優(yōu)先權(quán)文件

本申請要求2014年6月12日提交的名稱為“opticalbiosensor(光學(xué)生物傳感器)”的申請?zhí)枮?014902236的澳大利亞臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。

本發(fā)明涉及用于檢測生物分析物如肽和蛋白質(zhì)的光學(xué)生物傳感器。在具體形式中，本發(fā)明涉及用于檢測與特定疾病或病理狀況相關(guān)的肽和蛋白質(zhì)的光學(xué)生物傳感器。

技術(shù)背景

與特定疾病或病理狀況相關(guān)的肽、蛋白質(zhì)和其它生物學(xué)分析物(“生物分析物”)的檢測能夠診斷和預(yù)測疾病或病癥。例如，已經(jīng)識別了幾種心臟標(biāo)記蛋白，例如急性冠狀動脈綜合征(acs)和c-反應(yīng)蛋白(crp)，且其被用于心血管疾病的診斷和預(yù)測。

用于檢測或定量生物分析物的診斷工具通常依賴于配體和受體之間的配體-特異性結(jié)合。在診斷中常用的配體/受體結(jié)合對包括抗原-抗體、激素-受體、藥物-受體、細(xì)胞表面抗原-凝集素、生物素-親和素、底物/酶和互補(bǔ)核酸鏈。待檢測的生物分析物可以是結(jié)合對的成員；可選的，生物分析物可以是與配體競爭結(jié)合至補(bǔ)體受體的配體類似物。

用于檢測配體/受體相互作用的一系列裝置是已知的。例如，使用化學(xué)/酶試驗，其中通過測量或定量可檢測的反應(yīng)產(chǎn)物(例如金免疫粒子)來檢測生物分析物的存在或含量。配體/受體的相互作用也可以通過放射性標(biāo)記試驗檢測和定量。具體地，常用的試驗方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)。雖然非常準(zhǔn)確，但是耗時、昂貴、且技術(shù)復(fù)雜。

檢測與傷口相關(guān)的生物分析物的生物傳感器將有益于管理慢性傷口，例如糖尿病足潰瘍、壓迫性潰瘍和下肢靜脈潰瘍。由于在不愈合性傷口中發(fā)生的生物化學(xué)過程的固有復(fù)雜性，這些傷口的治療是漫長和具有挑戰(zhàn)性的。通常，由護(hù)士和臨床醫(yī)生進(jìn)行傷口床的常規(guī)檢查和評估，以通知個人主體的傷口治療計劃。這個評估過程消耗大量的護(hù)理時間和敷料材料，這帶來了增加的傷口護(hù)理中的醫(yī)療費用。

先進(jìn)的檢測技術(shù)的使用正在快速增長^[2,^6]，例如在傷口管理中的診斷和治療診斷生物傳感器，特別是用于監(jiān)測急性和慢性傷口的愈合狀態(tài)的先進(jìn)檢測技術(shù)。理想的診斷工具將提供清楚和簡單的讀出，不需要來自醫(yī)學(xué)專家的解釋，而治療診斷學(xué)將釋放響應(yīng)于改變的傷口愈合的療法^[1,2,6]，例如作為細(xì)菌感染的結(jié)果^[7-9]。將這種診斷或治療診斷的生物傳感器納入至傷口敷料(“智能”敷料)中或部署為快速響應(yīng)且具有靈敏性和選擇性的定點護(hù)理(point-of-care)(poc)裝置是理想的。

需要提供對傷口狀態(tài)或其他疾病或病理狀況的生物標(biāo)志物的快速、靈敏、選擇性和/或低成本的檢測的診斷工具。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

根據(jù)第一方面，提供了一種用于檢測樣本中的靶生物分析物的光學(xué)生物傳感器，所述生物傳感器包括：

-多孔硅或氧化鋁襯底，包括表面和固定在表面上的檢測劑，檢測劑包括感應(yīng)域和信號域，所述感應(yīng)域包括能夠與靶生物分析物相互作用的接頭，所述信號域包括發(fā)光供體和發(fā)光受體，其中發(fā)光供體和發(fā)光受體通過接頭連接，且在不存在靶生物分析物時光耦合，使來自發(fā)光供體的光發(fā)射基本上被發(fā)光受體淬滅，且靶生物分析物和接頭的相互作用導(dǎo)致發(fā)光供體和發(fā)光受體的光學(xué)解耦合，從而導(dǎo)致來自發(fā)光供體的光發(fā)射；以及

-在襯底表面上的多個光相互作用孔，其中孔配置為與來自發(fā)光供體的光發(fā)射相互作用以提供指示靶生物分析物的存在的可測量的光發(fā)射。

在某些實施例中，光相互作用孔的內(nèi)表面包括與來自發(fā)光供體的光發(fā)射相互作用的光學(xué)結(jié)構(gòu)。光學(xué)結(jié)構(gòu)可以是濾光片、反射鏡或光學(xué)腔。例如，光相互作用孔的內(nèi)表面可以包括布拉格反射鏡、皺褶(rugate)濾光片、共振微腔或這些光學(xué)特征中的任何組合。在某些實施例中，襯底是共振微腔(psirm)襯底，其中光相互作用孔包括由共振微腔隔開的分布式布拉格反射鏡。

發(fā)光供體和發(fā)光受體可以是熒光供體/受體對或磷光供體/受體對。

光學(xué)生物傳感器還可以進(jìn)一步包括用于檢測來自發(fā)光供體的光發(fā)射和提供含有所述光發(fā)射信息的輸出信號的檢測器。

有利地，相對于襯底表面上不存在光相互作用孔時測量的光發(fā)射，可測量的光發(fā)射是增強(qiáng)或放大的。這意味著相對于不包括光相互作用孔的生物傳感器，使用本文所描述的生物傳感器可以獲得更高水平的檢測。

在某些實施例中，生物傳感器進(jìn)一步包括生物分析物特異性捕獲劑。生物分析物特異性捕獲劑可以包括能夠選擇性結(jié)合靶生物分析物的結(jié)合劑。生物分析物特異性捕獲劑可以沉積在多孔硅或氧化鋁襯底的表面上或附近，使由捕獲劑捕獲的任何生物分析物中的至少一些能夠與檢測劑的感應(yīng)域相互作用。生物分析物特異性捕獲劑的形式可以是在其表面上包括結(jié)合劑的粒子。例如，粒子可以是具有結(jié)合到其表面的結(jié)合劑的功能化磁性納米粒子(mnp)。功能化mnp可以與襯底的表面相互作用并保留在襯底的表面上。

結(jié)合劑可以是選擇性結(jié)合靶生物分析物的任何試劑。結(jié)合劑可以選擇性地從包括與靶生物分析物結(jié)構(gòu)相關(guān)的其他組分的復(fù)雜流體中結(jié)合靶生物分析物。例如，這些實施例的生物傳感器可以用于選擇性檢測位于結(jié)構(gòu)相關(guān)的肽或蛋白質(zhì)家族中的特定肽或蛋白質(zhì)。

根據(jù)第二方面，提供了用于檢測樣本中的靶生物分析物的方法，所述方法包括：

-提供一光學(xué)生物傳感器，所述光學(xué)生物傳感器包括：多孔硅或氧化鋁襯底，其包括表面和固定在表面上的檢測劑，檢測劑包括感應(yīng)域和信號域，感應(yīng)域包括能夠與靶生物分析物相互作用的接頭，信號域包括發(fā)光供體和發(fā)光受體，其中發(fā)光供體和發(fā)光受體通過接頭連接且在不存在靶生物分析物時光耦合，使來自發(fā)光供體的光發(fā)射基本上被發(fā)光受體淬滅，靶生物分析物與接頭的相互作用導(dǎo)致發(fā)光供體和發(fā)光受體的光學(xué)解耦合，從而導(dǎo)致來自發(fā)光供體的光發(fā)射；和在襯底的表面上的多個光相互作用孔，其中孔配置為與來自發(fā)光供體的光發(fā)射相互作用，以提供指示靶生物分析物的存在的可測量的光發(fā)射；

-將光學(xué)生物傳感器的表面與樣本接觸，使靶生物分析物(如果存在)與接頭相互作用；以及

-檢測來自光學(xué)生物傳感器的光發(fā)射的變化。

根據(jù)第三方面，提供了用于測量樣本中的靶生物分析物的濃度的方法，所述方法包括：

-提供光學(xué)生物傳感器，所述光學(xué)生物傳感器包括：多孔硅或氧化鋁襯底，其包括表面和固定在表面上的檢測劑，檢測劑包括感應(yīng)域和信號域，感應(yīng)域包括能夠與靶生物分析物相互作用的接頭，信號域包括發(fā)光供體和發(fā)光受體，其中發(fā)光供體和發(fā)光受體通過接頭連接且在不存在靶生物分析物時光耦合，使來自發(fā)光供體的光發(fā)射基本上被發(fā)光受體淬滅，靶生物分析物與接頭的相互作用導(dǎo)致發(fā)光供體和發(fā)光受體的光學(xué)解耦合，從而導(dǎo)致來自發(fā)光供體的光發(fā)射；和在襯底表面上的多個光相互作用孔，其中孔配置為與來自發(fā)光供體的光發(fā)射相互作用，以提供指示靶生物分析物的存在的可測量的光發(fā)射；

-將光學(xué)生物傳感器的表面與樣本接觸，使靶生物分析物(如果存在)與接頭相互作用；

-檢測來自光學(xué)生物傳感器的光發(fā)射的變化；以及

-從光發(fā)射的變化確定樣本中的靶生物分析物的濃度。

在第二和第三方面的某些實施例中，光發(fā)射的變化可以是來自光學(xué)生物傳感器的發(fā)射光的波長變化和/或發(fā)射光的強(qiáng)度變化中的任一個。

在第一、第二和第三方面的某些實施例中，當(dāng)靶生物分析物與接頭接觸時，接頭被靶生物分析物裂解，以致接頭的裂解引起發(fā)光供體和發(fā)光受體的光學(xué)解耦合。

在第一、第二和第三方面的某些實施例中，光相互作用孔包括共振微腔，且襯底在反射光譜中的反射譜帶的中心顯示一共振微腔凹陷(dip)，并且微腔凹陷的波長與發(fā)光供體的發(fā)射波長基本相同，使來自發(fā)光供體的發(fā)射通過微腔得到增強(qiáng)。在這些實施例中，psirm的共振微腔凹陷對折射率變化敏感，相對小的折射率變化在光譜中引起相對大的偏移。在這些實施例中，光譜的偏移也指示靶生物分析物的存在。

微腔可以在多孔硅或多孔氧化鋁中形成。在某些實施例中，微腔在多孔硅中形成。

在某些實施例中，光相互作用孔包括分布式布拉格反射鏡，每個反射鏡包括在高孔隙率硅和低孔隙率硅之間交替變化的周期性層狀結(jié)構(gòu)。

在某些實施例中，襯底是共振微腔(psirm)襯底，其中光相互作用孔包括由共振微腔隔開的分布式布拉格反射鏡。每個分布式布拉格反射鏡的光學(xué)厚度是四分之一波長，微腔的光學(xué)厚度是半波長的倍數(shù)，且波長是熒光供體的發(fā)射波長。

在第一、第二和第三方面的某些實施例中，靶生物分析物是相關(guān)的肽或蛋白質(zhì)。在具體實施例中，靶生物分析物是酶。

在某些實施例中，生物傳感器進(jìn)一步包括生物分析物特異性捕獲劑。生物分析物特異性捕獲劑可以包括能夠選擇性結(jié)合靶生物分析物的結(jié)合劑。生物分析物特異性捕獲劑可以沉積在多孔硅或氧化鋁襯底的表面上或附近，使由捕獲劑捕獲的任何生物分析物中的至少一些能夠與檢測劑的感應(yīng)域相互作用。生物分析物特異性捕獲劑的形式可以是在它的表面上包括結(jié)合劑的粒子。例如，粒子可以是具有結(jié)合到其表面的結(jié)合劑的功能化磁性納米粒子(mnp)。功能化mnp可以與襯底的表面相互作用并保留在襯底的表面上。

結(jié)合劑可以是選擇性結(jié)合靶生物分析物的任何試劑。結(jié)合劑可以選擇性地從包括與靶生物分析物結(jié)構(gòu)相關(guān)的其他組分的復(fù)雜流體中結(jié)合靶生物分析物。例如，這些實施例的生物傳感器可用于選擇性檢測位于結(jié)構(gòu)相關(guān)的肽或蛋白質(zhì)家族中的特定肽或蛋白質(zhì)。

在某些實施例中，靶生物分析物是基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp)。mmp在慢性傷口中是臨床有效的生物標(biāo)記物。因此，在第四方面，提供了用于監(jiān)測和/或評估主體中的傷口狀態(tài)的方法，所述方法包括：

-提供一光學(xué)生物傳感器，用于檢測來自所述主體的傷口滲出液的基質(zhì)金屬蛋白酶，所述生物傳感器包括：多孔硅或氧化鋁襯底，其包括表面和固定在表面上的檢測劑，檢測劑包括感應(yīng)域和信號域，感應(yīng)域包括用作為基質(zhì)金屬蛋白酶的底物的接頭，信號域包括發(fā)光供體和發(fā)光受體，其中發(fā)光供體和發(fā)光受體通過接頭連接且光耦合，使來自發(fā)光供體的光發(fā)射基本上被所述發(fā)光受體淬滅，基質(zhì)金屬蛋白酶與接頭的相互作用導(dǎo)致接頭的裂解及發(fā)光供體和發(fā)光受體的光學(xué)解耦合，從而導(dǎo)致來自發(fā)光供體的光發(fā)射；和在襯底的表面上的多個光相互作用孔，其中孔配置為與來自發(fā)光供體的光發(fā)射相互作用以提供指示基質(zhì)金屬蛋白酶的存在的可測量的光發(fā)射；

-將光學(xué)生物傳感器的表面與傷口滲出液樣本接觸，使基質(zhì)金屬蛋白酶(如果存在)與接頭相互作用；

-檢測來自光學(xué)生物傳感器的光發(fā)射的變化；以及

-使用所檢測到的光發(fā)射的變化來提供傷口狀態(tài)的指示。

在癌癥進(jìn)展的多個階段(包括獲取侵襲性和轉(zhuǎn)移性質(zhì))中，也強(qiáng)烈地牽涉mmp^[71]。因此，在第五方面，提供了用于監(jiān)測和/或評估主體中癌癥狀態(tài)的方法，所述方法包括：

-提供一光學(xué)生物傳感器，用于檢測來自所述主體的癌組織或血液的基質(zhì)金屬蛋白酶，生物傳感器包括：多孔硅或氧化鋁襯底，其包括表面和固定在表面上的檢測劑，檢測劑包括感應(yīng)域和信號域，感應(yīng)域包括用作為基質(zhì)金屬蛋白酶底物的接頭，信號域包括發(fā)光供體和發(fā)光受體，其中發(fā)光供體和發(fā)光受體通過接頭連接且光耦合，使來自發(fā)光供體的光發(fā)射基本上被發(fā)光受體淬滅，基質(zhì)金屬蛋白酶與接頭的相互作用導(dǎo)致接頭的裂解及發(fā)光供體和發(fā)光受體的光學(xué)解耦合，從而導(dǎo)致來自發(fā)光供體的光發(fā)射；和在襯底表面上的多個光相互作用孔，其中孔配置為與來自發(fā)光供體的光發(fā)射相互作用，以提供指示基質(zhì)金屬蛋白酶的存在的可測量的光發(fā)射；

-將光學(xué)生物傳感器的表面與癌癥組織或血液的樣本接觸，使基質(zhì)金屬蛋白酶(如果存在)與接頭相互作用；

-檢測來自光學(xué)生物傳感器的光發(fā)射的變化；以及

-使用所檢測到的光發(fā)射的變化來提供癌癥狀態(tài)的指示。

在某些實施例中，生物傳感器進(jìn)一步包括生物分析物特異性捕獲劑。生物分析物特異性捕獲劑可以包括能夠選擇性結(jié)合特定mmp蛋白的結(jié)合劑，所述特定mmp蛋白選自由mmp-1、mmp-2、mmp-3和mmp-9組成的組中的一種。結(jié)合劑能夠在存在其它所列出的mmp時選擇性結(jié)合所選擇的一種mmp。結(jié)合劑可以是抗體。結(jié)合劑可以是具有結(jié)合到其表面的抗體的功能化磁性納米粒子(mnp)。

在某些其它實施例中，生物分析物是細(xì)菌生物標(biāo)記物。因此，在第六方面，提供了用于監(jiān)測和/或評估主體中的細(xì)菌感染的方法，所述方法包括：

-提供一光學(xué)生物傳感器，用于檢測來自所述主體的體液的細(xì)菌生物標(biāo)記物，所述生物傳感器包括：多孔硅或氧化鋁襯底，其包括表面和固定在表面上的檢測劑，檢測劑包括感應(yīng)域和信號域，感應(yīng)域包括用作為細(xì)菌生物標(biāo)記物的底物的接頭，信號域包括發(fā)光供體和發(fā)光受體，其中發(fā)光供體和發(fā)光受體通過接頭連接且光耦合，使來自發(fā)光供體的光發(fā)射基本上被發(fā)光受體淬滅，細(xì)菌生物標(biāo)記物與接頭的相互作用導(dǎo)致接頭的裂解及發(fā)光供體和發(fā)光受體的光學(xué)解耦合，從而導(dǎo)致來自發(fā)光供體的光發(fā)射；和在襯底表面上的多個光相互作用孔，其中孔配置為與來自發(fā)光供體的光發(fā)射相互作用，以提供指示細(xì)菌生物標(biāo)記物的存在的可測量的光發(fā)射；

-將光學(xué)生物傳感器的表面與體液樣本接觸，使細(xì)菌生物標(biāo)記物(如果存在)與接頭相互作用；

-檢測來自光學(xué)生物傳感器的光發(fā)射的變化；以及

-使用所檢測到的光發(fā)射的變化來提供細(xì)菌感染的指示。

細(xì)菌生物標(biāo)記物可用作為主體中傷口狀態(tài)的指示劑。因此，在第七方面，提供了用于監(jiān)測和/或評估主體中的傷口狀態(tài)的方法，所述方法包括：

-提供一光學(xué)生物傳感器，用于檢測來自所述主體的傷口滲出液的細(xì)菌生物標(biāo)記物，生物傳感器包括：多孔硅或氧化鋁襯底，其包括表面和固定在表面上的檢測劑，檢測劑包括感應(yīng)域和信號域，感應(yīng)域包括用作為細(xì)菌生物標(biāo)記物的底物的接頭，信號域包括發(fā)光供體和發(fā)光受體，其中發(fā)光供體和發(fā)光受體通過接頭連接且光耦合，使來自發(fā)光供體的光發(fā)射基本上被發(fā)光受體淬滅，細(xì)菌生物標(biāo)記物與接頭的相互作用導(dǎo)致接頭的裂解及發(fā)光供體和發(fā)光受體的光學(xué)解耦合，從而導(dǎo)致來自發(fā)光供體的光發(fā)射；和在襯底表面上的多個光相互作用孔，其中孔配置為與來自發(fā)光供體的光發(fā)射相互作用以提供指示細(xì)菌生物標(biāo)記物的存在的可測量的光發(fā)射；

-將光學(xué)生物傳感器的表面與傷口滲出液的樣本接觸，使細(xì)菌生物標(biāo)記物(如果存在)與接頭相互作用；

-檢測來自光學(xué)生物傳感器的光發(fā)射的變化；以及

-使用所檢測到的光發(fā)射的變化來提供傷口狀態(tài)的指示。

在第四至第七方面的某些實施例中，光發(fā)射的變化可以是來自光學(xué)生物傳感器的發(fā)射光的波長變化和/或發(fā)射光的強(qiáng)度變化中的任一種。

在第五至第七方面的某些實施例中，生物傳感器進(jìn)一步包括生物分析物特異性捕獲劑。生物分析物特異性捕獲劑可以包括能夠選擇性結(jié)合細(xì)菌生物標(biāo)記物的結(jié)合劑。結(jié)合劑可以是抗體。結(jié)合劑可以是具有結(jié)合到其表面的抗體的功能化磁性納米粒子(mnp)。

第五和第七方面的細(xì)菌生物標(biāo)記物可以是指示由細(xì)菌種類引起的感染的肽、蛋白質(zhì)或其它分子，所述細(xì)菌種類是，例如炭疽桿菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、肉毒桿菌、艱難梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)梭菌、伯氏疏螺旋體、蒼白密螺旋體、沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、白喉棒狀桿菌、結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、普氏立克次氏體、立克氏立克次氏體、斑疹傷寒立克次氏體、嗜吞噬細(xì)胞無形體、查菲埃立克體(ehrlichiachaffeensis)、羊布氏桿菌、百日咳博特氏桿菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌、類鼻疽伯克氏菌(b.pseudomallei)、淋病奈瑟氏菌、腦膜炎奈瑟氏菌、空腸彎曲桿菌、幽門螺桿菌、嗜肺性軍團(tuán)桿菌、鮑氏不動桿菌、卡他莫拉菌、銅綠假單胞菌、氣單胞菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、硫發(fā)菌(thiotrichalessp.)、流感嗜血桿菌、肺炎桿菌、奇異變形桿菌、鼠疫耶爾森氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、弗氏志賀氏菌、腸道沙門氏菌或大腸桿菌。

在第一至第七方面的某些實施例中，光學(xué)生物傳感器是檢測裝置的一部分。在這些實施例中，檢測裝置可以是定點護(hù)理(poc)裝置。檢測裝置包括可引入樣本的流體入口、本文所描述的光學(xué)生物傳感器和用于輸出關(guān)于發(fā)光供體的發(fā)射強(qiáng)度的信息的光學(xué)輸出。

檢測裝置還可以包括用于直接收集來自主體的測試樣本并將其轉(zhuǎn)移到檢測裝置的構(gòu)件。具體地，檢測裝置可以利用顯微操作針或一個或多個顯微操作針陣列，其設(shè)計為通過毛細(xì)管作用和/或表面張力將體液(例如傷口滲出液)從主體轉(zhuǎn)移至裝置。

檢測裝置可以用于檢測多個靶生物分析物。因此，外殼可以包括多個空間排列的光學(xué)生物傳感器，每個生物傳感器包括對不同生物分析物具有特異性的檢測劑，使每個生物傳感器能夠相對于鄰近的生物傳感器選擇性地檢測不同的生物分析物。例如，每個生物傳感器能夠檢測指示特定細(xì)菌種類的生物分析物，檢測裝置因此可以用于在單個步驟中檢測多種細(xì)菌感染。在這些實施例中，每個生物傳感器可以具有相同的發(fā)光供體和受體對，但具有不同的接頭。或者，單個或多個生物傳感器可以包括具有相同接頭但每個具有不同發(fā)光供體和受體對的檢測劑。

在某些其它實施例中，光學(xué)生物傳感器可以是傷口敷料或繃帶的一部分。在這些實施例中，光學(xué)生物傳感器可以固定或附著到傷口敷料或繃帶材料上，且可以向醫(yī)師提供關(guān)于傷口狀態(tài)的信息。

本文所描述的光學(xué)生物傳感器可以是治療診斷裝置的一部分。因此，在第八方面，提供了用于診斷和/或治療主體的疾病或病理狀況的治療診斷裝置，所述裝置包括：

-提供一光學(xué)生物傳感器，用于檢測和/或確定生物分析物的濃度，所述生物分析物是從所述主體獲得的體液樣本中所述疾病或病理狀況的生物標(biāo)記物，所述光學(xué)生物傳感器包括：多孔硅或氧化鋁襯底，其包括表面和固定在表面上的檢測劑，檢測劑包括感應(yīng)域和信號域，感應(yīng)域包括能夠與靶生物分析物相互作用的接頭，信號域包括發(fā)光供體和發(fā)光受體，其中發(fā)光供體和發(fā)光受體通過接頭連接且光耦合，使來自發(fā)光供體的光發(fā)射基本上被發(fā)光受體淬滅，靶生物分析物與接頭的相互作用導(dǎo)致發(fā)光供體和發(fā)光受體的光學(xué)解耦合，從而導(dǎo)致來自發(fā)光供體的光發(fā)射；和在襯底的表面上的多個光相互作用孔，其中孔配置為與來自發(fā)光供體的光發(fā)射相互作用以提供指示靶生物分析物的存在的可測量的光發(fā)射；

-檢測器，用于檢測來自光學(xué)生物傳感器的光發(fā)射的變化，并提供含有關(guān)于所述光發(fā)射變化的信息的輸出信號；

-遞送系統(tǒng)，用于將治療劑遞送至主體；以及

-控制器，用于處理來自檢測器的輸出信號，并且基于從輸出信號獲得的信息根據(jù)需要激活遞送系統(tǒng)。

在第八方面的某些實施例中，生物傳感器進(jìn)一步包括生物分析物特異性捕獲劑。生物分析物特異性捕獲劑可以包括能夠選擇性結(jié)合生物分析物的結(jié)合劑。結(jié)合劑可以是抗體。結(jié)合劑可以是具有結(jié)合到其表面的抗體的功能化磁性納米粒子(mnp)。

如前文所描述，相對于襯底表面上不存在光相互作用孔時測量的光發(fā)射，可測量的光發(fā)射有利地增強(qiáng)或放大。

附圖說明

本發(fā)明的實施例將參考附圖討論，其中：

圖1示出：(a)氫化物封端的多孔硅共振微腔(psirm)表面的表面功能化反應(yīng)的示意圖，包括采用十一碳烯酸的氫化硅烷化、nhs酯形成和與熒光基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp)底物反應(yīng)；和(b)psirm表面的基線校正ftir-atr光譜，(i)采用十一碳烯酸氫化硅烷化后，(ii)采用edc/nhs活化，和(iii)熒光mmp肽底物的固定；

圖2示出：在如表1所列出的五種不同電流密度下蝕刻的單層psi的俯視圖(a-e)和橫截面(f-j)sem圖像。(a)和(f)的電流密度是25ma/cm²，(b)和(g)的電流密度是30ma/cm²，(c)和(h)的電流密度是40ma/cm²，(d)和(i)的電流密度是50ma/cm²，(e)和(j)的電流密度是60ma/cm²。呈現(xiàn)在圖(a-e)和(f-j)中的比例尺分別為300nm和2μm；

圖3示出：(a)psirm的模擬反射光譜(灰色跡線)和使用來自新蝕刻的psirm的irs獲得的反射光譜(黑色跡線)；和(b)新蝕刻的psirm的俯視圖的sem圖像和(c)新蝕刻的psirm的橫截面的sem圖像；

圖4示出了edans的發(fā)射光譜，其固定在：(a)在psirm基質(zhì)中；(b)在來自3種不同mmp-1濃度的緩沖溶液中：1.2×10^-7m(實線)；1.2×10^-12m(虛線)；1.2×10^-17m(點線)和0m(點和虛線)；和(c)在緩沖溶液(實心)中和psirm表面(方格)上的每種mmp-1濃度在446.5nm的發(fā)射強(qiáng)度的圖，由三個獨立實驗計算誤差線；

圖5示出了不同psi架構(gòu)的熒光光譜(a)：具有低孔隙率的單層psi(psi-lp，灰色虛線)、具有高孔隙率的單層psi(psi-hp，灰色實線)、具有交替變化的hp和lp層的多層psi(在446.5nm處具有共振的psiml，黑色虛線)和psirm(黑色實線)。點線表示psirm的反射光譜；和(b)四種不同psi結(jié)構(gòu)在446.5nm處的發(fā)射強(qiáng)度的圖，由三個獨立實驗計算誤差線；

圖6示出：(a)在采用mmp-1孵育后，在446.5nm處觀察到的來自在446.5nm(實線)和506.7nm(虛線)處具有腔凹陷的psirm的熒光發(fā)射光譜的比較。點線相當(dāng)于未采用mmp-1孵育的對照樣本；及(b)兩種psirm在446.5nm處的發(fā)射強(qiáng)度的圖，由三個獨立實驗計算誤差線；

圖7示出了來自以下的edans發(fā)射的圖：(a)具有(hp/lp)3(hp)4(lp/hp)3和16.4％孔隙率對比度的psirm(實線)與具有(hp/lp)3(hp)4(lp/hp)3和19.3％孔隙率對比度(porositycontrast)的psirm(點線)的比較，(b)具有(hp/lp)3(hp)4(lp/hp)3和16.4％孔隙率對比度的psirm(實線)與具有(hp/lp)4(hp)4(lp/hp)4和16.4％孔隙率對比度的psirm的比較。添加到表面的mmp-1的濃度為1.2×10^-7m；

圖8是示出相同psirm的整個多孔層在edans的激發(fā)波長(340nm)下的電場分布的模擬圖。橫軸表示psirm結(jié)構(gòu)的層堆疊的位置，其被指定為從psi-塊si界面(psi-bulksiinterface)處的z＝0.6μm開始至作為psi-空氣界面的z＝1.8μm的電場(z)的空間范圍。黑色跡線表示具有(hp/lp)3(hp)4(lp/hp)3構(gòu)型的psirm，灰色跡線表示具有(hp/lp)4(hp)4(lp/hp)4構(gòu)型的psirm?；疑叫问境隽嗽趐sirm結(jié)構(gòu)的層堆疊中缺陷層的位置；

圖9示出了不同孵育時間的熒光發(fā)射強(qiáng)度的圖。從三個獨立的實驗計算誤差線；

圖10示出了在采用mmp-1在不同濃度下孵育15分鐘后，肽-功能化psirm的熒光發(fā)射強(qiáng)度的圖。從三個獨立的實驗計算誤差線；

圖11示出了傷口滲出液樣本和作為陽性對照的mmp-1的蛋白免疫印跡分析；

圖12示出：(a)在傷口滲出液(wf)浸漬后，肽-功能化psirm的熒光發(fā)射光譜(實線)的圖。點線相應(yīng)于未采用傷口滲出液孵育的對照psirm；和(b)在緩沖液中不同濃度的mmp-1和摻入傷口滲出液樣本的平均發(fā)射強(qiáng)度的圖，由三個獨立實驗計算誤差線；

圖13示出了在存在和不存在四種不同濃度的傷口滲出液時，純凈染料的熒光發(fā)射強(qiáng)度的圖，由三個獨立實驗計算誤差線；

圖14示出了在采用組織提取物(左邊)和兩種不同來源的傷口滲出液(中間和右邊)孵育后，肽-功能化psirm的熒光發(fā)射強(qiáng)度的圖；

圖15示出了mnp表面功能化的ftir光譜。(a)羧酸封端的mnp，(b)在采用edc/nhs活化后的羧酸封端的mnp，和(c)固定在mnp上的mmp-1ab；

圖16示出了采用固定于mnp-mmp-1ab中的mmp-1孵育后，在溶液(a)中和psi表面檢測到的mmp熒光肽底物的edans的熒光發(fā)射光譜；

圖17示出了采用在不同mmp-1ab濃度下與mnp-mmp-1ab結(jié)合的mmp-1裂解后，來自mmp熒光肽底物的edans的熒光強(qiáng)度的圖；

圖18示出了采用在mmp-1ab和mmp-1之間的不同相互作用時間下與mnp-mmp-1ab結(jié)合的mmp-1裂解后，來自mmp熒光肽底物的edans的熒光強(qiáng)度的圖；

圖19示出了顯示在含有mmp-1、mmp-9和混合的mmp-1mmp-9的緩沖液中的mnp-mmpab的選擇性的圖；

圖20示出了顯示在傷口滲出液樣本、摻有mmp-1的傷口滲出液、摻有mmp-9的傷口滲出液和摻有混合的mmp-1mmp-9的傷口滲出液中的mnp-mmpab的選擇性試驗的圖；

圖21示出了使用微接觸印刷技術(shù)功能化以固定mmp肽底物，接著采用mmp-1溶液孵育的psirm表面的共聚焦顯微鏡圖像；

圖22示出了由分選酶a裂解后，在溶液(a)和psirm表面(b)檢測到的fitc的熒光發(fā)射(頂部跡線)，而下部跡線是在與分選酶a酶(sortaseaenzyme)接觸前，分選酶a底物溶液(a)和功能化的psirm表面(b)的空白；

圖23示出了由分選酶a在不同接觸時間的裂解后，來自分選酶a肽底物的fitc的熒光強(qiáng)度，由三個不同的實驗計算誤差線；

圖24示出了由分選酶a在不同濃度的分選酶a酶下裂解后，來自分選酶a肽底物的fitc的熒光強(qiáng)度，由三個獨立實驗計算誤差線；

圖25示出了來自傷口滲出液實驗的分選酶a肽底物的fitc的熒光強(qiáng)度；

圖26示出了來自由細(xì)菌上清液樣本裂解后的分選酶a肽底物的fitc的熒光強(qiáng)度；

圖27示出了由具有不同培養(yǎng)時間(0、0.5、1、3、5和24小時)的細(xì)菌上清液樣本和采用細(xì)菌培養(yǎng)0和24小時的傷口滲出液裂解后，來自分選酶a肽底物的fitc的熒光強(qiáng)度，由三個獨立實驗計算誤差線；

圖28示出了緩沖溶液(實心圓圈)、添加于傷口滲出液樣本(空心圓圈)和添加于細(xì)菌上清液樣本(三角形)中的不同濃度的分選酶a的發(fā)射強(qiáng)度的比較，從三個獨立的實驗計算誤差線。

具體實施方式

本文公開了一種用于檢測樣本中的靶生物分析物的光學(xué)生物傳感器。生物傳感器包括多孔硅或氧化鋁襯底，襯底包括表面和固定在表面上的檢測劑。檢測劑包括感應(yīng)域和信號域。感應(yīng)域包括能夠與靶生物分析物相互作用的接頭，信號域包括發(fā)光供體和發(fā)光受體。發(fā)光供體和發(fā)光受體通過接頭連接，且在不存在靶生物分析物時光耦合，使來自發(fā)光供體的光發(fā)射基本上被發(fā)光受體淬滅。靶生物分析物與接頭的相互作用導(dǎo)致發(fā)光供體和發(fā)光受體的光學(xué)解耦合，從而導(dǎo)致來自發(fā)光供體的光發(fā)射。襯底的表面進(jìn)一步包括多個光相互作用孔，其中孔配置為與來自發(fā)光供體的光發(fā)射相互作用以提供指示靶生物分析物的存在的可測量光發(fā)射。

在實施例中，來自發(fā)光供體的光發(fā)射通過與襯底的光相互作用孔相互作用而增強(qiáng)。光相互作用孔的內(nèi)表面可以包括與來自發(fā)光供體的光發(fā)射相互作用的光學(xué)結(jié)構(gòu)。光學(xué)結(jié)構(gòu)可以是濾光片、反射鏡或腔。光相互作用孔的內(nèi)表面可以包括布拉格反射鏡、皺褶濾光片、共振微腔或這些光學(xué)特征中的任何組合。

為了便于討論，現(xiàn)在將進(jìn)一步參考屬于多孔硅共振微腔(psirm)襯底的襯底，其中光相互作用孔包括由共振微腔隔開的分布式布拉格反射鏡。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，該討論的方面適用于其它實施例，在所述其它實施例中，光相互作用孔包括另一類型的光學(xué)特征，例如皺褶濾光片、共振微腔或布拉格反射鏡。

此外，進(jìn)一步參考發(fā)光供體和發(fā)光受體，所述發(fā)光供體和發(fā)光受體是熒光供體和熒光受體。應(yīng)當(dāng)理解的是，發(fā)光供體和發(fā)光受體可以是磷光供體和磷光受體，進(jìn)一步討論的這方面也適用于這些實施例。

特別地，具體實施例提供實時、靈敏和選擇性的檢測裝置，以監(jiān)測在定點護(hù)理的慢性傷口的愈合狀態(tài)。多孔硅共振微腔(psirm)的光子性質(zhì)提供了光學(xué)生物傳感器以監(jiān)測在傷口滲出物中發(fā)現(xiàn)的特定生物標(biāo)記物的存在，例如基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp)和細(xì)菌酶生物標(biāo)記物。在實施例中，使用以熒光團(tuán)和淬滅劑為特征的熒光mmp肽底物將psirm功能化。接著將肽功能化的psirm用作為mmp的熒光基光學(xué)生物傳感器?；钚詍mp與接頭相互作用并裂解接頭，產(chǎn)生攜帶熒光團(tuán)的固定化肽片段。與其它psi光子結(jié)構(gòu)相比，嵌入psirm基質(zhì)的熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度通過psirm的光子結(jié)構(gòu)增強(qiáng)。這種熒光增強(qiáng)轉(zhuǎn)化為高的靈敏度，使得能夠在僅15分鐘孵育時間后，在低至7.5×10^-19m的檢測限下檢測mmp-1。

生物傳感器包括多孔硅共振微腔(psirm)襯底。多孔硅(psi)以前已經(jīng)在光學(xué)生物傳感器中使用。gao等人^[20]使用基于包被有明膠的psi皺褶濾光片的生物傳感器實現(xiàn)低至1.5×10^-12m的mmp-2檢測，所述明膠可以被mmp-2消化。接著消化產(chǎn)物進(jìn)入psi基質(zhì)并引起可以通過肉眼觀察到的顏色變化。martin等人^[21]設(shè)計了一種基于抗體功能化psirm檢測mmp-8的生物傳感器，并通過觀察psirm的共振腔凹陷(resonancecavitydip)的偏移來監(jiān)測mmp-8的存在。該裝置能夠檢測到低至1.5×10^-9m的mmp-8。然而，這些生物傳感器都不與復(fù)雜的生物流體一起使用。kilian等人^[22]開發(fā)了一種無標(biāo)記生物傳感器以檢測由人巨噬細(xì)胞分泌的mmp(作為生物流體的一個例子)。生物傳感器基于負(fù)載有生物聚合物的陽極氧化硅的光子晶體。其成功檢測到低至1.2×10^-12m水平的mmp-9。在我們以前的研究中，我們開發(fā)了一種基于用合成mmp抑制劑功能化的單層psi的光學(xué)生物傳感器，并證明該生物傳感器在慢性傷口滲出液中發(fā)現(xiàn)的生理相關(guān)濃度的mmp下選擇性地檢測傷口滲出液樣本中的mmp^[23]。

可選地，襯底可以是多孔氧化鋁襯底。

psirm是包括由微腔層隔開的兩個分布式布拉格反射鏡(dbr)的光子結(jié)構(gòu)，在反射帶的中心產(chǎn)生具有明顯的共振腔凹陷的反射光譜^[32-34]。每個dbr由交替變化的低孔隙率(lp)和高孔隙率(hp)psi的周期性層組成，這兩種psi分別具有高和低的折射率，但具有相同的光學(xué)厚度。每個dbr的光學(xué)厚度為1/4，其中1是具有接近100％反射率的光子共振譜帶的中心波長。共振微腔具有1/2的整數(shù)倍的光學(xué)厚度?？梢酝ㄟ^改變電化學(xué)蝕刻參數(shù)來調(diào)節(jié)共振腔凹陷的中心波長的位置^[35]。

psirm襯底可以通過電化學(xué)蝕刻形成。例如，可以通過使用在2288ms的50ma/cm²和1820ms的25ma/cm²之間交替變化的電流密度陽極蝕刻si晶片以分別形成hp層和lp層來制造psirm襯底?？梢栽?152ms的50ma/cm²的電流密度下蝕刻共振微腔。所得的psirm具有(hp/lp)3(hp)4(lp/hp)3構(gòu)型。為了在電化學(xué)蝕刻之前從襯底去除寄生層，可以對si晶片進(jìn)行預(yù)處理。

當(dāng)在無標(biāo)記光學(xué)生物傳感器中使用時，psi襯底具有許多優(yōu)點。具體地，psi襯底具有非常大的表面積(高達(dá)600m²/g)、可調(diào)的形態(tài)和光學(xué)性質(zhì)，它們是生物相容的且具有一系列的表面化學(xué)?？梢哉{(diào)節(jié)孔徑以允許大的生物分子進(jìn)入，例如抗體。有利地，可以調(diào)節(jié)形態(tài)性質(zhì)，例如孔徑、孔隙率和厚度，以制造適合靶生物分析物進(jìn)入同時排除其它物質(zhì)的psi襯底。

當(dāng)生物傳感器與人體直接接觸(例如通過智能敷料)時，襯底材料的生物相容性也是必要的。psi在體外和體內(nèi)耐受性良好，并降解為原硅酸，人類中硅的天然形式。

本文所描述的psirm襯底對于生物傳感的應(yīng)用具有兩個令人感興趣的光學(xué)特征。首先，psirm的共振腔凹陷對折射率的變化是敏感的。具體地，小的折射率變化引起大的光譜偏移。該光學(xué)特征適用于生物傳感器設(shè)計，且以前已經(jīng)在生物傳感應(yīng)用中研究過，例如葡萄糖檢測^[35]、細(xì)菌檢測^[33,41]、病毒和dna檢測^[42]。第二光學(xué)特征是微腔內(nèi)的光對特定波長的限制效應(yīng)，其有助于固定在psirm上的熒光供體的熒光發(fā)射的增強(qiáng)。如果微腔凹陷的波長與熒光供體的發(fā)射波長一致，則獲得熒光發(fā)射的最佳增強(qiáng)。

新蝕刻的psirm襯底的表面可能是不穩(wěn)定的，并且在氧的存在下易于氧化或在水的存在下易于水解，導(dǎo)致不可控的光學(xué)性質(zhì)，這對于生物傳感器的應(yīng)用是不希望的。為了克服這一點，可以將新蝕刻的psirm襯底的表面功能化。表面可以采用烷化劑功能化，以在襯底表面上產(chǎn)生功能化的烷基單層，或通過采用烯烴進(jìn)行表面改性，產(chǎn)生共價連接到表面的有機(jī)單層^[66]或通過使用導(dǎo)電原子力顯微鏡(atm)通過納米級陰極電接枝反應(yīng)通過直接的si-c鍵將炔接枝到氫化物封端的硅表面^[67]。

在實施例中，采用烷化劑將新蝕刻的襯底的表面功能化。烷化劑可以是烷基羧酸，例如c5-c20羧酸、酯、磺酸酯、炔、疊氮化物、烯烴或任何上述物質(zhì)的組合。在具體的實施例中，采用十一碳烯酸將表面氫化硅烷化。這產(chǎn)生具有穩(wěn)定的si-c鍵的致密烷基單層，保護(hù)psirm表面以防氧化水解。

烷化劑上的官能團(tuán)可以用于共價連接檢測劑。例如，羧酸可以使用已知的肽合成方法共價連接檢測劑。因此，通過將psirm樣本與n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)在偶聯(lián)劑，例如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(edc)存在下反應(yīng)，可以活化羧酸封端的表面以形成nhs酯–封端表面。接著可以通過將功能化的psirm表面與檢測劑反應(yīng)使檢測劑偶聯(lián)至nhs酯-封端的表面，以提供準(zhǔn)備用于生物傳感的改性的psirm表面。

檢測劑可以是包括信號域和感應(yīng)域的融合肽或蛋白質(zhì)。信號域包括熒光供體和熒光受體。感應(yīng)域包括生物分析物結(jié)合肽。熒光供體和熒光受體融合到生物分析物結(jié)合肽的兩個末端。熒光供體和/或熒光受體可以通過接頭融合至生物分析物結(jié)合肽或蛋白質(zhì)。

熒光供體和熒光受體通過接頭連接，且在不存在靶生物分析物時光耦合，使來自熒光供體的光發(fā)射基本上被熒光受體通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(“fret”)淬滅。fret是在具有不同發(fā)射波長的兩個熒光團(tuán)之間的非輻射能量轉(zhuǎn)移，其中激發(fā)態(tài)的熒光供體的激發(fā)能量被轉(zhuǎn)移到熒光受體，并觀察到熒光供體的淬滅^[68]。

如本文所使用的，術(shù)語“熒光供體”是指在fret機(jī)制中充當(dāng)供體的熒光團(tuán)，術(shù)語“熒光受體”指的是在fret機(jī)制中充當(dāng)受體的熒光團(tuán)。熒光供體可以是吸收光的任何染料分子，其將染料置于激發(fā)態(tài)，接著通過發(fā)射光(熒光)返回基態(tài)。熒光受體可以是沒有天然熒光的任何染料分子，其非輻射地接受來自熒光供體的能量以產(chǎn)生受體激發(fā)態(tài)。然后，熒光受體優(yōu)選通過釋放能量作為熱量而非輻射地返回基態(tài)。

fret的能量轉(zhuǎn)移效率根據(jù)熒光供體的發(fā)射光譜和熒光受體的吸收光譜彼此重疊的范圍、熒光供體的量子效率、熒光供體和熒光受體的過渡偶極子的相對取向，和熒光供體和熒光受體之間的距離而變化。因此，fret的能量轉(zhuǎn)移效率根據(jù)熒光供體和熒光受體之間的距離及其相對取向而變化。

可以使用任何熒光供體和熒光受體對，供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜可以彼此重疊以引起fret?？梢允褂玫臒晒夤w的實例包括具有各種波長的熒光蛋白、熒光染料、生物發(fā)光蛋白和量子點?？梢允褂玫臒晒馐荏w的實例包括熒光蛋白、熒光染料和量子點，其具有的波長與熒光供體的波長不同?；蛘撸瑹晒馐荏w可以由淬滅劑或金納米粒子組成，其降低熒光供體的熒光強(qiáng)度。

5-[(2-氨乙基)氨基]萘-1-磺酸(edans)是用于fret-基系統(tǒng)中的常見的熒光供體。edans可以與熒光受體4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(dabcyl)或4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮)磺酸(dabsyl)配對?？梢允褂玫钠渌黤ret對包括：ecfp(增強(qiáng)的青色熒光蛋白)和eyfp(增強(qiáng)的黃色熒光蛋白)，它們分別是充當(dāng)熒光供體和熒光受體的熒光蛋白；熒光素和dabcyl分別充當(dāng)熒光供體和熒光受體；熒光素和cy5分別充當(dāng)熒光供體和熒光受體；金納米粒子和cy3分別充當(dāng)熒光供體和熒光受體；或金納米粒子和cy5分別充當(dāng)熒光供體和熒光受體。

或者，熒光供體和熒光受體對可以是膠體半導(dǎo)體納米晶體(即，量子點)。量子點的寬吸收光譜允許在選擇希望的激發(fā)波長時的靈活性，其中可以大體上減少受體分子的直接激發(fā)。例如，發(fā)光cdse-zns核-殼量子點(qd)可以用作為熒光供體，與上文描述的任何熒光受體，例如cy3，共同使用。檢測劑可以通過將熒光受體與生物分析物結(jié)合肽綴合，接著使產(chǎn)物在適當(dāng)功能化的量子點(例如，采用二巰基-烷基-cooh配體功能化的量子點)上自組裝來制備。在clapp等人中表述的方法可以用于制備基于量子點的檢測劑^[70]。

感應(yīng)域連接熒光供體和熒光受體，且包括生物分析物結(jié)合域。生物分析物結(jié)合域可以是選擇性結(jié)合生物分析物且由于該結(jié)合而經(jīng)歷構(gòu)象或組成變化的肽、蛋白質(zhì)、糖、氨基酸、脂質(zhì)或其它試劑。

生物分析物結(jié)合域中的構(gòu)象變化可以起因于生物分析物競爭性結(jié)合至結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域在不存在生物分析物時(即，生物分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的解折疊)分子間結(jié)合至結(jié)構(gòu)域的另一部分。然而，在生物分析物存在時，分子內(nèi)結(jié)合減少，從而導(dǎo)致熒光供體和熒光受體在空間上彼此隔開以產(chǎn)生可測量的熒光發(fā)射。

或者，當(dāng)生物分析物結(jié)合域與生物分析物相互作用時，生物分析物結(jié)合域經(jīng)歷組成變化。生物分析物可以是蛋白酶，生物分析物結(jié)合域可以是作為酶底物的肽或蛋白質(zhì)。

任選地，為了有助于選擇性結(jié)合來自復(fù)雜流體或類似物的靶生物分析物，所述復(fù)雜流體或類似物含有在結(jié)構(gòu)上或功能上與靶生物分析物相關(guān)的其他組分且可競爭性結(jié)合至檢測劑的感應(yīng)域，生物傳感器可進(jìn)一步包括生物分析物特異性捕獲劑。

生物分析物特異性捕獲劑可以包括能夠選擇性結(jié)合靶生物分析物的結(jié)合劑。生物分析物特異性捕獲劑可以沉積在多孔硅或氧化鋁襯底的表面上或附近，使由捕獲劑捕獲的任何生物分析物中的至少一些能夠與檢測劑的感應(yīng)域相互作用。

生物分析物特異性捕獲劑的形式可以是在其表面上包括結(jié)合劑的粒子。例如，粒子可以是具有結(jié)合到其表面的結(jié)合劑的功能化納米粒子(np)。功能化的np可以與襯底表面相互作用并保留在襯底表面上。例如，功能化的np可以是功能化的磁性納米粒子(mnp)。

結(jié)合劑可以是選擇性結(jié)合靶生物分析物的任何試劑。結(jié)合劑可以選擇性地從包括與靶生物分析物結(jié)構(gòu)相關(guān)的其他組分的復(fù)雜流體中結(jié)合靶生物分析物。例如，結(jié)合劑可以是抗體。這些實施例的生物傳感器可以用于選擇性檢測位于結(jié)構(gòu)相關(guān)的肽或蛋白質(zhì)家族中的特定肽或蛋白質(zhì)。

在實施例中，生物分析物是基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp)(稍后詳細(xì)描述)，檢測劑的生物分析物結(jié)合域是mmp的底物。在這些實施例中，生物分析物結(jié)合域可以包括mmp底物gaba-pro-gln-gly-leu-glu-ala-lys-nh2，在這種情況下，檢測劑可以是dabcyl-gaba-pro-gln-gly-leu-glu(edans)-ala-lys-nh2。在這些實施例中，dabcyl和edans之間的距離是大約5-6nm，在該距離可以發(fā)生fret。因此，當(dāng)edans在335nm激發(fā)時，edans的激發(fā)發(fā)射能量轉(zhuǎn)移至dabcyl，然后是熱量。當(dāng)mmp裂解底物肽時，edans和dabcyl的距離和相對取向改變，導(dǎo)致它們之間fret效率不同，以及來自edans的熒光發(fā)射的增加。因此，可以通過測量來自edans的發(fā)射的變化來感應(yīng)mmp，從而可以定量測量mmp濃度，因為來自edans的光發(fā)射的變化增加與mmp濃度成比例。

可以使用本文所描述的光學(xué)生物傳感器檢測一系列生物分析物。生物分析物是在待檢測、待分析和/或待定量的樣本中的目標(biāo)生物分子。生物分析物的實例包括但不限于氨基酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖、碳水化合物、寡糖、多糖、脂肪酸、脂類、激素、代謝物、細(xì)胞因子、趨化因子、受體、神經(jīng)遞質(zhì)、抗原、變應(yīng)原、抗體、底物、代謝物、輔因子、抑制劑、藥品(drugs)、藥物(pharmaceuticals)、營養(yǎng)物、朊病毒、毒素、毒物、爆炸物、殺蟲劑、生物危險物質(zhì)、致癌物質(zhì)、誘變劑、麻醉劑、苯丙胺、巴比妥酸鹽和致幻劑。

主體的生物分析物水平的精確監(jiān)測對主體的健康是至關(guān)重要的。例如，監(jiān)測糖尿病主體中的葡萄糖水平。

在實施例中，生物分析物是與傷口相關(guān)的肽或蛋白質(zhì)。由于在這些傷口中發(fā)生的生物化學(xué)過程的復(fù)雜性，慢性傷口的管理特別具有挑戰(zhàn)性。考慮到傷口愈合和傷口滲出物基質(zhì)的復(fù)雜性，過多的分子已經(jīng)被鑒定為傷口生物標(biāo)記物，如harding等人所列舉的^[1]。

慢性傷口中臨床有效的生物標(biāo)記物是基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp)組^[1,2,10,^11]。mmp是在傷口愈合期間，參與細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)降解和組織重建過程的蛋白水解酶^[11-13]。存在超過20種mmp，其含有至少～20個氨基酸殘基的長信號肽^[12]。一般而言，基于它們的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，mmp可以分為五組。這些是膠原酶(例如mmp-1和mmp-8)；明膠酶(包括明膠酶a或mmp-2)；溶基質(zhì)素(例如溶基質(zhì)素-1或mmp-3)；膜型mmp(例如mt1-mmp或mmp-14)和含有基質(zhì)溶解因子(mmp-7)、釉質(zhì)溶解素(mmp-20)和巨噬細(xì)胞金屬彈性蛋白酶(mmp-12)的異質(zhì)亞組^[12,14,15]。例如，傷口樣本中mmp-9的存在可以指示不良的愈合傷口，而mmp-8的存在可以指示良好的愈合，因為mmp-8的存在是傷口閉合所必需的。

mmp的活性可以通過金屬蛋白酶(timp)組織抑制劑^[12,14-17]或合成抑制劑^[12,16]來抑制。抑制涉及在timp和在mmp活性部位的鋅離子之間形成螯合物^[11,16]。這提供了通過施用合成mmp抑制劑以維持mmp水平和促進(jìn)傷口愈合的治療性干預(yù)的可能性^[11,18]。然而，需要知道m(xù)mp的濃度以正確地給藥抑制劑，因為過度抑制也是有害的^[11]。因此，慢性傷口管理將受益于能夠在傷口滲出液中快速建立mmp水平的poc生物傳感器。

因此，還提供了用于監(jiān)測和/或評估主體中的傷口狀態(tài)的方法，所述方法包括：

-提供光學(xué)生物傳感器，用于檢測來自所述主體的傷口滲出液的基質(zhì)金屬蛋白酶，生物傳感器包括：多孔硅或氧化鋁襯底，其包括表面和固定在表面上的檢測劑，檢測劑包括感應(yīng)域和信號域，感應(yīng)域包括用作為基質(zhì)金屬蛋白酶的底物的接頭，信號域包括發(fā)光供體和發(fā)光受體，其中發(fā)光供體和發(fā)光受體通過接頭連接并且光耦合，使來自發(fā)光供體的光發(fā)射基本上被發(fā)光受體淬滅，且基質(zhì)金屬蛋白酶與接頭的相互作用導(dǎo)致接頭的裂解及發(fā)光供體和發(fā)光受體的光學(xué)解耦合，從而導(dǎo)致來自所述發(fā)光供體的光發(fā)射；和在襯底的表面上的多個光相互作用孔，其中孔配置為與來自發(fā)光供體的光發(fā)射相互作用，以提供指示基質(zhì)金屬蛋白酶的存在的可測量的光發(fā)射；

-將光學(xué)生物傳感器的表面與傷口滲出液的樣本接觸，使基質(zhì)金屬蛋白酶(如果存在)與接頭相互作用；

-檢測來自光學(xué)生物傳感器的光發(fā)射的變化；以及

-使用所檢測到的光發(fā)射的變化來提供傷口狀態(tài)的指示。

在具體實施例中，襯底是多孔硅共振微腔(psirm)襯底，并且提供了用于監(jiān)測和/或評估主體中的傷口狀態(tài)的方法，所述方法包括：

-提供一光學(xué)生物傳感器，用于檢測來自所述主體的傷口滲出液的基質(zhì)金屬蛋白酶，生物傳感器包括：多孔硅共振微腔(psirm)襯底，其包括一表面，所述表面包括多個光相互作用孔，每個孔包括由微腔隔開的分布式布拉格反射鏡；和固定在表面上的檢測劑，檢測劑包括感應(yīng)域和信號域，感應(yīng)域包括用作為基質(zhì)金屬蛋白酶底物的接頭，信號域包括熒光供體和熒光受體，其中熒光供體和熒光受體通過接頭連接且光耦合，使來自熒光供體的光發(fā)射基本上被熒光受體淬滅，基質(zhì)金屬蛋白酶與接頭的相互作用導(dǎo)致接頭的裂解及熒光供體和熒光受體的光學(xué)解耦合，從而從熒光供體產(chǎn)生指示基質(zhì)金屬蛋白酶的存在的可測量的發(fā)射，其中所述發(fā)射通過與襯底的光相互作用孔的相互作用而增強(qiáng)；

-將光學(xué)生物傳感器的表面與傷口滲出液的樣本接觸，使基質(zhì)金屬蛋白酶(如果存在)與接頭相互作用；

-檢測來自熒光供體的光發(fā)射；以及

-使用所檢測到的光發(fā)射來提供傷口狀態(tài)的指示。

mmp分析已經(jīng)存在，但是它們還沒有被開發(fā)和被證明用于慢性傷口^[19-21]。例如，beekman等人^[19]合成了可溶性和選擇性熒光肽底物tno211(dabcyl-gaba-pro-gln-gly-leu-glu(edans)-ala-lys-nh2)，其含有mmp可裂解肽序列(gly-leu)和一對edans(5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸)和dabcyl(4-(4-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲?；?分別作為熒光團(tuán)和淬滅劑。使用這種底物，他們能夠檢測復(fù)雜樣本中的mmp，例如培養(yǎng)基和滑液^[19]。這種特異性的肽底物現(xiàn)在可以從市場上購買(由merck生產(chǎn)，稱為mmp底物iii，熒光)。

生物傳感器對特定mmp的選擇性可以使用生物分析物特異性捕獲劑來實現(xiàn)。生物分析物特異性捕獲劑可以包括能夠選擇性結(jié)合特定mmp蛋白的結(jié)合劑，例如選自由mmp-1、mmp-2、mmp-3和mmp-9組成的組的一種。結(jié)合劑能夠在存在其它mmp時，選擇性結(jié)合所選擇的一種mmp。結(jié)合劑可以是抗體。

結(jié)合劑可以是具有結(jié)合到其表面的抗體的功能化納米粒子(np)，例如功能化磁性納米粒子(mnp)。采用mmp抗體(mmpab)功能化np以從緩沖液或從傷口滲出液樣本中收集靶mmp。根據(jù)靶mmp，可以采用任何類型的mmpab修飾np。例如，為了靶向mmp-1，采用mmp-1ab固定mnp。

功能化np的尺寸可以促進(jìn)納米粒子容易滲入整個多孔硅或氧化鋁襯底的多孔層。

在癌癥進(jìn)展的多個階段(包括獲取侵襲性和轉(zhuǎn)移性質(zhì))中，也強(qiáng)烈地牽涉mmp^[71]。因此，提供了用于監(jiān)測和/或評估主體中癌癥狀態(tài)的方法，所述方法包括：

-提供一光學(xué)生物傳感器，用于檢測來自所述主體的癌癥組織或血液的基質(zhì)金屬蛋白酶，生物傳感器包括：多孔硅或氧化鋁襯底，其包括表面和固定在表面上的檢測劑，檢測劑包括感應(yīng)域和信號域，感應(yīng)域包括用作為基質(zhì)金屬蛋白酶的底物的接頭，信號域包括發(fā)光供體和發(fā)光受體，其中發(fā)光供體和發(fā)光受體通過接頭連接且光耦合，使來自發(fā)光供體的光發(fā)射基本上被發(fā)光受體淬滅，基質(zhì)金屬蛋白酶與接頭的相互作用導(dǎo)致接頭的裂解及發(fā)光供體和發(fā)光受體的光學(xué)解耦合，從而導(dǎo)致來自發(fā)光供體的光發(fā)射；和在襯底表面上的多個光相互作用孔，其中孔配置為與來自發(fā)光供體的光發(fā)射相互作用，以提供指示基質(zhì)金屬蛋白酶的存在的可測量的光發(fā)射；

-將光學(xué)生物傳感器的表面與癌癥組織或血液的樣本接觸，使基質(zhì)金屬蛋白酶(如果存在)與接頭相互作用；

-檢測來自光學(xué)生物傳感器的光發(fā)射的變化；以及

-使用所檢測到的光發(fā)射的變化來提供癌癥狀態(tài)的指示。

癌癥組織或血液可以采用已知技術(shù)從主體獲得，例如活組織檢查。

在某些其他實施例中，生物分析物是細(xì)菌生物標(biāo)記物。因此，提供了用于監(jiān)測和/或評估主體中的細(xì)菌感染的方法，所述方法包括：

-提供一光學(xué)生物傳感器，用于檢測來自所述主體的體液的細(xì)菌生物標(biāo)記物，生物傳感器包括：多孔硅或氧化鋁襯底，其包括表面和固定在表面上的檢測劑，檢測劑包括感應(yīng)域和信號域，所述感應(yīng)域包括用作為細(xì)菌生物標(biāo)記物的底物的接頭，信號域包括發(fā)光供體和發(fā)光受體，其中發(fā)光供體和發(fā)光受體通過接頭連接且光耦合，使來自發(fā)光供體的光發(fā)射基本上被發(fā)光受體淬滅，細(xì)菌生物標(biāo)記物與接頭的相互作用導(dǎo)致接頭的裂解及發(fā)光供體和發(fā)光受體的光學(xué)解耦合，從而導(dǎo)致來自發(fā)光供體的光發(fā)射；和在襯底表面上的多個光相互作用孔，其中孔配置為與來自發(fā)光供體的光發(fā)射相互作用以提供指示細(xì)菌生物標(biāo)記物的存在的可測量的光發(fā)射；

-將光學(xué)生物傳感器的表面與體液樣本接觸，使細(xì)菌生物標(biāo)記物(如果存在)與接頭相互作用；

-檢測來自光學(xué)生物傳感器的光發(fā)射的變化；以及

-使用檢測到的光發(fā)射的變化來提供細(xì)菌感染的指示。

體液可以是懷疑含有有關(guān)的細(xì)菌生物標(biāo)記物的任何液體或組織，包括但不限于血液、傷口滲出液、汗液、唾液、分泌物、身體組織和組織液。體液可以采用已知技術(shù)收集。

在具體實施例中，襯底是多孔硅共振微腔(psirm)襯底，且提供了用于監(jiān)測和/或評估主體中的傷口狀態(tài)的方法，所述方法包括：

-提供一光學(xué)生物傳感器，用于檢測來自所述主體的傷口滲出液的細(xì)菌生物標(biāo)記物，生物傳感器包括：多孔硅共振微腔(psirm)襯底，其包括一表面，所述表面包括多個光相互作用孔，每個孔包括由微腔隔開的分布式布拉格反射鏡；和固定在表面上的檢測劑，檢測劑包括感應(yīng)域和信號域，感應(yīng)域包括用作為細(xì)菌生物標(biāo)記物的底物的接頭，信號域包括熒光供體和熒光受體，其中熒光供體和熒光受體通過接頭連接且光耦合，使來自熒光供體的光發(fā)射基本上被熒光受體淬滅，細(xì)菌生物標(biāo)記物與接頭的相互作用導(dǎo)致接頭的裂解及熒光供體和熒光受體的光學(xué)解耦合，從而產(chǎn)生來自熒光供體的指示細(xì)菌生物標(biāo)記物的存在的可測量的發(fā)射，其中所述發(fā)射通過與襯底的光相互作用孔相互作用而增強(qiáng)；

-將光學(xué)生物傳感器的表面與傷口滲出液的樣本接觸，使細(xì)菌生物標(biāo)記物(如果存在)與接頭相互作用；

-檢測來自熒光供體的光發(fā)射；以及

-使用所檢測到的光發(fā)射來提供傷口狀態(tài)的指示。

細(xì)菌生物標(biāo)記物可以是指示由細(xì)菌種類引起的感染的肽、蛋白質(zhì)或其它分子，這些細(xì)菌種類是，例如炭疽桿菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、肉毒桿菌、艱難梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)梭菌、伯氏疏螺旋體、蒼白密螺旋體、沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、白喉棒狀桿菌、結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、普氏立克次氏體、立克氏立克次氏體、斑疹傷寒立克次氏體、嗜吞噬細(xì)胞無形體、查菲埃立克體、羊布氏桿菌、百日咳博特氏桿菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌、類鼻疽伯克氏菌、淋病奈瑟氏菌、腦膜炎奈瑟氏菌、空腸彎曲桿菌、幽門螺桿菌、嗜肺性軍團(tuán)桿菌、鮑氏不動桿菌、卡他莫拉菌、銅綠假單胞菌、氣單胞菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、硫發(fā)菌、流感嗜血桿菌、肺炎桿菌、奇異變形桿菌、鼠疫耶爾森氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、弗氏志賀氏菌、腸道沙門氏菌或大腸桿菌。

可以使用合適的生物分析物結(jié)合肽或蛋白質(zhì)和fret對制備能夠選擇性地檢測任何一種上述細(xì)菌的檢測試劑，如前文所描述。例如，為了檢測大腸桿菌，生物分析物結(jié)合肽或蛋白質(zhì)可以是mbp(麥芽糖結(jié)合蛋白)、albp(阿洛糖結(jié)合蛋白)、arbp(阿拉伯糖結(jié)合蛋白)或ggbp(半乳糖/葡萄糖結(jié)合蛋白)。例如，蛋白酶k由銅綠假單胞菌分泌并且可以消化聚賴氨酸。因此，包括聚賴氨酸基序的生物分析物結(jié)合肽或蛋白質(zhì)可以用于檢測銅綠假單胞菌。透明質(zhì)酸酶由金黃色葡萄球菌分泌且可消化透明質(zhì)酸。因此，包括透明質(zhì)酸基序的生物分析物結(jié)合肽或蛋白質(zhì)可以用于檢測金黃色葡萄球菌。然而，任何生物分析物結(jié)合肽或蛋白質(zhì)可以用于所述方法和生物傳感器中，只要其可以由于生物分析物與其結(jié)合而經(jīng)歷構(gòu)象或組成變化。

如本文所使用的，術(shù)語“樣本”指的是被懷疑含有有關(guān)的生物分析物且有待分析的組合物。樣本可以包括或源自生物源，例如體液，包括，例如傷口滲出液或滲出物、血液、唾液、乳汁、粘液、尿液等。除了體液之外，可以測試的其它樣本包括水樣和可以監(jiān)測毒素和/或污染病原微生物的食品和飲料產(chǎn)品。樣本可以從細(xì)胞、水、土壤、空氣、食物、廢物，和動物和植物器官和組織中的一種或多種中收集。

可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法獲得樣本。

樣本中靶生物分析物的檢測通過使用熒光分析系統(tǒng)測量來自熒光供體和熒光受體的發(fā)射來進(jìn)行。合適的熒光分析系統(tǒng)包括濾光型和單色型熒光分光光度計。如果樣本含有靶生物分析物，則感應(yīng)來自熒光供體和熒光受體的發(fā)射的變化，從而可以檢測靶生物分析物。此外，如果發(fā)生靶生物分析物濃度的變化，則發(fā)生來自熒光供體和熒光受體的發(fā)射的變化。因此，生物傳感器也可以用于測量生物分析物濃度的變化。

來自熒光供體和熒光受體的發(fā)射也可以使用共聚焦顯微鏡測量。例如，檢測劑可以通過微接觸印刷在襯底表面上空間排列，且使用共聚焦顯微鏡觀察發(fā)射。該方法可以用于形成多分析物生物傳感器。

在實施例中，光學(xué)生物傳感器是檢測裝置的一部分。檢測裝置可以是定點護(hù)理(poc)裝置。檢測裝置包括可以引入樣本的流體入口，用作本文所描述的光學(xué)生物傳感器的外殼，以及用于輸出關(guān)于熒光供體的發(fā)射強(qiáng)度的信息的光學(xué)輸出。

檢測裝置還可以包括用于直接收集來自主體的測試樣本并將其轉(zhuǎn)移到檢測裝置的構(gòu)件。具體地，檢測裝置可以利用顯微操作針或一個或多個顯微操作針陣列，其設(shè)計為通過毛細(xì)作用和/或表面張力將體液(例如傷口滲出物)從主體轉(zhuǎn)移至裝置。

在實施例中，光學(xué)生物傳感器可以是傷口敷料或繃帶的一部分。在這些實施例中，光學(xué)生物傳感器可以固定或附著到傷口敷料或繃帶材料上，且可以向醫(yī)師提供關(guān)于傷口狀態(tài)的信息。

本文所描述的生物測定被設(shè)計為檢測樣本中有關(guān)的一種或多種生物分析物，其存在與特定疾病或疾病傾向相關(guān)。有關(guān)的生物分析物的存在可以作為對主體或醫(yī)療保健專業(yè)人員的警示(疾病存在或?qū)砜赡軔夯?。

檢測裝置可以用于檢測多個靶生物分析物。因此，外殼可以包括多個空間排列的光學(xué)生物傳感器，每個生物傳感器能夠相對于鄰近的生物傳感器選擇性地檢測不同的生物分析物。例如，每個生物傳感器能夠檢測指示特定細(xì)菌種類的生物分析物，檢測裝置因此可以用于在單個步驟中檢測多種細(xì)菌感染。

除了在人主體中的診斷外，本發(fā)明的方法和組合物也可以具有用于診斷動物疾病的獸醫(yī)用途?？梢栽O(shè)計適當(dāng)?shù)纳镌囼炓赃x擇性地檢測預(yù)期的靶生物分析物。

本文所描述的光學(xué)生物傳感器可以是治療診斷裝置的一部分。如本文所使用的，術(shù)語“治療診斷”指的是遞送系統(tǒng)，其可以用于治療、預(yù)防、監(jiān)測或診斷疾病或病理狀況中的至少一種。因此，本文提供了用于診斷和/或治療主體的疾病或病理狀況的治療診斷裝置，所述裝置包括：

-提供一光學(xué)生物傳感器，用于檢測和/或確定生物分析物的濃度，生物分析物是從所述主體獲得的體液樣本的所述疾病或病理狀況的生物標(biāo)記物，所述光學(xué)生物傳感器包括：多孔硅或氧化鋁襯底，其包括表面和固定在表面上的檢測劑，檢測劑包括感應(yīng)域和信號域，所述感應(yīng)域包括能夠與靶生物分析物相互作用的接頭，信號域包括發(fā)光供體和發(fā)光受體，其中所述發(fā)光供體和發(fā)光受體通過接頭連接且光耦合，使來自發(fā)光供體的光發(fā)射基本上被發(fā)光受體淬滅，靶生物分析物與接頭的相互作用導(dǎo)致發(fā)光供體和發(fā)光受體的光學(xué)解耦合，從而導(dǎo)致來自發(fā)光供體的光發(fā)射；和在襯底的表面上的多個光相互作用孔，其中孔配置為與來自發(fā)光供體的光發(fā)射相互作用以提供指示靶生物分析物的存在的可測量的光發(fā)射；

-檢測器，用于檢測來自發(fā)光供體的光發(fā)射的變化，并提供含有關(guān)于所述光發(fā)射變化的信息的輸出信號；

-遞送系統(tǒng)，用于將治療劑遞送至主體；以及

-控制器，用于處理來自檢測器的輸出信號，并且基于從輸出信號獲得的信息根據(jù)需要激活遞送系統(tǒng)。

如本文所使用的，術(shù)語“病理狀況”是指異常的解剖或生理狀況和疾病的客觀或主觀臨床表現(xiàn)，不列為疾病或綜合征。

可以使用大量遞送系統(tǒng)。例如，遞送系統(tǒng)可以包括微?；蚣{米粒子，其裝載有治療劑且被控制器激活而釋放治療劑以治療疾病或病理狀況。微?；蚣{米粒子可以是多級粒子、多孔粒子、多孔硅粒子、多孔二氧化硅粒子、無孔粒子、制造粒子、聚合粒子、合成粒子、半導(dǎo)體粒子、病毒、金粒子、銀粒子、量子點、磷酸銦粒子、氧化鐵粒子、膠束、脂質(zhì)粒子、脂質(zhì)體、二氧化硅粒子、介孔二氧化硅粒子、plga基粒子、明膠基粒子、碳納米管或富勒烯。遞送系統(tǒng)還可以是用于遞送液體治療劑至主體的泵。

可以使用各種治療劑。治療劑可以是能夠在動物(例如哺乳動物或人)的靶位點中產(chǎn)生所需生物效應(yīng)的生理學(xué)或藥學(xué)活性物質(zhì)。治療劑可以是任何無機(jī)或有機(jī)化合物。實例包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、核酸(包括sirna、mirna和dna)、聚合物和小分子。

治療劑的非限制性實例包括傷口修復(fù)劑、組織修復(fù)劑、熱治療劑、抗細(xì)菌劑、抗炎劑、抗癌劑、抗增殖劑、抗血管形成劑及其組合。

治療劑的更具體但非限制性的實例包括抗感染劑；抗生素，例如青霉素、頭孢菌素、大環(huán)內(nèi)酯、四環(huán)素、氨基糖苷和抗結(jié)核劑；抗真菌/抗霉菌劑；抗病毒劑，例如阿昔洛韋、更昔洛韋、利巴韋林、抗hiv劑和抗肝炎劑；抗炎劑，例如nsaid、甾體劑、大麻素；抗變應(yīng)性劑，例如抗組胺(例如非索非那定)；疫苗或免疫原性劑，例如破傷風(fēng)類毒素、減少的白喉類毒素、非細(xì)胞百日咳疫苗、腮腺炎疫苗、天花疫苗、抗hiv疫苗、肝炎疫苗、肺炎疫苗和流感疫苗；麻醉劑，包括局部麻醉劑；退熱劑，例如撲熱息痛、布洛芬、雙氯芬酸、阿司匹林；用于治療嚴(yán)重事件例如心血管發(fā)作、癲癇、低血糖的試劑；免疫調(diào)節(jié)劑和免疫刺激劑；心血管藥物，例如β-阻斷劑、α-阻斷劑和鈣通道阻斷劑；肽和甾類激素，如胰島素、胰島素衍生物、地特胰島素、胰島素單體、催產(chǎn)素、lhrh、lhrh類似物、促腎上腺皮質(zhì)激素、生長激素、亮丙瑞林、降血鈣素、甲狀旁腺激素、雌激素、睪酮、腎上腺皮質(zhì)類固醇、甲地孕酮、黃體酮、性激素、生長激素和生長因子；肽和蛋白質(zhì)相關(guān)藥物，例如氨基酸、肽、多肽和蛋白質(zhì)；維生素，例如維生素a，來自維生素b組的維生素、葉酸、維生素c、維生素d、維生素e、維生素k、煙酸和維生素a-e的衍生物；麻醉劑和拮抗劑，例如阿片劑和羥考酮；止痛藥，例如阿片劑、內(nèi)啡肽、曲馬多、可待因、nsaid和加巴噴丁。

實施例

我們開發(fā)了基于使用熒光mmp肽底物dabcyl-gaba-pro-gln-gly-leu-glu(edans)-ala-lys-nh2功能化的psirm的光子結(jié)構(gòu)的光學(xué)生物傳感器。在存在mmp下，攜帶淬滅劑的肽片段從表面裂解，這允許edans熒光發(fā)射被激活。特別地，我們靶向作為膠原酶之一的mmp-1，因為這種酶是負(fù)責(zé)裂解間隙纖維狀膠原^[44]的關(guān)鍵酶之一，其在傷口愈合期間是至關(guān)重要的^[45]。我們證實，psirm結(jié)構(gòu)提供的發(fā)射與其他psi結(jié)構(gòu)比較增強(qiáng)了，并使mmp-1的檢測低至緩沖液中的渺摩爾(attomolar)水平。該psi光學(xué)生物傳感器也成功地應(yīng)用于檢測人傷口滲出液中的mmp。

材料

除非另有說明，所有化學(xué)品和試劑均購買于sigma-aldrich。高純度溶劑(甲醇、乙醇、丙酮和二氯甲烷)購買于chemsupply。所有psi樣本由高度摻雜的(100)取向的磷摻雜的n型si晶片(0.008-0.02ωcm，siltronix)制備。使用金剛石刀具將si晶片切成3-4cm²的片狀。

實施例1-多孔硅共振微腔襯底的制造和表征

在基于teflon的電化學(xué)蝕刻電解槽中制備psi襯底，使用鋁帶作為硅片(作為陽極)和鉑網(wǎng)(作為陰極)的聯(lián)系。電化學(xué)蝕刻溶液含有25:200:1體積比的氫氟酸水溶液(48％，scharlau)/水/表面活性劑(ncw1001，wakopurechemicalindustries)^[36]。為了從襯底去除寄生層，通過在40ma/cm²的電流密度下對si晶片進(jìn)行陽極蝕刻30s，接著在250ma/cm²的電流密度下對si晶片進(jìn)行陽極蝕刻6s(這導(dǎo)致電解拋光)，對si晶片進(jìn)行預(yù)處理。在該步驟之后，將表面暴露于milliq水中1min以去除犧牲層，然后用甲醇、丙酮、二氯甲烷沖洗，并在氮氣流下干燥。

接著將預(yù)處理的si晶片在表1中規(guī)定的電流密度下蝕刻2min，以制造用于制造多孔硅共振微腔(“psirm”)襯底的單層psi襯底。用甲醇、丙酮、二氯甲烷沖洗單層psi襯底，并在氮氣流下干燥。

表1.在五種不同電流密度下蝕刻的單層psi的電流密度分布圖

使用irs表征新蝕刻的單層psi襯底，其中分叉光纖沿著表面法線遞送鎢光并將反射光收集到ccd光譜儀。采用irs收集在不同電流密度下蝕刻的單層psi襯底的反射光譜^[46]。通過基于轉(zhuǎn)移矩陣方法的模擬程序(scout，從m.theisshard-andsoftware獲得)，使用實驗和理論反射光譜之間的最佳擬合來確定單層psi襯底的孔隙率和厚度值^[65]。然后通過所獲得的單層psi襯底的孔隙率和厚度值基于scout程序，設(shè)計在光學(xué)生物傳感器中使用的psirm襯底。選擇孔隙率和厚度的對比度以獲得psirm襯底的適當(dāng)?shù)恼凵渎史植?，其中共振腔的位置在所希望的波長處。所需要的電流密度和蝕刻時間也通過該方法獲得。通過采用在2288ms，50ma/cm²和1820ms，25ma/cm²之間交替變化的電流密度(分別對應(yīng)于hp層和lp層)，陽極蝕刻si晶片來制造psirm襯底。在9152ms，50ma/cm²的電流密度下蝕刻缺陷層。所得的psirm具有(hp/lp)3(hp)4(lp/hp)3構(gòu)型。也采用irs表征psirm襯底，以確保反射光譜與模擬的反射光譜匹配。采用sem分析單層psi和psirm襯底。使用適配有固態(tài)檢測器(ssd)和30kv的加速電壓的量子450場發(fā)射槍(feg)環(huán)境sem。

實施例2-psirm襯底的肽功能化

氫化物封端的psirm表面的表面功能化反應(yīng)的示意圖顯示于圖1中。

來自實施例1的新蝕刻的psirm襯底通過在玻璃反應(yīng)燒瓶中的純十一碳烯酸的熱氫化硅烷化而功能化。在進(jìn)行反應(yīng)之前，采用氬氣吹掃十一碳烯酸15分鐘，以除去任何氧氣。然后將psirm襯底浸入十一碳烯酸中并吹掃額外30分鐘。然后，將反應(yīng)燒瓶浸入120℃的油浴中，并在氬氣流下進(jìn)行反應(yīng)3小時。然后，從燒瓶中取出氫化硅烷化的psirm襯底，用乙醇沖洗并在氮氣流下輕輕干燥。通過將psirm襯底與n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)(5mm)在水中，在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(edc，fluka)(5mm)存在下，在室溫下反應(yīng)20min，活化具有羧酸封端表面的氫化硅烷化的psirm襯底以形成nhs酯封端表面。然后用水沖洗襯底，并在氮氣流下輕輕干燥。熒光mmp肽底物dabcyl-gaba-pro-gln-gly-leu-glu(edans)-ala-lys-nh2(merck)的固定通過將功能化的psirm表面與肽(10mm)在緩沖溶液中過夜孵育而進(jìn)行，緩沖溶液由base(50mm，ph7.6)、氯化鈉(nacl，chemsupply)(150mm)、脫水氯化鈣(cacl2.2h2o，ajaxchemicalltd.)(5mm)、氯化鋅(zncl2，merck)(1μm)和0.01％l23制備^[11,19]。然后，用水、2:1水/乙醇、1:2水/乙醇和乙醇沖洗表面。最后，在氮氣流下輕輕干燥psirm表面。然后將該改性的psirm表面準(zhǔn)備用于生物傳感。

在表面功能化程序的每個步驟后進(jìn)行ftir分析。使用vertex70亥伯龍神顯微鏡(hyperionmicroscope)(bruker)在atr模式獲得ftir光譜。在分辨率為22cm^-1，孔徑大小為3mm且平均為64次掃描下，在空氣中獲取背景光譜，樣品光譜在650-4000cm^-1范圍內(nèi)記錄。采用opus7.2光譜軟件(bruker)校正和歸一化基線。所有用于ftir分析的樣本由電阻率為0.00055-0.001ωcm的p型si晶片在56ma/cm²的電流密度下蝕刻2min制備。

討論

新蝕刻的psirm襯底的特征是氫化物封端的表面。該表面是不穩(wěn)定的，且在氧的存在下易于氧化或在水的存在下易于水解，導(dǎo)致不可控制的光學(xué)性質(zhì)，這對于生物傳感器應(yīng)用是不希望的^[29,31,49]。我們通過十一碳烯酸的氫化硅烷化的手段將psirm表面功能化。這產(chǎn)生具有穩(wěn)定的si-c鍵的致密烷基單層，保護(hù)psirm表面免受氧化水解^[49,50]。然后可以將羧酸轉(zhuǎn)化為琥珀酰亞胺酯，其容易與熒光mmp肽底物的胺基反應(yīng)，如圖1(a)所示。

在每個表面功能化步驟(圖1(b))之后，通過傅立葉變換紅外(ftir)光譜在衰減全反射(atr)模式中表征psirm襯底。使用純十一碳烯酸(光譜(i))對新蝕刻的prism表面進(jìn)行氫化硅烷化，用si-c鍵代替表面上的si-h鍵。這通過在1459cm^-1、2865cm^-1和2935cm^-1處的特征譜帶的出現(xiàn)得以證實，這些特征譜帶分別歸屬于亞甲基的δchtet變形模式和脂肪族c-h鍵的伸縮振動。在1714cm^-1處觀察到羧酸的vc＝o伸縮模式的特征譜帶。在904cm^-1和2100cm^-1處存在非常微弱的譜帶，分別歸屬于新蝕刻psi的si-h2剪切振動模式和si-hx伸縮振動模式，表明在表面上留下少量未反應(yīng)的氫化硅基團(tuán)。此外，歸因于si-o伸縮振動的1033cm^-1處的譜帶表明在psirm襯底的表面上存在二氧化硅。在氫化硅烷化psi中通常觀察到殘留的氫化硅和少量的表面氧化^[49-52]。

在nhs(光譜(ii))的存在下，接枝酸封端的層采用edc的活化導(dǎo)致進(jìn)一步的光譜變化，包括在1735cm^-1、1785cm^-1和1815cm^-1處的三重譜帶，其是nhs酯基形成的特征^[49-51]。在1735cm^-1和1785cm^-1處的譜帶分別歸屬于vas(c＝o)反對稱伸縮振動模式和琥珀酰亞胺基環(huán)的vs(c＝o)對稱伸縮振動，而在1815cm^-1處的譜帶歸屬于兩種不同的化學(xué)種類，vs(c＝o)對稱拉伸振動模式和琥珀酰亞胺酯羰基的v(c＝o)伸縮振動模式^[49,51]。固定化熒光襯底后，出現(xiàn)了歸因于酰胺i和酰胺ii鍵的在1660cm^-1和1554cm^-1(光譜(iii))的譜帶。那些譜帶的存在表明肽通過酰胺鍵共價結(jié)合到psirm表面^[49]。

還采用irs來跟蹤這些表面反應(yīng)，以研究對psirm襯底的光學(xué)性質(zhì)的影響，特別是對微腔凹陷的波長偏移的影響^[25]。在氫化硅烷化反應(yīng)后觀察到5nm的紅移，接著采用琥珀酰亞胺酯活化后觀察到紅移(δλ＝1nm)，然后在固定熒光襯底后觀察到另一紅移(δλ＝1nm)。在采用mmp-1孵育后觀察到小的藍(lán)移(δλ＝0.5nm)。因此，整個表面改性產(chǎn)生了總共6.5nm的紅移。當(dāng)設(shè)計psirm襯底的共振凹陷的波長位置時，需要考慮這些偏移。

在氫化硅烷化之后的5nm紅移可以由多孔層內(nèi)的十一碳烯酸的單層形成導(dǎo)致的有效折射率的增加來解釋。例如，ouyang等人觀察到在考慮一些參數(shù)(例如結(jié)合前后的孔徑和折射率的變化)的不同厚度的薄層分子結(jié)合之后微腔凹陷的偏移。他們報道，通過3nm厚的涂層產(chǎn)生在大孔微腔中的共振腔凹陷的10nm紅移，這意味著在我們的情況下，對于5nm的紅移，單層厚度應(yīng)當(dāng)為1.5nm^[25]。該厚度與bocking等人用x射線反射計(0.9-1.1nm)對十一碳烯酸單層所觀察到的合理地一致^[53]。

實施例3-用作為光學(xué)生物傳感器

在使用于生物傳感器實驗之前，采用先前公開的程序活化重組人mmp-1(r&d系統(tǒng))^[11,12]。將在二甲基亞砜(sigma-aldrich)中新制備的4-氨基苯基汞酸(apma，aldrich)(100mm)加入到重組人mmp-1中，得到的apma的最終濃度為1mm，接著在37℃下孵育3小時。將肽功能化的psirm襯底在不同濃度的活化mmp-1中，在37℃下培養(yǎng)幾分鐘，然后用水、2:1水/乙醇、1:2水/乙醇和乙醇沖洗以除去未結(jié)合的分析物。然后，在氮氣流下輕輕地干燥襯底。將干燥的psirm表面放置在具有特殊支架的比色皿中以支撐psirm襯底。然后將比色皿放置在熒光計中，其中psirm表面的位置以36°角面向光源。最后，采用熒光計(parkinelmerls55luminescencespectrometer)測量熒光團(tuán)(edans)的熒光強(qiáng)度。在340nm的固定激發(fā)波長，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度每個為5nm及200nm/min的掃描速度下，測量在360-540nm的波長范圍內(nèi)的發(fā)射。由熒光計的光源和psirm襯底的缺陷層形成的角度，相對于表面法線被設(shè)置為36°，因為我們在該角度獲得了最高的熒光信號。從婦女和兒童醫(yī)院(阿德萊德，南澳大利亞)收集人傷口滲出液樣本。該研究方案，符合1975年赫爾辛基宣言的倫理準(zhǔn)則，由healthservicehumanresearchethicscommittee(衛(wèi)生服務(wù)人類研究倫理委員會)和centralnorthernadelaidehealthserviceethicsofhumanresearchcommittee(中央北部阿德萊德衛(wèi)生服務(wù)人類研究委員會倫理委員會)批準(zhǔn)。將傷口滲出液在緩沖液中稀釋10倍。將傳感平臺在37℃下在傷口滲出液樣本中孵育，接著以與上文描述的相同方式處理。

結(jié)果和討論

在本研究中研究的光學(xué)生物傳感器是基于由兩個dbr和一個共振腔層組成的光子psirm襯底進(jìn)行。每個dbr具有在具有四分之一波長(λ/4)光學(xué)厚度的不同孔隙率(hp和lp)之間交替變化的周期性層結(jié)構(gòu)，而缺陷層具有光學(xué)厚度為半波長(λ/2)倍數(shù)的hp層。第一個任務(wù)是設(shè)計在hp層和lp層之間具有適當(dāng)孔隙率對比度的psirm襯底。因此，我們制備了在不同的電流密度下蝕刻120s的五個單層psi襯底。在形態(tài)和光學(xué)上對樣本進(jìn)行表征以確定孔徑、孔隙率和厚度(參見表1)。

采用掃描電子顯微鏡(sem)(圖2)的手段測量平均孔徑和厚度。使用干涉反射光譜(irs)和使用轉(zhuǎn)移矩陣方法的模擬來確定孔隙率和厚度值。從模擬獲得的厚度值與sem結(jié)果具有良好的一致性。對于單層psi樣本獲得的條紋圖案是法布里-珀羅干涉的結(jié)果，并遵從以下方程^[24,^46,47]：

mλ＝2nl(1)

其中m是條紋級數(shù)，λ是最大相長干涉的入射光的波長，n是多孔膜的折射率，l是膜厚度，因子2是源自光源和檢測器的90°反向散射構(gòu)型的因子^[46,48]?？梢酝ㄟ^應(yīng)用快速傅立葉變換(fft)從反射光譜確定薄膜的光學(xué)厚度、折射率和薄膜厚度的乘積^[48]。通過調(diào)整孔隙率和厚度參數(shù)，使用轉(zhuǎn)移矩陣方法來獲得在光譜儀的波長范圍上的實驗反射光譜與理論反射光譜之間的最佳擬合。表s1示出了，如預(yù)期的，孔徑、孔隙率和厚度隨著蝕刻電流密度的增加而增加。通過將厚度除以蝕刻時間來計算蝕刻速率。

由于我們靶向mmp，特別是具有42kda分子量和大約14×14×11nm³的晶胞尺寸的mmp-1^[44]，所以需要具有>30nm孔的介孔psirm以允許mmp-1進(jìn)入整個結(jié)構(gòu)。這對于表1中的所有五種蝕刻條件是可以實現(xiàn)的。對于每個電流密度分布，一旦確定了孔隙率、蝕刻速率和孔徑，可以使用轉(zhuǎn)移矩陣方法設(shè)計和模擬psirm襯底^[46]。將在本研究中使用的介孔psirm襯底設(shè)計為具有對稱鏡像和(hp/lp)3(hp)4(lp/hp)3構(gòu)型。每個dbr的特征是三個周期性雙層，hp的孔隙率為83.4％，lp的孔隙率為67.0％，從第一dbr的hp和第二dbr的lp開始。這些孔隙率值分別產(chǎn)生對于lp層為40-60nm和對于hp層為110-140nm范圍內(nèi)的孔徑。這些孔徑大到足以允許所希望的靶分子進(jìn)入，同時保持生物傳感器的靈敏度?？讖绞侵匾膮?shù)，因為它影響psirm襯底的內(nèi)表面積，其中，其附著生物識別分子并捕獲靶生物分析物^[25,36]。通過減小孔徑，靶生物分析物的可用結(jié)合位點的內(nèi)表面面積和密度增加，這轉(zhuǎn)化為更高的靈敏度^[40]。另一方面，太小的孔徑阻止大生物分子滲透進(jìn)入到整個多孔層中^[25,36]。因此，所選擇的參數(shù)表示這兩個要求之間的折衷。

我們觀察到，psirm襯底的表面改性影響微腔凹陷的位置，需要調(diào)整蝕刻條件以彌補(bǔ)這些效應(yīng)并實現(xiàn)共振腔凹陷和所選熒光團(tuán)的最大熒光發(fā)射峰之間的良好對準(zhǔn)(在這種情況下使用在446.5nm的edans)。它們之間的良好對準(zhǔn)導(dǎo)致在psirm襯底中的熒光團(tuán)的熒光發(fā)射的增強(qiáng)效應(yīng)，其對于本文中研究的mmp的靈敏檢測是重要的。表面改性步驟將共振腔凹陷向更長波長偏移了6.5nm(紅移)。為了彌補(bǔ)由于表面改性引起的偏移和在表面改性之后在446.5nm處產(chǎn)生共振腔凹陷，在該研究中，psirm襯底被設(shè)計為具有共振腔凹陷的中心波長(λ)，其在光入射角為36°測量時是440nm或在0°測量時是478nm(從角度0°至36°有38nm藍(lán)移)。然而，通過irs獲得的實驗結(jié)果還表明，設(shè)計在440nm的psirm襯底在448nm(以36°的角度)處產(chǎn)生共振腔凹陷，相當(dāng)于在設(shè)計和irs實驗之間有8nm紅移的不同(圖3(a))。因此，為了補(bǔ)償這種偏移且實際上在蝕刻后在440nm處或者在表面改性后在446.5nm處產(chǎn)生共振腔凹陷，如與edans發(fā)射最大重疊所要求的，在432nm處重新設(shè)計psirm襯底。在該設(shè)計中，對于hp和lp層，折射率(n)分別為1.3和1.8，采用布魯格曼有效中值近似計算?？紤]到每個dbr的λ/4和缺陷層的λ/2，采用n和λ的值來確定每個周期層的厚度。在psirm襯底的制造期間，hp層形成83nm厚的層，而lp層形成60nm厚度。應(yīng)當(dāng)注意的是，從模擬獲得的厚度值與從所生產(chǎn)的psirm襯底的sem橫截面獲得的值具有良好的一致性。

還采用sem(圖3(b-c))表征表面，以獲得psirm襯底的俯視圖和橫截面圖像。圖3(b)示出了孔徑范圍為110-140nm的介孔psirm襯底的俯視sem圖像，其代表dbr的頂層的孔徑，或者在這種情況下為hp層。圖3(c)中的橫截面sem圖像揭示了形成psirm襯底的周期性層，頂部dbr和底部dbr中的每一個的特征在于具有由hp共振腔層隔開的3個hp/lp周期層。psirm襯底的周期性層的厚度為1.19μm。

然后采用肽功能化的psirm襯底檢測緩沖液中的mmp-1。選擇mmp-1，是因為該mmp在傷口滲出液中是顯著的^[54,55]，且已知其裂解熒光肽序列^[l9]。通過將肽功能化的psirm襯底孵育于mmp-1中進(jìn)行感應(yīng)，接著沖洗并干燥用于測量。在采用mmp-1孵育后，在psirm襯底上通過irs觀察到的小的藍(lán)移(δλ＝0.5nm)給出了肽在mmp存在下確實被裂解的第一指示。然而，如果僅通過irs進(jìn)行感應(yīng)，則這種小的偏移將限制裝置的靈敏度。因此，我們集中于一替代的方法來檢測mmp-1，利用在psirm結(jié)構(gòu)中的熒光增強(qiáng)效應(yīng)。

在不存在mmp-1時，肽功能化的psirm襯底在446.5nm處不顯示任何熒光，表明dabcyl基團(tuán)(moiety)有效地淬滅完整肽中的edans熒光(圖4(a))。然而，當(dāng)采用含有溶液的mmp-1孵育psirm襯底幾分鐘時，觀察到在446.5nm處的發(fā)射，表明mmp-1確實裂解了肽并除去了淬滅劑。該結(jié)果證明，熒光mmp肽底物固定到psirm基質(zhì)中不防止mmp-1的消化。將mmp-1孵育后從psirm襯底產(chǎn)生的熒光光譜與在相同孵育時間和mmp-1濃度下的緩沖溶液中的熒光底物的熒光信號進(jìn)行比較(圖4(a-c))。該比較表明，溶液中的熒光團(tuán)的發(fā)射峰(fwhm～87nm)比附著在psirm表面上的熒光團(tuán)的發(fā)射峰(fwhm～8nm)寬約十倍。這個顯著的差異證明了psirm襯底在限制逸出微腔的波長帶的寬度上的效果。此外，嵌入在psi基質(zhì)中的熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度高于在相同mmp-1濃度的溶液中的熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度。我們將此效應(yīng)歸因于微腔的熒光增強(qiáng)^[37,43,56]。與溶液測量相比，psirm襯底的較大誤差條很可能是由于每個樣本的固定肽的表面濃度的輕微變化。

我們的結(jié)果表明，來自psirm襯底的發(fā)射優(yōu)于溶液中的發(fā)射。我們接下來研究了在采用mmp-1(1.2×10^-7m)孵育后，相同厚度的不同psi架構(gòu)的發(fā)射(圖5)。所有樣本經(jīng)歷了相同的表面改性程序，導(dǎo)致表面顯示熒光肽(通過ir光譜證實)。

圖5(a-b)顯示，與單一psi層(hp和lp)和psi多層相比，嵌入在psirm襯底中的熒光團(tuán)的edans發(fā)射強(qiáng)度分別高大約3倍和2倍。該結(jié)果證實，微腔架構(gòu)確實能夠增強(qiáng)熒光發(fā)射^[43]，并且該平臺可以用作為溶液中mmp-1的存在的靈敏變換器。

我們還研究了將腔調(diào)節(jié)到熒光團(tuán)的發(fā)射波長的效果，并比較了在蝕刻后或表面功能化前的兩個psirm襯底，一個在440nm(設(shè)計在432nm)處具有凹陷，另一個在500nm(設(shè)計在492nm)處具有凹陷(圖6)。如上文所解釋的，在440nm處新蝕刻的psirm襯底的共振在表面改性后偏移至446.5nm處，產(chǎn)生與edans的發(fā)射最大值的完美匹配。表面改性后，另一個psirm襯底在506.7nm處產(chǎn)生共振峰，其中嵌入在psi層中的edans不具有實質(zhì)發(fā)射。

圖6顯示了，采用mmp-1(1.2×10^-7m)孵育后，經(jīng)調(diào)節(jié)的psirm襯底的發(fā)射強(qiáng)度與未調(diào)節(jié)的相比高大約四倍。這表明當(dāng)共振腔凹陷的波長調(diào)節(jié)到熒光團(tuán)的發(fā)射波長時獲得最佳熒光^[43]，且強(qiáng)調(diào)了共振腔層是psirm襯底的靈敏部分。

然后我們將我們的注意力轉(zhuǎn)移到lp和hp層之間的孔隙率對比度，因為這確定了q因子，q因子通常是光學(xué)生物傳感器中的靈敏度的預(yù)測者^[35,36,40]。q因子被定義作為q＝λ/δλ，其中λ是共振腔凹陷的中心波長，δλ是共振腔凹陷的半高全寬(fwhm)^[36,39,40]，并且指示光被限制在共振腔層中的有效性^[39]?？梢酝ㄟ^增加lp層和hp層之間的孔隙率對比度以及每個dbr中的周期數(shù)來增加q因子。

對于所選擇的(hp/lp)3(hp)4(lp/hp)3的構(gòu)型，孔隙率對比度為16.4％，反射光譜(圖1(a)中的黑色跡線)產(chǎn)生的q因子是25(在入射光0°處測量)。不存在q因子的標(biāo)準(zhǔn)值以產(chǎn)生基于psirm襯底的靈敏的生物傳感器^[57]。delouise等人報道了具有20％孔隙率對比度的psirm襯底具有28的q因子，其在dbr中有5個周期層，并且通過使周期層的數(shù)目加倍，該值增加至130^[40]。palestino等人表明，具有15％孔隙率對比度和40-50的q因子的psirm襯底足夠靈敏以檢測共振峰的1-2nm的偏移^[37]。我們的psirm襯底的q因子略低于delouise等人報道的q因子。

為了研究q因子值對生物傳感器性能的影響，我們增加了每個dbr的孔隙率對比度和周期數(shù)。注意，對于具有與((hp/lp)3(hp)4(lp/hp)3相同的構(gòu)型但孔隙率對比度為19.3％(hp為86.3％，lp為67％)的psirm襯底，q因子增加至44(在入射光角度為0°時測量)；對于具有相同孔隙率對比度但在每個dbr((hp/lp)4(hp)4(lp/hp)4)中具有四個周期層的psirm襯底，q因子為45(再次在入射光角為0°時測量)。我們比較了這三個psirm襯底，在相同濃度的mmp-1(1.2×10^-7m)下，觀察到q因子為25的psirm襯底顯示出最高的edans發(fā)射強(qiáng)度，分別產(chǎn)生比q因子為44和45的psirm襯底高4倍和8倍的信號(圖7)。這一發(fā)現(xiàn)表明，通過增加孔隙率對比度或dbr周期數(shù)來提高q因子在生物傳感器中并沒有轉(zhuǎn)化為更高的靈敏度(圖7(b))。我們將這個有趣的現(xiàn)象歸因于兩個效應(yīng)：mmp滲透和整個psirm層的光分布。在較高的孔隙率對比度下，lp和hp之間的孔徑差異也增加，導(dǎo)致在lp層中的mmp的潛在捕獲。這會負(fù)面影響mmp在psirm襯底的缺陷層內(nèi)裂解肽的能力。對于較厚的dbr，在340nm處的激發(fā)光的衰減變成一個問題，因為較少的光到達(dá)缺陷層，減少了限制的熒光發(fā)射。在圖8的模擬中證明了這種效果，其中缺陷層中的較薄腔的電場分布(黑色跡線)高于較厚腔的電場分布(灰色跡線)。

在poc診斷裝置中，非常希望短的響應(yīng)時間和低的檢測限。因此，研究了這兩個參數(shù)。我們首先采用具有經(jīng)調(diào)節(jié)的腔波長的肽功能化的psirm襯底研究了采用1.2×10^-7mmmp-1孵育的時間對熒光信號水平的影響。

圖9顯示了在不同孵育時間的edans熒光強(qiáng)度。孵育5min后，指示mmp-1的存在的顯著熒光發(fā)射已經(jīng)是可檢測的。熒光強(qiáng)度隨著孵育時間增加而增加(由于肽裂解的量增加)，然后在15min孵育時間(當(dāng)顯然所有熒光肽被裂解時)時達(dá)到高臺。因此，5分鐘的孵育時間和單次孵育和洗滌步驟足以產(chǎn)生響應(yīng)于mmp-1溶液的強(qiáng)光學(xué)信號，這對于poc生物傳感器是令人鼓舞的。

采用不同濃度的mmp-1(對數(shù)刻度)孵育后的熒光發(fā)射強(qiáng)度顯示在圖10中。光學(xué)信號隨著mmp-1濃度從10^-7m至10^-12m(5個數(shù)量級)的增加而線性增加，線性回歸方程為y＝10.345x+153.37(r²＝0.99535)。在較低濃度下，熒光強(qiáng)度僅隨著mmp-1濃度的增加而逐漸增加。這種效應(yīng)歸因于少量mmp-1在腔體層內(nèi)的擴(kuò)散產(chǎn)生預(yù)富集效應(yīng)^[43]。我們嘗試檢測的mmp-1的最低濃度為2.4×10^-18m，然而，為了確定檢測限(lod)，我們使用方程式

lod＝y(tǒng)b+3stdb(2)

其中yb是空白(不存在mmp-1的對照溶液)的濃度，stdb是空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差。根據(jù)該方程式，計算出的lod為7.5×10^-19m。

據(jù)我們所知，這代表了迄今為止最靈敏的用于mmp檢測的mmp生物傳感器。gogly等人報道在膠原酶譜上的mmp-1分析的情況下，檢測限低至2.4×10^-15m^[58,59]。采用表面等離子體共振(spr)，jung等人能夠檢測在9.3×10^-10m-3.7×10^-7m范圍內(nèi)的mmp-3^[60]?；趩伪谔技{米管的分析對于mmp-3的檢測限為7.4×10^-12m^[61]?；趍artin等人開發(fā)的psirm結(jié)構(gòu)的mmp生物傳感器，其觀察在感應(yīng)期間腔的偏移，能夠檢測到低至1.5×10^-9mmmp-8^[21]。

肽功能化的psirm生物傳感器檢測在緩沖溶液中的mmp-1(作為mmp的代表)，具有優(yōu)異的靈敏度。在這之后，應(yīng)用相同的感應(yīng)平臺來檢測傷口滲出液中的mmp，所述傷口滲出液含有大量可能潛在地干擾生物傳感器的生物分子^[45,62-64]。本研究中使用的傷口滲出液樣本是在我們前面的研究中使用的等份傷口滲出液樣本。它是來自患有慢性靜脈性腿部潰瘍的6名主體的人慢性傷口滲出液，其在伊利沙白女王醫(yī)院(thequeenelizabethhospital)(南澳大利亞，澳大利亞)的多學(xué)科足部診所看病^[23]。該傷口滲出液的蛋白印跡(圖11)證實了mmp的存在^[23]。

一旦具有經(jīng)調(diào)節(jié)腔凹陷的肽功能化的psirm在傷口滲出液中孵育，我們在15分鐘后觀察到強(qiáng)的發(fā)射信號，證實了傷口滲出液中mmp的存在(圖12(a))。為了確定傷口滲出液中的潛在基質(zhì)效應(yīng)，確定了添加入的不同濃度的mmp-1(1.2×10^-7m、1.2×10^-8m、1.2×10^-9m、1.2×10^-10m、1.2×10^-11m和1.2×10^-12m)的傷口滲出液樣本的熒光強(qiáng)度。從含有mmp-1的傷口滲出液樣本生成的信號產(chǎn)生具有y＝10.188x+185.52(r²＝0.99115)的線性回歸方程的線性響應(yīng)。在緩沖溶液(取自圖10的線性范圍)和傷口滲出液中的兩個校準(zhǔn)曲線(圖12(b))產(chǎn)生類似的斜率，證明不存在基質(zhì)效應(yīng)。使用標(biāo)準(zhǔn)加入法，來自圖8(a)中的傷口滲出液的信號相當(dāng)于1.5×10^-15m。為了研究大量的生物分子(包括傷口滲出液樣本中的蛋白質(zhì))對熒光信號的可能的影響，比較在存在和不存在傷口滲出液時，各種濃度的純?nèi)玖系臒晒獍l(fā)射(圖13)。結(jié)果表明，傷口滲出液樣本中的蛋白質(zhì)和其他生物分子的存在僅略微降低了熒光信號。我們的結(jié)果證實，采用傷口滲出液孵育后的psirm的發(fā)射信號是由于固定的熒光肽底物的mmp-催化裂解和傷口滲出液中其他分子的存在不引起顯著的干擾。

實施例4-傷口生物標(biāo)記物的檢測

在該實施例中，使用實施例3中描述的方法檢測在真實生物樣本中的mmp，包括傷口滲出液樣本和組織提取物樣本。樣本從臨床傷口患者獲得，但是其身份和傷口的類型被隱藏，因此基于所接收的樣本瓶上的標(biāo)簽對樣本進(jìn)行標(biāo)記。

由傷口樣本中的mmp裂解后，edans的熒光強(qiáng)度顯示在圖14中。該圖顯示，本發(fā)明的生物傳感器能夠檢測傷口滲出液樣本中和其它生物樣本中的mmp，在這種情況下，是組織提取物。

實施例5-生物傳感器對mmp的選擇性

固定在psirm襯底上的mmp特異性熒光肽底物沒有被任何一種類型的mmp選擇性裂解。實際上，熒光肽底物可以被具有不同催化活性的mmp-1、mmp-2、mmp-3和mmp-9裂解^[69]。因此，在復(fù)雜生物介質(zhì)(例如傷口滲出液或其它體液)中的感應(yīng)期間，不能鑒定由psirm感應(yīng)平臺檢測到的特定mmp。

我們通過使用磁性納米粒子(mnp)提高了psirm生物傳感器的選擇性。采用mmp抗體(mmpab)將mnp功能化，以從緩沖溶液或從傷口滲出液樣本中收集mmp。根據(jù)靶向的mmp，可以采用任何類型的mmpab修飾mnp。例如，采用mmp-1ab固定mnp，以靶向mmp-1。然后采用熒光肽底物功能化的psirm孵育結(jié)合mmp-1的mnp-mmp-1ab(mnp-mmp-1ab-mmp-1)。熒光測定觀察到的裂解后的熒光信號，可用于證實mmp-1的存在，而沒有來自其它mmp的任何干擾。因此，生物傳感器可用于選擇性檢測位于結(jié)構(gòu)相關(guān)的肽或蛋白質(zhì)家族中的特定肽或蛋白質(zhì)。

用于該實驗的mnp具有10nm的粒徑，具有能夠通過酰胺偶合固定mmp抗體的羧酸封端的基團(tuán)。mnp的粒徑足夠小以促進(jìn)納米粒子容易滲入整個psirm的多孔層。用于將mmpab固定在mnp表面上的表面化學(xué)與用于將mmp熒光肽底物固定在psirm表面上的表面化學(xué)相似。

根據(jù)如下方法制備mnp。洗滌具有末端羧酸基團(tuán)的mnp，接著采用edc/nhs活化以形成nhs酯，然后使其進(jìn)一步與mmp抗體的胺基反應(yīng)。使用傅立葉變換紅外光譜(ftir)證實該反應(yīng)，如圖15所示。ftir結(jié)果顯示，含有羧酸基團(tuán)的mnp在1693cm^-1處顯示一峰，這是c＝o羧基的特征。在采用edc/nhs活化后，來自nhs酯基的c＝o的特征性三重峰出現(xiàn)在1722cm^-1、1763cm^-1和1817cm^-1處。在1664和1579cm^-1的譜帶的存在(相當(dāng)于酰胺i和ii鍵)證實了mmp-1ab的共價固定。

然后將固定有500μg/mlmmp-1ab的mnp(mnp-mmp-1ab)與1.2×10^-12mmmp-1在37℃下相互作用5min。然后采用磁性柱從mmp-1溶液中分離功能化的納米粒子(mnp-mmp-lab-mmp-1)，并稀釋在100μl緩沖溶液中。然后將此含有mnp-mmp-1ab-mmp-1的100μl緩沖溶液在含有mmp熒光mmp肽底物的溶液中孵育15min，然后測量裂解后edans的熒光強(qiáng)度(圖16(a))。感應(yīng)測試也在psirm感應(yīng)平臺(采用熒光mmp肽底物功能化的psirm)中進(jìn)行15min，然后測量熒光強(qiáng)度(圖16(b))。

呈現(xiàn)在圖16中的結(jié)果顯示，在溶液(上部跡線圖16(a))和psirm感應(yīng)平臺(上部跡線圖16(b))中觀察到的熒光標(biāo)明，結(jié)合于mnp-mmp-1ab中的mmp-1仍然是活性的并且能夠裂解肽底物。它證實mmp-1與mmp-1ab的結(jié)合對mmp-1的活性沒有影響。與之前報道的mmp-1檢測(無mnp)的熒光強(qiáng)度相比，熒光強(qiáng)度也更高。該結(jié)果證實，mnp的利用增加捕獲mmp的能力并有效地裂解固定在psirm感應(yīng)平臺上的mmp肽底物。作為對照實驗，也采用psirm感應(yīng)平臺孵育mnp-mmp-1ab，沒有mmp-1。孵育15min后，沒有檢測到熒光信號(圖16(a)和16(b)中的下部跡線)。這表明熒光信號是由于存在mmp-1裂解mmp底物，且mnp或mmp-1ab不影響熒光信號。

然后優(yōu)化固定在mnp上的mmp-1ab的濃度。測試了五種不同的濃度：0、25、50、100和500μg/ml(圖17)。圖17中的圖表顯示，mmp-1ab的濃度影響熒光強(qiáng)度，證實mmp-1ab的濃度越高，捕獲的mmp-1越多，因此裂解的mmp熒光肽底物越多。

在優(yōu)化mmp-1ab的濃度后，我們優(yōu)化了mnp-mmp-1ab(25μg/mlmmp-1ab)與mmp-1(1.2×10^-12m)之間的相互作用時間。采用的mmp-1ab的濃度為25μg/ml，作為在先前實驗中測試的最低濃度，但是這已經(jīng)提供了明顯的信號。測試六個不同的時間：0、5、10、15、30和60min，如圖18所示。從圖中可以看出，在5min內(nèi)，大部分的mmp-1被mmp-1ab捕獲，且當(dāng)時間增加時，并不存在顯著差異。這表明mnp-mmp-1ab的利用是在緩沖溶液中收集mmp的有效和快速的方法。

在優(yōu)化相互作用時間和抗體濃度之后，我們接著測試這個系統(tǒng)在緩沖液(圖19)和傷口滲出液(圖20)中的選擇性。為了做到這一點，我們制備了兩種功能化mnp。一種是采用mmp-1ab功能化的mnp(mnp-mmp-1ab)，另一種是采用mmp-9ab功能化的mnp(mnp-mmp-9ab)。然后將每種mnp功能化抗體與緩沖液中的1.2×10^-12mmp-1、緩沖液中的1.2×10^-12mmp-9、緩沖液中的混合的mmp-1(1.2×10^-12)和mmp-9(1.2×10^-12m)相互作用5min。然后將已經(jīng)結(jié)合mmp的mnp功能化抗體在psirm感應(yīng)平臺中孵育15min，然后測量熒光。

圖19中的第一組的兩個柱狀圖示出了由mnp-mmp-1ab(左柱狀圖(點線))和mnp-mmp9ab(右柱狀圖)捕獲的mmp-1裂解后的edans的熒光強(qiáng)度。這些圖表顯示，采用與mmp-1結(jié)合的mnp-mmp-1ab(大約17.3±1.1)孵育的樣本的熒光強(qiáng)度比采用與mmp-1結(jié)合的mnp-mmp9ab(大約1.0±0.1)孵育的樣本的熒光強(qiáng)度更高。在mnp-mmp9ab中檢測到的少量mmp-1可能是由于在mnp-mmp9ab與mmp-1溶液相互作用之后在洗滌步驟期間，少量mmp-1捕獲于mnp中，從而干擾測量。

在第二組的兩個柱狀圖中，示出了類似的趨勢。與采用mnp-mmp-1ab結(jié)合的mmp-9(左柱狀圖(點線))(2.3±1.1)相比，采用與mnp-mmp9ab結(jié)合的mmp-9(右柱狀圖)裂解的edans的熒光強(qiáng)度更高(25.5±2.8)，證實了mnp-mmp9ab對mmp-9具有更高的親和力。

在第三組的兩個柱狀圖中，當(dāng)mmp-1和mmp-9在緩沖溶液中混合在一起時，與mnp-mmp-lab(左柱狀圖(點線))和mnp-mmp9ab(右柱狀圖)相互作用后的edans的熒光強(qiáng)度分別為14.9±4.0和20.5±1.1。當(dāng)mnp-mmpab與僅含有一種mmp的緩沖溶液接觸時，這個值與edans的熒光強(qiáng)度大致相同。它表明，在mmp的混合物中，mnp-mmpab選擇性地結(jié)合mmp。

選擇性試驗也在傷口滲出液樣本中進(jìn)行(圖20)。將mnp功能化的mmpab(mnp-mmp-1ab和mnp-mmp9ab)加入到傷口滲出液樣本中，每種mmpab在單獨的小瓶中，以收集mmp-1和mmp-9。然后將mnp-mmpab-mmp與功能化的psirm孵育15min，然后通過熒光計觀察熒光強(qiáng)度。

如圖6的第一組的兩個條形圖所示，從采用mnp-mmp9ab(7.7±0.8)孵育的表面發(fā)射的edans的熒光強(qiáng)度高于從采用mnp-mmp-1ab(4.1±0.2)孵育的表面發(fā)射的edans的強(qiáng)度，這表明傷口滲出液樣本含有比mmp-1更多的mmp-9。mnp-mmp-1ab和mnp-mmp9ab也與摻有1.2×10^-12mmmp-1、1.2×10^-12mmmp-9和混合的mmp-1mmp-9(每種濃度為1.2×10^-12m)的傷口滲出液樣本接觸(分別在圖20中的wfmmp-1、wfmmp9和wf混合的mmp)。

從圖20可以看出，在摻有mmp-1的傷口滲出液樣本(wfmmp-1)中，，與采用mnp-mmp9ab孵育的表面(右柱狀圖，6.5±0.6)相比，在采用mnp-mmp-1ab孵育后的功能化psi表面中觀察到的edans的熒光強(qiáng)度(左柱狀圖，22.4±2.1)較高。熒光強(qiáng)度的值由存在于傷口滲出液中的mmp-1和摻入傷口滲出液樣本中的mmp-1促成，如果它們從僅在傷口滲出液樣本中觀察到的熒光信號(在第一的兩個條形圖中的信號)中減少，熒光強(qiáng)度類似于在緩沖溶液中采用mmp-1結(jié)合mnp-mmpab后觀察到的熒光信號(圖19中的第一組的兩個柱狀圖)。

當(dāng)mnp-mmp9ab與摻有mmp-9的傷口滲出液相互作用時，也觀察到類似的趨勢。在采用mnp-mmp9ab孵育的表面上觀察到的熒光強(qiáng)度(28.6±1.0)比采用mnp-mmp-1ab孵育的表面(3.5±0.9)的熒光強(qiáng)度高。如果這個值從未摻有傷口滲出液樣本的熒光強(qiáng)度降低，則熒光信號與在緩沖溶液中檢測到的熒光信號一致(圖19)。

在摻入有混合的mmp的傷口滲出液樣本中，在采用mnp-mmp-1ab和mnp-mmp9ab孵育后，在psirm功能化表面上檢測到的熒光信號分別為21.9±1.6和28.9±1.1。如果它們從它們在傷口滲出液樣本中的熒光強(qiáng)度中減少，這些強(qiáng)度值也與緩沖溶液中混合的mmp的熒光強(qiáng)度一致。這證實了使用mnp-mmpab的選擇性結(jié)合可以用于復(fù)雜的生物樣本。

實施例6-通過共聚焦顯微鏡檢測mmp

除了使用熒光計之外，采用共聚焦顯微鏡研究由mmp裂解后的edans發(fā)射的熒光檢測。使用微接觸印刷技術(shù)將psirm表面功能化以固定mmp肽底物。然后采用mmp-1溶液孵育功能化的表面并在顯微鏡下觀察(圖21)。較淺的圓圈是mmp肽底物固定的表面，而較暗的周圍表面是沒有固定化肽的區(qū)域。較淺的顏色(藍(lán)色)是edans發(fā)射的顏色，這證實了mmp底物的裂解。這個結(jié)果證實，在顯微鏡下檢測熒光發(fā)射也是可能的。

實施例7-細(xì)菌生物標(biāo)記分選酶a的檢測

所描述的生物傳感器還可以用于檢測其它分析物，例如細(xì)菌酶，例如細(xì)菌分選酶a酶。該酶被革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌用于通過裂解在蘇氨酸和甘氨酸之間的酰胺鍵處的lpxtg，將表面蛋白錨定到細(xì)胞壁。lpxtg是普通標(biāo)簽，其中x是任何氨基酸，然而lpetg(其中x是e)是標(biāo)簽的最佳同種型^[72]。

我們設(shè)計了對分選酶a特異的檢測劑。底物序列是dnp-lpetg-(k-fitc)-nh2，其中2,4-二硝基苯酚(dnp)是熒光受體，fitc(異硫氰酸熒光素)是熒光供體，t-g(蘇氨酸-甘氨酸)作為接頭。該底物是商業(yè)合成的。

因為分選酶a底物具有與mmp底物相似的胺基，所以按照與實施例2中所描述的mmp肽底物相似的方式進(jìn)行分選酶a底物的固定化。然而，作為感應(yīng)平臺的psirm被重新設(shè)計，以具有與裂解后的fret底物的fitc發(fā)射對準(zhǔn)的微腔凹陷，其為大約514nm。

最初，我們測試了在溶液中和在psirm表面上檢測分選酶a的能力。將1mm分選酶a底物的溶液與1μg/ml分選酶a接觸30分鐘，然后通過熒光計測量fitc發(fā)射(圖22(a))。將相同濃度的分選酶a固定在psirm表面上。然后將表面與相同濃度的分選酶a接觸30分鐘，并測量fitc發(fā)射(圖22(b))。

圖22示出了在分選酶a酶裂解分選酶a底物后的fitc的發(fā)射，與在溶液中檢測到的發(fā)射(圖22(a))相比，在psirm表面中fitc的熒光發(fā)射(圖22(b))高4.3倍。它證實了psirm感應(yīng)平臺的熒光增強(qiáng)效應(yīng)。

接著我們優(yōu)化裂解分選酶a底物所需要的時間。我們將1μg/ml分選酶a與固定在psirm表面上的1mm分選酶a底物接觸6個不同的時間：0、5、10、15、30和60min，然后如圖23所示測量熒光發(fā)射。從該圖中可以看出，分選酶a酶和分選酶a底物之間的相互作用越長，檢測到的fitc發(fā)射越高，證實更多分選酶a被酶裂解。然而，這種趨勢僅直到30分鐘的接觸時間。在那之后，觀察到的熒光強(qiáng)度降低，表明fitc的熒光發(fā)射可能在該持續(xù)時間內(nèi)開始被淬滅。在任何情況下，獲得熒光信號的5分鐘相互作用時間和獲得最大熒光信號的30分鐘是感應(yīng)的理想時間。

下一步是優(yōu)化可檢測的分選酶a的濃度。為了做到這一點，分選酶a底物的濃度保持恒定在1mm，然后我們測試從1μg/ml降至1×10^-10μg/ml的6種不同濃度，如圖24所示。該圖顯示，熒光信號隨著分選酶a酶的濃度降低而降低，并且該感應(yīng)平臺仍然具有低至fg/ml的分選酶a濃度的明顯信號。

也在傷口滲出液中檢測分選酶a(圖25)。固定在psirm感應(yīng)平臺上的分選酶a底物與傷口滲出液樣本(下部跡線)、摻有1×10^-4μg/ml分選酶a的傷口滲出液(上部跡線)接觸30min，然后測量fitc的熒光強(qiáng)度。

圖25示出了，傷口滲出液樣本沒有產(chǎn)生任何熒光信號(下部跡線)，表明傷口滲出液不含任何分選酶a酶。因此，我們嘗試在傷口滲出液樣本中加入1×10^-4μg/ml分選酶a酶，并測量發(fā)射(上部跡線)。摻有分選酶a的傷口滲出液樣本發(fā)射具有強(qiáng)度為大約82.34a.u.的fitc熒光，其接近于如圖24所呈現(xiàn)的緩沖溶液中的該濃度的發(fā)射(100.2±22.7a.u.)。該結(jié)果表明酶仍然是活性的且即使在復(fù)雜樣本中也能夠裂解分選酶a底物。

由于傷口滲出液樣本不含有酶，我們使用來自金黃色葡萄球菌細(xì)菌的細(xì)菌上清液樣本進(jìn)行了另一個實驗。細(xì)菌上清液是細(xì)菌培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基采用金黃色葡萄球菌接種，然后過濾。然后將該過濾的培養(yǎng)基或上清液用于實驗。最初，我們嘗試采用金黃色葡萄球菌接種培養(yǎng)基1小時，并檢查熒光發(fā)射，如圖26所呈現(xiàn)的(下部跡線)。從圖中可以看出，細(xì)菌上清液樣本產(chǎn)生熒光發(fā)射信號(大約47.26a.u.)，表明分選酶a底物被存在于細(xì)菌上清液樣本中的分選酶a酶裂解。然而，為了證實該信號，我們還用1×10^-4μg/ml分選酶a酶摻入細(xì)菌上清液(上部跡線)。摻有分選酶a酶的細(xì)菌上清液樣本增加了大約112.19a.u.的熒光強(qiáng)度，這與當(dāng)psirm表面與溶液中的1×10^-4μg/ml分選酶a酶相互作用時檢測到的發(fā)射一致(圖24)。這些結(jié)果證明，在細(xì)菌上清液樣本中檢測到的熒光發(fā)射信號是由于在該樣本中存在分選酶a酶。

然后在細(xì)菌上清液實驗后，進(jìn)行不同的接種時間的細(xì)菌上清液實驗：0、0.5、1、3、5和24h，還接種傷口滲出液樣本0和24h，如圖27所呈現(xiàn)的。

圖27示出了采用來自細(xì)菌培養(yǎng)基的細(xì)菌上清液孵育的表面產(chǎn)生的熒光發(fā)射隨著接種時間的增加而增加。它證實接種時間越長，產(chǎn)生的分選酶a酶越多。在來自細(xì)菌培養(yǎng)基和傷口滲出液樣本的上清液樣本，在0h接種時間時，具有非常少量的分選酶a酶，正如由檢測到的非常低的發(fā)射熒光所指示的。然而，在24h接種時間后，與在接種的傷口滲出液樣本中產(chǎn)生的酶相比，在接種的細(xì)菌培養(yǎng)基樣本中產(chǎn)生的分選酶a酶更高，表明在細(xì)菌培養(yǎng)基中的分選酶a酶產(chǎn)生更快。

最后，為了證實沒有基質(zhì)效應(yīng)，我們使用標(biāo)準(zhǔn)加入法，并比較在緩沖液中、摻入傷口滲出液樣本和摻入細(xì)菌上清液樣本的分選酶a酶裂解后，fitc的熒光信號(圖28)。為了做到這一點，我們測試了四種不同濃度的分選酶a酶，其產(chǎn)生了在先前實驗中檢測到的線性響應(yīng)(圖24)。從圖28中的結(jié)果可以看出，所有樣本產(chǎn)生類似的斜率，表明沒有干擾基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)論

我們提出了一種用于mmp-1的基于熒光的光學(xué)生物傳感器，其圍繞光子psirm襯底設(shè)計且通過考慮參數(shù)(例如孔徑、孔隙率、q因子、dbr中的周期數(shù)、入射光的角度和光子帶隙的相應(yīng)波長)仔細(xì)設(shè)計。psirm表面采用mmp的熒光肽底物功能化，正如ftir-atr光譜所證實的。

由于psirm襯底中的限制和增強(qiáng)效應(yīng)，在psirm表面中觀察到的edans發(fā)射比在相同mmp-1濃度下在溶液中觀察到的發(fā)射更強(qiáng)和更窄，并且與其它psi架構(gòu)(例如單層和多層)相比也更強(qiáng)。我們發(fā)現(xiàn)將腔位置調(diào)節(jié)到edans發(fā)射峰是必要的。

在5min和單個培養(yǎng)步驟后檢測緩沖液中mmp-1的存在。此外，該生物傳感器成功檢測到檢測限為7.5×10^-19m的mmp-1。也實現(xiàn)了人慢性傷口滲出液的mmp檢測，人慢性傷口滲出液是這類生物傳感器的臨床相關(guān)樣本。因此，我們的結(jié)果為急需的poc生物傳感器的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，所述poc生物傳感器支撐了慢性傷口管理的改善。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的使用不限于所描述的特定應(yīng)用。關(guān)于本文描述或描繪的特定元件和/或特征，本發(fā)明并不限制于其優(yōu)選實施例。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于所公開的一個或多個實施例，而是在不脫離由所附權(quán)利要求闡述和限定的本發(fā)明的范圍下能夠進(jìn)行多種重新排列、修改和替換。

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在整個說明書和所附的權(quán)利要求書中，除非上下文另外有要求，詞語“包括(comprise)”和“包含(include)”以及例如“包括(comprising)”和“包含(including)”的變化將被理解為暗示包含所陳述的整體或多個整體的組，但不排除任何其他整體或多個整體的組。

在本說明書中對任何現(xiàn)有技術(shù)的引用不是且不應(yīng)當(dāng)被看作是承認(rèn)任何形式的暗示，即這樣的現(xiàn)有技術(shù)形成公知常識的一部分。