本發(fā)明是有關(guān)于一種用于根據(jù)權(quán)利要求1測(cè)定物質(zhì)或物質(zhì)混合物與目標(biāo)物之間的結(jié)合常數(shù)方法的，及有關(guān)于一種根據(jù)權(quán)利要求16的試劑盒。

背景技術(shù)：

物質(zhì)或物質(zhì)混合物與目標(biāo)物之間的相互作用和結(jié)合常數(shù)的測(cè)定在制藥行業(yè)，特別是在藥物研究與開(kāi)發(fā)中扮演重要角色。這兩個(gè)領(lǐng)域都涉及物質(zhì)或物質(zhì)混合物與生物之間的相互作用。在這里，必須用結(jié)合參數(shù)和結(jié)合常數(shù)量化各物質(zhì)的結(jié)合特性。

從de102010018965a1中已知一種用于測(cè)定結(jié)合常數(shù)方法。在所述方法中，蛋白質(zhì)固定在多個(gè)固體上，例如與待測(cè)物質(zhì)的水溶液接觸，并培養(yǎng)一段時(shí)間足以使溶解物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合。然后將固體支持的蛋白質(zhì)與溶液分離(例如通過(guò)沉降)。使用合適的測(cè)量方法，確定在剩余溶液(上清液)中或任選地在分離的固體支持的蛋白質(zhì)中測(cè)得待測(cè)物質(zhì)的濃度，特別是固體支持的蛋白質(zhì)與待測(cè)試物質(zhì)的多種不同混合比。為達(dá)此目的，用于結(jié)合的相同數(shù)量的待測(cè)物質(zhì)在不同量的固體支持蛋白溶液中以均勻的溶液體積進(jìn)行培養(yǎng)。待測(cè)試樣品的液相總體積，由待測(cè)物質(zhì)或物質(zhì)混合物溶解的緩沖液體的體積組成，在所有情況下保持恒定。這種方法的缺點(diǎn)是，對(duì)塑料或玻璃具有非常高親和力的物質(zhì)會(huì)非特異性地附著到樣品容器上，并因此由于低溶解度而失去或沉淀。

此外，ep1658499a1描述了一種方法，用于測(cè)定稀釋血漿和血清中的物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合常數(shù)或游離態(tài)濃度，其中物質(zhì)固定至膜(目標(biāo)1)和稀釋血漿(目標(biāo)2)。這種方法的缺點(diǎn)是不能確定對(duì)膜表現(xiàn)出極高或低親和力的物質(zhì)和目標(biāo)物之間的相互作用。例如，后者是肽的情況下，例如，與脂肪酸作為共軛脂質(zhì)錨定體，而前者通常是沒(méi)有這種脂質(zhì)錨的情況。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于確定物質(zhì)或物質(zhì)混合物與目標(biāo)物之間的結(jié)合常數(shù)的方法，其克服了現(xiàn)有方法相關(guān)的缺點(diǎn)。特別是，應(yīng)該可以測(cè)定物質(zhì)和目標(biāo)物之間的結(jié)合常數(shù)，對(duì)于在現(xiàn)有方法使用中對(duì)于膜表現(xiàn)出極高或低親和力或?qū)悠啡萜骶哂蟹浅８叩挠H和力的物質(zhì)。根據(jù)另一實(shí)施例，更提供了可以同時(shí)測(cè)定物質(zhì)和固定化目標(biāo)物與物質(zhì)與可溶性目標(biāo)物之間的結(jié)合常數(shù)的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種可以容易且廉價(jià)地進(jìn)行本發(fā)明方法的試劑盒。

所述目的通過(guò)具有權(quán)利要求1特征的方法和具有權(quán)利要求16特征的試劑盒來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例是權(quán)利要求2至15的所請(qǐng)目標(biāo)。

本發(fā)明涉及一種用于確定一物質(zhì)或一物質(zhì)混合物相對(duì)于一可溶性目標(biāo)物和一不溶性目標(biāo)物的多個(gè)結(jié)合常數(shù)的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

●將所述物質(zhì)或所述物質(zhì)混合物的一第一樣品與固定化于一固體上的一目標(biāo)物進(jìn)行培養(yǎng)，所述固體優(yōu)選為一第一樣品容器中的一顆粒載體，所述第一樣品容器含有一緩沖溶液和一溶解目標(biāo)物；

●將所述物質(zhì)或所述物質(zhì)混合物的一第二樣品與固定化于一固體上的所述目標(biāo)物進(jìn)行培養(yǎng)，所述固體優(yōu)選為一第二樣品容器中的一顆粒載體，所述第二樣品容器含有所述緩沖溶液和所述溶解目標(biāo)物；

●將所述物質(zhì)或所述物質(zhì)混合物的一第三樣品與固定化于一固體上的所述目標(biāo)物進(jìn)行培養(yǎng)，所述固體優(yōu)選為一第三樣品容器中的一顆粒載體，所述第三樣品容器含有所述緩沖溶液和所述溶解目標(biāo)物；

●將所述物質(zhì)或所述物質(zhì)混合物的一第四樣品與固定化于一固體上的所述目標(biāo)物進(jìn)行培養(yǎng)，所述固體優(yōu)選為一第四樣品容器中的一顆粒載體，所述第四樣品容器含有所述緩沖溶液和所述溶解目標(biāo)物；

根據(jù)本發(fā)明所提供的，包含不同物質(zhì)量的所述固定化目標(biāo)物和相同物質(zhì)量的所述溶解目標(biāo)物的所述物質(zhì)的所述第一和第二樣品被培養(yǎng)，以及包含與所述物質(zhì)的所述第一和第二樣品相同物質(zhì)量的所述固定化目標(biāo)物與包含相同物質(zhì)量的所述可溶性目標(biāo)物的所述物質(zhì)的所述第三和第四樣品被培養(yǎng)；其中所述第三和第四樣品容器中的所述可溶性目標(biāo)物的物質(zhì)量與所述第一和第二樣品容器中的所述可溶性目標(biāo)物的物質(zhì)量不同；以及培養(yǎng)過(guò)程中所述數(shù)個(gè)樣品容器含有相同體積的液相，所述液相由所述緩沖溶液、所述溶解目標(biāo)物和物質(zhì)樣品組成，所述方法更包括以下步驟：

●從各培養(yǎng)基分離出所述固體，所述固體優(yōu)選為顆粒載體；

●測(cè)量未與所述固定化目標(biāo)物結(jié)合的所述物質(zhì)或未與所述固定化目標(biāo)物結(jié)合的所述物質(zhì)混合物在各自培養(yǎng)基的上清液中的濃度(apa濃度)；

●根據(jù)測(cè)定的所述apa濃度，確定所述物質(zhì)或所述物質(zhì)混合物相對(duì)于所述固定化目標(biāo)物的一結(jié)合常數(shù)和所述物質(zhì)或所述物質(zhì)混合物相對(duì)于所述溶解目標(biāo)物的一結(jié)合常數(shù)。

本發(fā)明具體涉及用于測(cè)定單個(gè)物質(zhì)和目標(biāo)物之間的結(jié)合常數(shù)的方法。然而，在本發(fā)明的意義上，也可以相對(duì)于目標(biāo)物確定物質(zhì)混合物的結(jié)合常數(shù)。此處，物質(zhì)混合物特別被理解為指含有至少兩種任選地與目標(biāo)物結(jié)合的物質(zhì)的混合物。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以針對(duì)這種物質(zhì)混合物中的每種物質(zhì)確定相對(duì)于目標(biāo)物的結(jié)合常數(shù)。這尤其適用于多重應(yīng)用。除非在下文中明確區(qū)分，術(shù)語(yǔ)物質(zhì)的使用還包括物質(zhì)混合物。根據(jù)本發(fā)明方法的基本功能原理是通過(guò)改變結(jié)合平衡來(lái)確定目標(biāo)物的物質(zhì)結(jié)合常數(shù)。在這種情況下，兩個(gè)目標(biāo)物的濃度，即固定的和溶解的目標(biāo)物的濃度是被改變的并且通過(guò)各個(gè)培養(yǎng)基中結(jié)合平衡的改變來(lái)確定與目標(biāo)物的親和力。

因此，根據(jù)本發(fā)明的方法用于測(cè)定物質(zhì)或物質(zhì)混合物與目標(biāo)物之間的結(jié)合常數(shù)。然而，根據(jù)本發(fā)明的方法中，與現(xiàn)有技術(shù)相反，不僅固定化目標(biāo)物的濃度改變，而且還引入相同或不同目標(biāo)物的第二相態(tài)至溶液中，其濃度也會(huì)被改變。因此，根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)是也可以確定物質(zhì)或物質(zhì)混合物與兩種不同目標(biāo)物之間的相互作用。此外，引入第二溶解目標(biāo)物增加了物質(zhì)或物質(zhì)混合物的溶解度。為了測(cè)定結(jié)合常數(shù)，需要至少四個(gè)樣品：兩個(gè)針對(duì)不同物質(zhì)量的固定化目標(biāo)物與兩個(gè)不同物質(zhì)量的可溶性目標(biāo)物的組合。這給出了根據(jù)本發(fā)明測(cè)定物質(zhì)相對(duì)于固定化和溶解目標(biāo)物的結(jié)合常數(shù)所需的上清液中物質(zhì)的最小測(cè)量濃度(游離或結(jié)合到可溶性目標(biāo)物)。由于根據(jù)本發(fā)明的方法，除了固定化目標(biāo)物之外還包含可溶性目標(biāo)物，并且不僅固定化目標(biāo)物的濃度可改變，而且可溶性目標(biāo)物的濃度也改變，所以根據(jù)本發(fā)明的方法可以同時(shí)確定物質(zhì)和固定化目標(biāo)物之間的結(jié)合常數(shù)以及物質(zhì)和可溶性目標(biāo)物之間的結(jié)合常數(shù)。

根據(jù)本發(fā)明的基本實(shí)施例，為了確定結(jié)合常數(shù)，結(jié)合平衡被改變。在這種情況下，固定化目標(biāo)物和溶解目標(biāo)物的濃度會(huì)產(chǎn)生變化。將所述物質(zhì)的第一樣品和第二樣品與不同質(zhì)量的固定化目標(biāo)物進(jìn)行培養(yǎng)。這使得培養(yǎng)基一中固定化目標(biāo)物的物質(zhì)量與培養(yǎng)基二中固定化目標(biāo)物的物質(zhì)量不同。此外，將所述物質(zhì)的第三樣品和第四樣品與不同質(zhì)量的可溶性目標(biāo)物進(jìn)行培養(yǎng)。這使的培養(yǎng)基三和培養(yǎng)基四中可溶性目標(biāo)物的物質(zhì)量與培養(yǎng)基一和培養(yǎng)基二中的可溶性目標(biāo)物的物質(zhì)量不同。達(dá)到所述目標(biāo)濃度變化所需物質(zhì)量的各自差異可以在每一種情況下改變，在1.5至100倍，特別是2至10倍的范圍內(nèi)彼此不同。

將物質(zhì)的第三和第四樣品與物質(zhì)的第一和第二樣品的相同物質(zhì)量的固定化目標(biāo)物進(jìn)行培養(yǎng)。其結(jié)果是，培養(yǎng)基三和培養(yǎng)基四的固定化目標(biāo)物的物質(zhì)量與培養(yǎng)基一和培養(yǎng)基二相同的方式變化。

換句話說(shuō)，從中可以看出培養(yǎng)基一與培養(yǎng)基三含有相同的固定化目標(biāo)物的物質(zhì)量。培養(yǎng)基二和培養(yǎng)基四也含有相同的固定化目標(biāo)物的物質(zhì)量，但這不同于培養(yǎng)基一與培養(yǎng)基三的固定化目標(biāo)物的物質(zhì)量。培養(yǎng)基一和培養(yǎng)基二含有相同的物質(zhì)量的溶解目標(biāo)物，培養(yǎng)基三和培養(yǎng)基四也含有相同的物質(zhì)量的溶解目標(biāo)物，但后者物質(zhì)量不同于培養(yǎng)基一和培養(yǎng)基二的物質(zhì)量。

在測(cè)定apa濃度時(shí)，測(cè)量未與所述固定化目標(biāo)物結(jié)合的所述物質(zhì)或未與所述固定化目標(biāo)物結(jié)合的所述物質(zhì)混合物在各自培養(yǎng)基的上清液中的濃度。apa濃度是與各自培養(yǎng)基的上清液中未結(jié)合固定化目標(biāo)物的物質(zhì)或未結(jié)合固定化目標(biāo)物的物質(zhì)混合物的全部濃度，即含有游離物質(zhì)或游離物質(zhì)混合物和結(jié)合至可溶性目標(biāo)物的物質(zhì)或物質(zhì)混合物。

可以看出，根據(jù)本發(fā)明的方法中，至少四個(gè)apa濃度被測(cè)定，因?yàn)橹辽偈褂镁哂袑?duì)應(yīng)培養(yǎng)基的四個(gè)樣品容器。

根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施例提供了除了所述物質(zhì)的所述第一、第二、第三和第四樣品之外，所述物質(zhì)或所述物質(zhì)混合物的至少一個(gè)另外的樣品，優(yōu)選是介于1至21個(gè)之間的另外的樣品，與固定化于一固體上的所述目標(biāo)物進(jìn)行培養(yǎng)，所述固體優(yōu)選為含有所述緩沖溶液和所述溶解目標(biāo)物的至少一個(gè)另外的樣品容器中的顆粒載體，并優(yōu)選在1-21個(gè)含有所述緩沖溶液的樣品容器中進(jìn)行培養(yǎng)。其中，含有不同物質(zhì)量的所述固定化目標(biāo)物的多個(gè)另外的樣品被培養(yǎng)，以及含有不同物質(zhì)量的所述溶解目標(biāo)物的多個(gè)另外的樣品被培養(yǎng)，以及將多個(gè)另外的樣品中的至少一個(gè)在具有相同濃度的所述固定化目標(biāo)物且同時(shí)具有不同濃度的所述溶解目標(biāo)物的兩個(gè)樣品容器中進(jìn)行培養(yǎng)，以及所有另外的樣品容器在培養(yǎng)期間含有與所述第一、第二、第三和第四樣品容器相同量的所述緩沖溶液。樣品數(shù)量增加的優(yōu)點(diǎn)是誤差率隨著可用于測(cè)定的濃度值數(shù)量增加而減小。

為了估計(jì)結(jié)合常數(shù)，固定化目標(biāo)物濃度分別在2至5個(gè)反應(yīng)培養(yǎng)基中變化，并加入恒定量的物質(zhì)。此外，還向這些反應(yīng)培養(yǎng)基中加入恒定體積的溶解目標(biāo)物(血漿，白蛋白等)。此處應(yīng)該注意的是，溶解在體積中的目標(biāo)物的濃度可以用緩沖液稀釋而不同。在2至5個(gè)平行培養(yǎng)基中使用多達(dá)5種不同濃度的溶解目標(biāo)物，其產(chǎn)生4至25個(gè)反應(yīng)培養(yǎng)基，并具有不同濃度的固定化目標(biāo)物和溶解目標(biāo)物。

根據(jù)另外的實(shí)施例，除了第一、第二、第三和第四物質(zhì)樣品之外，使用物質(zhì)或物質(zhì)混合物的至少五個(gè)另外的樣品(即9個(gè)樣品，對(duì)應(yīng)于固定化目標(biāo)物的三個(gè)濃度梯度與可溶性目標(biāo)物的三個(gè)濃度梯度的組合)。優(yōu)選使用25個(gè)樣品。在這種情況下，將5種不同物質(zhì)量的固定化目標(biāo)物與5種不同物質(zhì)量的可溶性目標(biāo)物組合，使每種物質(zhì)量的固定化目標(biāo)物的與每種物質(zhì)量的可溶性目標(biāo)物一起培養(yǎng)，得到25種不同的結(jié)合平衡點(diǎn)。然而，在培養(yǎng)期間，多個(gè)樣品容器總是含有與第一、第二、第三和第四樣品容器相同量的緩沖溶液。為了估計(jì)結(jié)合常數(shù)，目標(biāo)濃度在25個(gè)反應(yīng)培養(yǎng)基中變化，并加入恒定量的物質(zhì)。因此使用至少兩種不同濃度的兩種目標(biāo)物，即溶解目標(biāo)物和固定化目標(biāo)物。

進(jìn)一步的實(shí)施例提供了相對(duì)于一參考樣品，各個(gè)培養(yǎng)基的上清液中物質(zhì)或物質(zhì)混合物(apa)的濃度。特別地，這樣的一參考樣品是僅含有緩沖溶液、所述溶解目標(biāo)物、以及可溶性目標(biāo)物和待測(cè)物質(zhì)的一樣品，而不含有固定化目標(biāo)物。

在根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施例中，溶解目標(biāo)物與固定化目標(biāo)物是相同的。根據(jù)另一變化，溶解目標(biāo)物與固定化目標(biāo)物是不同的。

根據(jù)本發(fā)明的目標(biāo)物應(yīng)優(yōu)選為一目標(biāo)化合物或一目標(biāo)受體。因此，多個(gè)目標(biāo)物可以被當(dāng)作多個(gè)受體。例如，活性或有害成分可以與目標(biāo)物結(jié)合。特別是，合適的目標(biāo)物包括生物性目標(biāo)物，例如蛋白質(zhì)，優(yōu)選為酵素、抗體或混合物，例如血漿。具體來(lái)說(shuō)，目標(biāo)物可以是非膜結(jié)合蛋白質(zhì)或負(fù)責(zé)結(jié)合的細(xì)胞外蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，如表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)和腫瘤壞死因子受體(tnfr)、血漿蛋白如人血清白蛋白(hsa)或α-1型糖蛋白(agp)、蛋白質(zhì)混合物如血漿或血清或組織液。所述目標(biāo)物可以是自然產(chǎn)生的或人為制造的目標(biāo)物?？梢钥闯?，目標(biāo)物可以是不同目標(biāo)化合物或目標(biāo)物受體的一混合物。所有固定化目標(biāo)物的共同特征是它們固定在一固體上。

待測(cè)試的物質(zhì)或物質(zhì)混合物也可稱為配體。這些待測(cè)試的物質(zhì)可以是肽、核酸、核糖核酸、脂質(zhì)和其它生物分子。待測(cè)試的物質(zhì)也可以是藥物或毒素等化學(xué)物質(zhì)。目標(biāo)物與物質(zhì)或物質(zhì)混合物之間的相互作用可以涉及特定或非特異性的鍵結(jié)。這些鍵結(jié)通常不是共價(jià)的。在這種情況下，多個(gè)測(cè)試的物質(zhì)會(huì)競(jìng)爭(zhēng)與目標(biāo)物結(jié)合。相對(duì)于多個(gè)膜，使用包括蛋白質(zhì)(例如白蛋白或抗體)在內(nèi)的固定化目標(biāo)物得以確定物質(zhì)和目標(biāo)物之間的相互作用，這些相互作用僅顯示對(duì)于膜的極低或極高的親和力。肽是這些物質(zhì)的一個(gè)例子。

根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施例，要測(cè)定的結(jié)合常數(shù)是親和力或解離常數(shù)。

在一有利的實(shí)施例中，親和力或解離常數(shù)的測(cè)定根據(jù)方程式i進(jìn)行：

其中，

apa是未與所述固定化目標(biāo)物結(jié)合的所述物質(zhì)的濃度，即游離的物質(zhì)與結(jié)合至所述可溶性目標(biāo)物的物質(zhì)；

是所述固定化目標(biāo)物的解離常數(shù)；

是所述溶解目標(biāo)物的解離常數(shù)；

c0是總恒定添加物質(zhì)濃度；

[immot]是所述固定化目標(biāo)物的濃度；以及

[p]是所述溶解目標(biāo)物的濃度。

因此，物質(zhì)相對(duì)于固定化目標(biāo)物的解離常數(shù)和物質(zhì)相對(duì)于溶解目標(biāo)物的解離常數(shù)被測(cè)定。已知各自的關(guān)聯(lián)常數(shù)在數(shù)學(xué)上是從解離常數(shù)導(dǎo)出的，反之亦然。

為了使所述方程式能被使用，物質(zhì)和目標(biāo)物之間的相互作用必須遵循一級(jí)或大致遵循一級(jí)結(jié)合動(dòng)力學(xué)。

因此，解離常數(shù)的測(cè)定是通過(guò)根據(jù)上述其中一實(shí)施例的方法進(jìn)行的，優(yōu)選更包括以下步驟：

●對(duì)及在方程式i中使用一解離常數(shù)矩陣；

●計(jì)算預(yù)期用于所述解離常數(shù)矩陣的各自的apa濃度；

●進(jìn)行比較計(jì)算出的apa濃度與測(cè)定出的apa濃度；

●選擇及的數(shù)值對(duì)，其顯示計(jì)算出的apa濃度和測(cè)定出的apa濃度之間的最小偏差，作為待測(cè)所述物質(zhì)相對(duì)于所述固定化目標(biāo)物或所述溶解目標(biāo)物的多個(gè)指定解離常數(shù)。

在所述方法的優(yōu)選實(shí)施例中，選擇所述及的數(shù)值對(duì)以顯示計(jì)算出的apa濃度與測(cè)定出的apa濃度之間的所述最小偏差是通過(guò)一數(shù)值優(yōu)化方法進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的方法的改進(jìn)，使用所述等式確定結(jié)合常數(shù)：其中，多個(gè)及的結(jié)合常數(shù)數(shù)值首先被導(dǎo)入到等式中，并且針對(duì)上述數(shù)值的預(yù)期的各個(gè)apa濃度被計(jì)算出。后將計(jì)算出的apa濃度與測(cè)量的apa濃度進(jìn)行比較。在另一步驟中，通過(guò)數(shù)值優(yōu)化方法，優(yōu)選“最小二乘法”優(yōu)化方法來(lái)確定計(jì)算出的apa濃度與測(cè)量的apa濃度之間的最小偏差，其方程式為γ＝(apameasured–apacalculated)²。從這些偏差中選擇偏差的最小值。接下來(lái)，選擇結(jié)合常數(shù)及對(duì)應(yīng)的數(shù)值對(duì)，并將其分配給所述最小偏差的數(shù)值。這些然后構(gòu)成待測(cè)試的物質(zhì)的結(jié)合常數(shù)。

根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，及的一解離常數(shù)矩陣因此可以構(gòu)成。所述矩陣填充了從多個(gè)測(cè)量的apa值導(dǎo)出的剩余誤差，且從矩陣相應(yīng)的行和列的及值計(jì)算所得到的多個(gè)所述apa值，根據(jù)下列方程式：γ＝(apameasured–apacalculated)²。

及值的組合給出最小偏差構(gòu)成及值的最佳組合，這最能說(shuō)明測(cè)量值。以上述方式測(cè)定的及值為根據(jù)本發(fā)明所獲得的所述結(jié)合常數(shù)。

在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一固定化目標(biāo)物的載體，其不溶于水溶液。這使得載體可以很容易地從培養(yǎng)基中分離出來(lái)，并可選擇地可重復(fù)使用以重復(fù)所述方法。

在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，載體由有機(jī)或無(wú)機(jī)聚合物所組成，特別優(yōu)選洋菜膠。洋菜膠的優(yōu)點(diǎn)在于其對(duì)待測(cè)物質(zhì)的低非特異性結(jié)合，特別是肽。

根據(jù)本發(fā)明的所述方法的另一實(shí)施例，所提供的載體是顆粒形式，其中顆粒是至少部分微米或納米級(jí)顆粒。在這種情況下，所述顆?？梢允谴判曰蚍谴判约{米顆粒、二氧化硅顆?；颦傊俏⒅轶w。

在所述方法的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，所述載體是顆粒狀洋菜膠載體。這種載體的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它是市售的。

特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述方法的變化實(shí)施例，其中所述固定化目標(biāo)物是白蛋白。白蛋白特別適用于固定化目標(biāo)物，因?yàn)樗梢愿鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行固定。

在所述方法的另一有利實(shí)施例中，可溶性目標(biāo)物是人或動(dòng)物來(lái)源的血漿或血清。血漿或血清的優(yōu)點(diǎn)在于測(cè)量結(jié)果的特殊生理相關(guān)性。

根據(jù)本發(fā)明所述方法的另一個(gè)實(shí)施例，提供了通過(guò)過(guò)濾、離心或傾析緩沖溶液來(lái)進(jìn)行載體的分離。這樣的方法允許載體與培養(yǎng)基分離，而不增加所需的時(shí)間和成本。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，載體為顆粒形式，并且顆粒具有磁性。在這種情況下，根據(jù)本發(fā)明提供的實(shí)施例，其中通過(guò)施加磁場(chǎng)來(lái)分離載體以使載體分離。與其他技術(shù)相比，使用磁性顆粒和磁性分離提供了相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)。磁性顆?？梢灾苯雍瓦x擇性地與培養(yǎng)基分離并純化。與傳統(tǒng)的分離方法相比，磁性分離簡(jiǎn)便快捷。此外，多個(gè)步驟，例如改變緩沖液或洗滌的步驟，可以以簡(jiǎn)單的方式進(jìn)行。

特別優(yōu)選地，通過(guò)質(zhì)譜法、熒光光譜法、使用放射性方法或色譜方法或這些方法的組合來(lái)進(jìn)行所述物質(zhì)或所述物質(zhì)混合物的濃度測(cè)量。這些方法可以廣泛變化，并且可以根據(jù)待測(cè)試物質(zhì)相應(yīng)地適應(yīng)和修改。以這種方式，物質(zhì)的濃度可以盡可能精確地測(cè)定。

根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施例，所述緩沖溶液是一鹽水溶液。這些溶液特別適用于測(cè)試結(jié)合常數(shù)，因?yàn)樗褂玫哪繕?biāo)物在其中是穩(wěn)定的，并且溶液是可購(gòu)買(mǎi)的。

根據(jù)本發(fā)明所述方法的特別優(yōu)選實(shí)施例中，所述多個(gè)樣品容器是多個(gè)微量滴定板的多個(gè)腔室，或具體地，所述多個(gè)樣品容器具有不干擾所述物質(zhì)或所述物質(zhì)混合物的多個(gè)表面特征。

本發(fā)明還涉及一種通過(guò)上述實(shí)施例之一的方法用于測(cè)定物質(zhì)或物質(zhì)混合物與目標(biāo)物之間的結(jié)合常數(shù)的試劑盒。這里，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明提供了至少四個(gè)樣品容器或一個(gè)微量滴定板的至少四個(gè)腔室、一緩沖溶液、一定量的一溶解目標(biāo)物，以及一定量的一目標(biāo)物，固定在一固體上，所述固體優(yōu)選為顆粒載體，其中，所述溶解目標(biāo)物和固定的目標(biāo)物是相同的或不同的。

根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施例，根據(jù)上述實(shí)施例的其中之一，測(cè)定一物質(zhì)或一物質(zhì)混合物相對(duì)于一可溶性目標(biāo)物和一固定化目標(biāo)物的結(jié)合常數(shù)的方法特別被用以測(cè)定所述物質(zhì)或所述物質(zhì)混合物相對(duì)于固定化目標(biāo)物的一結(jié)合常數(shù)，及通過(guò)執(zhí)行一計(jì)算機(jī)程序，基于測(cè)量的apa濃度來(lái)測(cè)定物質(zhì)或物質(zhì)混合物相對(duì)于溶解目標(biāo)物的一結(jié)合常數(shù)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例涉及用于測(cè)定一物質(zhì)或一物質(zhì)混合物相對(duì)于可溶性目標(biāo)物的多個(gè)結(jié)合常數(shù)的計(jì)算機(jī)程序，其被配置為可以基于測(cè)量的apa濃度進(jìn)行來(lái)測(cè)定所述物質(zhì)或所述物質(zhì)混合物相對(duì)于固定化目標(biāo)物的一結(jié)合常數(shù)，以及測(cè)定所述物質(zhì)或所述物質(zhì)混合物相對(duì)于可溶性目標(biāo)物的一結(jié)合常數(shù)。本發(fā)明的另一實(shí)施例涉及一種計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，例如一數(shù)據(jù)載體、一存儲(chǔ)介質(zhì)或一機(jī)器可讀介質(zhì)，可以由所述計(jì)算機(jī)程序讀取。如果需要，上述套件還可以包括這樣的一計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品。

本發(fā)明的其它特征、細(xì)節(jié)和優(yōu)點(diǎn)在權(quán)利要求和以下描述的例示性實(shí)施例的敘述中被指定，其中本發(fā)明不限于所描述實(shí)施例的其中之一，而是可以以各種各樣的方式使用。在這種情況下，來(lái)自權(quán)利要求書(shū)、說(shuō)明書(shū)和附圖的所有特征和優(yōu)點(diǎn)，包括設(shè)計(jì)細(xì)節(jié)、空間設(shè)置和工藝步驟，對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，可以是個(gè)別的和最廣泛的各種組合。

具體實(shí)施方式

例示性實(shí)施例1

a)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

特別優(yōu)選的實(shí)施例是微量滴定板用于上述方法，其中的5個(gè)柱具有7個(gè)腔室，使得具有固定化目標(biāo)物的25個(gè)樣品，而沒(méi)有固定化目標(biāo)物的10個(gè)樣品則作為對(duì)照組。人血清白蛋白(hsa)用作固定化目標(biāo)物(目標(biāo)1)。根據(jù)一標(biāo)準(zhǔn)方法將hsa固定在商業(yè)瓊脂糖珠(mini-leakbeadsmedium，kem-en-tecnordica/s)上，人血漿被作為可溶性目標(biāo)物。要測(cè)試的物質(zhì)是一種肽。5種濃度的固定化hsa用于5種血漿濃度中的每一種。為此，微量滴定板的腔室填充如下：

微量滴定板的柱i(使用第1至7行)：

微量滴定板的柱ii(使用第1至7行)：

微量滴定板的柱iii(使用第1至7行)：

微量滴定板的柱iv(使用第1至7行)：

微量滴定板的柱v(使用第1至7行)：

這里，根據(jù)下表將血漿預(yù)稀釋并加入到相應(yīng)的腔室中：

¹在計(jì)算解離常數(shù)時(shí)，任意假設(shè)整體血漿的濃度為600μm。這個(gè)假設(shè)接近現(xiàn)實(shí)，但是沒(méi)有問(wèn)題，因?yàn)橛?jì)算的解離常數(shù)是指這個(gè)濃度，因此即使“真實(shí)”濃度不同，也能獲得血漿結(jié)合物質(zhì)在百分比意義上的正確結(jié)合數(shù)值。

可以看出，根據(jù)本發(fā)明改變兩個(gè)目標(biāo)物，例如多個(gè)固定化及多個(gè)溶解目標(biāo)物濃度的原理，并在此實(shí)現(xiàn)。將包含不同物質(zhì)量的固定化目標(biāo)物和相同物質(zhì)量的溶解目標(biāo)物的物質(zhì)的第一和第二樣品進(jìn)行培養(yǎng)(例如腔室i-3和i-7以固定的hsa濃度為11μm或120μm，其中兩個(gè)腔室含有1:3稀釋的血漿)。此外，將包含與物質(zhì)的第一和第二樣品相同物質(zhì)量的固定化目標(biāo)物與包含相同物質(zhì)量的可溶性目標(biāo)物的物質(zhì)的第三和第四樣品進(jìn)行培養(yǎng)(例如腔室v-3和v-7以固定的hsa濃度為11μm或120μm，其中兩個(gè)腔室含有1:48稀釋的血漿)。其中第三和第四樣品容器中可溶性目標(biāo)物的物質(zhì)量不同于第一和第二樣品容器中的可溶性目標(biāo)物的物質(zhì)量。

b)實(shí)驗(yàn)方法

將10μl的10至2000μm測(cè)試物質(zhì)儲(chǔ)備溶液加入到多個(gè)腔室中。在所述實(shí)施例中，使用1012.5μm的肽儲(chǔ)備溶液。在上述實(shí)驗(yàn)裝置中加入10μl后，所有腔室中肽的濃度為22.5μm?；旌隙鄠€(gè)再懸浮的珠后，其中目標(biāo)1(這里是人血清白蛋白)固定化在所述珠上，固定在載體材料上的目標(biāo)物是分離的。為了這個(gè)目的，將微量滴定板離心以使多個(gè)珠沉淀。通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒?，如lc/ms/ms或閃爍計(jì)數(shù)確定上清液中的濃度。在多個(gè)所述腔室中未結(jié)合部分的物質(zhì)與固定化目標(biāo)物相對(duì)于參考樣品得到確定。只要測(cè)試物質(zhì)的信號(hào)濃度比和使用的定量系統(tǒng)遵循一線性關(guān)系，就可以避免校準(zhǔn)的需要。

c)實(shí)驗(yàn)評(píng)估

如果將所有25個(gè)樣品相對(duì)于參考樣品測(cè)量的濃度乘以實(shí)驗(yàn)中使用的測(cè)試物質(zhì)的濃度(此處為22.5μm)，則可以獲得所有25個(gè)樣品中apa濃度(見(jiàn)第3列)。根據(jù)上述的apa公式，可以從解離常數(shù)及計(jì)算預(yù)期的apa值。為了確定這些解離常數(shù)，使用通常已知的數(shù)值“最小二乘法”優(yōu)化方法。所述方法的配置可以有很大差異。對(duì)于所述實(shí)施例，建構(gòu)了從1.9×10^-5至1.1×10^-7μm的離解常數(shù)和6.0×10^-4至1.8×10^-11μm的解離常數(shù)的矩陣。所述矩陣填充了從多個(gè)測(cè)量的apa值導(dǎo)出的剩余誤差，且從矩陣相應(yīng)的行和列的及值計(jì)算所得到的多個(gè)所述apa值，根據(jù)下列方程式：γ＝(apameasured–apacalculated)²。

及值的組合給出最小偏差構(gòu)成及值的最佳組合，這最能說(shuō)明測(cè)量值。以上述方式測(cè)定的及值作為結(jié)合常數(shù)的結(jié)果。從所述數(shù)值組合計(jì)算的apa值顯示在下表的第4列中，剩余誤差在第5列中顯示。

對(duì)于所述實(shí)施例，實(shí)施例中以這種方式確定的物質(zhì)的解離常數(shù)為然后根據(jù)以下通?，F(xiàn)有的方程式測(cè)定出用于與全血漿結(jié)合的肽的部分：

其中[p]是任意選擇的血漿濃度，而是通過(guò)優(yōu)化方法從血漿獲得的肽的解離常數(shù)數(shù)值。在所述實(shí)施例中，結(jié)合至全血漿(未稀釋)的肽的部分為97％。這意味著溶解在血漿中的肽僅有3％是游離的或未結(jié)合的形式。

例示性實(shí)施例2

a)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

特別優(yōu)選的實(shí)施例是微量滴定板用于上述方法，其中的5個(gè)柱具有7個(gè)腔室，使得具有固定化目標(biāo)物的25個(gè)樣品，而沒(méi)有固定化目標(biāo)物的10個(gè)樣品則作為對(duì)照組。人血清白蛋白(hsa)用作固定化目標(biāo)物(目標(biāo)1)。根據(jù)多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法將hsa固定在商業(yè)瓊脂糖珠(mini-leakbeadsmedium，kem-en-tecnordica/s)上，人血漿被作為可溶性目標(biāo)物。要測(cè)試的物質(zhì)是利拉魯肽。5種濃度的固定化hsa用于5種血漿濃度中的每一種。為此，微量滴定板的腔室填充如下：

微量滴定板的柱i(使用第1至7行)：

微量滴定板的柱ii(使用第1至7行)：

微量滴定板的柱iii(使用第1至7行)：

微量滴定板的柱iv(使用第1至7行)：

微量滴定板的柱v(使用第1至7行)：

這里，根據(jù)下表將血漿預(yù)稀釋并加入到相應(yīng)的多個(gè)腔室中：

¹在計(jì)算解離常數(shù)時(shí)，任意假設(shè)整體血漿的濃度為600μm。這個(gè)假設(shè)接近現(xiàn)實(shí)，但是沒(méi)有問(wèn)題，因?yàn)橛?jì)算的解離常數(shù)是指這個(gè)濃度，因此即使“真實(shí)”濃度不同，也能獲得血漿結(jié)合物質(zhì)在百分比意義上的正確結(jié)合數(shù)值。

可以看出，根據(jù)本發(fā)明改變兩個(gè)目標(biāo)物，例如多個(gè)固定化及多個(gè)溶解目標(biāo)物濃度的原理，并在此實(shí)現(xiàn)。將包含不同物質(zhì)量的固定化目標(biāo)物和相同物質(zhì)量的溶解目標(biāo)物的物質(zhì)的第一和第二樣品進(jìn)行培養(yǎng)(例如腔室v-3和v-6)。此外，將包含與物質(zhì)的第一和第二樣品相同物質(zhì)量的固定化目標(biāo)物與包含相同物質(zhì)量的可溶性目標(biāo)物的物質(zhì)的第三和第四樣品進(jìn)行培養(yǎng)(例如腔室iv-3和v-3)。

b)實(shí)驗(yàn)方法

將10μl的0.022μm測(cè)試物質(zhì)利拉魯肽的儲(chǔ)備溶液加入到多個(gè)腔室中。

在上述實(shí)驗(yàn)裝置中加入10μl后，所有腔室中所述肽的濃度為22μm。混合多個(gè)再懸浮的珠后，其中目標(biāo)1(這里是人血清白蛋白)固定化在所述珠上，固定在載體材料上的目標(biāo)物是分離的。為此目的，將微量滴定板離心以使多個(gè)珠沉淀。通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ǎ鏻c/ms/ms或閃爍計(jì)數(shù)確定上清液中的濃度。在多個(gè)所述腔室中未結(jié)合部分的物質(zhì)與固定化目標(biāo)物相對(duì)于參考樣品得到確定。只要測(cè)試物質(zhì)的信號(hào)濃度比和使用的定量系統(tǒng)遵循一線性關(guān)系，就可以避免校準(zhǔn)的需要。

c)實(shí)驗(yàn)評(píng)估

如果將所有25個(gè)樣品相對(duì)于參考樣品測(cè)量的濃度乘以實(shí)驗(yàn)中使用的測(cè)試物質(zhì)的濃度(此處為22μm)，則可以獲得所有25個(gè)樣品中apa濃度(見(jiàn)第3列)。根據(jù)上述的apa公式，可以從解離常數(shù)及計(jì)算預(yù)期的apa值。為了確定這些解離常數(shù)，使用通常已知的數(shù)值“最小二乘法”優(yōu)化方法。所述方法的配置可以有很大差異。對(duì)于所述實(shí)施例，建構(gòu)了從1.9×10^-5至1.1×10^-7μm的離解常數(shù)和6.0×10^-4至1.8×10^-4μm的解離常數(shù)的矩陣。所述矩陣填充了從多個(gè)測(cè)量的apa值導(dǎo)出的剩余誤差，且從矩陣相應(yīng)的行和列的及值計(jì)算所得到的多個(gè)所述apa值，根據(jù)下列方程式：γ＝(apameasured–apacalculated)²。

及值的組合給出最小偏差構(gòu)成及值的最佳組合，這最能說(shuō)明測(cè)量值。以上述方式測(cè)定的及值作為結(jié)合常數(shù)的結(jié)果。從所述數(shù)值組合計(jì)算的apa值顯示在下表的第4列中，剩余誤差在第5列中顯示。

對(duì)于所述實(shí)施例，實(shí)施例中以這種方式確定的一種肽-利拉魯肽的解離常數(shù)為然后根據(jù)以下通常現(xiàn)有的方程式測(cè)定出用于與全血漿結(jié)合的肽的部分：

其中[p]是任意選擇的血漿濃度，而是通過(guò)優(yōu)化方法從血漿獲得的肽的解離常數(shù)值。在所述實(shí)施例中，結(jié)合至全血漿(未稀釋)的肽的部分為98.8％。這意味著溶解在血漿中的肽僅有1.2％是游離的或未結(jié)合的形式。