢測(cè)大豆種子中多種大豆異黃酮的絕對(duì)含量的步驟包括采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)待測(cè)大豆種子樣本中的大豆異黃酮含量進(jìn)行分析并得到大豆異黃酮靶向代謝圖譜的步驟和利用所述大豆異黃酮靶向代謝圖譜計(jì)算得到各種大豆異黃酮的絕對(duì)含量的步驟。獲取植物代謝圖譜所涉及的方法種類繁多，主要采用色譜方法分離特征成分，采用UV、IR、NMR、MS等光譜方法鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，主要方法有GC-MS、HPLC-MS、NMR等。植物代謝圖譜形象地反映了物種具有遺傳特性的代謝物群體的“整體確定性(共有特征)”，而地域、生長(zhǎng)環(huán)境、采收等多種不定因素對(duì)植物代謝存在重要影響，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)中多元隨機(jī)分布的“模糊性(非共有特征)”。利用模糊數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)建立同時(shí)反映此兩種特征的方法，并基于化學(xué)計(jì)量學(xué)、數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)等方法，可實(shí)現(xiàn)植物系統(tǒng)、科學(xué)、客觀的有效評(píng)價(jià)，進(jìn)而判別種質(zhì)資源的優(yōu)劣。本發(fā)明主要是采用基于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)平臺(tái)的代謝組學(xué)研究平臺(tái)，尤其是提取離子模式(SIM)的應(yīng)用，有效實(shí)現(xiàn)了微量異黃酮含量的準(zhǔn)確測(cè)定，并通過(guò)獲取大豆異黃酮靶向代謝圖譜來(lái)計(jì)算得到各種大豆異黃酮的絕對(duì)含量。其中，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)待測(cè)大豆種子樣本中的大豆異黃酮含量進(jìn)行分析并得到大豆異黃酮靶向代謝圖譜的步驟包括以下子步驟：a、將待測(cè)大豆種子樣本粉碎后得到豆粉，將豆粉儲(chǔ)存于-80～-60℃的環(huán)境下備用。其中，優(yōu)選地將豆粉過(guò)60目篩以獲得更細(xì)的粉末，有利于后續(xù)的分析和處理。b、取豆粉置于真空干燥機(jī)干燥后冷卻至室溫，再稱取豆粉置于帶蓋離心管中，加入甲醇水溶液并控制料液比為40:1～20:1，密封震蕩后進(jìn)行超聲提取，離心后取上清液并將上清液經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣瓶，將所得樣品在-70～-20℃下保存待測(cè)。其中，優(yōu)選地選擇甲醇體積濃度為80％的甲醇水溶液。c、對(duì)樣品進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，獲得待測(cè)大豆種子樣本的提取離子流圖，即為大豆異黃酮靶向代謝圖譜。在子步驟c中，高效液相色譜系統(tǒng)的參數(shù)條件包括：采用反相C18色譜柱，其中，流動(dòng)相A為純乙腈，流動(dòng)相B為體積濃度0.1％乙酸水溶液，以A(V/V)：0min15％、0～30min20％、30～60min40％、60～70min40％的梯度洗脫；流速梯度為：0min1.0ml/min、0～30min0.8ml/min、30～60min0.8ml/min、60～70min1.0ml/min；洗脫延遲時(shí)間為5～10min，隨后起始梯度平衡5～10min，流速控制為0.8～1.2ml/min；柱后流出液不經(jīng)分流直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。其中，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B混合使用并進(jìn)行洗脫，并且在不同的階段采用不同的混合比例，例如，在0min時(shí)，采用15％的流動(dòng)相A和85％的流動(dòng)相B；在0～30min內(nèi)，采用20％的流動(dòng)相A和80％的流動(dòng)相B，以此類推，其中，二者的配比均為體積比。質(zhì)譜系統(tǒng)的參數(shù)條件包括：采用電噴霧離子源并采用正離子模式檢測(cè)，其中，使用高純N2輔助噴霧電離與脫溶劑，控制干燥氣流速為10～14L/min，霧化室壓力為30～42psig，干燥器溫度為340～360℃，毛細(xì)管電壓為3200～3800V，質(zhì)量掃描范圍為m/z100～700。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)，選定m/z417、m/z447分別進(jìn)行大豆苷DG和黃豆黃苷GLG的采集并分別控制采集時(shí)間為12～20min；選定m/z433、m/z503、m/z533分別進(jìn)行染料木苷GEG、丙二酰大豆苷MD和丙二酰黃豆黃苷MGL的采集并分別控制采集時(shí)間為28～38min；選定m/z459、m/z489、m/z519分別進(jìn)行乙酰大豆苷AD、乙酰黃豆黃苷AGL和丙二酰染料木苷MG的采集并分別控制采集時(shí)間為40～48min；選定m/z255、m/z475、m/z285分別進(jìn)行大豆苷元DE、乙酰染料木苷AG和黃豆黃素GLE的采集并分別控制采集時(shí)間為48～54min；選定m/z271進(jìn)行染料木素GE的采集并控制采集時(shí)間為60～65min。之后，即可獲得被分析樣本的提取離子流圖，即大豆異黃酮靶向代謝圖譜。根據(jù)本發(fā)明，利用所獲得的大豆異黃酮靶向代謝圖譜計(jì)算得到各種大豆異黃酮的絕對(duì)含量的步驟實(shí)際上是靶向代謝物的定量分析步驟，其包括以下子步驟：i、分別精確稱量1.0mg大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)樣品，其中，所述大豆異黃酮包括大豆苷DG、黃豆黃苷GLG、染料木苷GEG、丙二酰大豆苷MD、丙二酰黃豆黃苷MGL、乙酰大豆苷AD、乙酰黃豆黃苷AGL、丙二酰染料木苷MG、大豆苷元DE、乙酰染料木苷AG、黃豆黃素GLE和染料木素GE；ii、將每種大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)樣品分別溶于10～20μLDMSO并以純乙腈定容至10ml，控制溶液中大豆異黃酮的濃度為100μg/ml；平衡20～30min后，以純乙腈分別稀釋為75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、4μg/ml的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述高效液相色譜系統(tǒng)和質(zhì)譜系統(tǒng)的參數(shù)條件由低到高進(jìn)樣，記錄各種大豆異黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；iii、根據(jù)所述大豆異黃酮靶向代謝圖譜中各種大豆異黃酮的峰面積參數(shù)并對(duì)照所述各種大豆異黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸分析，計(jì)算得到各種大豆異黃酮的絕對(duì)含量。優(yōu)選地，從多個(gè)大豆種子樣本中隨機(jī)抽取一個(gè)或多個(gè)樣品的混合物設(shè)為質(zhì)量控制樣本，在對(duì)大豆種子樣本獲得的樣品進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析的過(guò)程中，每分析5～10個(gè)樣本后，將所述質(zhì)量控制樣本進(jìn)樣一次并通過(guò)保證質(zhì)量控制樣本的提取離子流圖的重復(fù)性來(lái)確保分析過(guò)程中儀器的運(yùn)行穩(wěn)定性。在獲得大豆種子樣本中各種大豆異黃酮的絕對(duì)含量之后，需對(duì)其進(jìn)行分析和識(shí)別，從而篩選出對(duì)大豆的耐逆潛力影響顯著的一種或多種大豆異黃酮，并利用該一種或多種對(duì)大豆的耐逆潛力影響顯著的大豆異黃酮及其絕對(duì)含量對(duì)大豆種子的耐逆潛力進(jìn)行判別，獲得具有耐逆潛力的大豆種質(zhì)資源。接下來(lái)，對(duì)篩選出對(duì)大豆的耐逆潛力影響顯著的一種或多種大豆異黃酮的具體步驟進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)是根據(jù)物質(zhì)所含化學(xué)成分信息，用計(jì)算機(jī)對(duì)其進(jìn)行分類或描述，其能夠較好地迎合代謝圖譜整體性和模糊性的要求，分為非監(jiān)督方法和監(jiān)督方法兩類。非監(jiān)督方法針對(duì)那些不利用或沒(méi)有樣本所屬類別信息的情況，它將復(fù)雜的數(shù)據(jù)降低到一個(gè)低維空間，以分類圖的形式顯示出來(lái)，從而使肉眼能夠進(jìn)行系統(tǒng)分析。常用的非監(jiān)督方法主要方法包括：主成分分析(PCA)和系統(tǒng)聚類分析(HCA)兩類。監(jiān)督方法的基本思路是用一組已知類別的樣本作為訓(xùn)練集，即用已知的樣本進(jìn)行訓(xùn)練，并由這個(gè)訓(xùn)練集得到判別模型，再去識(shí)別未知樣本。常用的監(jiān)督方法包括：簇類獨(dú)立軟模式分類法(SIMCA)、偏最小二乘法(PLS)、K鄰域判別法(KNN)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(NN)、線性判別分析(LDA)。正交偏最小二乘-判別分析(OPLS-DA)是新發(fā)展起來(lái)的數(shù)據(jù)分析方法，可以將正交信號(hào)校正方法(OSC)與偏最小二乘法(PLS)結(jié)合并對(duì)PLS進(jìn)行修正，在代謝組學(xué)研究中其判別能力優(yōu)于主成分分析法。本發(fā)明主要利用了正交偏最小二乘-判別分析(OPLS-DA)進(jìn)行分析并實(shí)現(xiàn)多元回歸建模，不僅能夠去除光譜數(shù)據(jù)中的干擾信號(hào)，而且可以去除濃度數(shù)據(jù)中最大的有效信息，剔除與樣品成分濃度含量無(wú)關(guān)的主成分，所提取的成分對(duì)濃度數(shù)據(jù)有較大的貢獻(xiàn)率，使得預(yù)測(cè)精度更高。根據(jù)本發(fā)明，所述篩選出對(duì)大豆的耐逆潛力影響顯著的一種或多種大豆異黃酮的步驟包括以下子步驟：Ⅰ、將檢測(cè)得到的大豆種子中多種大豆異黃酮的絕對(duì)含量形成一個(gè)數(shù)據(jù)矩陣，其中，所述大豆異黃酮包括大豆苷DG、黃豆黃苷GLG、染料木苷GEG、丙二酰大豆苷MD、丙二酰黃豆黃苷MGL、乙酰大豆苷AD、乙酰黃豆黃苷AGL、丙二酰染料木苷MG、大豆苷元DE、乙酰染料木苷AG、黃豆黃素GLE和染料木素GE；Ⅱ、將所述數(shù)據(jù)矩陣中的變量進(jìn)行標(biāo)度化后利用正交偏最小二乘-判別分析方法對(duì)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)大豆種子的代謝指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，根據(jù)模型中的變量重要性因子篩選對(duì)分類有重要貢獻(xiàn)的大豆異黃酮，這些代謝物可被認(rèn)為是在具有不同抗逆潛力大豆種質(zhì)資源分類中起重要作用的化合物。Ⅲ、對(duì)篩選出的大豆異黃酮進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際檢測(cè)耐逆潛力表型選出含量差異顯著的大豆異黃酮，并將其作為對(duì)大豆的耐逆潛力影響顯著的一種或多種大豆異黃酮。更優(yōu)選地，在獲取對(duì)大豆的耐逆潛力影響顯著的一種或多種大豆異黃酮之后，可以根據(jù)現(xiàn)有的大豆種子樣本信息將所述對(duì)大豆的耐逆潛力影響顯著的一種或多種大豆異黃酮及其絕對(duì)含量與大豆種子的耐逆潛力建立關(guān)聯(lián)，形成判別標(biāo)準(zhǔn)，由此可以根據(jù)大豆種子樣本中相應(yīng)大豆異黃酮及其絕對(duì)含量來(lái)快速、高效地評(píng)價(jià)大豆的不同耐逆潛力。下面結(jié)合示例對(duì)本發(fā)明的基于代謝組學(xué)手段判別不同耐逆潛力大豆的方法作進(jìn)一步說(shuō)明。示例1：本示例待測(cè)大豆樣本包括四川、重慶、廣西等西南地區(qū)搜集得到的9個(gè)大豆種質(zhì)資源，包括野生資源和西南大豆生產(chǎn)中常用的典型品種及未審定的育種中間材料，大豆種子樣本信息如表1所示。表1示例1中9種不同抗田間霉菌特性大豆的材料信息首先，將各樣本采集后進(jìn)行粉碎并過(guò)60目篩，再將所得豆粉儲(chǔ)存于-80℃的超低溫冰箱中備用。其次，各樣本的豆粉分析步驟如下：1)準(zhǔn)確稱量200.0mg豆粉，置于10mL的帶蓋離心管中，加入體積濃度為80％的甲醇水溶液5mL(控制料液比為40:1)；密封后置于漩渦振蕩器中震蕩10s，再于40℃下超聲(40KHz，300w)提取3小時(shí)，11000×g離心10min，取上清液約1.5mL并過(guò)0.22μm濾膜(有機(jī)相針式濾頭)至2mL進(jìn)樣瓶，置于-20℃的環(huán)境下保存待測(cè)。2)高效液相色譜HPLC-MS(AgilentQuadrupoleLC/MS6120)的具體參數(shù)條件：色譜柱YMC-packODS-AQ(4.6×250mm，S-5μm,12nm)，流動(dòng)相A為100％的純乙腈，流動(dòng)相B為體積濃度為0.1％的乙酸水溶液，以A(V/V)：0min15％、0～30min20％、30～60min40％、60～70min40％梯度洗脫；流速梯度：0min1.0ml/min、0～30min0.8ml/min、30～60min0.8ml/min、60～70min1.0ml/min；洗脫延遲時(shí)間5min，隨后起始梯度平衡5min，流速1.0ml/min；柱后流出液不經(jīng)分流直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)。質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源(ESI)，采用正離子模式檢測(cè)；使用高純N2輔助噴霧電離與脫溶劑，干燥氣流速為10L/min，霧化室壓力為35psig，干燥器溫度為350℃，毛細(xì)管電壓為3800V，質(zhì)量掃描范圍m/z為100～700。選定m/z417、m/z447分別進(jìn)行大豆苷DG和黃豆黃苷GLG的采集并分別控制采集時(shí)間分別為17.7min和19.6min；選定m/z433、m/z503、m/z533分別進(jìn)行染料木苷GEG、丙二酰大豆苷MD和丙二酰黃豆黃苷MGL的采集并分別控制采集時(shí)間為32.9min、36.2min和37.7min；選定m/z459、m/z489、m/z519分別進(jìn)行乙酰大豆苷AD、乙酰黃豆黃苷AGL和丙二酰染料木苷MG的采集并分別控制采集時(shí)間為43.6min、44.9min和46.9min；選定m/z255、m/z475、m/z285分別進(jìn)行大豆苷元DE、乙酰染料木苷AG和黃豆黃素GLE的采集并分別控制采集時(shí)間為51.6min、52.3min和53.0min；選定m/z271進(jìn)行染料木素GE的采集并控制采集時(shí)間為62.9min，繼而獲得被分析樣本的提取離子流圖，即為大豆異黃酮靶向代謝圖譜。其中，典型的大豆異黃酮靶向代謝圖譜如圖1所示，其中有十二個(gè)峰，分別代表十二種大豆異黃酮，可以根據(jù)峰的面積統(tǒng)計(jì)得到每種大豆異黃酮的絕對(duì)含量。但是，由于本示例中大豆種子樣本的數(shù)量較多，在此不一一進(jìn)行圖示展示。3)靶向代謝物定量分析：分別精確稱量1.0mg大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品，溶于20μLDMSO，以色譜純乙腈定容至10ml(C＝100μg/ml)；平衡20min后，以色譜純乙腈稀釋為75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、4μg/ml濃度的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液；按上述色譜、質(zhì)譜條件由低到高進(jìn)樣，記錄各種大豆異黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，根據(jù)各大豆種子樣本對(duì)應(yīng)的大豆異黃酮靶向代謝圖譜中各種大豆異黃酮的峰面積參數(shù)并對(duì)照各種大豆異黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸分析，計(jì)算得到各種大豆異黃酮的絕對(duì)含量。4)分別采集獲得9個(gè)大豆樣本的12種異黃酮含量數(shù)據(jù)，，形成一個(gè)9×12的數(shù)據(jù)矩陣，將數(shù)據(jù)矩陣中的變量進(jìn)行標(biāo)度化后導(dǎo)入SIMCA-P軟件(V13.0，UmetricsAB，Umea，Sweden)，利用正交偏最小二乘-判別分析(O2PLS-DA)方法對(duì)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行模式識(shí)別多變量分析，所建模型具有2個(gè)主成分，根據(jù)每個(gè)樣本在主成分上的投影，得到得分矩陣圖，具體如圖2A所示。從圖2A可知，3種高感菌大豆、5種中度感菌大豆和4種高抗性大豆樣本的投影在得分矩陣圖上可以得到很好的分離，這表明不同霉變抗性的大豆之間存在明顯的區(qū)別。之后，再根據(jù)每個(gè)變量在主成分上的投影，得到載荷矩陣圖，具體如圖2B所示。其中，與得分矩陣圖對(duì)應(yīng)的載荷矩陣圖反映出導(dǎo)致樣本對(duì)組間分開(kāi)作出了貢獻(xiàn)的差異代謝物，從圖2B可知，化合物DE、GLE、GLG、AGL、MGL離中心點(diǎn)較遠(yuǎn)，其對(duì)區(qū)分樣本所做貢獻(xiàn)較大。將上述5個(gè)化合物在典型的高感材料(D15、E60、E70、A13)與高抗材料(A3、D49、2162、C103)的變量信息導(dǎo)入到SPSS，兩者間做樣本t檢驗(yàn)，通過(guò)t檢驗(yàn)的變量(p<0.05)認(rèn)為是對(duì)不同抗逆潛力大豆種質(zhì)資源的代謝有顯著性差異的化合物，并結(jié)合各大豆籽粒實(shí)際霉變指數(shù)(如表1所示)，對(duì)上述判別分類進(jìn)行驗(yàn)證，可發(fā)現(xiàn)gl型異黃酮(GLE、GLG、AGL、MGL)含量高的大豆確實(shí)具有更大的抗霉變潛力。當(dāng)某大豆材料的gl型異黃酮含量高于0.5mg/g時(shí)，其具有較好的抗田間霉變潛力，可作為抗霉型重點(diǎn)育種基礎(chǔ)材料加以利用。表2示例1中9種不同抗田間霉菌特性大豆的12種異黃酮含量信息示例2：本示例待測(cè)大豆樣本均來(lái)源于四川各地，包括6份地方野生種質(zhì)資源，1個(gè)生產(chǎn)常用栽培品種(南豆12)，1個(gè)栽培品種(貢選5號(hào))的田間雜株，大豆種子樣本信息如表3所示。表3示例2中8種不同耐蔭特性大豆的材料信息首先，將各樣本采集后進(jìn)行粉碎并過(guò)60目篩，再將所得豆粉儲(chǔ)存于-60℃的超低溫冰箱中備用。其次，各樣本的豆粉分析步驟如下：1)準(zhǔn)確稱量200.0mg豆粉，置于10mL的帶蓋離心管中，加入體積濃度為80％的甲醇水溶液5mL(控制料液比為40:1)；密封后置于漩渦振蕩器中震蕩10s；再于40℃下超聲(40KHz，300w)提取3小時(shí)，11000×g離心10min，取上清液約1.5mL過(guò)0.22μm濾膜(有機(jī)相針式濾頭)至2mL進(jìn)樣瓶，置于-20℃的環(huán)境下保存待測(cè)。2)高效液相色譜HPLC-MS(AgilentQuadrupoleLC/MS6120)的具體參數(shù)條件：色譜柱YMC-packODS-AQ(4.6×250mm，S-5μm,12nm)，流動(dòng)相A為100％的純乙腈，流動(dòng)相B為體積濃度為0.1％的乙酸水溶液，以A(V/V)：0min15％、0～30min20％、30～60min40％、60～70min40％梯度洗脫；流速梯度：0min1.0ml/min、0～30min0.8ml/min、30～60min0.8ml/min、60～70min1.0ml/min；洗脫延遲時(shí)間2min，隨后起始梯度平衡5min，流速1.0ml/min；柱后流出液不經(jīng)分流直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)。質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源(ESI)，采用正離子模式檢測(cè)；使用高純N2輔助噴霧電離與脫溶劑，干燥氣流速為10L/min，霧化室壓力為35psig，干燥器溫度為350℃，毛細(xì)管電壓為為3800V，質(zhì)量掃描范圍m/z為100～700。選定m/z417、m/z447分別進(jìn)行大豆苷DG和黃豆黃苷GLG的采集并分別控制采集時(shí)間分別為17.7min和19.6min；選定m/z433、m/z503、m/z533分別進(jìn)行染料木苷GEG、丙二酰大豆苷MD和丙二酰黃豆黃苷MGL的采集并分別控制采集時(shí)間為32.9min、36.2min和37.7min；選定m/z459、m/z489、m/z519分別進(jìn)行乙酰大豆苷AD、乙酰黃豆黃苷AGL和丙二酰染料木苷MG的采集并分別控制采集時(shí)間為43.6min、44.9min和46.9min；選定m/z255、m/z475、m/z285分別進(jìn)行大豆苷元DE、乙酰染料木苷AG和黃豆黃素GLE的采集并分別控制采集時(shí)間為51.6min、52.3min和53.0min；選定m/z271進(jìn)行染料木素GE的采集并控制采集時(shí)間為62.9min，繼而獲得被分析樣本的提取離子流圖，即為大豆異黃酮靶向代謝圖譜。其中，典型的大豆異黃酮靶向代謝圖譜如圖1所示，其中有十二個(gè)峰，分別代表十二種大豆異黃酮，可以根據(jù)峰的面積統(tǒng)計(jì)得到每種大豆異黃酮的絕對(duì)含量。但是，由于本示例中大豆種子樣本的數(shù)量較多，在此不一一進(jìn)行圖示展示。3)靶向代謝物定量分析：分別精確稱量1.0mg大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品，溶于20μLDMSO，以色譜純乙腈定容至10ml(C＝100μg/ml)；平衡20min后，以色譜純乙腈稀釋為75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、4μg/ml濃度的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液；按上述色譜、質(zhì)譜條件由低到高進(jìn)樣，記錄各種大豆異黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，根據(jù)各大豆種子樣本對(duì)應(yīng)的大豆異黃酮靶向代謝圖譜中各種大豆異黃酮的峰面積參數(shù)并對(duì)照各種大豆異黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸分析，計(jì)算得到各種大豆異黃酮的絕對(duì)含量。4)分別采集獲得8個(gè)大豆樣本的12種異黃酮含量數(shù)據(jù)，形成一個(gè)8×12的數(shù)據(jù)矩陣，將數(shù)據(jù)矩陣中的變量進(jìn)行標(biāo)度化后導(dǎo)入SIMCA-P軟件(V13.0，UmetricsAB，Umea，Sweden)，利用正交偏最小二乘-判別分析(O2PLS-DA)方法對(duì)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行模式識(shí)別多變量分析，所建模型具有2個(gè)主成分，根據(jù)每個(gè)樣本在主成分上的投影，得到得分矩陣圖，具體如圖3A所示。從圖3A可知，2種弱耐蔭大豆、4種中度耐蔭大豆和2種高耐蔭大豆樣本的投影在得分矩陣圖上可以得到很好的分離，表明不同耐蔭特性的大豆存在明顯的區(qū)別。根據(jù)每個(gè)變量在主成分上的投影，可以得到載荷矩陣圖，具體如圖3B所示。其中，與得分矩陣對(duì)應(yīng)的載荷矩陣圖反映出導(dǎo)致樣本對(duì)組間分開(kāi)作出了貢獻(xiàn)的差異代謝物，從圖3B可知，化合物DE、GE、GLE、GLG、AGL、MGL離中心點(diǎn)較遠(yuǎn)，對(duì)區(qū)分樣本所做貢獻(xiàn)大。將上述6個(gè)化合物在典型的強(qiáng)耐蔭材料(ND12、14011)與弱耐蔭材料(14059、14055)的變量信息導(dǎo)入到SPSS，兩者間做樣本t檢驗(yàn)，通過(guò)t檢驗(yàn)的變量(p<0.05)認(rèn)為是對(duì)不同抗逆潛力大豆種質(zhì)資源的代謝有顯著性差異的化合物，并結(jié)合各大豆實(shí)際耐蔭表型(加權(quán)敏感指數(shù)越小，越耐蔭)(如表3所示)，對(duì)上述判別分類進(jìn)行驗(yàn)證，可發(fā)現(xiàn)E型異黃酮苷元含量高(大豆苷元、黃豆黃素、染料木素)的大豆具有更大的苗期耐蔭特性。當(dāng)某大豆材料的E型異黃酮苷元含量高于90μg/g時(shí)，其具有較好的耐蔭潛力，可作為耐蔭型重點(diǎn)育種基礎(chǔ)材料加以利用。表4示例2中8種不同耐蔭特性大豆的12種異黃酮含量信息本發(fā)明并不局限于前述的具體實(shí)施方式。本發(fā)明擴(kuò)展到任何在本說(shuō)明書(shū)中披露的新特征或任何新的組合，以及披露的任一新的方法或過(guò)程的步驟或任何新的組合。