本發(fā)明涉及通過使用質(zhì)譜成像表征樣品的方法。更具體地，本發(fā)明提出通過質(zhì)譜法獲得的成像數(shù)據(jù)用于提取和測定與樣品中一種或多種離子的分布相關(guān)的形態(tài)測定數(shù)據(jù)和/或紋理數(shù)據(jù)的用途。本發(fā)明還提出這種形態(tài)測定數(shù)據(jù)和/或紋理數(shù)據(jù)用于鑒定和/或選擇樣品中一種或多種目標分子的用途。

一般來說，本發(fā)明可用于其中樣品或樣品中的化合物的表征是有用的/必要的任何領(lǐng)域。例如，本發(fā)明可用于藥學領(lǐng)域中用于在不同生物組織中鑒定分子標記物，或用于醫(yī)學診斷的領(lǐng)域，從而鑒定樣品中組織的類型和/或細胞的類型。此外，本發(fā)明可用于質(zhì)量控制領(lǐng)域，以檢查部分實際上具有期望的特性。

背景技術(shù)：

質(zhì)譜法是一種廣泛已知并且在化學和生物化學分析中用于檢測和鑒定樣品中的目標分子的技術(shù)。近年來，已經(jīng)開發(fā)了通過質(zhì)譜法的分子成像，這提供了直接在樣品中觀察目標分子的分布的可能性。質(zhì)譜成像(MSI)集合了使用電離源的所有成像技術(shù)，這提供了定位來自樣品的分子離子的可能性?？梢蕴峒岸喾N電離源，如激光，離子，氣體，液體，溶劑，等離子體(單獨或組合的源)，微波，電子，它們可以用在成像模式中，如DESI(“解吸電噴霧電離”)，LAESI(“激光消融電噴霧電離”)，MALDI(“基質(zhì)輔助激光解吸電離”)，SIMS(“次級離子質(zhì)譜分析法”)，MALDESI(“基質(zhì)輔助激光解吸電噴霧電離”)和LESA(“液體提取表面分析”)，ICP-MSI(電感耦合等離子體質(zhì)譜成像)。

通過質(zhì)譜法的成像目前主要用于生物組織的分析。事實上，可以利用MSI直接研究組織的分子組成或組織的切片的分子組成，而無需通過熒光標記且不具有任何放射性。此外，因為其特異性，MSI提供了在樣品上直接辨別和鑒定所檢測的離子的可能性。因此，現(xiàn)在通常利用MSI來研究或搜索目標生物樣品中的內(nèi)源性分子標記物。更具體地，通過將離子或其質(zhì)量對電荷比(m/z)作為目標，可以直接分析已知分子的分布。也可以使用統(tǒng)計工具，尤其是ACP(主成分分析)、PLSA、T-檢驗、ANOVA或其它工具，以比較至少兩個目標區(qū)域，并由此鑒定對于這些區(qū)域中的一個或另一個區(qū)域來說特異性的一種或多種分子(J.Stauber等,蛋白質(zhì)組研究雜志(J Proteome Res),2008.7(3):p.969-78；D.Bonnel等,分析和生物分析化學(Anal Bioanal Chem),2011)。在樣品的圖像的光譜的分析中使用分割方法也是已知的，以根據(jù)所述樣品的離子的強度將光譜分類。因此，根據(jù)所檢測的組織學區(qū)域的分子強度屬性(profile)，知道生物組織的表征(T.Alexandrov等,癌癥研究和臨床腫瘤學雜志(J Cancer Res ClinOncol),2012.139(1):p.85-95；T.Alexandrov等,蛋白質(zhì)組學雜志(J Proteomics),2011.75(1):p.237-45)。于是可以根據(jù)組織的完整分子屬性而不再僅根據(jù)少量標記物的光譜屬性來將組織分類。

然而，所有MSI數(shù)據(jù)分析方法目前都基于與m/z比相關(guān)的強度值的研究。更具體地，在通過MSI獲取樣品的圖像期間，利用來自電離源的束分析所述樣品以在樣品的每個點中記錄對應于所檢測的離子的平均光譜。所記錄的數(shù)據(jù)的整體表現(xiàn)為具有每個記錄值的坐標的矩陣，一種在一列上含有不同m/z比且在第二列中含有相應強度的光譜。隨后，對于與特定化合物對應的特定離子(即，給定的m/z比)來說，該離子的強度的測定(或峰的面積的積分)提供了利用圖像重建軟件包，通過將具有記錄坐標的峰的強度考慮在內(nèi)并通過向每個點分派具有限定的顏色和/或顏色強度的像素，獲得該離子的分布(并因此獲得相應的化合物)的可能性?？蛇x地，還已知如何將電離源散焦以在單次射擊中分析全部或部分樣品。然后利用位置檢測器獲得定位(Luxembourg等,分析化學(Anal.Chem)2004)。

然而，不能辨別具有相同屬性或光譜特征的兩種生物樣品，即使它們顯示出不同的組織和/或細胞構(gòu)造。于是需要將通過MSI的分析與另一種用于分析樣品的方法如染色(免疫組織化學，組織射線照相術(shù)等)組合，以例如鑒定在兩種樣品的組織構(gòu)造中的差異。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出通過質(zhì)譜法成像常規(guī)獲得的樣品的成像數(shù)據(jù)(即，位置，m/z比，強度)的用途，其中不再僅考慮與所述樣品的離子相關(guān)的強度值，也考慮樣品中所述離子的空間布置和表征所述空間布置的測量結(jié)果。

根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)樣品中一種或多種離子的分布形態(tài)和相關(guān)測量結(jié)果(形態(tài)測定數(shù)據(jù))和/或在所述一種或多種離子的紋理上表征樣品。與樣品中所述離子的存在相關(guān)的形狀和形狀的布置提供了相對于來自光譜強度的信息獲得另外的信息(表面，形狀，體積，圖案，重復，量，分散和來自該信息的值，例如它們的比率等)的可能性。于是可以根據(jù)所述樣品中至少一種離子的形狀和/或在這些形狀的尺寸上和/或它們在樣品中的布置上表征樣品。根據(jù)本發(fā)明，因此可以區(qū)分具有相似或相同分子屬性的兩種樣品。此外，可以在樣品的形態(tài)測定數(shù)據(jù)和/或紋理數(shù)據(jù)的基礎上鑒定樣品，以例如通過將特定形狀和/或紋理等作為目標來鑒定樣品中的目標分子。更一般地，本發(fā)明提出樣品中一種或多種離子的分布的形態(tài)測定和/或紋理的表征，以及這些形態(tài)測定和紋理數(shù)據(jù)與光譜成像數(shù)據(jù)的組合或取代光譜成像數(shù)據(jù)的用途。根據(jù)本發(fā)明，該表征可以與例如將強度考慮在內(nèi)的本發(fā)明的成像數(shù)據(jù)處理方法組合，并且更一般來說，與樣品的任何表征方法(包括通過光學、物理處理，通過著色等實現(xiàn)的表征方法)組合。

本發(fā)明的目的因此是通過質(zhì)譜成像(MSI)表征樣品的方法，根據(jù)所述方法，在形態(tài)測定和/或紋理方面，從與所述樣品中的至少一種離子相關(guān)的成像數(shù)據(jù)表征所述離子的空間布置。

換句話說，從MSI數(shù)據(jù)測定和/或定量所述樣品中的至少一種離子的空間布置，以鑒定形狀、形狀的布置、特別是測量結(jié)果，并且相應地通過這些形狀測定和/或紋理特征表征樣品中所述離子的分布。

本發(fā)明的目的還是用于鑒定樣品中新目標分子的方法，根據(jù)所述方法

i)將與所述樣品中的多種離子相關(guān)的多種形態(tài)測定和/或紋理跟與參考樣品中的多種離子相關(guān)的形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)比較；

ii)鑒定所述樣品的至少一種特征性離子；

iii)鑒定與步驟ii)中鑒定的所述離子對應的分子。

本發(fā)明還提出通過質(zhì)譜成像鑒定樣品的方法，其中：

i)利用從若干參考樣品獲得的與多種參考離子相關(guān)的形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫或模型，所述形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)代表所述參考樣品中所述參考離子的空間布置；

ii)記錄與待鑒定的樣品中的至少一種離子相關(guān)的形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)；

iii)將與待鑒定的樣品的離子相關(guān)的形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)跟與數(shù)據(jù)庫或模型中含有的參考離子相關(guān)的形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)比較。

本發(fā)明的另一個目的在于計算機可讀的數(shù)據(jù)載體，所述數(shù)據(jù)載體包含指令，所述指令可以通過計算機執(zhí)行并且適合于使計算機系統(tǒng)執(zhí)行本發(fā)明的樣品表征方法的至少一個步驟，和/或用于鑒定樣品的方法的至少一個步驟，和/或用于鑒定樣品中的目標分子的方法的至少一個步驟。

附圖說明

圖1：為兩個樣品(1A和1B)通過質(zhì)譜成像獲取的數(shù)據(jù)集的說明性實例，其中白色具有值0而黑色具有最大值；

圖2：根據(jù)本發(fā)明的肺組織樣品的質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)的形態(tài)表征的實例，其導致與健康組織(健康氣道)相比較的病態(tài)肺組織(纖維化氣道)的鑒定；

圖3：通過將本發(fā)明的方法應用至兩種纖維化組織的兩種氣道樣品的質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)集，利用形態(tài)測定計數(shù)氣道的實例；

圖4：通過將根據(jù)本發(fā)明的方法從所述樣品的成像數(shù)據(jù)獲得的形態(tài)數(shù)據(jù)外推來分析和確定大鼠的氣道的表面；

圖5：通過質(zhì)譜成像獲得的在皮膚樣品中兩種離子的分布的圖示和用于鑒定組織(例如，表皮和角質(zhì)層)的所述離子在樣品中的空間布置的表征；

圖6：通過將本發(fā)明的方法應用至皮氏培養(yǎng)皿上的生物組織的切片中細胞的計數(shù)和分型，從來自所述生物組織切片的質(zhì)譜成像的數(shù)據(jù)集獲得的圖案和紋理的示意性圖示；

圖7：用于靶離子的不同形態(tài)測定標準的示意性圖示，所述不同形態(tài)測定標準可以用于辨別在樣品A和B中的對于所述目標離子來說具有相同強度平均值而不能通過它們自身彼此區(qū)分的兩個目標區(qū)域。對于給定離子的相同強度平均值來說，分布因此可以在對象的數(shù)目、對象的表面、在目標區(qū)域中的分散、形狀、從一個對象到另一個對象的表面的變化性等方面變化；

圖8：本發(fā)明的表征和/或鑒定方法的某些步驟的示意性圖示，其導致樣品中具有91.5895的m/z的離子的形態(tài)測定標準的提?。簩Ψ肿訄D像進行分割以獲得二值圖像，對所述二值圖像進行處理以表征所述離子在許多對象中和在所述對象的表面中的分布；

圖9：來自在示出分布強度的分子圖像處的718.505的m/z的分布的和提出所述m/z的分布表面差異的二值圖像的參考組織(對照組織)和目標組織(經(jīng)處理的組織)的比較。

具體實施方式

本發(fā)明的目的因此是通過質(zhì)譜成像(MSI)表征樣品的方法，根據(jù)所述方法，在形態(tài)測定和/或紋理方面，從與所述樣品中的至少一種離子相關(guān)的成像數(shù)據(jù)表征所述離子的空間布置。根據(jù)本發(fā)明，樣品中離子的分布不再根據(jù)強度來表征，而且還根據(jù)由該分布畫出的形狀/對象以及根據(jù)相關(guān)測量結(jié)果(表面、體積等)和/或在這些形狀/對象在它們之間的布置上表征。于是可以容易地辨別雖然對于給定離子來說具有相同的平均強度，但具有與所述離子相關(guān)的不同形態(tài)測定和/或紋理特征的兩種樣品。

本發(fā)明的方法可以被應用于任何類型的樣品，所述樣品可以通過質(zhì)譜法在真空(MALDI)中或在環(huán)境氣氛(LAESI,DESI)中分析，不論它是有機或無機的，液體或固體。例如，本發(fā)明的方法特別適合于動物或植物來源的生物組織的表征。

“組織”一般是指來源相同且被分組在功能性組合體中以完成相同功能的一組細胞。在特定情況下，組織可以被理解為器官、器官片段或器官的特定區(qū)域，其可能組合細胞的若干組合體。例如，組織可以為在器官內(nèi)的局部腫瘤。

在示例性實施方式中，樣品可以在于一種或多種組織的組織學切片，對于所述樣品來說，目標區(qū)域可能事先已通過染色和/或通過它們的分子特征進行表征。更一般地，本發(fā)明的方法可以用于進一步表征通過任何現(xiàn)有技術(shù)的方法事先鑒定的樣品的所有或一部分目標區(qū)域。

本發(fā)明的方法還可以用于表征生物液體如血液、血漿、血清、唾液、腦脊髓液、尿等。

在液體樣品的情況下，可以將其在表面上干燥以產(chǎn)生干燥樣品的MS圖像，然后利用所述方法表征該樣品。另外，尤其可以利用據(jù)稱在大氣壓下的MSI系統(tǒng)來分析液體或溶劑的表面。

本發(fā)明的方法還可以用于表征環(huán)境樣品，如土壤、水、植物樣品等。

在示例性實施方式中，本發(fā)明的方法被用于表征對象，如電子部件，生物材料，膠囊，高精密零件等。

“表征樣品”是指將區(qū)別性/特定性質(zhì)與所述樣品關(guān)聯(lián)，所述性質(zhì)尤其使得能夠?qū)⑺鰳悠窂钠渌鼧悠分斜鎰e/鑒定出來。

根據(jù)本發(fā)明，使用成像數(shù)據(jù)和更特別的光譜，以為給定離子確定其在所述樣品中采取的空間布置。在有利情況下，更具體地使用與給定離子的m/z比特性相關(guān)的數(shù)據(jù)。在本發(fā)明的上下文中，表述“m/z比”或“質(zhì)量對電荷比”指示陰離子的物理量特性，其中m表示所述離子的質(zhì)量而z表示所述離子的價態(tài)。在質(zhì)譜成像中，給定離子可以對應于若干m/z比。

離子或m/z比的“空間布置”或“分布”是指通過樣品中所述離子或m/z比的存在繪出的一種或多種形狀。

根據(jù)本發(fā)明，確定所研究的一種或多種離子的空間布置以將其與一種或多種形狀、尺寸等關(guān)聯(lián)。與樣品中至少一種離子的存在相關(guān)的成像數(shù)據(jù)被用于限定代表樣品中所述離子的分布的形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)，而不依賴于與所述樣品中所述離子相關(guān)的強度的變化。

有利地，用于表征樣品中至少一種離子的空間布置的步驟使用形狀識別和/或紋理分析方法以在不同的目標區(qū)域中分割所述離子的成像數(shù)據(jù)和/或繪出圖案的輪廓。例如，使用數(shù)學形態(tài)學技術(shù)，如水分線技術(shù)(water divide line technique)，Hough變換，尤其是以其廣義形狀，灰色調(diào)的空間依賴性矩陣等。

“形態(tài)測定數(shù)據(jù)”或“形態(tài)測定特征”是指與以下相關(guān)的數(shù)據(jù)/特征：通過樣品中有關(guān)離子(或與所述離子相關(guān)的m/z比)的存在形成的幾何形狀或圖案，和/或它們的數(shù)學尺寸，例如表面、體積、直徑、半徑、長度、寬度、厚度等。在特定情況下，所述圖案可以在于文字要素，如數(shù)字、字母、詞匯等。

“紋理數(shù)據(jù)”或“紋理特征”是指與以下相關(guān)的數(shù)據(jù)/特征：樣品中圖案彼此的布置，例如復現(xiàn)圖案的數(shù)目，距離，所述圖案之間的分散等。

“參考樣品”是指與目標樣品具有相同的性質(zhì)和/或來源的樣品。例如，在目標受試者的生物組織的研究期間，參考樣品在于來自對照受試者的具有相同性質(zhì)的生物組織。

根據(jù)本發(fā)明，可以整體或分別地表征所述樣品的一種或多種離子或m/z比的空間布置。因此，給定的圖案可以與被同時考慮的若干m/z比的存在和分布關(guān)聯(lián)。可選地，可以同時或按序?qū)ν粯悠分械牟煌琺/z比表征不同的圖案。根據(jù)本發(fā)明，這些不同的m/z比可以代表相同的離子或不同的離子。

在一個實施方式中，本發(fā)明的方法包括用于獲取成像數(shù)據(jù)的準備步驟，從所述準備步驟確定至少一種m/z比的形態(tài)測定和/或紋理特征。

本發(fā)明的方法可以利用任何已知質(zhì)譜成像技術(shù)來應用，尤其是MALDI、LDI、DESI、LESA、LAESI(激光消融電噴霧電離)、DART(實時直接分析)、SIMS、JEDI(噴射解吸電噴霧電離)、LAMMA(激光微探針質(zhì)量分析)、SMALDI(掃描微探針基質(zhì)輔助激光解吸電離)成像，它們與不同類型的分析儀組合，例如TOF(飛行時間)、軌道阱、FTICR(傅里葉變換離子回旋共振)、四極桿(“簡單或三重”)、ICP MS分析儀等。

在本發(fā)明的特別實施方式中，例如通過使用MALDI成像，可以直接在樣品的離子圖像上觀察與至少一種離子相關(guān)的形態(tài)測定和/或紋理特征。更具體地，與所分析的離子相關(guān)的形態(tài)測定和/或紋理特征可以被生成為重現(xiàn)所述樣品的圖像，使得可以在其中觀察它們的空間布置。當然，可以疊加樣品的不同圖像，以同時觀察若干離子的數(shù)據(jù)，甚至通過其他分析方法如光學顯微術(shù)、組織學染色等獲得的組織學數(shù)據(jù)或其它數(shù)據(jù)。

在一個實施方式中，本發(fā)明的表征樣品的方法包括以下步驟：

c)利用MSI獲取樣品中至少一種離子的數(shù)據(jù)；然后

d)根據(jù)形態(tài)測定和/或紋理特征，從與所述至少一種離子的位置相關(guān)的數(shù)據(jù)表征樣品中所述至少一種離子的空間布置。

從目標樣品中離子的空間布置，通過對所述樣品來說特異性的形態(tài)測定和紋理特征來表征所述離子。相同的離子在另一種樣品中可以具有不同的形態(tài)測定和紋理特征，即使兩種樣品的分子屬性是相同的。

因此，本發(fā)明的方法提供了為樣品中的離子獲取另一水平的信息的可能性，其可以被單獨考慮或與樣品和/或相關(guān)離子的任何其它數(shù)據(jù)/特征組合考慮。例如，不僅可以同時或按序分析目標離子的形態(tài)測定和紋理特征，而且可以同時或按序分析全部或部分的光譜特性(質(zhì)譜的峰的強度，信噪比(S/N)，峰面積等)。

有利地，本發(fā)明的方法提供了直接在樣品的相同離子圖像上同時觀察所有這些數(shù)據(jù)/特征的可能性。

在另一實施方式中，本發(fā)明的用于表征樣品的方法包括以下步驟：

e)將樣品的成像數(shù)據(jù)分割成代表樣品的分子強度屬性的目標區(qū)域；并且

f)根據(jù)形態(tài)測定和/或紋理特征表征目標區(qū)域的分子屬性的離子的空間布置。

步驟c)在于在相同樣品中根據(jù)分子屬性分割樣品。每個目標區(qū)域?qū)趶臉悠返馁|(zhì)譜獲得的分子屬性。不同光譜特性可以常規(guī)地用于獲得所述樣品的分子屬性，尤其是質(zhì)譜的峰的強度，信噪比(S/N)，峰面積等。

一旦樣品中一個或多個目標區(qū)域被鑒定后，就對與選擇的目標區(qū)域相關(guān)的成像數(shù)據(jù)進行處理，以表征所述選擇的目標區(qū)域的離子的整體的空間布置。它們是目標區(qū)域中離子的整體的數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)被考慮在內(nèi)并對所述數(shù)據(jù)進行分析以鑒定所述目標區(qū)域的特征性圖案和紋理。同樣地，根據(jù)本發(fā)明，可以從這些數(shù)據(jù)重建樣品的數(shù)字圖像，以直接在樣品圖像上觀察結(jié)果。

根據(jù)本發(fā)明，步驟c)和d)的應用可以獨立于步驟a)和b)，即，不應用步驟a)和b)。在另一個特別實施方式中，可以連續(xù)應用步驟a)和b)，然后是c)和d)，反之亦然，以在相關(guān)樣品上的一種或多種相關(guān)離子的形態(tài)測定和紋理方面獲得不同水平的信息。此外，可以將步驟d)應用于步驟c)中鑒定的若干或全部目標區(qū)域。

在本發(fā)明的另一個實施方式中，表征方法包括以下步驟：

e)制作包含來自所述樣品中的多種離子的形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(DB)。

可選地，所述表征方法包括以下步驟：

f)生成包含所述樣品中多種離子的形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)的模型。

在本發(fā)明的上下文中，“多種”是指兩種以上。

“模型”是指數(shù)據(jù)集，所述數(shù)據(jù)集在本發(fā)明的情況下具有來自樣品的特性，尤其是強度數(shù)據(jù)、形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)等，所述數(shù)據(jù)已被建模，尤其是為了限定所述數(shù)據(jù)之間的依賴性和/或關(guān)系，并且所述數(shù)據(jù)代表相關(guān)樣品。至于“數(shù)據(jù)庫”是指其中存儲有原始數(shù)據(jù)集的基礎(base)。

因此，可以獲得數(shù)據(jù)集的組合體，即，對樣品或樣品類型來說特異性的圖案、尺寸、布置等的組合體，或者模型。根據(jù)本發(fā)明，該數(shù)據(jù)庫(DB)或該模型可以利用所述樣品中至少一種離子的光譜MSI數(shù)據(jù)，和/或?qū)λ鰳悠穪碚f特異性的物理化學、生理學和/或生物學數(shù)據(jù)來實現(xiàn)(步驟g)。例如，數(shù)據(jù)庫(DB)或模型利用通過樣品或相同樣品的組織學、化學研究或其它研究獲得的數(shù)據(jù)來實現(xiàn)，以限定不同的目標區(qū)域。

這種數(shù)據(jù)庫(DB)或模型可以特別用于快速且以自動方式鑒定組織、組織的區(qū)域、細胞類型、組織的生理學條件例如健康或病態(tài)的、等等。此外，所述數(shù)據(jù)庫或模型可以用于細胞鑒定和計數(shù)，或在生物樣品中的編號。

本發(fā)明的目的還是通過質(zhì)譜成像鑒定樣品的方法，其中：

i)利用從若干參考樣品獲得的與至少一種參考離子相關(guān)的形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫或生成模型，所述形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)代表所述參考樣品中的所述至少一種參考離子的空間布置；

ii)記錄與待鑒定樣品中至少一種離子相關(guān)的形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)(表面、體積、形狀、圖案、重復等)；

iii)將步驟ii)的形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)跟步驟i)的數(shù)據(jù)庫或模型中含有的形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)比較。

根據(jù)本發(fā)明，在步驟ii)中，將離子對應于來自數(shù)據(jù)庫或來自模型的離子進行分析。有利地，所述數(shù)據(jù)庫或模型包含與多種參考離子相關(guān)或無關(guān)的形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)。

上面結(jié)合表征樣品的方法所描述的特性和定義的整體在細節(jié)上作必要的修改后被應用至所述鑒定方法。

有利地，對于每種參考樣品來說，對若干離子建立形態(tài)和紋理數(shù)據(jù)的集以盡可能可靠地表征每種參考樣品。

根據(jù)本發(fā)明，在步驟iii)中，在不同的參考數(shù)據(jù)集和待鑒定的樣品的數(shù)據(jù)集之間繼續(xù)進行相似性和/或差異的分析，以選擇具有相似或相同形態(tài)測定特征的一種或多種參考樣品，并由此鑒定樣品。

本發(fā)明的方法例如可以提供鑒定生物組織的性質(zhì)和/或來源、細胞類型、疾病的發(fā)展階段等的可能性。

本發(fā)明的目的還是用于鑒定樣品中的目標分子的方法，根據(jù)所述方法

i)將與所述樣品中多種離子相關(guān)的形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)跟與參考樣品中多種離子相關(guān)的形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)比較；

ii)鑒定樣品的至少一種特征性離子，所述特征性離子有利地不存在于參考樣品中；

iii)鑒定與前述步驟中鑒定的所述離子對應的分子。

這種方法提供了發(fā)現(xiàn)和鑒定目標樣品中的新分子的可能性。

在實施方式中，用于鑒定目標樣品中的新目標分子的方法事先包括用于獲取對所述樣品來說特異性的MSI數(shù)據(jù)并通過形態(tài)測定和/或紋理特征表征一種或多種離子的分布的步驟。

上面結(jié)合表征樣品的方法所描述的特性和定義的整體在細節(jié)上作必要的修改后被應用至用于鑒定分子的本方法。

根據(jù)本發(fā)明的該實施方式，樣品的性質(zhì)是已知的并且期望鑒定對所述樣品來說特異性的一種或多種標記物，即，在參考樣品中不存在的那些標記物，或者相對于那些在參考樣品中存在的標記物表現(xiàn)出不同的形態(tài)測定和/或紋理特征的標記物(圖7)。對于給定離子來說被考慮的形態(tài)測定特征可以為例如對象的數(shù)目，對象的表面的平均值，分散，形狀，表面的變化性等。因此優(yōu)先使用與目標樣品具有相同性質(zhì)和/或相同類型的參考樣品。

有利地，步驟i)可以通過查詢編譯參考樣品的多種參考數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)庫(DB)來應用，或通過將樣品的數(shù)據(jù)跟編譯參考樣品的多種參考數(shù)據(jù)集的模型比較來應用。

一旦目標樣品的區(qū)別性形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)被鑒定后，則將相應的一種或多種離子與其關(guān)聯(lián)，從而回到與每種離子相關(guān)的分子。

該方法在制藥或醫(yī)學領(lǐng)域中，尤其是對于鑒定新型生物標記物來說是特別有用的。

本發(fā)明的目的還是計算機可讀的數(shù)據(jù)介質(zhì)，所述數(shù)據(jù)介質(zhì)包含用于計算機的可執(zhí)行指令，所述指令適合于使計算機系統(tǒng)執(zhí)行本發(fā)明的用于鑒定樣品的方法的至少一個步驟，和/或本發(fā)明的用于鑒定樣品或樣品中的目標分子的方法的至少一個步驟。

因此，本發(fā)明提出如下計算機程序，所述計算機程序包含當所述程序在計算機上執(zhí)行時用于執(zhí)行上述全部或部分步驟的程序代碼指令。

有利地，所述計算機程序包含至少用于執(zhí)行表征目標樣品中一種或多種離子的空間布置的步驟的程序代碼指令。

有利地，本發(fā)明的計算機可讀的數(shù)據(jù)介質(zhì)或程序包含數(shù)據(jù)庫或模型，所述數(shù)據(jù)庫或模型包含至少一種樣品中的至少一種離子、優(yōu)選多種樣品的多種離子的形態(tài)測定和/或紋理數(shù)據(jù)。

標記物的搜索

本發(fā)明的方法可以用于鑒定標記物，尤其是分子標記物。事實上，在生物樣品的情況下，可以鑒定在兩種條件(例如，病態(tài)的相比于健康的，經(jīng)處理的相比于載體，暴露的相比于未暴露的，等等)之間存在的形態(tài)變化。尤其，根據(jù)本發(fā)明，可以更特別地研究在例如通過樣品的結(jié)構(gòu)的宏觀和/或微觀研究事先鑒定的目標區(qū)域中特異性存在的離子。

一旦獲得形態(tài)測定和/或紋理特征后，并且如果在統(tǒng)計分析后，與所研究的離子相關(guān)的形狀被認為顯著不同，則以常規(guī)方式回到相關(guān)的一種或多種目標分子量是足夠的。在查詢專門數(shù)據(jù)庫后，可以鑒定相應的一種或多種分子。為此，可以使用微分(differential)統(tǒng)計檢驗，從而基于分子分布要素的形態(tài)而不僅基于強度。尤其可以使用Fischer檢驗，z檢驗，Student檢驗，Welch檢驗，成對Student檢驗，ANOVA，Dunett檢驗，Tukey檢驗，Kruskal-Wallis檢驗，Wilcoxon-Mann-Whitney檢驗，Wilcoxon符號秩檢驗，MANOVA等。

過濾和分子分類

本發(fā)明的方法可以用于分子過濾目的。

例如，可以以或不以任意方式選擇特定形態(tài)測定(例如，最小表面積的X mm2的星形)以進行樣品中的分子過濾。因此，僅選擇進入所限定的一個或多個標準的離子。然后可以鑒定與所尋找的那種分子具有相同的形狀影響的分子。

這種過濾也可以允許樣品的分類。因此，利用本發(fā)明的方法，基于關(guān)于強度和形狀的信息可以獲得相似性分數(shù)?？梢宰詣釉跇悠防缟锝M織中認出例如為生理狀況特征性的給定形狀的存在。于是變得可以在與僅基于強度標準的分數(shù)相比更精確和可靠的分數(shù)的基礎上確立分類，所述強度標準與不管所選方案如何都被保留的形態(tài)測定和紋理特征不同，其本身可以根據(jù)樣品的制備(基質(zhì)的沉積、干燥時間、冷凍、組織的類型等)而變化。

根據(jù)本發(fā)明，可以有利地構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(DB)或模型，所述數(shù)據(jù)庫(DB)或模型編譯來自相同種群的若干樣品的規(guī)格，所述若干樣品例如為來自相同生物組織或來自相同來源/性質(zhì)的生物組織的若干樣品。從這種數(shù)據(jù)庫中，或從這種模型中，容易鑒定相同種群的新樣品或確定無疑地鑒定種群中的樣品。

例如，可以相對于健康肺組織的樣品表征纖維化的肺組織樣品。圖2更特別地示出從為健康肺組織樣品和纖維化肺組織樣品獲得的成像數(shù)據(jù)集的形態(tài)測定表征獲得的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的方法，在橢圓形中鑒定兩種形態(tài)測定，其中一種在短軸和長軸之間的比率傾向于1(纖維化組織)。這些形態(tài)測定特征的使用提供了分別表征兩種形狀的健康(橢圓類型1)和纖維化(橢圓類型2)的氣道的可能性。

相似地，可以表征無機樣品，例如電子部件，汽車零件或其它部件，尤其是為了進行質(zhì)量控制。

細胞計數(shù)和形態(tài)測定分選

本發(fā)明的方法也可以用在細胞或細菌計數(shù)的領(lǐng)域中，尤其是在環(huán)境或健康評價的范圍內(nèi)。出于該目的，可以在質(zhì)譜成像中選擇細胞壁的特異性分子(例如脂類)，以提高待計數(shù)的對象。

利用本發(fā)明的方法，利用分子因子分離形狀，雖然到目前為止，這是利用光學信號，尤其是利用光學顯微術(shù)或流式細胞術(shù)來實現(xiàn)的。本發(fā)明提供了超過利用光學信號獲得的檢測靈敏度限制的可能性，以及具有精確性(較少假陽性事件)的工作速度，并同時提高了所分析的參數(shù)的數(shù)目。根據(jù)本發(fā)明，細胞可以在它們的形態(tài)的基礎上編號和認出，同時指示分子屬性如所鑒定的細胞的代謝活性。因此可以將多種細胞、生物學或組織學類型和它們的生理學活性編號。

圖3描述了在為兩種纖維化組織的氣道的樣品獲得的成像數(shù)據(jù)集上通過形態(tài)測定進行的自動計數(shù)。橢圓形的自動檢測提供了在與相鄰組織學染色沒有任何關(guān)系的情況下鑒定并編號目標組織學結(jié)構(gòu)(此處為氣道)的可能性。

形態(tài)測定的動力學研究

本發(fā)明的方法也可以用于形狀的動力學研究，尤其是用于追蹤樣品中目標要素(分子、離子、m/z)的形態(tài)測定(形狀、表面、體積……)的時間依賴性變化。尤其可以顯示形態(tài)測定的變化，例如目標區(qū)域隨著時間的擴大或縮小。

也可以設想生物樣品中形狀的時間依賴性變化的階段，其與生物樣品的階段的其它研究一致。例如，可以通過本發(fā)明的方法獲得取決于一種或多種目標質(zhì)量的隨著時間變化的表面曲線。如果鑒定到特定的穩(wěn)定期或階段(形態(tài)測定變化、穩(wěn)定期、形狀的波動)，則它們可以潛在地與生物樣品的已知階段(例如，致癌組織的等級的變化)相關(guān)聯(lián)。

圖4示出了本發(fā)明的方法在纖維化組織中的氣道的收縮的時間依賴性變化的研究中的應用。如圖所示，可以利用本發(fā)明的方法來確定氣道的隨著時間變化的表面積并且因此追蹤纖維化對氣道的收縮的影響。

細胞或組織分型

本發(fā)明的方法可以用于鑒定植物或動物生物樣品中的細胞類型或組織亞結(jié)構(gòu)。通過各種細胞的對于它們來說特異性的形態(tài)測定，可以進行該細胞分型。因此，取決于所獲得的細胞形態(tài)測定，可以確定一種或多種樣品中含有的一種或多種細胞類型。

近年來，儀器發(fā)展已經(jīng)提供了將MALDI成像的空間分辨率降低到低于10μm的可能性。至于SIMS技術(shù)，其提供了通常獲得低于1μm的分辨率的可能性?？紤]到細胞的平均尺寸為10-15μm，可以認為質(zhì)譜成像獲得了使得它們在分子數(shù)據(jù)集中被分辨的細胞分辨率。

圖5示出了本發(fā)明的方法在皮膚組織切片上的組織分型的范圍內(nèi)在沒有任何組織學相關(guān)性的情況下的應用。組織的區(qū)域(角質(zhì)層和表皮)通過它們在MSI獲取(MSI acquisition)后獲得的特定形態(tài)測定進行鑒定。

此外，圖6示意性示出了本發(fā)明的方法在直接在生物樣品上/中編號和細胞分型的范圍內(nèi)在沒有任何組織學相關(guān)性的情況下的應用。樣品(組織、細胞溶液或培養(yǎng)物)的細胞借助于它們在MSI獲取后獲得的特定形態(tài)測定進行分型。

實施例

現(xiàn)在將借助于具體實施例更詳細地描述本發(fā)明。這些實施例是作為說明給出的并且絕不作為本發(fā)明的限制。

實施例1：通過將光譜和空間信息組合來表征樣品或目標區(qū)域的程序。

本實施例的目的是示出可能來自為樣品獲取的同一成像數(shù)據(jù)集的信息片的差異，這取決于是僅僅考慮了所述樣品中與給定m/z比的強度相關(guān)的數(shù)據(jù)，還是考慮了與該m/z比相關(guān)的形態(tài)測定和紋理特征。

一旦獲取樣品的質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)(位置、m/z比、強度)后，則通過任何已知方法，例如根據(jù)以下步驟繼續(xù)進行：

1/加載從成像數(shù)據(jù)獲得的圖像；

2/例如通過使用Otsu法，為將圖像二值化而確定閾值；

3/通過未經(jīng)優(yōu)化的算法將對象標記并計數(shù)；

4/在變量中恢復非零位置的數(shù)目；

5/在一個變量中恢復對象或圖像的像素的數(shù)目；

6/在一個變量中計算平均強度；

7/試驗以確定對象是否至少具有某些形狀性質(zhì)。

以簡單化的方式，步驟3可以通過以下算法來應用：

“只要圖像未被完全覆蓋：

一行一行地覆蓋圖像

如果遇到非零像素(或非零像素屬于對象)

覆蓋其鄰居和連續(xù)8個相鄰的鄰居，以將對象的像素設置為0增加對象計數(shù)器

鄰居覆蓋的結(jié)束

非零像素的結(jié)束

行覆蓋的結(jié)束

算法的結(jié)束”

試驗步驟7可以例如通過制作含有具有一種或多種待測性質(zhì)的結(jié)構(gòu)元素(SE)的開口(侵蝕ε，隨后擴張δ)來應用。如果通過SE的開口的像素的添加是非零的，那么該圖像/區(qū)域具有該性質(zhì)。

開口：

侵蝕：

擴張：

結(jié)果

將上述步驟應用至為各具有6個像素的長度并在這6個像素上具有相同的平均強度的2個片段(圖1)常規(guī)獲取的成像數(shù)據(jù)，所述6個像素是連續(xù)的(圖1A)或具有碎片(圖1B)。

雖然考慮單獨的強度并不提供區(qū)分這兩個片段的可能性，但是通過本發(fā)明的方法獲得的形態(tài)和紋理表征提供了示出在這兩個片段之間的差異的可能性(表1)。

表1：來自成像數(shù)據(jù)的特性

實施例2：用于鑒定目標峰和來自形態(tài)測定數(shù)據(jù)的相關(guān)生物標記物的程序

材料和方法

動物：

將5個大鼠肺用于該研究。三個來自利用博來霉素(ApolloScientific公司,UK)通過氣道(口咽吸入途徑)以1mg/kg的劑量處理7天的大鼠，兩個來自以相似的方式接受鹽溶液處理相同的時間段的動物。所有大鼠為Sprague Dawley,Crl:CD(SD)雄性大鼠。兩組在實驗開始后22天處死。利用瓊脂糖使肺膨脹，設置在具有10％甲醛的中性緩沖溶液中，并冰凍至-80℃。該動物實驗符合1986年的動物(科學程序)法(Animals(Scientific Procedures)Act of 1986)。

用于獲取質(zhì)譜(MS)圖像的制備物：

為獲取圖像，從Delta Technologies公司(Loveland,USA)購買ITO玻片并利用9-氨基吖啶(9AA)將其涂布。

通過使用microm HM560低溫恒溫器(賽默科技(Thermo Scientific)公司，德國)在-35℃下獲得厚12μm的新鮮組織切片并將其放置在ITO玻片上。此外，將10μm厚的用藥物摻雜的大鼠腎的勻漿物的切片沉積在相同玻片上以用作用于評估重復性和可變性的質(zhì)量控制。一小時后從低溫恒溫器取出玻片，然后干燥20分鐘，接著最終儲存在-80℃下直到使用。

使用的基質(zhì)為5mg/mL的9AA在MeOH/H₂O(4:1v:v)溶劑中的溶液；利用自動沉積裝置Suncollect(SunChrom GmbH公司,Friedrichsdorf,德國)以10個連續(xù)層的方式將其沉積。以10μL/min的流速施加第一層，以20μL/min的流速施加第二層，并且以30μL/min的流速施加剩下的層。

MS圖像的獲?。?/u>

將裝配有以80％的輸出能量和1000Hz的重復率使用的SmartBeam II激光器的質(zhì)譜儀MALDI-FTICR(7T Solarix,BrukerDaltonics公司,Brême,德國)用于對于在100和1000之間的m/z以30μm的空間分辨率在負模式中獲取呈“全掃描”模式的質(zhì)量過濾器。各質(zhì)譜對應于在相同位置的500個連續(xù)激光射擊的積累。通過使用9AA基質(zhì)以及在200和900的m/z之間的磷脂質(zhì)進行內(nèi)部校準。通過使用FTMS Control 2.0和FlexImaging 4.0軟件包(BrukerDaltonics,Brême,德國)來控制質(zhì)譜儀。

被選擇用于獲取的區(qū)域為肺氣道，因為博來霉素應該在其中引起變化。

峰的檢測：

從超過閾值的條件轉(zhuǎn)換的平均光譜的最大值被認為是峰。所使用的轉(zhuǎn)換為減去沒有零值的信號的中值，除以來自沒有零值的信號的中值的絕對偏差，乘以1.4826。這給出在各點中信噪比的近似值。在噪點或多或少遵從正態(tài)分布且實際信號在平均光譜中以小于合計測量結(jié)果的一半存在的觀點下，實現(xiàn)零值的抑制，因為信號似乎通過FTMSControl 2.0通過破壞性小波而經(jīng)歷了壓縮。測試了接近噪點的其它方式(例如，局部完成的相同測量，或從一個峰到假設代表它的高斯分布的距離)，但對低閾值沒有給出更好的結(jié)果。對于該研究來說保持的閾值為1，以具有盡可能少的假陰性警報并排除盡可能多的噪點。

輸出的圖像：

對于每個對應于潛在生物標記物的檢測到的峰來說，并且對于每個成像區(qū)域來說，將峰窗口中最大強度的圖像在具有8位的深度的灰度的范圍中拉伸，然后在沒有任何壓縮的情況下輸出為JPEG格式。選擇僅使用單通道以便于結(jié)果的目檢。獲得了在12個區(qū)域(在條件1中6個，且在條件2中6個)上的待成像的約2000個離子。

形態(tài)表征：

對于各圖像：

為了從圖像除去噪點，通過使用尺寸為2x 2的結(jié)構(gòu)元素以灰度在圖像上制造開口，隨后使用相同的結(jié)構(gòu)元素進行閉合：O為灰度的原始圖像，在我們的情況下B₁＝B₂＝B，結(jié)構(gòu)元素，值的布爾值在右下角中在中心變化，缺少的值通過復制最近的行或列獲得。

然后通過應用Otsu法將圖像二值化(在我們的情況下具有單一閾值)：對于含有N個像素、L個灰度且n_i為采取灰度i值的像素的數(shù)目的圖像來說，的最大值，其中其中ω₁＝1-ω₀，

在此之前或之后，計算像素圖像的表面積；

然后，通過使用用于以4連通方式如Rosenfeld和Pfaltz(1996)中描述的那樣生成標記圖像的標簽的整體的基數(shù)，對在二值化圖像中的對象的數(shù)目進行計數(shù)。

最后，確立每單位表面的對象的平均表面積。

比較：

在兩種條件下進行兩個Welch t檢驗，一種基于每單位表面的對象的數(shù)目，另一種基于每單位表面的對象的平均表面積。保留Welch t檢驗，因為其很好地適用于小尺寸的非配對樣品，且不確定兩個總體的差異是相等的。否則能夠使用Mann-Whitney-Wilcoxon檢驗。

在使用形態(tài)測定標準的基礎上將200個生物標記物鑒定為在對照條件和未處理條件之間顯著不同的，其中特定生物標記物僅通過使用形態(tài)測定標準來鑒定。

如在圖9中示出的，能夠鑒定細胞凋亡中涉及的膜成分(m/z718.505)，其僅通過考慮強度是不可檢測的(NS：不顯著；*：顯著差異)。

建模：

在經(jīng)處理條件的潛在的鑒定的生物標記物的基礎上制作數(shù)學模型。將該模型用于探索目的以在提取的形態(tài)測定特征的基礎上對試驗樣品進行分類。

可以對以下繼續(xù)進行本研究：

-將數(shù)據(jù)標準化；

-進行峰鑒定以將分子與峰關(guān)聯(lián)；

-進行生物學解讀；

-例如通過使用云平臺進行分類/機器學習。

實施例3：其它應用

可以設想非常多的應用，并且尤其可以通過使用實施例1或?qū)嵤├?中描述的步驟來應用。例如，如以上所討論的，本發(fā)明可以用在醫(yī)學和制藥領(lǐng)域，以鑒定新型生物標記物，用于分子過濾和分類、細胞和形態(tài)測定計數(shù)、疾病或治療的隨時間變化的發(fā)展的研究、細胞或組織分型等。根據(jù)本發(fā)明，也可以從樣品中離子的分布表面和/或體積相對或絕對地定量所述樣品中的所述離子。當然，本發(fā)明可用于其它領(lǐng)域例如質(zhì)量控制、藝術(shù)、比較的和自動的對象分析，材料的組成的研究等。