本發(fā)明涉及一種分析液滴內(nèi)容物的方法，所述方法包括以下步驟：

-提供包含于載流體中的多個(gè)液滴，至少一個(gè)所述液滴包括顆粒的至少一個(gè)聚集體，所述聚集體限定沿著主軸線的細(xì)長物體，至少一些所述液滴包含能夠附著在聚集體上的至少一種靶成分。

這種方法目的在于例如對分散在液滴中的感興趣的分子進(jìn)行篩選。具體地，該方法目的在于確定或甚至選擇包括特定靶成分的液滴，該靶成分可能由化學(xué)反應(yīng)或生物反應(yīng)得到。

具體地，液滴的測量和之后對液滴的選擇可基于產(chǎn)物的濃度或連接活性。

背景技術(shù)：

文獻(xiàn)wo2009/011808a1描述了一種用于測定在液滴中來附著蛋白質(zhì)的活性的方法。

mazutis等人于2013年4月4日在“natureprotocols”雜志上在線發(fā)表出版物“single-cellanalysisandsortingusingdroplet-basedmicrofluidics”闡述了這一原理。

用包被抗小鼠抗體的珠粒將小鼠雜交瘤封裝在滴液中。雜交瘤分泌抗體。與熒光團(tuán)偶聯(lián)的二抗為顯示分泌的抗體的存在提供了可能性。在不存在分泌的抗體的情況下，液滴中二抗的分布是均勻的，但是在存在抗體的情況下二抗重新定位在珠粒上。

因此，該方法對于確定特定細(xì)胞的活性是非常有選擇性的。

另一方面，這種方法具有多種缺點(diǎn)。用于使細(xì)胞和珠粒區(qū)室化的方法是隨機(jī)的。可通過泊松分布法估算滴液中的珠粒數(shù)。此外，可通過獨(dú)立泊松分布法估算滴液中的細(xì)胞數(shù)。調(diào)整珠粒和液滴的初始濃度，以使每個(gè)液滴具有平均一個(gè)細(xì)胞和一個(gè)珠粒。因此，對于實(shí)現(xiàn)的分析只有液滴的一部分是令人感興趣的。

此外，每個(gè)液滴存在的顯著尺寸的單個(gè)珠粒不利于該方法的分辨率。實(shí)際上，二抗分布在珠粒的整個(gè)表面上。因此，該方法的動(dòng)態(tài)范圍受限于每個(gè)珠?？捎玫耐獗砻娣e。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供比現(xiàn)有方法更可靠和更靈敏的分析方法。

為此，本發(fā)明的目的是提供一種上述類型的方法，其特征在于，所述方法包括測量步驟，所述測量步驟用于測量靶成分在聚集體上附著的物理參數(shù)特征。

根據(jù)本發(fā)明的方法可包括以下特征中的一個(gè)或幾個(gè)，這些特征單獨(dú)使用或根據(jù)技術(shù)上所有可能的組合來使用：

-顆粒是磁性顆粒，有利地是順磁性顆粒，優(yōu)選超順磁性顆粒；

-提供液滴的步驟包括：

-將顆粒分散在流體質(zhì)量中，用于形成液滴，然后

-以液滴形式分散所述流體質(zhì)量，

-在每一液滴中形成至少一個(gè)顆粒的聚集體，所述聚集體限定沿主軸線的細(xì)長物體，分散后，顆粒的聚集體形成于每一液滴中；

-靶成分是選自由蛋白質(zhì)、抗體、肽、dna或rna片段、代謝物、離子、脂質(zhì)和能由細(xì)胞產(chǎn)生的生物分子形成的組的成分；

-至少一些液滴包括能產(chǎn)生靶成分的生產(chǎn)實(shí)體，生產(chǎn)實(shí)體優(yōu)選選自由細(xì)胞或體外表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)成的組；

-所述測量步驟包括在位于所述液滴中的多個(gè)點(diǎn)中局部測量所述物理參數(shù)，所述測量步驟優(yōu)選包括確定所述液滴內(nèi)測量的值的積分；

-該方法包括在測量步驟之前，沿檢測軸線定向聚集體的主軸線的步驟；

-該方法包括多個(gè)測量步驟，具有用于為每次測量，沿不同的檢測軸線定向聚集體的主軸線的步驟；

-測量步驟在不存在任何液滴循環(huán)的微流體腔室中進(jìn)行；

-所述方法包括：

-提供設(shè)備，所述設(shè)備包括用于使液滴進(jìn)入循環(huán)的組件和檢測區(qū)域；

-朝檢測區(qū)域傳送液滴，在檢測區(qū)域內(nèi)進(jìn)行液滴內(nèi)的測量；

-所述方法包括：

-提供設(shè)備，所述設(shè)備包括用于使液滴進(jìn)入循環(huán)的組件和多個(gè)分類區(qū)域，以及用于將液滴或液滴的一部分選擇性地導(dǎo)向分類區(qū)域的構(gòu)件，

-決定所述液滴或所述液滴的一部分進(jìn)行分類，所述決定由從多個(gè)分類區(qū)域中選擇性地選擇分類區(qū)域組成，

-朝決定步驟期間所選擇的液滴的分類區(qū)域，分別傳送所述液滴的部分液滴。

-至少一個(gè)液滴包括至少一種靶成分、能夠與靶成分形成復(fù)合物的至少一個(gè)第一信號實(shí)體和能夠與靶成分形成復(fù)合物的不同的至少一個(gè)第二信號實(shí)體，所述方法包括測量指示在聚集體上重新定位的每一信號實(shí)體濃度的信號；

-至少一個(gè)液滴包括至少一種靶成分、能與靶成分形成復(fù)合物的至少一個(gè)信號實(shí)體和能與靶成分形成復(fù)合物的至少一個(gè)定量實(shí)體，所述方法包括：

-測量在聚集體上重新定位的信號實(shí)體的濃度信號，

-測量在聚集體上重新定位的定量實(shí)體的濃度信號，

-由重新定位的信號實(shí)體信號與重新定位的定量實(shí)體信號的比值，確定靶成分與信號實(shí)體的解離常數(shù)；

-至少一些液滴包含生產(chǎn)實(shí)體，所述生產(chǎn)實(shí)體是可以產(chǎn)生作為靶成分的至少一種抗體細(xì)胞，所述方法包括確定由所述生產(chǎn)實(shí)體所產(chǎn)生的抗體對至少一種抗原的親和力的步驟，該方法優(yōu)選包括在確定步驟之后，對液滴進(jìn)行分選的步驟；

-至少一個(gè)液滴包括至少兩個(gè)不同的信號實(shí)體，所述兩個(gè)不同的信號實(shí)體各自都能與聚集體上的不同靶成分形成復(fù)合物，所述方法包括測量每一重新定位的信號實(shí)體的濃度信號；

-至少一些液滴包括生產(chǎn)實(shí)體，所述生產(chǎn)實(shí)體是能產(chǎn)生一種或幾種蛋白質(zhì)類型的細(xì)胞，每種蛋白質(zhì)是不同的靶成分，對信號的測量表示每一重新定位的信號實(shí)體的濃度，從而能對所述一種或幾種蛋白質(zhì)進(jìn)行定量；

-物理參數(shù)的測量是熒光測量；

-所述液滴中的至少一個(gè)包括能夠分泌所述靶成分的細(xì)胞，并且所述方法包括孵育步驟，在所述孵育步驟期間所述靶成分由所述細(xì)胞分泌到所述液滴中；

-所述滴劑的至少一個(gè)包括細(xì)胞，且所述方法包括用于細(xì)胞裂解的步驟；

-所述液滴的至少一個(gè)包括能夠表達(dá)靶成分的體外翻譯系統(tǒng)；

-該方法包括以下步驟：在所述液滴的至少一個(gè)中，在位于遠(yuǎn)離聚集體的第一點(diǎn)局部地測量物理參數(shù)的步驟，以及在同一液滴中的聚集體附近的第二點(diǎn)局部測量相同的物理參數(shù)；

-顆粒的最大維度小于液滴直徑的50％

-液滴包含至少一個(gè)信號實(shí)體，并且物理參數(shù)的測量取決于信號實(shí)體在液滴的位置或相對于聚集體的位置；

-生產(chǎn)實(shí)體產(chǎn)生幾種靶成分，靶成分選自由蛋白質(zhì)、肽、dna或rna片段、代謝物、離子、脂質(zhì)和能由細(xì)胞產(chǎn)生的生物分子構(gòu)成的組；

-該方法包含確定生產(chǎn)實(shí)體的至少一個(gè)特征的步驟；

-用于在測量步驟之后進(jìn)行分類的步驟；

-液滴包含超順磁性顆粒，通過選自磁力、電場、介電電泳、電聚結(jié)或表面聲的引導(dǎo)構(gòu)件將液滴或液滴的一部分引向分類區(qū)域；

-通過磁力構(gòu)件提取液滴的一部分，所提取的部分形成輔液滴并包含聚集體。

本發(fā)明的目的還在于一種用于分析液滴內(nèi)容物的裝置，所述裝置包括：

用于提供包含于載流體中的多個(gè)液滴的組件，所述液滴中的至少一個(gè)包括顆粒的至少一個(gè)聚集體，該聚集體限定沿主軸線的細(xì)長物體，其特征在于，所述裝置包括用于測量靶成分在聚集體上附著的特征物理參數(shù)的組件，

優(yōu)選地，所述裝置進(jìn)一步包括：

用于使液滴循環(huán)的組件，

用于決定所述液滴分類的組件。

附圖說明

通過參照附圖，閱讀下面僅作為示例給出的描述之后，將更好地理解本發(fā)明。在附圖中：

-圖1是根據(jù)本發(fā)明的第一分析裝置的靶成分的示意圖，

-圖2是使用第一裝置的方法步驟的示意圖，

-圖3至圖6是在執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的不同方法步驟期間，根據(jù)本發(fā)明的第二裝置的一部分的照片，

-圖7是根據(jù)本發(fā)明的第三裝置的示意圖，

-圖8是根據(jù)本發(fā)明的第四裝置的示意圖，

-圖9是使用第一裝置的方法步驟的示意圖，

-圖10示出了通過該方法確定解離系數(shù)kd，

-圖11和圖12示出了用于產(chǎn)生液滴的設(shè)備，

-圖13和圖14示出了用于間隔開液滴并用于測量的組件，

-圖15和圖16示出了用于在兩個(gè)維度中讀取的組件，

-圖17、圖18和圖19示出了實(shí)施例3，

-圖20和圖21示出了實(shí)施例4，

-圖22和圖23示出了實(shí)施例5，

-圖24是在實(shí)施方法的步驟期間液滴的示意圖，

-圖25示出了實(shí)施例6，

-圖26、圖27和圖28示出了實(shí)施例7，

-圖29和圖30示出了實(shí)施例8，

-圖31和圖32示出了實(shí)施例9，

-圖33和圖34示出了實(shí)施例10。

具體實(shí)施方式

圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的用于分析液滴內(nèi)容物的第一裝置1。

裝置1包括組件4，該組件用于提供包含于載流體8中的多個(gè)液滴6，液滴6的至少一部分包括顆粒12的至少一個(gè)聚集體10，其中顆粒12的至少一個(gè)聚集體10限定主軸線x的細(xì)長物體。

裝置1進(jìn)一步包括用于液滴中的物理參數(shù)的測量組件14。

測量組件14例如能夠在至少一個(gè)液滴中遠(yuǎn)離聚集體10的第一點(diǎn)16中局部測量物理參數(shù)，并且在同一液滴中位于聚集體10附近的第二點(diǎn)18中局部測量相同的物理參數(shù)。

裝置1還包含設(shè)備20，該設(shè)備包括循環(huán)組件22、循環(huán)導(dǎo)管24和檢測區(qū)域26。

循環(huán)組件22能夠使各液滴6作為一連串連續(xù)的液滴在導(dǎo)管24中的載流體8中循環(huán)。

供應(yīng)組件4包括加載組件28和聚集組件30。供應(yīng)組件4進(jìn)一步包括間隔組件(ensembled'espacement)31。

加載組件28能提供含顆粒12分散體的多個(gè)初始液滴32，至少一個(gè)初始液滴32進(jìn)一步包括至少一種靶成分37。

間隔組件31能夠?qū)⒁幌盗幸旱沃械膬蓚€(gè)連續(xù)液滴6分開，即增加兩個(gè)連續(xù)液滴之間的距離。例如，間隔組件31包含載流體8的入口。間隔組件的實(shí)施例示出在圖13和圖14中。

載流體8能夠?qū)⒁幌盗幸旱沃械膬蓚€(gè)連續(xù)液滴6分開，以防止它們的接觸?；蛘?，液滴6的分離由機(jī)械設(shè)備進(jìn)行。

形成液滴6內(nèi)相的流體和載流體8基本上不混溶。例如，液滴6包括水性內(nèi)相，而載流體8是有機(jī)相或油相。

載流體8有利地是氟化油。

載流體8或形成液滴內(nèi)相的流體有利地包括能夠防止兩個(gè)液滴6接觸時(shí)融合的表面活性劑，例如美國專利2010/0105112中所述，或者還有來自raindancetechnologies的表面活性劑ea。

“基本上不混溶”通常是指在25℃和環(huán)境壓力下測量的，形成液滴的流體在載流體8中的溶解度小于1％。

液滴6的尺寸例如在1μm至1000μm之間。

液滴6的體積有利地在0.1皮升和1微升之間。

所提供的液滴6基本上是單分散的。這意味著液滴6的多分散性小于5％。

在所示實(shí)施例中，液滴6是球形的。或者，液滴6沿導(dǎo)管24的循環(huán)軸線y具有細(xì)長形狀?；蛘?，液滴6是沿與循環(huán)軸線y垂直的軸線呈扁平的圓盤形。

每個(gè)初始液滴32包括基礎(chǔ)流體、基礎(chǔ)流體中的固體顆粒12的分散體和多個(gè)信號實(shí)體34。此外，至少一個(gè)初始液滴32包括至少一種靶成分37。

顆粒12用于形成細(xì)長形狀的聚集體10。例如，顆粒12是在施加磁場時(shí)獲得磁矩的超順磁性顆粒。超順磁性是當(dāng)它們呈小粒子或納米顆粒形式時(shí)，呈現(xiàn)出的鐵磁性或亞鐵磁性材料的行為。在足夠小尺寸的粒子中，磁化可在溫度影響下自發(fā)地反轉(zhuǎn)。術(shù)語“磁性顆?！痹谖闹斜硎境槾判灶w粒。

磁性顆粒12例如選自dynal(lifetechnologies)或ademtech或miltenyi提供的顆粒。

顆粒12例如是納米級的。因此，它們的最大維度小于1μm，例如在50nm和1000nm之間。顆粒12有利地基本上是單分散的。例如，顆粒12的最大維度之間的差異嚴(yán)格地小于10％。選擇每個(gè)液滴6中的顆粒12的尺寸和數(shù)量，以形成所需數(shù)量的聚集體。顆粒12最大維度的尺寸小于液滴6直徑的50％。

顆粒12的濃度允許膠體穩(wěn)定性。

每個(gè)液滴6中的顆粒12的濃度使得顆粒12占據(jù)液滴6的體積的0.1％至5％，例如1.7％。

在一個(gè)例子中，33皮升的每個(gè)液滴6平均包含500個(gè)直徑為300nm的顆粒12。

顆粒12最初在初始液滴32中形成均勻的分散體。它們基本均勻地分布在初始液滴32的體積中。因此，顆粒12的濃度在整個(gè)初始液滴32中是均勻的。

顆粒12有利地具有允許生物分子偶聯(lián)的表面，由表面材料組成。例如，顆粒12包覆具有cooh或nh2官能團(tuán)的聚合物。

有利的是，該表面材料還為限制顆粒12在液滴中的自發(fā)聚集提供了可能性。

此外，例如通過聚集體中的珠粒材料與其相鄰體材料之間的非特異鍵，其可以有利地促進(jìn)聚集體10的穩(wěn)定性。

顆粒12有利地被官能團(tuán)化。這顯然意味著顆粒12的表面材料包括官能團(tuán)部分。

在示例的實(shí)施例中，官能團(tuán)部分包括捕獲成分36。捕獲成分36例如能夠捕獲靶成分37。捕獲成分36能夠經(jīng)由靶成分37間接地結(jié)合信號實(shí)體34?；蛘撸东@成分能夠直接與信號實(shí)體34結(jié)合。

例如，顆粒12上的捕獲成分36是蛋白g，靶成分37是能夠結(jié)合蛋白g的抗體，信號實(shí)體34是被抗體識別的抗原，抗原能夠結(jié)合抗體。

聚集組件30能夠沿主軸線x產(chǎn)生顆粒12的聚集體。

聚集組件30例如包含位于導(dǎo)管24兩側(cè)的兩個(gè)磁體38。磁場不與循環(huán)軸線y平行，而有利地與循環(huán)軸線y垂直。聚集組件30允許在每個(gè)液滴6中形成細(xì)長的聚集體。

在一個(gè)實(shí)施例中，磁體38是永磁體。

或者，聚集組件30包含非永磁體。

或者，聚集組件30能夠從活動(dòng)模式切換到非活動(dòng)模式，以便僅在一些液滴中產(chǎn)生細(xì)長的聚集體10。

顆粒12的每個(gè)聚集體10例如包含沿主軸線x方向的柱形物。柱形物的高度有利地在液滴6直徑的50％至100％之間。其寬度例如小于其高度的60％。

此外，聚集組件30例如能使聚集體沿著優(yōu)先軸線定向。在示例的實(shí)施例中，聚集體12的軸線x與循環(huán)導(dǎo)管24中的液滴6的循環(huán)軸線y垂直。

測量組件14例如包括激光線，該激光線能沿著沿軸線x'延伸的線光學(xué)測量熒光強(qiáng)度，其中軸線x'垂直于循環(huán)軸線y或相對于循環(huán)軸線y傾斜。

測量組件14能夠在檢測區(qū)域26中液滴內(nèi)進(jìn)行測量。

激光線的軸線x'有利地平行于檢測區(qū)域26中的聚集體的軸線x。

當(dāng)載流體8的流速恒定時(shí)，作為由激光線獲得的信號的時(shí)間函數(shù)，測量對應(yīng)于對通過激光線前部的液滴6進(jìn)行空間掃描。這可以連續(xù)地假設(shè)幾個(gè)測量點(diǎn)，尤其是位于遠(yuǎn)離聚集體10的至少一個(gè)第一測量點(diǎn)16和位于聚集體10附近更靠近聚集體10的第二測量點(diǎn)18。

實(shí)際上，在液滴6朝測量組件14逐漸通過期間，在液滴6的縱向維度上取多個(gè)連續(xù)的測量點(diǎn)。

在圖1和圖2示例的實(shí)施例中，信號實(shí)體34是發(fā)熒光的。

循環(huán)導(dǎo)管24用于允許液滴6、液滴32沿循環(huán)方向上的循環(huán)軸線y，從供應(yīng)組件4循環(huán)到測量組件14。

循環(huán)導(dǎo)管24有利地具有小于或等于1mm的內(nèi)徑。

循環(huán)導(dǎo)管24沿循環(huán)軸線y延長。循環(huán)導(dǎo)管24具有圓形輪廓的橫截面，例如圓形或橢圓形，或?yàn)槎噙呅螌?dǎo)管，具有諸如矩形輪廓。

例如，循環(huán)導(dǎo)管24限定為半透明材料，允許通過測量組件14來測量光學(xué)參數(shù)?；蛘?，循環(huán)導(dǎo)管24在檢測區(qū)域26中限定有至少一個(gè)透明測量窗口。

循環(huán)導(dǎo)管24的壁不能滲透載流體8。

例如，循環(huán)導(dǎo)管24被限定在內(nèi)徑有利地小于1mm的毛細(xì)管中?；蛘撸h(huán)導(dǎo)管24被限定在微流體芯片中。

液滴的循環(huán)組件22用于使液滴6、液滴32沿循環(huán)方向一個(gè)接一個(gè)地在導(dǎo)管24中移動(dòng)。

循環(huán)組件22例如包括注射泵，該注射泵可向載流體8施加受控流速?；蛘撸h(huán)組件22包括壓力控制器。

現(xiàn)在將描述應(yīng)用于第一裝置1中的根據(jù)本發(fā)明的第一分析方法。

提供如前所述的裝置1。在載流體8中制備如上所述的初始液滴32。

優(yōu)選地，顆粒12均勻分散在每個(gè)初始液滴32中。考慮到單個(gè)顆粒12具有比初始液滴32小的尺寸，每個(gè)初始液滴32包含大量的單個(gè)顆粒12，例如大于10個(gè)。獲得沒有任何顆粒12的初始液滴32的概率非常低，甚至為零。

優(yōu)選地，靶成分37和信號實(shí)體34均勻地分散在每個(gè)初始液滴32中。

在初始液滴32內(nèi)，在具有特定親和性的成分之間形成鍵。

在一個(gè)實(shí)施例中，每個(gè)靶成分37結(jié)合信號實(shí)體34且結(jié)合捕獲成分36。信號實(shí)體34因此被重新定位在顆粒12上。

在下文中，“重新定位”的實(shí)體是指結(jié)合聚集體10的實(shí)體。

通過循環(huán)組件22，將初始液滴32與導(dǎo)管24中的載流體8一起放入循環(huán)中。

朝聚集組件30引導(dǎo)至少一個(gè)初始液滴32。通過聚集組件30在初始液滴32中形成顆粒12的聚集體10，該顆粒12的聚集體10限定沿著主軸線x的細(xì)長物體。

優(yōu)選地，當(dāng)顆粒12是磁性顆粒時(shí)，在它們通過聚集組件30的每個(gè)磁體38的前部期間，顆粒12沿主軸線x對齊。

朝檢測區(qū)域26傳送含細(xì)長物體的液滴6。通過測量組件14，在至少一個(gè)液滴6中的至少一個(gè)第一點(diǎn)16中局部測量物理參數(shù)。

在具體應(yīng)用中，通過測量組件14在至少一個(gè)液滴6中的至少一個(gè)第一點(diǎn)16中局部測量物理參數(shù)，并且通過測量組件14在同一液滴6中的聚集體10附近的至少一個(gè)第二點(diǎn)18中局部測量相同的物理參數(shù)。

圖2示出了針對不同液滴6獲得的不同測量結(jié)果。該曲線圖示出了作為時(shí)間函數(shù)，通過激光線測量的熒光強(qiáng)度。

在信號實(shí)體34的波長特征的范圍內(nèi)測量熒光強(qiáng)度。在實(shí)施例中，在顆粒12的波長特征的范圍內(nèi)進(jìn)一步測量熒光強(qiáng)度，顆粒12是發(fā)熒光的。因此聚集體10更容易定位。

針對不同的液滴6，在圖2中以虛線示出了熒光強(qiáng)度40，其對應(yīng)于在激光線上測量的信號實(shí)體34的熒光。

針對不同的液滴6，在圖2中以實(shí)線示出了熒光強(qiáng)度41，其對應(yīng)于顆粒12的熒光。

測量步驟包含局部確定位于液滴中的多個(gè)點(diǎn)中的物理參數(shù)。它還有利地包括多個(gè)點(diǎn)中的測量值的累加，例如確定滴液6內(nèi)的測量值的積分。

示出的第一液滴42是不同的信號實(shí)體34還未重新定位在顆粒12上的液滴6。液滴6內(nèi)信號實(shí)體34的分布是均勻的。測量的熒光強(qiáng)度信號為平穩(wěn)期44。

示出的第二液滴48是部分信號實(shí)體34已被重新定位在顆粒12上的液滴6。實(shí)際上，這些信號實(shí)體34結(jié)合由捕獲成分36捕獲的靶成分37。因此，聚集體10附近的熒光強(qiáng)度比液滴6的其余部分更為顯著。測量的熒光強(qiáng)度信號除穩(wěn)定期52之外還具有峰50。

第二液滴48的平穩(wěn)期52的高度小于第一液滴42的平穩(wěn)期44的高度，因?yàn)楦俚男盘?4自由地遠(yuǎn)離聚集體10。

示出的第三液滴56是更顯著比例的信號實(shí)體34已被重新定位在聚集體上的液滴。熒光強(qiáng)度信號具有峰58和平穩(wěn)期59。所測量的峰58的高度大于在第二液滴48中測量的峰50的高度，因?yàn)楦嗟男盘枌?shí)體34被顆粒12捕獲并因此位于聚集體10附近。

圖9示出了對用于估算重新定位的信號實(shí)體34濃度的有用參數(shù)的選擇。

在示出了信號s隨時(shí)間t變化的圖9中，看到三個(gè)液滴含具有較高信號峰的一個(gè)(左側(cè)和右側(cè))或兩個(gè)(聚集體)。有用的參數(shù)可以是信號的最大值(表示為max)，即相對于給定閾值的信號積分(int)。

第一種方法由通過每個(gè)液滴6中信號最大值(max)估算該濃度，即重新定位在聚集體上的信號峰的高度組成。

第二種方法更精確，例如如圖9所示，其由計(jì)算每個(gè)液滴6的超過用戶所設(shè)閾值的信號積分(int)組成。如將在實(shí)施例3中闡明的，這種方法可證明對于限制信號的離差是更有趣的。

這些信號處理方法都可以實(shí)時(shí)地進(jìn)行。

可應(yīng)用其他方法，例如將這些方式組合，用于例如測量重新定位的和非重新定位的信號實(shí)體34。

本發(fā)明還允許測量液滴6中的靶成分37的濃度。

在這種情況下，簡單的一個(gè)例子是：

-捕獲成分36具有足夠的量并且對靶成分37具有足夠的親和力，以便在聚集體上捕獲至少大于90％的靶成分，有利地捕獲全部；

-信號實(shí)體34的濃度大于靶成分37的濃度，并且信號實(shí)體34和靶成分37之間的解離常數(shù)kd有利地以大于10的因數(shù)小于靶成分37的濃度。對于如實(shí)施例5所示的，在使用優(yōu)化的劑量試劑，如具有次納摩爾kd的單克隆抗體時(shí)，和當(dāng)想要檢測大于1納摩爾的濃度的靶成分37時(shí)，這是通常的情況。

“納摩爾”是指等于1納摩爾/l。

在這些具體條件下，每個(gè)靶成分37的存在引起捕獲成分36-靶成分37-信號實(shí)體34復(fù)合物的形成。因此，靶成分37的濃度與重新定位在聚集體10上的信號實(shí)體34的信號成比例。通過調(diào)整捕獲成分36或信號實(shí)體34對于靶成分37的濃度和親和力，其它條件可以實(shí)現(xiàn)定量，并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。

圖3至圖6示出了根據(jù)本發(fā)明的第二裝置60的一部分。

該第二裝置60與第一裝置1的不同之處在于，裝置20包括腔室62。腔室62包含多個(gè)循環(huán)通道64和多個(gè)分離墊66。

其他的腔室也是可能的。在另一個(gè)選擇中，腔室不包括文獻(xiàn)pct/fr2009/051396中所描述的，和由圖15和圖16所示的分離墊。

腔室62用于在聚集步驟或定向步驟期間和在測量步驟期間，將多個(gè)滴液6存儲在載流體8中。

第二裝置60的測量組件與第一裝置1的測量組件14的不同之處在于，它能夠同時(shí)測量存在于腔室62中的幾個(gè)液滴6上的物理參數(shù)。

圖3示出了含有在載流體8中的初始液滴32的腔室62。磁性顆粒12的分散體是可見的。

圖4示出了在液滴中形成聚集體10之后的同一腔室62。在每個(gè)液滴6中形成多個(gè)細(xì)長的聚集體。

圖5示出了在相同裝置60中具有細(xì)長的聚集體10的多個(gè)液滴6。已經(jīng)調(diào)節(jié)了液滴6的性質(zhì)和數(shù)量，使得每個(gè)液滴中僅存在一個(gè)細(xì)長的聚集體10。每個(gè)液滴6存在一個(gè)聚集體10有利于測量。

圖6示出了在沿相同檢測軸線d定向聚集體之后的同一腔室62。

根據(jù)本發(fā)明的第二裝置60的分析方法與先前描述的方法的不同之處在于，例如通過同時(shí)在整個(gè)腔室62中進(jìn)行測量，而不是使液滴6在檢測器前循環(huán)，同時(shí)對多個(gè)液滴6進(jìn)行測量，。

該方法的不同之處還在于，其包括在測量步驟之前，沿檢測軸線d定向聚集體10的主軸線x的步驟。

有利地，可以通過施加可變方向的磁場使檢測軸線倍增。該方法具有能區(qū)分液滴的其他非磁性物體的聚集體10，或者減少寄生信號的優(yōu)點(diǎn)。例如，可降低背景熒光噪聲。例如，沿不同軸線的檢測可以區(qū)分信號實(shí)體34在聚集體10上的重新定位，和信號實(shí)體34在液滴6的另一物體(例如細(xì)胞)上的重新定位。

該想法的實(shí)現(xiàn)由以下組成：施加磁場b1，用于使聚集體10的主軸線x沿第一方向d1對齊，然后施加垂直于b1的磁場b2，以使聚集體10的主軸線x沿垂直于d1的第二方向d2對齊。

圖7中示出了根據(jù)本發(fā)明的第三裝置70。

該第三裝置70與第一裝置1的不同之處在于它還包括分類組件72。

此外，第三裝置70與第一裝置1的不同之處在于，加載組件28包括內(nèi)相輸入?yún)^(qū)域74，和載流體輸入?yún)^(qū)域76，和匯合區(qū)域78。加載組件28還包括孵育區(qū)域79。

內(nèi)相輸入?yún)^(qū)域74包含第一輸入導(dǎo)管80、第二輸入導(dǎo)管82和匯合流導(dǎo)管84。

第一輸入導(dǎo)管80用于引入第一流體質(zhì)量86，該第一流體質(zhì)量86旨在形成液滴的內(nèi)相的一部分。在實(shí)施例中，內(nèi)部的第一流體質(zhì)量包含顆粒12和多個(gè)信號實(shí)體34。

第二輸入導(dǎo)管82用于引入第二流體質(zhì)量88，該第二流體質(zhì)量88旨在形成液滴的內(nèi)相的一部分。在實(shí)施例中，內(nèi)部第二流體質(zhì)量包含靶成分37的生產(chǎn)實(shí)體90的懸浮液。生產(chǎn)實(shí)體90例如是細(xì)胞90。

細(xì)胞90有利地是能夠分泌靶成分37的細(xì)胞。具體地，特定的細(xì)胞90是分泌抗體的細(xì)胞，如雜交瘤或漿細(xì)胞。分泌的抗體被顆粒12的捕獲成分36和信號實(shí)體34識別。

在液滴6中存在這些靶成分37能使信號實(shí)體34在聚集體10上重新定位。

第二流體質(zhì)量中的細(xì)胞90的濃度有利地使得相當(dāng)大比例的液滴僅含有一個(gè)細(xì)胞90，例如大于10％的液滴含有細(xì)胞90。

匯合流導(dǎo)管84允許要形成內(nèi)相的兩個(gè)流體質(zhì)量86、88進(jìn)行分布。

載流體輸入?yún)^(qū)域76用于輸入載流體8。在所示實(shí)施例中，載流體8通過兩個(gè)輸入導(dǎo)管92進(jìn)入。

匯合區(qū)域78連接載流體輸入?yún)^(qū)域76和內(nèi)相輸入?yún)^(qū)域74。具體地，匯合區(qū)域連接匯合流導(dǎo)管84與載流體輸入管道92。

匯合區(qū)域78能夠形成初始液滴32。這里所示的匯合區(qū)域78是流體動(dòng)力學(xué)聚集匯合處。流體動(dòng)力學(xué)聚集匯合處的實(shí)施例在圖11和圖12中示出?；蛘撸跏家旱?2形成于匯合處t處。

初始液滴32包括兩個(gè)流體質(zhì)量86、88的混合物。初始液滴32包括顆粒12和信號實(shí)體34的分散體。

至少某些初始液滴32進(jìn)一步包括細(xì)胞90。

孵育區(qū)域79位于匯合區(qū)域78的下游。孵育區(qū)域旨在允許通過細(xì)胞90分泌靶成分37?；蛘?，細(xì)胞90旨在在孵育區(qū)域79中被裂解，以便釋放靶成分37。

或者，孵育在設(shè)備20外進(jìn)行。

第三裝置70的不同之處在于，設(shè)備20進(jìn)一步包括多個(gè)分類區(qū)域94、96，和用于將液滴或液滴的一部分選擇性地導(dǎo)向分類區(qū)域94、96的構(gòu)件98。

分類區(qū)域94、96位于檢測區(qū)域26的下游。導(dǎo)管24包含在兩個(gè)輸出導(dǎo)管102、104中的分叉部100。第一分類區(qū)域94包含旨在接收第一組液滴106的第一輸出導(dǎo)管102。第二分類區(qū)域96包含旨在接收第二組液滴108的第二輸出導(dǎo)管104?；蛘?，設(shè)備20根據(jù)分選標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)量而包含更多數(shù)量的分類區(qū)域94、96。

用于選擇性地引導(dǎo)液滴的構(gòu)件98例如能夠利用磁力，將一個(gè)液滴6導(dǎo)向分類區(qū)域94、96。

或者，利用電極引導(dǎo)液滴6。

例如，通過介電電泳，通過具有流動(dòng)的電聚結(jié)或通過表面聲波(saw)，將液滴導(dǎo)向分類區(qū)域。

現(xiàn)在將描述根據(jù)本發(fā)明的使用第三裝置70的分析方法。

提供如前所述的裝置70。制備磁性顆粒12和信號實(shí)體34的懸浮液，并將其注入第一輸入導(dǎo)管80中。

制備細(xì)胞90懸浮液，并注入第二輸入導(dǎo)管82中。

提供載流體8，并注入用于載流體輸入管道92中。

利用循環(huán)組件22，使流體86、88開始運(yùn)動(dòng)。初始液滴32形成于匯合區(qū)域78中。

該方法進(jìn)一步包含孵育步驟，在該步驟期間，區(qū)室化的細(xì)胞90分泌靶成分37，例如待分析的蛋白質(zhì)。

或者，該方法包含用于細(xì)胞裂解的步驟，以釋放靶成分37，例如待在細(xì)胞質(zhì)外分析的蛋白質(zhì)。

這些裂解或孵育步驟在設(shè)備20的孵育區(qū)域79中進(jìn)行。

或者，這些步驟在設(shè)備20之外進(jìn)行。

用于形成聚集體10的步驟和測量步驟與使用第一設(shè)備1所進(jìn)行的分析方法相同。

該方法的不同之處在于，測量步驟之后是分析步驟。分析步驟可以根據(jù)預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)確定組106、108中的哪一組屬于液滴6，并且在測量步驟之后對于每個(gè)液滴6生成分類決定。

根據(jù)分類決定，通過引導(dǎo)構(gòu)件98將液滴6導(dǎo)向分類區(qū)域94、96之一。

在圖7所示的實(shí)施例中，其中強(qiáng)熒光強(qiáng)度的信號大部分位于聚集體10附近的液滴106被引導(dǎo)到第一分類區(qū)域94中。第一組液滴106例如對應(yīng)于圖2的第三液滴56。

這些液滴106包含例如能夠產(chǎn)生感興趣蛋白質(zhì)的細(xì)胞90?？蛇x地回收液滴106，以便通過其它技術(shù)分析其內(nèi)容物，或者以便再次培養(yǎng)細(xì)胞90。

液滴108被導(dǎo)向另一分類區(qū)域96，在液滴108中，測量到了不同信號，特別是液滴108上的基本均勻的信號。第二組液滴108例如包括：不含任何細(xì)胞90的液滴，和含有未以足夠的量和質(zhì)量產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞90的液滴。

圖8中示出了根據(jù)本發(fā)明的第四裝置120。該裝置120與第一裝置1的不同之處在于它進(jìn)一步包括提取組件122。

提取組件122能夠?qū)⒁旱?分離成兩個(gè)被提取的液滴124、126，主液滴124和輔液滴126，輔液滴126包括聚集體10。

有利地，顆粒12是磁性的，并且提取組件122能夠施加用于實(shí)現(xiàn)提取的磁力。

此外，第四裝置120包括在提取組件122下游的，類似于根據(jù)本發(fā)明的第三裝置70的分類組件的分類組件72，其可以將輔液滴126與主液滴124分離開。

在另一種選擇中，分類組件和提取組件是相同的。

這樣的裝置120對于利用細(xì)長的聚集體10實(shí)現(xiàn)選擇性捕獲特別有用。由顆粒12捕獲的靶成分37旨在回收所選擇的液滴之后被洗脫。

根據(jù)本發(fā)明的第五裝置與第一裝置不同之處在于它包括額外的注射設(shè)備和第二檢測區(qū)域。額外的注射設(shè)備能夠在檢測之后將成分添加到滴液中。

額外的注射設(shè)備例如是用于使滴液融合的設(shè)備或用于微量注射的設(shè)備。

根據(jù)本發(fā)明的第五裝置的分析方法包括在測量步驟之后的注射步驟，和在注射步驟之后的測量步驟。

例如，信號實(shí)體34是發(fā)熒光的，在額外的注射步驟期間，添加非熒光的額外的實(shí)體。除了熒光之外，額外的實(shí)體具有與信號實(shí)體34相同的特征。例如，額外的實(shí)體具有與信號實(shí)體34相同的對靶成分的親和力。在第一測量步驟中，確定熒光信號實(shí)體34的捕獲水平。在注射之后，額外的實(shí)體和信號實(shí)體34與聚集10附近的靶成分37競爭結(jié)合。

第二次測量在一定時(shí)間之后進(jìn)行，可以確定熒光信號實(shí)體34的釋放速率，從而確定信號實(shí)體34與靶成分37之間的鍵的解離常數(shù)k解離(koff)。

使用比液滴尺寸小的顆粒12的分散體，確保顆粒12在液滴6中均勻分布，因此在每個(gè)液滴6中準(zhǔn)確地形成具有顯著尺寸的聚集體10。

在全球范圍內(nèi)，該方法可以定量/量化液滴中的分析物。與mazutis等中描述的單個(gè)珠粒被封裝的試驗(yàn)(natprot2013)相比，細(xì)長的聚集體10的形成可以獲得更好的信噪比和更大的動(dòng)態(tài)區(qū)間。事實(shí)上，由信號實(shí)體34產(chǎn)生的信號將聚集在比相同表面積的球體的寬度小的寬度上。因此，對于相同數(shù)目的重新定位的信號實(shí)體34，如圖2所示峰的高度將比單個(gè)珠粒的情況高。

該方法可用于許多生物分析方法中。

根據(jù)本發(fā)明的方法可應(yīng)用于許多類型的分析物，生物分子、多肽、蛋白質(zhì)、代謝物、核酸、細(xì)胞、細(xì)胞器、微粒和納米顆粒、聚合物、膠體、感染劑、食品化合物、環(huán)境樣品。

根據(jù)本發(fā)明的裝置可作為技術(shù)磚集成在更復(fù)雜的裝置中，尤其是集成在高流量篩選設(shè)備、芯片實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)室儀器中的“即時(shí)(pointofcare)”裝置、機(jī)器人或其他設(shè)備中。

此外，根據(jù)本發(fā)明的方法可整合至復(fù)雜的程序中，可以進(jìn)行診斷、藥物發(fā)現(xiàn)、靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)、藥物評價(jià)。

此外，根據(jù)本發(fā)明的微流體系統(tǒng)和根據(jù)本發(fā)明的方法可以組合或包括在其他類型的微流體構(gòu)件中，或用于現(xiàn)有技術(shù)中已知的其它微流體功能中。

此外，由于所使用的樣品的尺寸小，本發(fā)明對于細(xì)胞試驗(yàn)中的應(yīng)用尤為有利，尤其是對于單細(xì)胞篩選和數(shù)字式生物學(xué)。

數(shù)字式是指生物操作是在化學(xué)或生物物體的單一拷貝上進(jìn)行的，并且可分離對每個(gè)單一拷貝的操作結(jié)果，而不是在一組這樣的生物體上進(jìn)行操作。

生物或化學(xué)物體是指任何分子、超分子結(jié)晶、膠體、細(xì)胞、亞細(xì)胞，以非窮舉的方式包括，細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒、修飾的天然dna或人工dna、rna或其它核酸、蛋白質(zhì)、糖蛋白、磷脂蛋白、人工或天然蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、磷脂、有機(jī)分子、有機(jī)金屬分子、大分子、分離的晶體、量子點(diǎn)(quantumdots)或量子點(diǎn)(pointsquantiques)、納米顆粒、囊泡、微膠囊和其他實(shí)體。

本發(fā)明可進(jìn)一步特別適用于與各種光學(xué)方法，特別是光學(xué)檢測方法結(jié)合。

上述方法例如可用于確定溶液中靶成分37的存在，溶液中靶成分37的濃度，上述方法允許建立靶成分37與存在于顆粒12上或液滴6中的另一物質(zhì)的親合特征。

本發(fā)明還允許測量靶成分37和信號實(shí)體34之間的解離常數(shù)kd。

在這種情況下，液滴6還包括具有與信號實(shí)體34不同的熒光的定量實(shí)體。

更具體地，成分a(靶成分37)和成分b(信號實(shí)體34)之間這一對a:b的解離常數(shù)kd的定義是：kd＝[a游離][b游離]/[a:b]

其中：

[a游離]是溶液中未與b結(jié)合的a的濃度，

[b游離]是溶液中未與a結(jié)合的b的濃度，

[a:b]是溶液中的a:b復(fù)合物的濃度，其中a與b結(jié)合。

物質(zhì)a的總濃度是：

[a總]＝[a游離]+[a:b]

物質(zhì)b的總濃度是：

[b總]＝[b游離]+[a:b]

液滴6中信號實(shí)體34的[b總]濃度由使用者所選擇且是已知的。

濃度[a總]可能事先不知道，例如當(dāng)a是由封裝在液滴6中的細(xì)胞90分泌的靶成分37時(shí)。

本發(fā)明可以通過信號實(shí)體34的信號測量重新定位在聚集體上的復(fù)合物[a:b]的濃度。

該測量可以允許在受控濃度條件下估算a和b之間的解離常數(shù)kd，其中a的定量是通過定量實(shí)體實(shí)現(xiàn)的，該定量實(shí)體為另一信號實(shí)體34。

這樣做的簡單的例子是以下情況：

-捕獲成分36對于靶成分37具有足夠的數(shù)量并且具有足夠的親和力，用于捕獲90％以上的靶成分37，聚集體10上的a，有利地捕獲全部，

-信號實(shí)體34的濃度大于靶成分37的濃度，

-用于定量a的定量實(shí)體的濃度大于靶成分37的濃度，并且定量實(shí)體和靶成分37之間的解離常數(shù)有利地以大于10的因數(shù)小于靶成分37的濃度。

特定條件下，每個(gè)靶成分37的存在引起形成捕獲成分36-靶成分37-定量實(shí)體復(fù)合物，和/或形成由捕獲成分36-靶成分37-信號實(shí)體34形成的復(fù)合物。

通過以下等式，捕獲成分36-靶成分37-信號實(shí)體34復(fù)合物的數(shù)量與靶成分37對信號實(shí)體34的kd直接相關(guān)：

即

存在以下條件，其中b總被設(shè)定，a總的變化可以忽略，并且對[a:b]/a總的唯一測量可以推斷kd。因此，a總<b總時(shí)，[a:b]/a總是的出色的近似值。

圖10再現(xiàn)了[a:b]/a總比值的模擬是對于不同的a總/b總比值的logkd的函數(shù)。

通過[a:b]/a總得到kd再次顯示出了對于高流量測量的明顯優(yōu)勢，因?yàn)樵谏鲜鎏囟ㄇ闆r下，這樣能夠通過信號實(shí)體信號34與定量實(shí)體信號的比值來估算[a:b]/a總的比值，其中信號實(shí)體信號34對應(yīng)于a:b復(fù)合物，定量實(shí)體信號對應(yīng)于a總。

該比值可以在液滴上實(shí)時(shí)獲取，并且是根據(jù)kd分選出液滴的標(biāo)準(zhǔn)。

該方法適用于確定靶成分37針對各種信號實(shí)體34的特異性，或者被捕獲成分36固定的分子或分子集合相對于各種信號實(shí)體34分子的特異性。在這種情況下，將多種信號實(shí)體34，例如標(biāo)記有不同顏色熒光團(tuán)的分子，注入到液滴6中。例如通過獲取不同波長的熒光，可以同時(shí)記錄每種信號實(shí)體34產(chǎn)生的信號。因此可以確定哪些信號實(shí)體34被定位在聚合體10上并對它們進(jìn)行定量。

例如，捕獲成分36是蛋白質(zhì)g，其捕獲由細(xì)胞90分泌的抗體37，并且信號實(shí)體34是不同動(dòng)物物種中的同源抗原，各自標(biāo)記有不同顏色的熒光團(tuán)。在這個(gè)實(shí)施例中，對每種信號實(shí)體34的信號進(jìn)行同時(shí)測量，可以確定作為抗體的靶成分37對動(dòng)物物種是特異性的(觀察到單一顏色的峰)，或不是特異性的(觀察到多種顏色的峰)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，顆粒12包被有能夠捕獲互補(bǔ)核苷酸序列的核苷酸序列。

或者，靶成分37是在液滴6中生產(chǎn)的蛋白，其中液滴6不包含任何細(xì)胞但包含體外翻譯系統(tǒng)。

上述方法對標(biāo)記產(chǎn)物的親和力分析和定量是有用的。例如，當(dāng)靶成分是包括熒光蛋白(如gfp)的融合蛋白時(shí)。

上述方法進(jìn)一步允許分選、捕獲和提取具有感興趣的特征的液滴。

在一個(gè)實(shí)施例中，上述方法包括形成夾心結(jié)構(gòu)，靶成分37一方面與顆粒14的捕獲成分36結(jié)合，另一方面與信號實(shí)體34結(jié)合，信號實(shí)體34是發(fā)熒光的。

在一個(gè)實(shí)施例中，捕獲成分36是抗體。

在一個(gè)實(shí)施例中，信號實(shí)體34是抗體。

在一個(gè)實(shí)施例中，靶成分37是蛋白質(zhì)。

或者，靶成分37是抗體或抗體片段。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，靶成分37是抗體，捕獲成分36是蛋白質(zhì)g，或蛋白質(zhì)a或結(jié)合抗體的另一種蛋白質(zhì)，如蛋白質(zhì)a/g或蛋白質(zhì)l.

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，靶成分37是抗體，捕獲成分36是抗體。

在一個(gè)實(shí)施例中，靶成分37是抗體，捕獲成分36是由抗體識別的抗原。

在另一實(shí)施例中，靶成分37是抗體，信號實(shí)體34是抗原。

在另一實(shí)施例中，捕獲成分36由彼此不相同的多種捕獲分子組成，并且靶實(shí)體37由彼此不相同的多種分子組成。

在另一實(shí)施例中，可以同時(shí)分析捕獲成分36-靶成分37對或捕獲成分36-靶成分37-信號實(shí)體34三聯(lián)體，用于檢測具有不同分子性質(zhì)的幾種靶成分37的存在，或用于檢測和表征在同一靶成分37上不同結(jié)合位點(diǎn)的存在。

例如，如圖24中的液滴所示，液滴包括具有不同性質(zhì)的幾種靶成分37a、37b和幾種信號實(shí)體34a、34b，每種信號實(shí)體能夠與靶成分37a、37b之一形成復(fù)合物。聚集體10的某些顆粒12包括適于捕獲第一靶成分37a的捕獲成分36a，其它顆粒包括適于捕獲第二靶成分37b的另一捕獲成分36b。

在一個(gè)實(shí)施例中，上述方法可以根據(jù)所測量的分泌抗體的永生化細(xì)胞的親和力進(jìn)行選擇。然后將所選擇的細(xì)胞再次投入培養(yǎng)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，上述方法可以在搜索抗體的基因序列之前，根據(jù)所測量的分泌抗體的非永生化細(xì)胞的親和力進(jìn)行選擇。

在另一實(shí)施例中，上述方法可以定量由血液中存在的不同類型的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。

在某些應(yīng)用中，顆粒12的聚集是可逆的。

在某些情況下，靶成分37的存在使得聚集不可逆，并且在聚集組件30中形成聚集體10期間進(jìn)行鞏固。因此，聚集體10僅在包含靶成分37的液滴6中以穩(wěn)定的方式預(yù)先存在。在不含靶成分37的液滴中，只要顆粒12不進(jìn)入讀取區(qū)域26，顆粒12的聚集可逆性就會使聚集體10解體。在選定的磁化和流體學(xué)條件下，聚集體10僅能形成并在這種預(yù)聚集的存在下自身進(jìn)行定向，這限制了通過除了經(jīng)由信號實(shí)體34之外的其它方法，獲取包含閾值成分37的液滴的根據(jù)圖2的峰。

上述方法特別適用于通過測量所產(chǎn)生的抗體的親和力，來篩選產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。例如，如果細(xì)胞是可產(chǎn)生抗體的b細(xì)胞，則該抗體對至少一種抗原的親和力由根據(jù)本發(fā)明的方法確定。并且根據(jù)所確定的親和力，通過根據(jù)本發(fā)明的方法對液滴進(jìn)行分選。

在另一應(yīng)用中，上述方法可以通過白細(xì)胞的異質(zhì)群體分析一種或多種細(xì)胞因子的分泌。例如，如果細(xì)胞是可產(chǎn)生一種或幾種類型細(xì)胞因子的細(xì)胞，則根據(jù)本發(fā)明的方法定量細(xì)胞因子。分析結(jié)果是關(guān)于細(xì)胞狀態(tài)的信息，具有潛在的診斷價(jià)值。

現(xiàn)在將描述上述方法的應(yīng)用實(shí)施例。

以下實(shí)施例的程序包括：

-制備水溶液，這幾種水溶液含有顆粒12、信號實(shí)體34和靶成分，或有利地是能夠在液滴中產(chǎn)生靶成分的系統(tǒng)，在液滴生成芯片的入口處注入水溶液，

-產(chǎn)生包括所有測試試劑的液滴，

-孵育含有液滴的溶液，

-將液滴注入根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備中(下面在實(shí)施例1和2中描述了兩種設(shè)備)，

-測量測試結(jié)果，

-可選地，根據(jù)測量分選出液滴。

實(shí)施例1：用于產(chǎn)生液滴并測量1型液滴的設(shè)備

在將試劑溶液和樣品溶液混合在芯片上之后，實(shí)現(xiàn)液滴的生產(chǎn)，或稱為區(qū)室化。

將溶液保持在冰中直到進(jìn)行區(qū)室化，以避免試劑和樣品發(fā)生任何降解。

就在開始區(qū)室化之前，將試劑溶液吸入到與填充有礦物油的1mlhamilton注射器(sigmaaldrich，#330760)連接的罐中。

待篩選的樣品在區(qū)室化前與工作溶液混合，然后轉(zhuǎn)移到預(yù)先裝有氟化油(3m，novechfe-7500)的玻璃小瓶中，并將小瓶在冰上保持在4℃。

毛細(xì)管，有利地是內(nèi)徑為0.3mm的ptfe(由fischer出售，#11919445)，可以將試劑溶液的小瓶和罐連接到用于形成液滴的設(shè)備。

這兩種溶液都注入到用于形成液滴的芯片上，這可以產(chǎn)生液滴，該液滴包括相同體積的兩種溶液中的每一種。

液滴的體積由使用者根據(jù)氟化油的流速來選擇。有利地，液滴的體積為33皮升。氟化油是載流體8。它形成含液滴的乳液連續(xù)相。

將試驗(yàn)試劑溶液和待篩選的試驗(yàn)樣品溶液以相同的流速注射到芯片中，各溶液有利地以200微升/小時(shí)的流速注射。通過標(biāo)準(zhǔn)注射泵系統(tǒng)(例如cetoni的泵nemesys)或通過控制壓力的泵(例如由fluigent銷售的系統(tǒng))，來改善流速。

如圖11和圖12所示，液滴在流體動(dòng)力學(xué)聚集匯合處產(chǎn)生。在此處，外相是氟化油(3m，novechfe-7500)，在其中添加有重量/體積為2％的表面活性劑(例如包含兩個(gè)全氟聚醚(pfpe)尾部(分子量約為6000g/mol)和peg頭部(約600g/mol)的三嵌段共聚物)。

圖11和圖12代表流動(dòng)聚集設(shè)備，其可以在右側(cè)的流體動(dòng)力學(xué)聚集匯合處形成液滴之前，混合含磁珠的流與含樣品的流，其中在含磁珠的流中，磁珠與其它試劑混合。在圖11中，磁性顆粒直徑的測量值為500nm，而在圖12中，磁性顆粒直徑的測量值為200nm。

第二步是收集步驟。小瓶允許液滴的收集，該小瓶在磁場下保持為4℃，磁場有利地由環(huán)形磁體(amazingmagneth250h-dm)產(chǎn)生。短的毛細(xì)管可以將小瓶連接到芯片。理想情況下，輸出毛細(xì)管測量值小于20厘米，有利地小于10厘米。

將液滴設(shè)置為有利地在37℃下孵育20至90分鐘并處于磁場中，時(shí)間和孵育溫度取決于所進(jìn)行的分析，以及生產(chǎn)實(shí)體90的類型和所研究的靶成分37的類型。

隨后進(jìn)行孵育，在4℃下轉(zhuǎn)移含有乳液的小瓶，且始終保持在磁場中。

第一種類型的設(shè)備是如圖1所述的根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備。

含有液滴的小瓶連接到用于再注射的芯片，小瓶一方面連接到芯片，另一方面連接到壓力系統(tǒng)、壓力泵或注射器及其泵，從而形成循環(huán)組件22。

間隔組件31包括與芯片連接的兩個(gè)油入口。這些入口旨在注入油，有利地注入氟化油，從而可以如圖13所示，將乳液的液滴間隔開。

有利地，間隔開的油的流速各自設(shè)定為300微升/小時(shí)，循環(huán)組件的流速有利地設(shè)定為50微升/小時(shí)，并且可以調(diào)整液滴的流速和再注射頻率，以便獲得包括在250hz和1000hz之間的頻率。

將有利地由k&jmagnetics，#bc14-n52提供的永磁體對38放置在芯片兩側(cè)主通道24的周圍。這些磁體38旨在在液滴的再注入期間產(chǎn)生和定向珠粒聚集體。

生成用于控制裝備，例如激光器或光電倍增管的軟件，用于分析和分選出液滴。分選系統(tǒng)需要用于進(jìn)行實(shí)時(shí)信號分析的fpga卡。

在液滴進(jìn)入間隔組件之后逐個(gè)進(jìn)行液滴測量，并且在經(jīng)過圖14所示的讀取區(qū)域之后，這些液滴可被分選至期望的出口。

在分選和回收是期望的時(shí)，被分選出來的液滴和未被分選出來的乳液收集在冰上，并且按照標(biāo)準(zhǔn)程序回收液滴的內(nèi)容物。

實(shí)施例2：用于測量2型液滴的設(shè)備

第二類型的測量設(shè)備是用于存儲在二維平面中產(chǎn)生的液滴的腔室。本實(shí)施例有兩個(gè)可能的替代選擇來制造該腔室。

第一選擇是以pdms用常規(guī)的微制造制成的腔室，如圖3～圖6所示，其有利地包括以規(guī)則的方式定位的柱形物以避免腔室的塌陷。

第二選擇是如圖14和圖16所示，根據(jù)發(fā)明pct/fr2009/051396的玻璃腔室。有利地，該方式可以在不使液滴變形的情況下長時(shí)間(>1h)孵育液滴。因此，在液滴形成后，可以將其直接收集在該腔室中。

圖15和圖16示出了根據(jù)本發(fā)明的二維讀出設(shè)備的實(shí)例，此處在玻璃腔室中，磁場由位于腔室一側(cè)的永磁體來操控。

以下實(shí)施例通用

在以下實(shí)施例中，液滴的制備包括：

-制備在以下實(shí)施例中被稱為“試劑溶液”和“待篩選的樣品溶液”的兩種水溶液，其中“試劑溶液”含有顆粒12、信號實(shí)體34，而“待篩選的樣品溶液”含有靶成分，

-在芯片入口處注入兩種水溶液，用于產(chǎn)生液滴，

-產(chǎn)生液滴，該液滴包括相同體積的兩種溶液中的每一種，

-在1型設(shè)備中測量液滴，

-可選地，分選出液滴(實(shí)施例4)。

將大體地描述兩種水溶液的制備，且如果需要，將在實(shí)施例中提及相對于該標(biāo)準(zhǔn)程序的差異。

a)試劑溶液的制備

該溶液中所包含的成分有利地彼此是惰性的，以避免在產(chǎn)生液滴之前發(fā)生試劑的聚集。

該第一水溶液包含：

-經(jīng)捕獲成分36(此處是蛋白質(zhì)g)官能化的顆粒12，此處是膠體磁性顆粒，和

-信號實(shí)體34，此處是標(biāo)記有熒光的抗原，例如標(biāo)記有熒光團(tuán)alexafluor488的抗原，

-可以檢測液滴6的著色劑，例如磺酰羅丹明b，

-用于定量抗體的實(shí)體，此處是發(fā)熒光的，例如標(biāo)記有熒光團(tuán)alexafluor647的抗小鼠單克隆抗體的片段，

-工作溶液。

每一試劑的濃度將針對每一實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。

將這些試劑稀釋于被稱為工作溶液的溶液中。所述工作溶液例如包括：

-30％v/v珀可(percoll)(由sigmaaldrich提供)，

-50mmnacl，

-25mmhepes緩沖液，ph7.4，

-由lifetechnologies提供的0.1％v/vpluronicf-68，

-thermoscientific的5％v/v血清超低igg。

使用lifetechnologies提供的補(bǔ)充有的rpmi-1640補(bǔ)足工作溶液的體積，以達(dá)到最終體積。

在使用前，處理磁性膠體顆粒12。顆粒12是由chemicell(screenmag)或ademtech(bioadembeads)以儲存溶液形式提供的顆粒。它們保留在磁性載體上以便抑制儲存溶液，但它們以10％w/w懸浮在過量的pluronicf-127(sigmaaldrich)中，有利地是顆粒初始體積的10倍，并在室溫下孵育30分鐘。

在該處理之后，磁性膠體顆粒12在pbs中洗滌兩次并懸浮在工作溶液中。

有利地，在加入測試試劑之前，將懸浮在工作溶液中的顆粒12超聲處理十分鐘。

熒光試劑在使用前進(jìn)行處理。熒光試劑例如是信號成分34、液滴的檢測著色劑和定量試劑。在抑制痕量的試劑聚集體前，熒光試劑在4℃下以至少12000g離心5分鐘。

b)待篩選的樣品溶液的制備。

待篩選的樣品溶液包括：

-靶成分37，該靶成分37能夠被捕獲成分36捕獲，

-或生產(chǎn)實(shí)體90，該生產(chǎn)實(shí)體90可在孵育階段期間在液滴中合成該靶成分37。該系統(tǒng)可以例如是細(xì)胞，或dna或體外表達(dá)系統(tǒng)。在這種情況下，靶成分37不預(yù)先存在于待篩選的樣品溶液中。

-工作溶液。

待使用的細(xì)胞的濃度取決于液滴所需的尺寸。有利地，每個(gè)液滴的細(xì)胞濃度為每個(gè)液滴0.3個(gè)細(xì)胞。具有33皮升液滴的乳液每毫升含有30×10⁶以上的液滴。對于33皮升的液滴，為了使每個(gè)液滴具有0.3個(gè)細(xì)胞，待篩選的樣品溶液中濃度大約需要是每毫升18×10⁶個(gè)細(xì)胞(其相對于液滴濃縮兩倍)。

應(yīng)當(dāng)注意，待篩選的樣品溶液中的細(xì)胞濃度比最終濃度高兩倍，因?yàn)閮煞N水溶液將以50/50的比例混合在液滴中。

細(xì)胞的制備過程取決于細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)。

實(shí)施例3：單克隆抗體對其抗原的親和力的定量和測量。

在本實(shí)施例中，靶成分37是已被包含于待篩選的溶液中的抗體，本實(shí)施例不使用細(xì)胞。

本實(shí)施例的一個(gè)目的是說明使用多種顏色進(jìn)行結(jié)合測試的可能性。另一個(gè)目的是證明用另一信號使重新定位信號歸一化的可能性。這樣通過可以使與重新定位的抗體(定量實(shí)體)的輕鏈結(jié)合的蛋白質(zhì)的信號歸一化，可以從抗原(信號實(shí)體)的定位信號來估算kd。

在本實(shí)驗(yàn)中，液滴測量值為33皮升。

待篩選的樣品溶液含有不同濃度的抗htnfα的單克隆抗體(由sigmaaldricht6817提供)，其稀釋于補(bǔ)充有30％v/vpercoll、0.1％v/vpluronicf-68、18mmhepes的、含2mm谷氨酰胺的rpmi-1640中。

在待篩選的樣品溶液中，抗htnfα的單克隆抗體的濃度如下：0nm、10nm、25nm或50nm。

試劑溶液含有以下試劑：

-8.33％v/v磁性顆粒(ademtech#0433)

-200nm的fab-dl650抗小鼠fab'2(定量實(shí)體)，

-100nm的htnfα-af488(信號實(shí)體)，

-1μm的磺酰羅丹明b(用于標(biāo)記液滴)。

由綴合有dylight-650(由abcam銷售，ab98760)的山羊f(ab')2抗小鼠igg(fab')2制備抗體fab-dl650片段，使用木瓜蛋白酶進(jìn)行消化并在蛋白g柱上純化。

該溶液用補(bǔ)充有30％v/vpercoll、0.1％v/vpluronicf-68和18mmhepes的rpmi-1640+2mm谷氨酰胺補(bǔ)足。

這樣可獲得具有50nm抗原af488、100nmfab-dl650，和分別為0nm、5nm、12.5nm或25nm針對該抗原的單克隆抗體的四種不同乳液。

然后利用1型設(shè)備分析液滴。

如圖17所示，本實(shí)驗(yàn)可示出以下可能性：在具有兩種熒光讀數(shù)的二級試劑的液滴中，在柱狀物中的磁性顆粒上進(jìn)行結(jié)合測試。此外，該方法可以通過將抗原的結(jié)合信號與參與抗原捕獲的抗體數(shù)量相關(guān)聯(lián)，來表征結(jié)合親和力。實(shí)際上，可從分析中提取不依賴抗體濃度的參數(shù)。

圖17示出了對于兩種顏色，且對于a的量從0nm到25nm增加的一連串液滴的實(shí)時(shí)熒光測量，其中的兩種顏色中，一種顏色對應(yīng)于信號實(shí)體34(復(fù)合物ab，在圖17中為淺灰色)，一種顏色對應(yīng)于定量實(shí)體(化合物a，深灰色)。圖18是對應(yīng)于本實(shí)驗(yàn)的二維圖，其中每個(gè)點(diǎn)是一液滴，橫坐標(biāo)是定量實(shí)體的顏色為熒光最大值，縱坐標(biāo)是信號實(shí)體34為熒光最大值。圖19表示對于同一組液滴的二維圖，其中每個(gè)點(diǎn)的橫坐標(biāo)是定量實(shí)體的顏色的積分，縱坐標(biāo)是信號實(shí)體34的積分。

我們看到，盡管特別是由于在全部液滴上聚集體的形狀和位置的波動(dòng)，數(shù)據(jù)點(diǎn)具有離差，但“最大”信號之間的關(guān)系是全局線性的(如r²＝0.79的線性回歸所示)。我們看到，“積分”信號之間的關(guān)系由具有更好的r²(r²＝0.90)的線性回歸所表征，點(diǎn)的離差更低，并且可以如前闡明的由ab/a比值估算kd。

實(shí)施例4：根據(jù)雜交瘤分泌的抗體的親和力，在單個(gè)細(xì)胞的規(guī)模上分選出雜交瘤。

本實(shí)驗(yàn)的目的是通過使用類似于實(shí)施例3的試劑和方法，根據(jù)分泌的單克隆抗體的結(jié)合親和力，來證明產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的篩選。具體地，看到可以區(qū)分和分選出兩種雜交瘤：分泌抗tnfα抗體的雜交瘤(25h12系)和分泌抗c-myc抗體的雜交瘤(9e10系)。

在這個(gè)實(shí)施例中，不僅估算了親和力，而且根據(jù)細(xì)胞的親和力分選出了細(xì)胞。

在本實(shí)驗(yàn)中，液滴測量值為33皮升。

待篩選的樣品溶液含有懸浮在實(shí)施例1中描述的工作溶液中的、13.5×10⁶個(gè)雜交瘤9e10細(xì)胞和4.5×10⁶個(gè)雜交瘤25h12細(xì)胞。

試劑溶液含有懸浮在工作溶液中的以下試劑：

-8.33％v/v磁性顆粒(ademtech#0433)，

-100nm的抗體-dl650抗小鼠fab'2片段(定量實(shí)體)，

-100nm的htnfα-af488(信號實(shí)體)，

-2μm的磺酰羅丹明b。

這樣得到具有50nm的htnfα-af488、50nm的fab-dl650和一種雜交瘤細(xì)胞的乳劑，其中一種雜交瘤細(xì)胞要么對于25h12雜交瘤來說分泌抗htnfα的抗體，要么對于9e10雜交瘤來說分泌抗c-myc的抗體。25h12細(xì)胞占細(xì)胞的25％，而9e10細(xì)胞占細(xì)胞的75％。

測量不同熒光通道的熒光，綠色用于測量抗原，紅色用于測量定量實(shí)體。本實(shí)施例中的相關(guān)信號是熒光最大值。分選出并收集顯示出顯著綠色和紅色熒光信號的液滴。

如mazutis等人(natprot2013)所述，破壞經(jīng)分選并收集的液滴，并回收細(xì)胞。

然后對從被分選出來的液滴或從未被分選出來的乳液中提取的細(xì)胞溶液，進(jìn)行實(shí)時(shí)pcr，并通過使用兩種限制酶消化pcr產(chǎn)物。bamhi酶在來自9e10細(xì)胞的cdna上具有限制性位點(diǎn)，而kpni酶在來自25h12的cdna上具有限制性位點(diǎn)。通過電泳分析消化產(chǎn)物。在圖20和圖21中，可以看出該方法能使25h12細(xì)胞在通過該設(shè)備篩選后中得到富集。

因此，本發(fā)明可以以高流速的單細(xì)胞進(jìn)行特定選擇，其中單個(gè)細(xì)胞分泌識別信號實(shí)體的抗體。

圖20和圖21示出了根據(jù)本發(fā)明的雜交瘤的分選。圖20描繪了二維圖，其中每個(gè)點(diǎn)是以下液滴，該液滴的橫坐標(biāo)是對于信號實(shí)體顏色的熒光最大值，并且縱坐標(biāo)是對于定量實(shí)體的熒光最大值。黑框表明所選的用于進(jìn)行分選的取值范圍。

圖21示出了通過實(shí)時(shí)pcr和使用bamh1(左四欄系列)或kpn1(右四欄系列)的酶切進(jìn)行的分析，該分析是對來自純雜交瘤25h12(抗tnfα)和純雜交瘤9e10(抗cmyc)(每系列的前兩欄)，和25/75混合物(每個(gè)系列的第三欄)，最后是根據(jù)本發(fā)明使用識別tnfα的生物測試進(jìn)行富集后的該混合物(在每個(gè)系列的第四欄)的dna進(jìn)行的。分選后，25h12細(xì)胞富集約20倍。

實(shí)施例5：在單細(xì)胞規(guī)模上定量分泌的細(xì)胞因子。

本實(shí)施例的目的是通過夾心免疫學(xué)試驗(yàn)的一般方法，來證明在單細(xì)胞規(guī)模上檢測和定量分泌的細(xì)胞因子的可能性。在本實(shí)施例中，捕獲成分36是與鏈霉親和素連接的生物素化抗體，而信號實(shí)體34是熒光檢測抗體。

顆粒用鏈霉親和素功能化，捕獲抗體被生物素化?？梢允褂昧硪环N用于將捕獲抗體偶聯(lián)在顆粒上的方法。

偶聯(lián)方法是共價(jià)的或非共價(jià)的。重要的準(zhǔn)則是信號實(shí)體不直接捕獲在顆粒表面上。

此處顯示了一種方法，其用于根據(jù)本發(fā)明并用1型的測量設(shè)備，在單細(xì)胞規(guī)模上定量γ干擾素(ifnγ)的分泌，其中γ干擾素是許多炎癥或感染情況下的生物標(biāo)記細(xì)胞因子。這樣的生物測定可在功能免疫學(xué)測試范圍內(nèi)，用于測試患者的免疫系統(tǒng)的運(yùn)行。在該測試中，刺激免疫細(xì)胞并測量它們的細(xì)胞因子分泌。

在本實(shí)施例中，我們證明了在體積測量值為25至40pl的液滴中，測定重組ifnγ的可能性。

但是，這個(gè)測定法的目的是用于單獨(dú)封裝的細(xì)胞，現(xiàn)在描述該測定法的一般步驟。

每個(gè)液滴含有免疫夾心系統(tǒng)所需的所有成分：夾心結(jié)構(gòu)例如由包被有鏈霉親和素的磁性熒光珠粒、生物素化抗體和熒光抗體組成。兩種抗體抗ifnγ的兩個(gè)不同的表位。

工作溶液含有一些培養(yǎng)基和細(xì)胞活化劑(例如分裂素、抗原)。

一旦將細(xì)胞和免疫測試夾心系統(tǒng)封裝在液滴中，就孵育乳液。在磁場的作用下，顆粒在液滴內(nèi)定向并形成柱狀物。在捕獲抗體通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)非共價(jià)偶聯(lián)的情況下，通過位于捕獲抗體上的多個(gè)生物素橋接珠粒，使柱狀物中的珠粒的聚集變得不可逆。

孵育允許分泌，并可選地允許分子彼此結(jié)合。孵育后，利用根據(jù)本發(fā)明的1型設(shè)備分析液滴。

含細(xì)胞的液滴不對激活信號作出反應(yīng)，且不分泌任何γ干擾素，包括全部液滴內(nèi)的熒光抗體。分泌γ干擾素的液滴具有生物素化的捕獲抗體-ifnγ-熒光檢測抗體的夾心結(jié)構(gòu)，該夾心結(jié)構(gòu)重新定位在珠粒的鏈霉親和素表面上。從而在這些液滴中，測量了在聚集體處重新定位的熒光。

分泌的γ干擾素越多，顆粒線上的熒光越強(qiáng)，熒光峰和/或熒光信號的積分越高。因此，這可以定量被刺激細(xì)胞分泌的γ干擾素。

在本實(shí)施例中，我們已經(jīng)表明，可以通過使用以下試劑來實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的用于檢測和定量γ干擾素的測試：

試劑溶液：

-200nm的生物素化捕獲抗體(mabtech7-b6-1)。

-200nm的標(biāo)記有藻紅蛋白(pe)(miltenyi45-15)的檢測抗體(信號實(shí)體)

-工作溶液：30％percoll(sigma)/1％pluronicf-68(lifetech)/69％pbs(sigma)

待篩選的溶液：

-0nm或20nm或200nm的重組ifnγ1b(miltenyi)

-磁珠篩選mag/r鏈霉親和素0.5μm(chemicell)(120μl乳液為20μl)。

使用類似于實(shí)施例1和3的設(shè)備，通過作用于流量以獲得對于每一ifnγ濃度的不同大小(但總是通過保持水溶液兩個(gè)注射流量相等以獲得所需的最終濃度)，從三種待篩選的溶液產(chǎn)生液滴。對于0nm的ifnγ，液滴為約25pl；終濃度為10nm時(shí)液滴為31pl，終濃度為100nm時(shí)液滴為38pl?；旌?、孵育并分析這三種液滴群，以測量重新定位的橙色檢測抗體。相同的步驟是實(shí)施例3中的步驟之一。2個(gè)熒光通道所測量的熒光：橙色為檢測抗體(pmt3)，紅色為珠粒(pmt4)。本實(shí)施例中所考慮的信號是熒光最大值。

我們?nèi)コ藢Φ蚿mt4(珠粒)值(pmt4<0.34)的液滴的分析，這對應(yīng)于磁珠線形成或定向不良的情況。

如圖22和圖23所示，對剩余液滴的分析表明，可以由尺寸和檢測抗體信號(pmt3)來區(qū)分三種液滴群，這證明了定量液滴中ifnγ的可能性。

還顯示了pmt3和pmt4上的信號之間存在線性關(guān)系，這表明每個(gè)磁珠的檢測抗體量是恒定的，并且信號實(shí)體信號(pmt3)的變化與聚集體形狀的變化直接相關(guān)。

圖22和圖23示出了根據(jù)本發(fā)明的微流體液滴中的細(xì)胞因子(γ干擾素，ifnγ)的檢測和定量。在圖22中，按照相對于其尺寸(寬度)的，它們的橙色(pmt3)的最大熒光表示含有0nm、10nm或100nmifnγ的三種液滴群，其中橙色(pmt3)的最大熒光對應(yīng)于檢測抗體。在圖23中，按照相對于其紅色(pmt4)的最大熒光，按照它們的橙色(pmt3)的最大熒光，示出三種液滴群，其中紅色(pmt4)的最大熒光對應(yīng)于珠粒。

實(shí)施例6：根據(jù)所分泌的抗體的結(jié)合活性，在單細(xì)胞規(guī)模上分選出原代細(xì)胞，更特別是淋巴細(xì)胞b(漿細(xì)胞)。

本實(shí)驗(yàn)的目的是通過使用類似于實(shí)施例4的試劑和方法，根據(jù)所分泌的單克隆抗體的結(jié)合活性，來證明對生產(chǎn)抗體的原代細(xì)胞的篩選。具體地說，已表明可以根據(jù)b淋巴細(xì)胞分泌的單克隆抗體的結(jié)合活性，對b淋巴細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分和分選。

已經(jīng)預(yù)先從小鼠的脾臟中提取了b淋巴細(xì)胞，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法(panb試劑盒ii#130-104-443，miltenyibiotec)進(jìn)行了純化。在本實(shí)施例中，捕獲成分36是生物素化抗原，更特別的是“tt生物素”，“tt生物素”是利用例如由thermofisher提供的標(biāo)準(zhǔn)試劑盒的標(biāo)記程序，預(yù)先經(jīng)生物素功能化的蛋白質(zhì)破傷風(fēng)毒素(tetanustoxoid)。在本實(shí)施例中，僅觀察抗體與靶抗原的結(jié)合活性，除此以外還根據(jù)其結(jié)合活性對細(xì)胞進(jìn)行分選。

在本實(shí)驗(yàn)中，液滴測量值為40皮升。

在本實(shí)施例中，工作溶液包括：

-5％v/v血清超低igg(#sh30898.03，thermothermoscientific)，

-25mmhepes緩沖液，ph7.4，

-由lifetechnologies提供的0.1％v/vpluronicf-68，

-1％v-v抗菌-抗真菌劑(#15240，thermofisher)。

使用lifetechnologies提供的dmem-f12補(bǔ)足工作溶液的體積，以達(dá)到最終體積。

生產(chǎn)兩種乳液，并在生產(chǎn)之后，分析和篩選之前放在一起。多數(shù)乳液(約1000萬個(gè)液滴)由待篩選的細(xì)胞以及檢測試劑組成。第二乳液，所謂的陰性對照乳液，包含約100萬個(gè)液滴，僅由檢測試劑組成。兩種乳液利用兩種不同濃度的橙色熒光團(tuán)、磺酰羅丹明b是可區(qū)分的。

待篩選的樣品溶液含有懸浮在實(shí)施例1中描述的工作溶液中的6.6×10⁶純化的原代細(xì)胞。

試劑溶液含有懸浮在工作溶液中以下試劑：

-33.33％v-v磁性顆粒鏈霉親和素(ademtech#0433)，

-200nm兔fab'2抗fc小鼠af647，jacksonir#315-606-146(定量實(shí)體)，

-100nmtt生物素(捕獲成分36)，

-0.8μm或1.6μm或2.4μm磺酰羅丹明b(sigmaaldrich#s1402)。

這樣得到具有以下物質(zhì)的乳液：50nm生物素化抗原(tt生物素)、100nm兔fab'2抗fc小鼠af647，和分泌或不分泌抗抗原(破傷風(fēng)類毒素)的抗體的獨(dú)特的原代細(xì)胞。

測量定量實(shí)體的紅色熒光。本實(shí)施例中所考慮的信號是熒光最大值。將具有大的紅色熒光信號、具有正確尺寸和來源于原代細(xì)胞乳液(磺酰羅丹明b的低橙色熒光)的液滴分選出來，收集并破碎，然后如實(shí)施例4那樣回收細(xì)胞。

圖25表示對于在定量實(shí)體通道上測量的熒光信號，所計(jì)數(shù)的液滴數(shù)目的直方圖。橫坐標(biāo)表示定量實(shí)體的顏色的熒光最大值，縱坐標(biāo)表示在該熒光值下測量的液滴數(shù)目的底數(shù)10的對數(shù)。將獲得的待篩選的原代細(xì)胞乳液的值繪制成黑色實(shí)線。將獲得的陰性對照乳液的值繪制成灰色虛線。具有黑色圓點(diǎn)狀垂直線表示閾值，選擇該閾值以上的液滴用于分選。

然后，對從被分選出來的液滴所提取的細(xì)胞或未被分選出來的細(xì)胞溶液進(jìn)行elispot，即在純化之后(miltenyi試劑盒)但在微流體篩選之前。從而測試由elispot分析的細(xì)胞的抗體分泌和抗tt抗體分泌。

通過elispot，實(shí)現(xiàn)了對被分選出來的原代細(xì)胞，和經(jīng)純化的、但未被分選出來的原代細(xì)胞的分析。通過使用如小鼠iggelispot^basic試劑盒(mabtech#3825-2a)所述的方法，對兩種標(biāo)記物進(jìn)行分析。第一標(biāo)記物，所謂的igg，使用“總igelsipot”方法，并可以檢測分泌抗體的細(xì)胞數(shù)量。第二標(biāo)記物，所謂的tt，使用“抗原特異性igelsipot，protocolii”方法，并且能檢測分泌具有對抗原tt的結(jié)合活性的抗體的細(xì)胞數(shù)目。

豐度(enrichissement)η根據(jù)下式計(jì)算：n+,0是分選前的陽性細(xì)胞數(shù)目，n+,1是分選后的陽性細(xì)胞數(shù)目，n-,0和n-,1分別為分選前后陰性細(xì)胞的相應(yīng)值。

在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對于5000個(gè)未被分選出來的細(xì)胞，獲得對tt的51個(gè)陽性細(xì)胞和4949個(gè)陰性細(xì)胞，并且對于1000個(gè)被分選出來的細(xì)胞，獲得對tt的132個(gè)陽性細(xì)胞和868個(gè)陰性細(xì)胞。

該實(shí)驗(yàn)顯示，在分選后對tt具有結(jié)合活性的分泌細(xì)胞中豐度η因子為約15，并且這些細(xì)胞占所檢測的分泌抗體的細(xì)胞的93％。

elispot測試顯示，該方法允許在使用設(shè)備進(jìn)行篩選之前在原代細(xì)胞中進(jìn)行富集的可能性。

因此，本發(fā)明允許對高流速的單個(gè)原代細(xì)胞進(jìn)行特定選擇，其中單個(gè)原代細(xì)胞分泌識別捕獲成分的抗體。

實(shí)施例7：在2d腔室中定量單克隆抗體并檢測與其抗原的結(jié)合。

在本實(shí)施例中，靶成分37是已被包含于待篩選的溶液中的抗體，本實(shí)施例不應(yīng)用細(xì)胞。

本實(shí)施例的目的是證明，在60型設(shè)備中，可以根據(jù)針對給定抗原的單克隆抗體的濃度，測量定量反應(yīng)，其中60型設(shè)備即為液滴以單層二維分布于其中的腔室。在本實(shí)施例中，信號實(shí)體是熒光抗原，更特別的是“tt-af488”，一種利用例如由thermofisher提供的標(biāo)準(zhǔn)試劑盒的標(biāo)記程序，預(yù)先經(jīng)熒光團(tuán)alexaflour-488功能化的蛋白質(zhì)破傷風(fēng)毒素。在本實(shí)施例中，用于形成液滴的柱狀物的磁性顆粒用捕獲實(shí)體進(jìn)行飽和標(biāo)記，此處，捕獲實(shí)體是“captureselecttm生物素抗lc-κ(鼠科)偶聯(lián)物”(thermofisher#7103152500)。

在本實(shí)驗(yàn)中，液滴測量值為40皮升。

在本實(shí)施例中，工作溶液包括：

-5％v-v血清超低igg(#sh30898.03，thermothermoscientific)，

-25mmhepes緩沖液，ph7.4，

-由lifetechnologies提供的0.1％v/vpluronicf-68。

使用lifetechnologies提供的不含任何酚紅的dmem-f12補(bǔ)足工作溶液的體積，用于達(dá)到最終體積。

試劑溶液含有懸浮在工作溶液中以下試劑：

-33.33％v-v磁性顆粒鏈霉親和素(ademtech#0433)，預(yù)先用捕獲實(shí)體飽和標(biāo)記，

-150nm兔fab'2抗fc小鼠af647，jacksonir#315-606-146(定量實(shí)體)，

-50nm的tt-af488(捕獲實(shí)體)，

-0.8μm或1.6μm或2.4μm磺酰羅丹明b(sigmaaldrich#s1402)。

這樣得到具有25nm熒光抗原(tt-af488)、75nm定量實(shí)體(兔fab'2.抗fc小鼠af647)，和一定濃度范圍的單克隆抗體的乳液，該單克隆抗體(tt7)具有對抗原的結(jié)合活性，且濃度范圍包括以下數(shù)值：0、4.2、12.5、20.8、42(僅圖s7b)，62.5、83.3、125、208、250(僅圖s7b)。通過表達(dá)由brandonjdekosky等人撰寫的文章中公開的序列的重組蛋白，獲得稱為tt7的抗tt抗體，該文章的名稱為“high-throughputsequencingofthepairedhumanimmunoglobulinheavyandlightchainrepertoire”2013年發(fā)表在“naturebiotechnology”第31卷，第166至169頁。

所測量的多種乳液可以通過使用一系列濃度的橙色熒光團(tuán)、磺酰羅丹明b來區(qū)分。所收集的測量結(jié)果并不是同時(shí)實(shí)現(xiàn)的。

圖26表示在本實(shí)施例中使用的第二裝置60的類型的測量設(shè)備。在兩個(gè)玻璃載片之間產(chǎn)生高度為40μm的腔室。上玻璃載片上制成入口和出口，各自均設(shè)置有標(biāo)準(zhǔn)連接器，用于將其與連接毛細(xì)管連接。

如圖27所示，本實(shí)驗(yàn)示出以下可能性：在具有兩種熒光讀數(shù)的二級試劑的液滴中，對柱狀物中的磁性顆粒上進(jìn)行結(jié)合測試。在沒有任何單克隆抗體的情況下，觀察到信號實(shí)體(圖27a)和定量實(shí)體(圖27b)的分散的熒光。相反，在存在50nm的對抗原具有結(jié)合活性的單克隆抗體(tt7)的情況下，觀察到信號實(shí)體(圖27c)和定量實(shí)體(圖27d)的熒光的重新定位。

圖28是滴定曲線，表示根據(jù)靶成分(抗體tt7)的納摩爾濃度，定量實(shí)體(圖28a)和信號實(shí)體(圖28b)的重新定位的信號與分散信號的比值。

實(shí)施例8：在2d腔室中測量單克隆抗體對其抗原的親和力

除了測量幾種不同的靶成分37之外，本實(shí)施例在各方面與實(shí)施例7類似，其中靶成分37代表對于抗原的親和力范圍。

本實(shí)施例的目的是證明，在60型設(shè)備中，可以測量單克隆抗體針對給定抗原的親和力，其中60型設(shè)備即為液滴以單層二維分布于其中的腔室。

根據(jù)測量與珠粒柱上的固定化抗體結(jié)合的熒光抗原的濃度，并且根據(jù)同時(shí)測量珠粒柱上所捕獲的抗體的濃度，來估算解離常數(shù)kd。

通過表達(dá)由brandonjdekosky等人撰寫的文章中公開的序列的重組蛋白，獲得稱為tt4、tt7和tt10的抗tt的抗體，該文章名稱為“high-throughputsequencingofthepairedhumanimmunoglobulinheavyandlightchainrepertoire”2013年發(fā)表在“naturebiotechnology”第31卷，第166至169頁。

在幾種不同的乳液中，使用不同濃度的三種抗體中的每一種，以便通過線性回歸，分別獲得三個(gè)抗體的每一種的信號實(shí)體信號與定量實(shí)體信號的比值，更具體地，對于tt10抗體為0nm、5nm和10nm，對于tt4抗體為0nm、2.5nm和10nm，以及對于tt7抗體為0nm、5nm、10nm，15nm和25nm。

如圖29和圖30所示，本實(shí)驗(yàn)為示出以下可能性：將信號實(shí)體信號與定量實(shí)體信號的比值，與所選擇的靶成分的解離常數(shù)相關(guān)聯(lián)。

圖29是表示對于本實(shí)驗(yàn)中測試的三種單克隆抗體tt4、tt7和tt10的圖，橫坐標(biāo)表示定量實(shí)體的重新定位的信號和分散信號比值，縱坐標(biāo)表示信號實(shí)體的重新定位的信號和分散信號比值。

圖30是如下的圖，其橫坐標(biāo)表示通過表面等離子共振(spr)獲得的三種單克隆抗體的解離常數(shù)，縱坐標(biāo)表示它們信號實(shí)體信號與定量實(shí)體信號的比值。

實(shí)施例9：在2d腔室中原代細(xì)胞分泌單克隆抗體的動(dòng)力學(xué)和定量測量。

除了靶成分37是由原代細(xì)胞分泌的單克隆抗體且動(dòng)力學(xué)測量了該分泌之外，本實(shí)施例在各方面與實(shí)施例8類似。

本實(shí)施例的一個(gè)目的是證明，對于給定抗原，可以同時(shí)測量分離于60型設(shè)備的液滴中的單原代細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的分泌動(dòng)力學(xué)和親和力。

如實(shí)施例6那樣，預(yù)先從小鼠的脾臟提取b淋巴細(xì)胞，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法(panbkitii#130-104-443，miltenyibiotec)純化。

圖31是表示在單細(xì)胞規(guī)模上，磁珠線重新定位的信號與液滴的分散信號的比值隨時(shí)間(分鐘)的時(shí)間依賴性變化的曲線圖。此外，通過滴定曲線(實(shí)施例7的圖28a)，可以將所測量的信號與單克隆抗體濃度相關(guān)聯(lián)。該濃度如圖30所示。

圖32是表示對于n＝25的不同的原代細(xì)胞，在單細(xì)胞規(guī)模上，磁珠線重新定位的信號與液滴的分散信號的比值，隨時(shí)間(分鐘)的時(shí)間依賴性變化的曲線圖。圖32示出了原代細(xì)胞的異質(zhì)性。

實(shí)施例10：液滴中磁珠的聚集體的數(shù)量、幾何形狀和穩(wěn)定性。

在本實(shí)施例中，靶成分37是生物素化的熒光分子，例如af546-生物素(thermofisher#s11225)，其還具有信號實(shí)體的作用并已經(jīng)包含于待篩選的溶液中。本實(shí)施例不應(yīng)用任何細(xì)胞。

本實(shí)施例的一個(gè)目的是證明，可以通過使用橫向結(jié)合分子，來穩(wěn)定磁珠聚集體線，并確保其在液滴中的奇點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)的情況下，我們顯示使用不同濃度的多重生物素化蛋白質(zhì)，生物素-bsa(sigmaaldrich#a8549)作為橫向結(jié)合分子。所使用的生物素-bsa每摩爾白蛋白具有8摩爾至16摩爾生物素。

在本實(shí)驗(yàn)中，液滴測量值為40皮升。

在本實(shí)施例中，工作溶液包括：

-5％v/v血清超低igg(#sh30898.03，thermothermoscientific)，

-25mmhepes緩沖液，ph7.4，

-由lifetechnologies提供的0.1％v/vpluronicf-68，

-1％v-v抗菌-抗真菌劑(#15240，thermofisher)。

使用lifetechnologies提供的dmem-f12補(bǔ)足工作溶液的體積，以達(dá)到最終體積。

用于本實(shí)驗(yàn)的七種乳液含有懸浮在工作溶液中的以下試劑：

-終濃度為100nm的af546-生物素(信號實(shí)體)

-標(biāo)準(zhǔn)量33.33％v/v的一倍、兩倍或三倍的磁性顆粒鏈霉親和素(ademtech#0433)，

-50nm、100nm、200nm、400nm、800nm或1600nm的dy-649(dyomics)，

-生物素-bsa、磁珠的可變比率，對于0為1，對于1為5，對于1為25，或?qū)τ?為100，即生物素-bsa的濃度為0nm、0.5nm、2.5nm、5nm或15nm。

如實(shí)施例“c”所述，產(chǎn)生稱為“vhh線”的參考乳液。在乳液“vhh線”的情況下，通過靶成分(抗體)和捕獲實(shí)體(“captureselecttm生物素抗-lc-κ(鼠科)偶聯(lián)物”thermofisher#7103152500)之間的橫向鍵合，獲得磁珠線的穩(wěn)定性，因?yàn)橥话谐煞?抗體)可結(jié)合兩個(gè)捕獲實(shí)體。

圖33是表示根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)條件的磁珠線的格式比的圖，并且通過顯微鏡圖像示出每種情況。

圖34是表示根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)條件的奇點(diǎn)或多個(gè)磁珠線的圖。

如圖33和圖34所示，本實(shí)驗(yàn)示出，可以穩(wěn)定每個(gè)液滴磁珠線數(shù)目和幾何形狀。