Maldi用試樣調(diào)制方法以及試樣調(diào)制裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于調(diào)制使用了基質(zhì)輔助激光解吸離子化(MALDI=Matrix AssistedLaser Desorpt1n/1nizat1n)法的質(zhì)譜分析試樣的調(diào)制方法、以及根據(jù)該方法調(diào)制試樣時(shí)使用的試樣調(diào)制裝置，更詳細(xì)的，涉及適合質(zhì)譜成像(MS Imaging)的試樣調(diào)制方法以及試樣調(diào)制裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]MALDI法，是為了分析難以吸收激光的試樣或蛋白質(zhì)等容易受激光損傷的試樣，將容易吸收激光并且容易離子化的基質(zhì)物質(zhì)預(yù)先混合在測(cè)定對(duì)象試樣中，通過(guò)向其照射激光而使試樣離子化的方法。一般，將基質(zhì)物質(zhì)作為溶液添加到樣品中，該基質(zhì)溶液吸收樣品所含的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)。然后，通過(guò)干燥將溶液中的溶劑氣化，形成含有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的結(jié)晶粒。向其照射激光的話，通過(guò)測(cè)定對(duì)象物質(zhì)、基質(zhì)物質(zhì)以及激光的相互作用，可以使測(cè)定對(duì)象物質(zhì)離子化。通過(guò)使用MALDI法，可以幾乎無(wú)需離解而分析大分子量的高分子化合物，并且靈敏度高，也適宜微量分析，因此近年來(lái)被廣泛運(yùn)用于生命科學(xué)等領(lǐng)域。
[0003]MALDI用的基質(zhì)物質(zhì)，可以根據(jù)測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的種類、特性、離子極性等而適當(dāng)選擇，作為代表性的物質(zhì)，可舉出有1，4- 二苯、1，8，9-三羥基蒽、2，4，6-三羥基苯乙酮、2，5- 二羥基苯甲酸、2-(4-羥基苯基偶氮)苯甲酸、2-氨基苯甲酸、3-氨基吡嗪-2-羧酸、3-羥基吡啶甲酸、4-羥基-3-甲氧基肉桂酸、反式-吲哚丙烯酸、2，6-二羥基苯乙酮、5-甲氧基水楊酸、5-氯水楊酸、9-蒽羧酸、吲哚乙酸、反式-3- 二甲氧基-羥基肉桂酸、α -氰基-4-羥基肉桂酸、I, 4- 二苯基丁二烯、3，4- 二羥基肉桂酸、9-氨基吖啶等。
[0004]近年來(lái)，使用MALDI質(zhì)譜裝置、將生物組織切片上的生物分子和代謝物等的二維分布狀況直接可視化的質(zhì)譜成像法受到矚目，也開發(fā)了所使用的裝置(參照非專利文獻(xiàn)I等)。質(zhì)譜成像法中，在生物組織切片等試樣上，可以得到表示出具有特定質(zhì)荷比的離子的強(qiáng)度分布的二維圖像。因此被期待應(yīng)用于例如，通過(guò)調(diào)查癌等病理組織的特異物質(zhì)的分布狀況，掌握疾病的發(fā)展?fàn)顩r、確認(rèn)用藥等的治療效果等的醫(yī)療領(lǐng)域、創(chuàng)藥領(lǐng)域、生命科學(xué)領(lǐng)域等。另外，非專利文獻(xiàn)I中，可以質(zhì)譜成像的質(zhì)譜裝置也能同時(shí)進(jìn)行顯微觀察，因此被稱為顯微質(zhì)譜裝置，但是本說(shuō)明書中，為了明確是以質(zhì)譜成像為目的的裝置，因此稱為成像質(zhì)譜裝置。
[0005]為了得到正確反映了質(zhì)譜成像法中的目標(biāo)物質(zhì)分布狀況的質(zhì)譜成像圖像，要求較高的空間分辨率。決定MALDI成像質(zhì)譜裝置中的空間分辨率的一個(gè)很大因素，是所調(diào)制的試樣中的基質(zhì)物質(zhì)的粒徑及其均勻性。質(zhì)譜成像法中的以往一般的基質(zhì)添加方法，是以噴墨方式向樣品陣列狀射出基質(zhì)溶液的方法、以噴射等向樣品噴涂基質(zhì)溶液的方法等。但是，此種方法中，難以提高質(zhì)譜成像的空間分辨率。其原因如下。
[0006]例如使用噴射向樣品噴霧基質(zhì)溶液的情況下，結(jié)晶粒會(huì)從其周圍較大范圍內(nèi)吸收測(cè)定對(duì)象物質(zhì)。其結(jié)果是，樣品上的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的位置信息會(huì)受損，某種物質(zhì)的存在區(qū)域分界線變得不清晰。另一方面，使用噴墨方式向樣品射出添加基質(zhì)溶液的情況下，由于添加的基質(zhì)溶液的測(cè)定部位(點(diǎn))陣列狀排列，因此該測(cè)定部位間的位置信息可以保證。但是，測(cè)定部位的大小依賴于基質(zhì)溶液的液量，根據(jù)可射出的最少液量極限，樣品上會(huì)擴(kuò)展至數(shù)十?百ym程度的直徑。因此，無(wú)法再進(jìn)一步大幅減小測(cè)定部位，因此空間分辨率也由自身所決定。另外，此種問(wèn)題點(diǎn)在專利文獻(xiàn)I中也有指出。
[0007]此外，將經(jīng)常用作基質(zhì)物質(zhì)的2，5- 二羥基苯甲酸(DHB)等以噴射噴霧時(shí)，結(jié)晶形狀為針狀，并且該針狀結(jié)晶的長(zhǎng)度不同。因此，離子化時(shí)，會(huì)因?yàn)榻Y(jié)晶大小不同而產(chǎn)生樣品上的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的位置信息混亂，難以提升空間分辨率。
[0008]對(duì)于上述問(wèn)題，專利文獻(xiàn)I中提出了，作為現(xiàn)有的基質(zhì)物質(zhì)的替代，將金屬氧化物構(gòu)成的內(nèi)核上覆蓋有聚合物的微粒附著在樣品上的試樣調(diào)制方法，并列出了使用該方法對(duì)鼠的小腦切片進(jìn)行質(zhì)譜成像的結(jié)果。但是，此種試樣調(diào)制方法中，調(diào)制順序繁瑣，由于無(wú)法使用廉價(jià)的現(xiàn)有基質(zhì)物質(zhì)，因此成本不可避免的增加。此外，如果是現(xiàn)有的基質(zhì)物質(zhì)，由于可離子化的成分種類等較為熟悉，因此可以根據(jù)測(cè)定對(duì)象物質(zhì)等而選擇適當(dāng)?shù)幕|(zhì)物質(zhì)，但是上述新的試樣調(diào)制方法的話，由于沒(méi)有充分掌握哪些成分可以檢測(cè)、哪些成分不可以檢測(cè)，因此還存在難以使用的問(wèn)題。
[0009]另一方面，作為使用現(xiàn)有的基質(zhì)物質(zhì)而實(shí)現(xiàn)較高的空間分辨率的試樣調(diào)制方法，已知的有非專利文獻(xiàn)2所述的方法。該方法中，為了進(jìn)行蛋白質(zhì)的質(zhì)譜成像，在貼有樣品的載玻片表面，通過(guò)真空蒸鍍法形成基質(zhì)膜層，然后，將該載玻片置于甲醇等溶劑氣化后的氣氛中，由此促進(jìn)包含測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的基質(zhì)物質(zhì)的再結(jié)晶化。本申請(qǐng)的發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)中也確認(rèn)了，此種試樣調(diào)制方法對(duì)于提升質(zhì)譜成像的空間分辨率很有效。
[0010]但是，根據(jù)本申請(qǐng)的發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)，非專利文獻(xiàn)2所述的試樣調(diào)制方法中，存在難以提高檢測(cè)靈敏度的問(wèn)題。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)
[0011]專利文獻(xiàn)1:日本專利特開2008-232842號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)
[0012]非專利文獻(xiàn)1:小河潔，另5人，“顯微質(zhì)譜裝置的開發(fā)”，島津評(píng)論，株式會(huì)社島津制作所，2006年3月31日發(fā)行，第62卷，第3.4號(hào)，p.125-135
非專利文南犬 2: Junhai Yang，另 I 人，‘‘Matrix Sublimat1n/Recrystallizat1n forImaging Proteins by Mass Spectrometry at High Spatial Resolut1n，，，AnalyticalChemistry, 2011 年，83，pp.5728-5734

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明為解決上述課題而作，其目的是提供可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜成像時(shí)的高空間分辨率、并且檢測(cè)靈敏度高、成本也可控制的MALDI用試樣調(diào)制方法以及試樣調(diào)制裝置。
[0014]為解決上述課題而作的本發(fā)明所涉及的MALDI用試樣調(diào)制方法的第I方式，是用于調(diào)制使用了基質(zhì)輔助激光解吸離子化法的質(zhì)譜分析試樣的試樣調(diào)制方法，實(shí)施步驟為:
a)基質(zhì)層疊步驟，在真空氣氛中使基質(zhì)物質(zhì)氣化，使該基質(zhì)物質(zhì)層疊在載有測(cè)定對(duì)象樣品的試樣基板表面，
b)溶劑導(dǎo)入步驟，使形成在所述試樣基板上的基質(zhì)膜層表面與氣體狀或液體狀的規(guī)定溶劑接觸，使該溶劑浸潤(rùn)到所述基質(zhì)膜層中，
C)基質(zhì)再層疊步驟，在真空氣氛中使基質(zhì)物質(zhì)氣化，在所述溶劑已浸潤(rùn)狀態(tài)下、或浸潤(rùn)溶劑已揮發(fā)狀態(tài)下的所述基質(zhì)膜層表面，再次層疊基質(zhì)物質(zhì)。
[0015]在這里，“作為測(cè)定對(duì)象的樣品”指的是，想要通過(guò)MALDI離子化而實(shí)施質(zhì)譜分析的對(duì)象物，特別是想要使用利用了 MALDI的成像質(zhì)譜裝置進(jìn)行質(zhì)譜成像的對(duì)象物，例如，取自生物的薄切片的生物組織切片等。此外，“試樣基板”指的是，例如導(dǎo)電性載玻片或不銹鋼等金屬制的板等。
[0016]此外，作為“基質(zhì)物質(zhì)”，可以使用以往一般的MALDI用試樣調(diào)制方法所使用的現(xiàn)有的各種種類的基質(zhì)物質(zhì)。此外，作為“溶劑”，可以使用以往一般的MALDI用試樣調(diào)制方法中調(diào)制基質(zhì)溶液時(shí)使用的現(xiàn)有的各種種類的溶劑。這些基質(zhì)物質(zhì)以及溶劑，可根據(jù)樣品所含的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的種類等，由用戶(測(cè)定操作人員)適當(dāng)選擇。
[0017]本發(fā)明涉及的第I方式的MALDI用試樣調(diào)制方法中，將作為測(cè)定對(duì)象的樣品置于試樣基板表面后，在基質(zhì)層疊步驟中，通過(guò)所謂的真空蒸鍍，在試樣基板表面層疊基質(zhì)物質(zhì)而形成覆蓋樣品的基質(zhì)膜層。接著，在溶劑導(dǎo)入步驟中，使形成在試樣基板上的基質(zhì)膜層表面與氣體狀或液體狀的規(guī)定溶劑接觸，使該溶劑浸潤(rùn)到基質(zhì)膜層中。然后，在該溶劑干燥前或干燥后，在之前形成的基質(zhì)膜層表面，通過(guò)真空蒸鍍，再層疊基質(zhì)物質(zhì)。
[0018]另外，即使在溶劑沒(méi)有干燥狀態(tài)下進(jìn)行基質(zhì)物質(zhì)真空蒸鍍的情況下，將試樣基板置于真空氣氛中的時(shí)點(diǎn)，浸潤(rùn)到基質(zhì)膜層中的溶劑會(huì)急速揮發(fā)，被從基質(zhì)膜層中除去。因此，即使在溶劑干燥前開始真空蒸鍍，實(shí)質(zhì)上也是在溶劑已干燥的狀態(tài)下，在基質(zhì)膜層上蒸鍍新的基質(zhì)物質(zhì)。
[0019]通過(guò)真空蒸鍍所形成的基質(zhì)膜層中的基質(zhì)物質(zhì)結(jié)晶非常細(xì)，并且均勻性高。在浸潤(rùn)到此種基質(zhì)膜層的溶劑氣化過(guò)程中，基質(zhì)物質(zhì)的結(jié)晶吸收樣品中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)，再結(jié)晶化?；|(zhì)再層疊步驟中，如此，在分散有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的微細(xì)結(jié)晶的基質(zhì)膜層表面，形成較薄的基質(zhì)膜層。特別是蛋白質(zhì)等來(lái)自生物試樣的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)容易受到激光損傷，雖然與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)混雜的基質(zhì)物質(zhì)具有抑制激光損傷的作用，但由于其結(jié)晶非常微細(xì)，因此較之于較大的結(jié)晶，其作用變?nèi)酢?br> 與此相對(duì)，本發(fā)明涉及的試樣調(diào)制方法所調(diào)整的試樣中，表面形成有不含測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的基質(zhì)膜層，因此通過(guò)MALDI離子化時(shí)，其表面的基質(zhì)膜層會(huì)適當(dāng)吸收激光，抑制測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的損傷。其結(jié)果是，較之于溶劑潤(rùn)濕后不再層疊基質(zhì)物質(zhì)的情況，產(chǎn)生的離子量增加，可幫助提升檢測(cè)靈敏度。
[0020]本發(fā)明涉及的第I方式的MALDI用試樣調(diào)制方法中，例如，可以在溶劑導(dǎo)入步驟中，在充滿了氣化溶劑的容器內(nèi)，放置形成有基質(zhì)膜層的試樣基板，由此使基質(zhì)膜層表面與氣化溶劑接觸，將該狀態(tài)維持規(guī)定時(shí)間，使溶劑浸潤(rùn)到基質(zhì)膜層中。
此外，也可以在相同的溶劑導(dǎo)入步驟中，用噴射等向形成在試樣基板上的基質(zhì)膜層表面噴霧液體狀溶劑，由此使該基質(zhì)膜層表面與液體狀的溶劑接觸，使該溶劑浸潤(rùn)到基質(zhì)膜層中。
[0021]前者的方法如后所述，可以使用同一個(gè)裝置，連續(xù)進(jìn)行基質(zhì)層疊步驟以及基質(zhì)再層疊步驟的處理，這一點(diǎn)很好。另一方面，該方法中溶劑浸潤(rùn)到基質(zhì)膜層中需要時(shí)間，因此溶劑導(dǎo)入步驟處理需要花費(fèi)時(shí)間。與此相對(duì)，后者的方法可以在短時(shí)間內(nèi)向基