發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明提供用于用聚合物捕獲膜捕獲單細胞的方法、系統(tǒng)、組件和制品。在某些實施方案中，聚合物捕獲膜包括具有頂部和底部開口的多個單獨通道，其中所述通道的尺寸經(jīng)設(shè)計，以便單細胞：i)在向所述底部開口提供負壓時，在所述通道內(nèi)被捕獲，從而部分地或基本上封閉所述通道；或ii)在向所述底部開口提供負壓時，由所述頂部開口捕獲，但未進入所述通道。在一些實施方案中，所述聚合物捕獲膜的通道與多阱芯片的阱對齊，以便細胞或單細胞的內(nèi)容物可轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的阱。

背景

遺傳學家正在努力表征復(fù)雜的疾病，如癌癥、自身免疫病癥和神經(jīng)病癥，但是找到驅(qū)動這些疾病的基本機制一直是難以捉摸的。在細胞一生中積累的體細胞突變、自發(fā)性變體是驅(qū)動疾病發(fā)作和復(fù)發(fā)的主要因素。隨著細胞積累新的突變，它們形成與正常細胞共存的多克隆細胞群體。對大細胞群體進行測序可掩蔽這些獨特的罕見細胞類型的潛在異質(zhì)性，致使難以將所述細胞類型與正常種系突變區(qū)分開來。顯示這些差異以及可視化克隆構(gòu)造的最佳方式是對群體中的單獨細胞進行測序。雖然單細胞測序可幫助揭開復(fù)雜疾病的機制，但是傳統(tǒng)方法是昂貴的、勞動密集的，并且需要大的樣品輸入。需要的是例如易于與多阱裝置一起使用的分離單細胞的方法。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供用于用聚合物捕獲膜捕獲單細胞的方法、系統(tǒng)、組件和制品。在某些實施方案中，聚合物捕獲膜包括具有頂部和底部開口的多個單獨通道，其中所述通道的尺寸經(jīng)設(shè)計，以便單細胞：i)在向所述底部開口提供負壓時，在所述通道內(nèi)被捕獲，從而部分地或基本上封閉所述通道；或ii)在向所述底部開口提供負壓時，由所述頂部開口捕獲，但未進入所述通道。在一些實施方案中，所述聚合物捕獲膜的通道與多阱芯片的阱對齊，以便細胞或單細胞的內(nèi)容物可轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的阱。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供用于通過聚合物膜上的單獨通道或點捕獲單細胞的方法、系統(tǒng)、組件和制品。在某些實施方案中，聚合物膜具有能夠使用特定尺寸和負壓捕獲單細胞的多個單獨通道(例如，在多阱匹配模式中)。在其他實施方案中，聚合物膜具有能夠捕獲單細胞的多個單獨親水性點(例如，在多阱匹配模式中)。在某些實施方案中，在多阱匹配模式中所述聚合物膜和捕獲的單細胞一起與具有匹配阱開口模式的多阱板或多阱芯片配對，以便捕獲的細胞可分配于其中，從而允許各阱接收單細胞(例如，然后可將所述單細胞裂解，并且對核酸進行測序)。在某些實施方案中，采用例如附著到(例如，通過雙面PCR相容性粘合劑)多阱裝置并且與多阱裝置對齊的尺寸排阻聚合物膜。在一些實施方案中，多阱通過裝置設(shè)置有細胞尺寸的頂部開口和較大的底部開口(例如，被配置來接收反應(yīng)組分)。在其他實施方案中，多阱裝置通過使PCR相容性膜附著到多阱通孔芯片底部來產(chǎn)生。在另外的實施方案中，本文提供具有細胞尺寸的凹坑或阱(例如，各自含有單細胞)的捕獲芯片，其可與具有多個阱的多阱裝置配對，所述多個阱含有將分離和/或裂解所述單細胞的試劑?？蓪⒉东@芯片和多阱裝置配對，以便所述芯片的凹坑與所述裝置的阱對齊，然后處理，以便試劑從多阱裝置的阱流到所述細胞尺寸的凹坑中的細胞，然后再次處理，以便處理過的細胞流入所述多阱裝置的阱中。

在一些實施方案中，本文提供包括聚合物膜的制品，其中所述聚合物膜包括頂面、底面和延伸穿過所述聚合物膜的多個單獨通道(例如，布置于多阱裝置模式中)，其中每個所述單獨通道：a)在所述聚合物膜的頂面具有頂部開口，b)在所述聚合物膜的底面具有底部開口，并且c)尺寸經(jīng)設(shè)計，以便來自細胞懸液的一個細胞且僅有所述一個細胞：i)在向所述底部開口提供負壓時，在所述單獨通道內(nèi)被捕獲，從而部分地或基本上封閉所述單獨通道；或ii)在向所述底部開口提供負壓時，由所述頂部開口捕獲，但未進入所述單獨通道。在特定實施方案中，所述多個單獨通道的頂部開口與多阱裝置(例如，多阱板或多阱芯片)中的阱開口一對一匹配并且對齊。

在特定實施方案中，本文提供包括以下的系統(tǒng)或組件：a)聚合物膜，其包括頂面、底面和延伸穿過所述聚合物膜的多個單獨通道，其中每個所述單獨通道：i)在所述聚合物膜的頂面具有頂部開口，ii)在所述聚合物膜的底面具有底部開口，并且iii)尺寸經(jīng)設(shè)計，以便來自細胞懸液的一個細胞且僅有所述一個細胞：A)在向所述底部開口提供負壓時，在所述單獨通道內(nèi)被捕獲，從而部分地或基本上封閉所述單獨通道；或B)在向所述底部開口提供負壓時，由所述頂部開口捕獲，但未進入所述單獨通道；以及b)多孔層，其包含允許液體但不允許細胞從中穿過的多孔材料，其中所述多孔層的尺寸被設(shè)計成與所述聚合物膜的底面接觸，以便所述多個單獨通道中的每個的底部開口由所述多孔材料覆蓋。多孔層，其包含允許液體但不允許細胞從中穿過的多孔材料，其中所述多孔層的尺寸被設(shè)計成與所述聚合物膜的底面接觸，以便所述多個單獨通道中的每個的底部開口由所述多孔材料覆蓋。

在另外的實施方案中，本文提供分離單細胞的方法，其包括：a)使細胞懸液與細胞分離系統(tǒng)接觸，其中所述細胞分離系統(tǒng)包括：i)聚合物膜，其包括頂面、底面和延伸穿過所述聚合物膜的多個單獨通道，其中每個所述單獨通道：A)在所述聚合物膜的頂面具有頂部開口，B)在所述聚合物膜的底面具有底部開口，并且C)尺寸經(jīng)設(shè)計，以便來自所述細胞懸液的一個細胞且僅有所述一個細胞：1)在向所述底部開口提供負壓時，在所述單獨通道內(nèi)被捕獲，從而部分地或基本上封閉所述單獨通道；或2)在向所述底部開口提供負壓時，由所述頂部開口捕獲，但未進入所述單獨通道；ⅱ)氣動裝置，其提供所述負壓，其中所述氣動裝置包括界面表面，以及iii)多孔層，其包含允許液體但不允許細胞從中穿過的多孔材料，其中所述多孔層與A)所述聚合物膜的底面接觸以便所述多個單獨通道中的每個的底部開口由所述多孔材料覆蓋；并且與B)所述氣動裝置的界面表面接觸；b)用所述細胞分離系統(tǒng)孵育所述細胞懸液，其中所述氣動裝置提供所述負壓，以便所述聚合物膜中的每個所述單獨通道捕獲來自所述細胞懸液的一個且僅有所述一個細胞，以便每個單獨通道具有一個捕獲的細胞；以及c)洗滌所述聚合物膜以將來自所述細胞懸液的非捕獲的細胞移除，以便產(chǎn)生捕獲的細胞聚合物膜。

在一些實施方案中，所述方法還包括將所述捕獲的細胞聚合物膜和多阱裝置(例如，多阱板或多阱芯片)組合在一起以產(chǎn)生一個組件，其中所述多阱裝置具有多個阱開口，并且其中所述捕獲的細胞聚合物膜的多個單獨通道的頂部開口與所述多阱裝置中的所述多個阱開口一對一匹配并且對齊。在特定實施方案中，所述方法還包括處理組件的步驟，以便將每個所述單獨通道的一個捕獲的細胞或每個所述單獨通道的一個捕獲的細胞的部分內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到對應(yīng)的多阱裝置(例如，多阱板或多阱芯片)的阱開口中。在某些實施方案中，離心所述組件以將細胞從聚合物中釋放到多阱裝置，或停止負壓和/或采用正壓以釋放所述細胞。

在某些實施方案中，捕獲的細胞在與多阱裝置接觸之前在仍然處于聚合物上時裂解。在其他實施方案中，所述方法還包括將試劑添加到多阱裝置中的每個阱開口的步驟，以便修飾一個捕獲的細胞或一個捕獲的細胞的內(nèi)容物。在另外的實施方案中，所述試劑選自由以下組成的組：緩沖液、裂解緩沖液、聚合酶、測序試劑、蛋白酶和核苷酸。在特定實施方案中，一旦單細胞處于多阱裝置中的多個阱中的每個中，用戶或自動化系統(tǒng)(例如，來自WAFERGEN)就分配切口酶和聚合酶(例如，Pyrophage 3137聚合酶)的混合物和裂解緩沖液。然后將所述阱在約37℃下處理，然后在95℃下處理以激活切口酶，并且通過使用聚合酶來進行等溫擴增。在某些實施方案中，所述細胞可替代地以加熱方式裂解。然后將蛋白酶(例如，蛋白酶K)分配到阱中，在55℃下孵育(以消化聚合酶，諸如pyrophage 3137)，并且進行95℃的孵育以使蛋白酶失活。然后，可在各阱中進行基因特異性反應(yīng)。

在另外的實施方案中，所述多個單獨通道的頂部開口與多阱裝置中的阱開口一對一匹配并且對齊。在另外的實施方案中，所述多個單獨通道包含至少50、至少500、至少5000或至少50,000個單獨通道(例如，至少50…100…687…1000…5000…7500…13,000…33,000…或50,000個單獨通道)。在某些實施方案中，所述多阱裝置中的所述阱開口各自的直徑為約50μm至900μm(例如，50…100…300…500…700…900um)。

在一些實施方案中，所述多阱裝置中的所述多個阱包含至少50、至少500、至少5000或至少50,000個單獨阱(例如，至少50…100…687…1000…5000…7500…13,000…33,000…或50,000個單獨阱)。

在另外的實施方案中，所述聚合物膜由疏水性聚合物構(gòu)成。在某些實施方案中，所述疏水性聚合物包括聚酰亞胺、聚酯、聚乙烯、聚氨酯、TEFLON和/或PTFE(例如，所述疏水性聚合物為約20-30μm厚，具有3-5μm孔)。在其他實施方案中，所述聚合物膜的頂面包括疏水性涂層。在特定實施方案中，所述疏水性涂層包括選自由以下組成的組的材料：聚丙烯酸酯(例如，聚(丙烯酸丁酯)和聚(丙烯酸甲酯)、丙烯腈聚合物和共聚物(例如，聚丙烯腈)、馬來酸酐共聚物(例如，聚(苯乙烯-共聚-馬來酸酐))、甲基丙烯酸酯聚合物(例如，聚(甲基丙烯酸芐酯)和聚(甲基丙烯酸丁酯))、酰胺和酰亞胺(例如，尼龍)、碳酸酯(例如，聚(雙酚A碳酸酯))、二烯(例如，聚丁二烯)、酯(例如，聚(1,4-丁烯琥珀酸酯))、醚(例如，聚(丙二醇))、氟碳化合物(例如，聚(四氟乙烯))、氟硅烷、烯烴(例如，聚乙烯)、苯乙烯(例如，聚苯乙烯)、乙烯醇縮醛(例如，聚(乙烯醇縮丁醛-共聚-乙烯醇-共聚-乙酸乙烯酯))、氯乙烯和偏二氯乙烯(例如，聚(氯乙烯))、乙烯酯(例如聚(乙酸乙烯酯))、乙烯醚和乙烯酮(例如，聚(乙基乙烯醚))、乙烯吡啶和乙烯吡咯烷酮聚合物(例如，聚(4-乙烯吡啶))、來自Lotus Leaf的HYDROFOE涂層和ACULON疏水性涂層。

在某些實施方案中，所述多孔材料選自由以下組成的組：剛性多孔泡沫、超高分子量聚乙烯(UHMWPE)、高密度聚乙烯(HDPE)、低密度聚乙烯(LDPE)、極低密度聚乙烯(VLDPE)、聚丙烯(PP)、乙烯乙酸乙烯酯(EVA)、聚苯乙烯(PS)、環(huán)氧玻璃和苯酚玻璃。在其他實施方案中，所述多孔材料為來自以下的材料：GENPORE(Morgantown,RD)、POREX(Fairburn,GA)或PERMAPLAS Corp.(Fayetteville,GA)。

在另外的實施方案中，每個所述單獨通道的頂部開口的直徑為約5μm至約80μm(例如，5…15…25…45….65…或約80um)。在某些實施方案中，所述單獨通道為激光形成的通道(例如，使用UV激光鉆孔或者CO2或準分子激光鉆孔)。在其他實施方案中，光刻或等離子體蝕刻用來在聚合物膜中產(chǎn)生通道。在某些實施方案中，所述聚合物膜為約1平方厘米至約16平方厘米(例如，1…5…10…13…或16平方厘米)。

在某些實施方案中，所述系統(tǒng)還包括多阱裝置(例如，多阱板或多阱芯片)，其中所述多個單獨通道的頂部開口與所述多阱裝置中的所述阱開口一對一匹配并且對齊。在其他實施方案中，所述聚合物膜的厚度在25μm與2mm之間(例如，25μm…75μm…500μm…1mm…2mm)。在其他實施方案中，所述多個單獨通道中的每個均近似為圓柱形。

在一些實施方案中，每個所述單獨通道的所述一個細胞選自由以下組成的組：血小板(約2μm直徑)、紅細胞(約3至8μm直徑)、嗜中性粒細胞(約8-10μm直徑)、淋巴細胞(約6-12μm直徑)、外分泌細胞(約10μm直徑)、成纖維細胞(約10-15μm直徑)、骨細胞(約10-20μm直徑)、軟骨細胞或肝細胞(約20μm直徑)、杯狀細胞或纖毛細胞(約50μm長和5-10μm寬)、巨噬細胞(約20-80μm直徑)、造血干細胞(約30-40μm直徑)、填充有儲存脂質(zhì)的脂肪細胞(約70-120μm直徑)以及神經(jīng)元(約4-120μm直徑)。在某些實施方案中，所述細胞為原核的或真核的。在一些實施方案中，所述細胞為哺乳動物細胞(例如，人細胞)。

在一些實施方案中，所述系統(tǒng)還包括c)提供負壓的氣動裝置，其中所述氣動裝置包括界面表面，并且其中所述多孔層的尺寸被設(shè)計成與所述氣動裝置的界面表面接觸。在其他實施方案中，所述氣動裝置包括高精度計，所述高精度計允許確定是否所有或基本上所有的單獨通道部分地或基本上被細胞封閉。在其他實施方案中，所述多孔層與所述聚合物膜的底面和所述氣動裝置的界面表面接觸。在特定實施方案中，所述氣動裝置被進一步配置來提供足以將所述一個細胞從每個單獨通道中移去的正壓。在其他實施方案中，所述細胞懸液包含100個與1x 10¹³個之間的細胞(例如，100…1000…1x10⁶…1x 10⁹…1x 10¹²和1x 10¹³)。

在某些實施方案中，本文提供包括聚合物膜的制品，其中所述聚合物膜包括頂面，其中除了布置于多阱模式中的多個單獨親水性點之外，所述頂面大部分或完全是疏水的，其中每個所述單獨親水性點的尺寸經(jīng)設(shè)計，以便來自細胞懸液的一個細胞且僅有所述一個細胞由每個所述單獨親水性點捕獲，并且其中所述多阱模式與多阱裝置(例如，多阱板或多阱芯片)中的所述多個阱開口一對一匹配并且對齊。在特定實施方案中，所述親水性點由聚多巴胺或相似材料構(gòu)成(參見，以引用方式并入本文的Kang和Choi,Bull.Korean,Soc.,2013,34(8):2525-2527)。在其他實施方案中，所述單獨親水性點的直徑為5-30μm(例如，約5…15…25…或約30μm)。

在某些實施方案中，本文提供包括以下的系統(tǒng)：a)多阱裝置(例如，多阱板或多阱芯片)，其中所述多阱裝置包括多個阱開口，以及b)包括頂面的聚合物膜，其中除了布置于多阱模式中的多個單獨親水性點之外，所述頂面是疏水的，其中每個所述單獨親水性點的尺寸經(jīng)設(shè)計，以便來自細胞懸液的一個細胞且僅有所述一個細胞由每個所述單獨親水性點捕獲，并且其中所述多阱模式與所述多阱裝置中的所述多個阱開口一對一匹配并且對齊。

在特定實施方案中，本文提供包括以下的方法：a)使細胞懸液與細胞分離聚合物膜接觸，其中所述細胞分離聚合物膜包括頂面，其中除了布置于多阱模式中的多個單獨親水性點之外，所述頂面是疏水的，其中每個所述單獨親水性點的尺寸經(jīng)設(shè)計，以便來自細胞懸液的一個細胞且僅有所述一個細胞由每個所述單獨親水性點捕獲，并且其中所述多阱模式與多阱裝置(例如，多阱板或多阱芯片)中的所述多個阱開口一對一匹配并且對齊；b)用所述細胞分離聚合物膜孵育所述細胞懸液，以便每個所述單獨親水性點捕獲來自所述細胞懸液的一個且僅有所述一個細胞，以便每個所述單獨點具有一個捕獲的細胞；以及c)洗滌所述細胞分離聚合物膜以將來自所述細胞懸液的非捕獲的細胞移除，以便產(chǎn)生捕獲的細胞聚合物膜。

在另外的實施方案中，所述方法還包括將所述捕獲的細胞聚合物膜和多阱裝置(例如，多阱板或多阱芯片)組合在一起以產(chǎn)生一個組件，其中所述多阱裝置具有多個阱開口，并且其中所述捕獲的細胞聚合物膜的單獨親水性點(各自具有捕獲的細胞)與所述多阱裝置中的所述多個阱開口一對一匹配并且對齊。在其他實施方案中，所述方法還包括處理組件的步驟，以便將每個所述單獨親水性點的一個捕獲的細胞或每個所述單獨親水性點的一個捕獲的細胞的部分內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到對應(yīng)的多阱裝置(例如，板或多阱芯片)的阱開口中。例如，在某些實施方案中，離心所述組件以轉(zhuǎn)移細胞，或者改變緩沖條件以允許所述細胞從所述親水性點中釋放。在特定實施方案中，所述細胞與多阱裝置接觸之前在聚合物膜上裂解。在一些實施方案中，所述方法還包括將試劑添加到多阱裝置中的每個阱開口的步驟，以便修飾一個捕獲的細胞或一個捕獲的細胞的內(nèi)容物。在其他實施方案中，所述試劑選自由以下組成的組：緩沖液、裂解緩沖液、聚合酶、測序試劑、蛋白酶和核苷酸。

在一些實施方案中，本文提供包括以下的系統(tǒng)：a)多阱通孔芯片，其具有頂面和底面；以及b)PCR相容性膜，其附著到或可附著到所述多阱通孔芯片的所述底面以產(chǎn)生具有多個阱的多阱裝置，其中所述PCR相容性膜形成所述多個阱中的每個的底部。在特定實施方案中，所述細胞還包括尺寸排阻聚合物膜，其中所述尺寸排阻聚合物膜附著到所述多阱通孔芯片的所述頂面。

在某些實施方案中，本文提供包括以下的系統(tǒng)：a)包括多個阱開口的多阱裝置；以及b)包括頂面的聚合物膜；其中除了布置于多阱模式中的多個單獨親水性點之外，所述頂面是疏水的，其中每個所述單獨親水性點的尺寸經(jīng)設(shè)計，以便來自細胞懸液的一個細胞且僅有所述一個細胞由每個所述單獨親水性點捕獲，并且其中所述多阱模式與所述多阱裝置中的所述多個阱開口一對一匹配并且對齊；以及c)雙面PCR相容性粘合劑，其中所述雙面PCR相容性粘合劑使所述聚合物膜粘結(jié)到所述多阱裝置。

在特定實施方案中，所述多阱裝置由與PCR相容性膜組合的多阱通孔芯片形成，其中所述PCR相容性膜附著到所述多阱通孔芯片的底部，從而產(chǎn)生具有多個阱的多阱裝置，其中所述PCR相容性膜形成所述多個阱中的每個的底部。

在某些實施方案中，本文提供包括基底的多阱通過芯片，所述基底在其中具有多個通孔，其中每個通孔具有頂部開口和底部開口，其中所述頂部開口的尺寸被設(shè)計來僅接收單細胞，并且其中所述底部開口具有比所述頂部開口大的直徑。

在一些實施方案中，所述底部開口的直徑比所述頂部開口大至少10％(例如，10％…25％…75％…100％…300％…1000％或更多)。在另外的實施方案中，所述基底包括硅、石英、玻璃或其任何組合。在另外的實施方案中，所述頂部開口的直徑為2和50um(例如，2…24…40um或2-10um、2-20um、4-10；10-25；以及25-50um)。在其他實施方案中，所述底部開口的直徑為100至800um(例如，100…450…600…或800um)。在某些實施方案中，所述基底的厚度為0.5mm至3.0mm(例如，0.5…1.0…2.0…2.6…3.0mm)。在另外的實施方案中，所述基底包括粘結(jié)到玻璃晶片的硅晶片。在一些實施方案中，所述頂部開口處于所述硅晶片中，并且所述底部開口處于所述玻璃晶片中。在另外的實施方案中，所述單細胞選自由以下組成的組：骨細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞、上皮細胞、肌肉細胞、分泌細胞、脂肪細胞、紅細胞、白細胞、血小板和凝血細胞。

在一些實施方案中，本文提供包括以下的方法：a)使本文描述的多阱通過芯片與含有細胞的溶液接觸，以便單細胞進入所述多個通孔中的至少一些的頂部開口；b)將蓋施加到所述多個通孔中的所述至少一些的頂部開口以產(chǎn)生具有多個阱的多阱裝置，所述多個阱各自含有單細胞，其中所述蓋形成所述多個阱中的每個的底部。在另外的實施方案中，所述方法還包括：將試劑添加到所述多個阱中的至少一些中，其中所述試劑用于進行生化反應(yīng)。在其他實施方案中，所述試劑包含選自以下的藥劑：裂解緩沖液、PCR引物、聚合酶及其組合。在另外的實施方案中，所述蓋包括PCR相容性膜。

在某些實施方案中，本文提供包括以下的系統(tǒng)：a)包括基底的捕獲芯片，所述基底包括各自允許從細胞混合物中捕獲單細胞的多個細胞尺寸的凹坑或阱；以及b)包括多個阱的多阱芯片裝置，其中所述多個細胞尺寸的凹坑或阱與所述多阱芯片中的所述多個阱一對一匹配并且對齊。

在特定實施方案中，所述細胞尺寸的凹坑或阱中的一些或所有各自含有單細胞。在一些實施方案中，所述多阱芯片中所述多個阱中的一些或所有均含有分離和/或裂解細胞的試劑。在另外的實施方案中，所述細胞尺寸的凹坑或阱中的一些或所有各自含有單細胞。在另外的實施方案中，所述細胞尺寸的凹坑或阱通過光刻來蝕刻。

在某些實施方案中，本文提供包括以下的方法：a)提供：i)包括基底的捕獲芯片，所述基底包括各自允許從細胞混合物中捕獲單細胞的多個細胞尺寸的凹坑或阱，其中每個所述細胞尺寸的凹坑或阱均含有單細胞；以及ii)包括多個阱的多阱芯片裝置，其中所述多個細胞尺寸的凹坑或阱與所述多阱芯片中的所述多個阱一對一匹配并且對齊，其中所述多個阱中的每個均含有分離和/或裂解細胞的試劑；b)將所述捕獲芯片和所述多阱芯片組合在一起以形成配對裝置，以便所述捕獲芯片的所述細胞尺寸的凹坑或阱與所述多阱裝置的所述阱對齊；c)攪拌所述配對裝置，以便所述多阱裝置的所述阱中的所述試劑行進到所述細胞尺寸的凹坑或阱中，從而接觸所述單細胞以產(chǎn)生處理過的細胞；以及d)攪拌所述配對裝置，以便每個所述細胞尺寸的凹坑或阱中的處理過的細胞行進到對應(yīng)的所述多阱裝置的阱中。在一些實施方案中，所述攪拌包括提供離心力。

在特定實施方案中，所述多阱裝置中所述多個阱中的至少一些的容積在0.1納升與500納升之間(例如，約0.1nl…0.9nl…1.5nl…5.0nl…10nl…20nl…35nl…50nl…75nl…100nl…150nl…300nl…450nl…500nl)。在特定實施方案中，所述多個阱中的至少一些的容積在1.0納升與250納升之間(例如，1-250nl、10-200nl、25-150nl、40-100nl或50-100nl)。在一些實施方案中，所述多個阱包括至少3個開口阱(例如，3…10…100…350…500…750…1000…1500…3000…5000…7500…10,000…15,000…20,000…30,000…45,000個或更多開口阱)。

在另外的實施方案中，多阱裝置(例如，芯片)的長度為10mm至200mm(例如，10mm…50mm…100mm…150mm…或200mm)，寬度為10mm至200mm(例如，10mm…50mm…100mm…150mm…或200mm)，并且厚度為0.1mm至10厘米(例如，0.1mm…1.0mm…10mm…10cm)。在其他實施方案中，用于所述多阱裝置的基底包括選自由以下組成的組的材料：玻璃、陶瓷、準金屬、硅、硅酸鹽、氮化硅、二氧化硅、石英、砷化鎵、塑料和有機聚合材料。在另外的實施方案中，多阱裝置(例如，芯片)還包括單獨受控加熱元件，所述單獨受控加熱元件中的每個均可操作地連接到阱。

在一些實施方案中，本公開提供包括聚合物捕獲膜的制品，其中所述聚合物捕獲膜包括頂面、底面和延伸穿過所述聚合物捕獲膜的多個單獨通道，其中每個所述單獨通道：a)在所述聚合物捕獲膜的頂面具有頂部開口，b)在所述聚合物捕獲膜的底面具有底部開口，并且c)尺寸經(jīng)設(shè)計，以便來自細胞懸液的一個細胞(例如，且僅有所述一個細胞)：i)在向所述底部開口提供負壓時，在所述單獨通道內(nèi)被捕獲，從而部分地或基本上封閉所述單獨通道；或ii)在向所述底部開口提供負壓時，由所述頂部開口捕獲，但未進入所述單獨通道。

在某些實施方案中，聚合物捕獲膜包含惰性和/或疏水性聚合物(例如，聚酰亞胺、聚酯、聚乙烯、聚氨酯、TEFLON和/或PTFE)。在另外的實施方案中，所述制品還包括附著到聚合物捕獲膜或與聚合物捕獲膜成一體的至少一個膜導向部件(例如，在其中具有導向孔的瓣片或其他突出物)，其中膜導向部件被配置來允許使所述聚合物捕獲膜中的所述多個單獨通道與多阱裝置中的阱和/或聚合物膜支撐板中的孔一對一對齊。在其他實施方案中，所述多個單獨通道的頂部開口與多阱裝置(例如，來自Wafergen Biosystems的SMARTCHIP)中的阱開口一對一匹配并且對齊。在另外的實施方案中，所述多個單獨通道包括至少10…250…500…1000…5000…或30,000個單獨通道。在另外的實施方案中，每個所述單獨通道的尺寸經(jīng)設(shè)計，以便當向底部開口提供負壓時，來自細胞懸液的一個細胞(例如，且僅有所述一個細胞)由所述頂部開口捕獲，但未進入所述單獨通道。在其他實施方案中，所述聚合物膜的厚度在10μm與50μm之間(例如，10…20…40…或50μm)，并且所述頂面的面積在1cm²與30cm²之間(例如，1…20..25…或30cm²)。在另外的實施方案中，每個所述單獨通道的直徑為約2-10μm(例如，2…4…6…8…10μm)。

在某些實施方案中，本公開提供包括以下的系統(tǒng)：a)聚合物捕獲膜，其包括頂面、底面和延伸穿過所述聚合物捕獲膜的多個單獨通道，其中每個所述單獨通道：i)在所述聚合物捕獲膜的頂面具有頂部開口，ii)在所述聚合物捕獲膜的底面具有底部開口，并且iii)尺寸經(jīng)設(shè)計，以便來自細胞懸液的一個細胞(例如，且僅有所述一個細胞)：A)在向所述底部開口提供負壓時，在所述單獨通道內(nèi)被捕獲，從而部分地或基本上封閉所述單獨通道；或B)在向所述底部開口提供負壓時，由所述頂部開口捕獲，但未進入所述單獨通道；以及b)第一部件，其選自由以下組成的組：i)多孔層，其包含允許液體但不允許細胞從中穿過的多孔材料，其中所述多孔層的尺寸被設(shè)計成與所述聚合物捕獲膜的底面接觸，以便所述多個單獨通道中的每個的底部開口由所述多孔材料覆蓋；ii)膜支撐部件，其包括基底(例如，金屬、陶瓷、硅、鋁等)，所述基底具有穿過其的多個單獨孔(例如，所述多個單獨孔的直徑比所述聚合物捕獲膜中的通道大)，所述多個單獨孔與所述聚合物捕獲膜中的所述多個單獨通道一對一對齊，其中所述膜支撐部件的尺寸被設(shè)計成與所述聚合物捕獲膜的底面接觸并且支撐所述聚合物捕獲膜的底面；iii)多阱芯片，其包括多個單獨阱(例如，微阱或納米阱)，其中所述多阱芯片的尺寸被設(shè)計成與所述聚合物捕獲膜的頂面接觸，以便所述多個單獨阱與所述聚合物捕獲膜中的所述多個單獨通道一對一對齊；以及iv)細胞(例如，活細胞)，所述細胞：A)在一個所述單獨通道內(nèi)捕獲，或B)由一個所述單獨通道的頂部開口捕獲。

在某些實施方案中，所述系統(tǒng)還包括外殼基部，其中所述外殼基部被配置來容納聚合物捕獲膜(例如，提供用于聚合物捕獲膜的底部支撐，并且通常圍繞聚合物捕獲膜)，并且包括選自由以下組成的組的至少一個基部特征：真空連接端口(例如，在所述外殼基部的底部中)、用于對齊聚合物捕獲膜和膜支撐部件的至少兩個導向銷、膜支撐板凹部、液體儲器、墊圈以及用于連接到外殼頂部的至少一個連接桿。

在特定實施方案中，所述系統(tǒng)還包括外殼頂部，其中外殼頂部被配置來連接到外殼基部以包圍所述聚合物捕獲膜，并且包括選自由以下組成的組的至少一個頂部特征：入口端口(以連接到樣品遞送部件，以便遞送細胞懸液和洗滌液)、出口端口(例如，以連接到隔膜泵)、狹槽陣列(例如，具有多個狹槽以將液體引導至所述聚合物捕獲膜的通道中)、導向銷接收器以及連接桿接收器。

在某些實施方案中，所述聚合物捕獲膜包含惰性和/或疏水性聚合物(例如，聚酰亞胺、聚酯、聚乙烯、聚氨酯、TEFLON、PTFE或所述聚合物中任何兩種、任何三種、任何四種、任何五種或任何六種的組合)。在特定實施方案中，所述聚合物捕獲膜為約20-30μm厚，具有3-5μm孔。在另外的實施方案中，所述聚合物捕獲膜還包括附著到聚合物捕獲膜或與聚合物捕獲膜成一體的至少一個膜導向部件，其中膜導向部件被配置來允許使所述聚合物捕獲膜中的所述多個單獨通道與所述多阱裝置中的所述阱和/或所述聚合物膜支撐板中的所述孔一對一對齊。在其他實施方案中，所述多個單獨通道的頂部開口與所述多阱裝置中的所述阱開口和/或所述聚合物膜支撐板中的所述孔一對一匹配并且對齊。在另外的實施方案中，所述聚合物捕獲膜具有選自由以下組成的組的特性中的至少一種：i)所述多個單獨通道包括至少5…100…500…30,000個單獨通道，ii)每個所述單獨通道的尺寸經(jīng)設(shè)計，以便在向底部開口提供負壓時，來自細胞懸液的一個細胞且僅有所述一個細胞由頂部開口捕獲，但未進入所述單獨通道，iii)厚度在10μm與50μm之間，iv)頂面的面積在1cm²與30cm²之間；以及iv)每個所述單獨通道的直徑為約2-120μm。

在一些實施方案中，所述細胞選自由以下組成的組：血小板(約2μm直徑)、紅細胞(約3至8μm直徑)、嗜中性粒細胞(約8-10μm直徑)、淋巴細胞(約6-12μm直徑)、外分泌細胞(約10μm直徑)、成纖維細胞(約10-15μm直徑)、骨細胞(約10-20μm直徑)、軟骨細胞或肝細胞(約20μm直徑)、杯狀細胞或纖毛細胞(約50μm長和5-10μm寬)、巨噬細胞(約20-80μm直徑)、造血干細胞(約30-40μm直徑)、填充有儲存脂質(zhì)的脂肪細胞(約70-120μm直徑)以及神經(jīng)元(約4-120μm直徑)。在其他實施方案中，所述系統(tǒng)還包括選自由以下組成的組的第二部件：提供負壓的真空泵、被配置來使外殼基部旋轉(zhuǎn)的離心機馬達、隔膜泵、芯片對齊部件、附著到擺臂支撐桿的擺臂、樣品遞送部件、用戶界面顯示器和至少一個廢物容器。

在一些實施方案中，本公開提供分離單細胞的方法，其包括：a)使細胞懸液與細胞分離系統(tǒng)接觸，其中所述細胞分離系統(tǒng)包括：i)聚合物捕獲膜，其包括頂面、底面和延伸穿過所述聚合物捕獲膜的多個單獨通道，其中每個所述單獨通道：A)在所述聚合物捕獲膜的頂面具有頂部開口，B)在所述聚合物捕獲膜的底面具有底部開口，并且C)尺寸經(jīng)設(shè)計，以便來自所述細胞懸液的一個細胞且僅有所述一個細胞：1)在向所述底部開口提供負壓時，在所述單獨通道內(nèi)被捕獲，從而部分地或基本上封閉所述單獨通道；或2)在向所述底部開口提供負壓時，由所述頂部開口捕獲，但未進入所述單獨通道；以及ⅱ)氣動裝置，其提供所述負壓，以及b)用所述細胞分離系統(tǒng)孵育所述細胞懸液，其中所述氣動裝置提供所述負壓，以便所述聚合物捕獲膜中的至少一些所述單獨通道捕獲來自所述細胞懸液的一個細胞，以便所述多個單獨通道中的至少一些具有一個捕獲的細胞；以及c)洗滌所述聚合物捕獲膜以將非捕獲的細胞移除，以便產(chǎn)生捕獲的細胞聚合物膜。

在其他實施方案中，所述方法還包括將所述捕獲的細胞聚合物膜和多阱裝置組合在一起以產(chǎn)生一個組件，其中所述多阱裝置具有多個阱開口，并且其中所述捕獲的細胞聚合物膜的多個單獨通道的頂部開口與所述多阱裝置中的所述多個阱開口一對一匹配并且對齊。在某些實施方案中，所述細胞分離系統(tǒng)還包括：i)多孔層，其包含允許液體但不允許細胞從中穿過的多孔材料，其中所述多孔層的尺寸被設(shè)計成與所述聚合物捕獲膜的底面接觸，以便所述多個單獨通道中的每個的底部開口由所述多孔材料覆蓋；或ii)膜支撐部件，其包括基底，所述基底具有穿過其的多個單獨孔，所述多個單獨孔與所述聚合物捕獲膜中的所述多個單獨通道一對一對齊，其中所述膜支撐部件的尺寸被設(shè)計成與所述聚合物捕獲膜的底面接觸并且支撐所述聚合物捕獲膜的底面。

附圖描述

圖1A示出本發(fā)明的示例性系統(tǒng)或組件，包括具有頂面(12)和多個通道(一個通道用14標記)的聚合物膜(10)。聚合物膜(10)位于多孔層(20)上，多孔層(20)自身位于向通道(14)的底部提供負壓(由向下箭頭示出)的氣動裝置(30)上。示出了在內(nèi)部具有細胞(40)的通道(14)，細胞(40)基本上封閉所述通道。

圖1B示出可替代的示例性實施方案，并且總體上示出與圖1A相同的部件，除了聚合物膜(10)中的通道(14)小于細胞(40)以便所述細胞在聚合物膜(10)的頂面(12)上捕獲之外。

圖2示出具有示例性附著的樣品遞送部件(190)的示例性外殼組件(45)。外殼組件(45)具有外殼基部(60)，外殼基部(60)具有內(nèi)部頂面(120)，內(nèi)部頂面(120)在其中具有兩個導向銷(100)。外殼基部(60)還具有液體儲器(80)、膜支撐凹部(70)和對應(yīng)的墊圈(85)，以及儲器(80)的底部中的真空連接端口(90)。外殼基部(60)還具有將外殼基部(60)連接到外殼頂部(140)的一對連接桿(110)。外殼頂部(140)具有入口端口(150)和出口端口(160)。入口端口(150)與此圖中作為注射器示出的樣品遞送部件(190)連接。外殼頂部(140)具有狹槽陣列(180)和一對連接桿接收器(170)，以連接到連接桿(110)。外殼頂部(140)還具有兩個導向銷接收器(105)。示例性外殼組件(45)還具有位于膜支撐部件(50)上的聚合物捕獲膜(10)。聚合物捕獲膜(10)具有一對膜導向部件(130)，膜導向部件(130)各自具有用于接收導向銷(100)的膜導向銷接收器(135)。膜支撐部件(50)被配置來位于膜支撐凹部(70)中，以便導向銷(100)插入膜導向銷接收器(135)中，從而使聚合物膜中的多個單獨的細胞捕獲通道與膜支撐部件(50)中的多個孔對齊。

圖3A示出具有兩個導向銷(100)、聚合物捕獲膜(10)和膜導向部件(130)的示例性外殼基部(60)。圖3B示出具有外殼基部(60)和外殼頂部(140)的示例性外殼組件(45)。示出了具有入口端口(150)和出口端口(160)的外殼頂部(140)。

圖4示出具有外殼組件(45)和擺臂(210)的示例性細胞捕獲儀(200)，擺臂(210)具有被設(shè)計來與出口端口(160)嚙合的排放端口(220)。所述細胞捕獲儀還具有用戶界面顯示器(240)。

圖5A示出具有擺臂(210)的示例性細胞捕獲儀(200)，擺臂(210)具有擺臂樣品遞送槽和排放端口(220)。示例性細胞捕獲儀(200)還具有真空泵(280)、第一廢物收集容器(270)、隔膜泵(260)和第二廢物收集容器(290)。

圖5B示出具有終止于一對狹槽陣列端板(185)的多個狹槽的狹槽陣列(180)。

圖5C示出具有終止于狹槽陣列端板(185)的多個端板(此圖中示出的72個)的狹槽陣列(180)的特寫透視圖。

圖6A示出在移除外殼頂部(140)、顯示出聚合物捕獲膜(10)的情況下的示例性細胞捕獲儀(200)。

圖6B示出含有膜支撐部件(50)上的聚合物捕獲膜(10)的外殼基部(60)下方的離心機馬達(250)。

圖7A示出向下放置于導向銷(100)上的芯片對齊部件(310)。示出了置于聚合物捕獲膜(10)上的芯片對齊部件(310)之內(nèi)的多阱芯片(320)。

圖7B示出處于外殼基部(60)之上的芯片對齊部件(310)，以及聚合物捕獲膜(10)上方的多阱芯片(320)。

圖8示出圖7B中的布置的側(cè)視圖。具體而言，示出了多阱芯片由通孔芯片(370)和在多阱芯片中形成底部并且產(chǎn)生阱(360)的第一密封膜(340)構(gòu)成。示出了多阱芯片的頂面具有雙面粘合劑膜(350)，雙面粘合劑膜(350)允許多阱芯片附著到聚合物捕獲膜(10)，以便單個捕獲的細胞(40)與多阱芯片的阱(360)對齊。示出的具有捕獲的細胞(40)的聚合物捕獲膜(10)位于具有真空連接端口(90)的外殼基部(60)內(nèi)的膜支撐部件(50)上。

圖9A示出具有在多阱芯片(320)上向下提供力的擺臂(210)的細胞捕獲儀(200)。

圖9B示出通孔芯片(370)的多阱芯片(320)部件，通孔芯片(370)涂覆有第一密封膜(340)以形成所述芯片的底部。在頂部上具有聚合物捕獲膜(10)的膜支撐部件(50)處于多阱芯片(370)下方。示出了位于膜支撐部件(50)下方的第二密封膜(380)。

詳述

本發(fā)明提供用于用聚合物捕獲膜捕獲單細胞的方法、系統(tǒng)、組件和制品。在某些實施方案中，聚合物捕獲膜包括多個具有頂部和底部開口的單獨通道，其中所述通道的尺寸經(jīng)設(shè)計，以便單細胞：i)當向所述底部開口提供負壓時，在所述通道內(nèi)被捕獲，從而部分地或基本上封閉所述通道；或ii)當向所述底部開口提供負壓時，由所述頂部開口捕獲，但未進入所述通道。在一些實施方案中，所述聚合物捕獲膜的通道與多阱芯片的阱對齊，以便細胞或單細胞的內(nèi)容物可轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的阱。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供用于通過聚合物膜上的單獨通道或點捕獲單細胞的方法、系統(tǒng)、組件和制品。在某些實施方案中，聚合物膜具有能夠使用特定尺寸和負壓捕獲單細胞的多個單獨通道(例如，在多阱匹配模式中)。在其他實施方案中，聚合物膜具有能夠捕獲單細胞的多個單獨親水性點(例如，在多阱匹配模式中)。在某些實施方案中，在多阱匹配模式中所述聚合物膜和捕獲的單細胞一起與具有匹配阱開口模式的多阱裝置配對，以便捕獲的細胞可分配于其中，從而允許各阱接收單細胞(例如，然后可將所述單細胞裂解，并且對核酸進行測序)。在某些實施方案中，采用例如附著到(例如，通過雙面PCR相容性粘合劑)多阱裝置并且與多阱裝置對齊的尺寸排阻聚合物膜。在一些實施方案中，多阱通過裝置設(shè)置有細胞尺寸的頂部開口和較大的底部開口(例如，被配置來接收反應(yīng)組分)。在其他實施方案中，多阱裝置通過使PCR相容性膜附著到多阱通孔芯片底部來產(chǎn)生。在另外的實施方案中，本文提供具有細胞尺寸的凹坑或阱(例如，各自含有單細胞)的捕獲芯片，其可與具有多個阱的多阱裝置配對，所述多個阱含有將分離和/或裂解所述單細胞的試劑?？蓪⒉东@芯片和多阱裝置配對，以便所述芯片的凹坑與所述裝置的阱對齊，然后處理，以便試劑從多阱裝置的阱流到所述細胞尺寸的凹坑中的細胞，然后再次處理，以便處理過的細胞流入所述多阱裝置的阱中。

在一些實施方案中，本公開中采用的多阱裝置(例如，以下進一步詳細描述的)可由多阱通孔芯片和PCR相容性膜構(gòu)造。除了延伸穿過基底而形成孔而不是阱的“阱”的開口之外，多阱通孔芯片是例如與本文描述的多阱裝置相同的，并且在本領(lǐng)域中是已知的(例如，納米阱或微阱，具有成百上千個阱)。多阱裝置可通過用PCR相容性膜(例如，PCR密封膜；VWR PCR密封膜；LABNET熱密封膜；BRANDTECH SCIENTIFIC密封膜；AXYGEN SCIENTIFIC PCR-SP密封膜；等)覆蓋多阱通孔芯片一側(cè)上的至少一些或所有的孔來由多阱通孔芯片形成。

在特定實施方案中，本文提供的多阱裝置(例如，包括由上述PCR相容性膜制成的那些多阱裝置)附著到本文描述的尺寸排阻聚合物膜，以形成具有尺寸排阻和多阱裝置特性的裝置。在某些實施方案中，用雙尺寸PCR相容性粘合劑(例如，3M 9965粘合帶)將尺寸排阻聚合物膜附著到多阱裝置的頂部。在某些實施方案中，一旦單細胞由膜捕獲并轉(zhuǎn)移到多阱裝置的阱中，就將裂解緩沖液加入所述阱中(例如，以啟動全基因組擴增或全轉(zhuǎn)錄組擴增測定方案)。

在某些實施方案中，提供了具有多個通孔的多阱通孔芯片，其中每個所述通孔在所述芯片的一側(cè)上具有細胞尺寸的開口(例如，直徑為2-10μm或更大，取決于待捕獲的細胞的尺寸)，并且在另一側(cè)上具有較大反應(yīng)尺寸的開口(例如，直徑為100-800μm或直徑為400-500μm)。在一些實施方案中，芯片的厚度為至少0.5mm(例如，至少0.5..1.0…1.5…2.0mm或更多)。在特定實施方案中，所述芯片(例如，大部分地或完全地)由硅、石英、玻璃或所述材料的組合構(gòu)成。在特定實施方案中，兩種材料粘結(jié)在一起(例如，玻璃和硅)以形成具有通孔的芯片。在示例性實施方案中，玻璃晶片(例如，500um厚)(例如，F(xiàn)ORTRAN玻璃晶片)粘結(jié)到硅晶片(例如，25um厚)以形成粘結(jié)的芯片(例如，所述粘結(jié)的芯片為約525um厚)。然后，在硅側(cè)上對齊并模式化掩模，并且將細胞尺寸的孔(例如，4um)蝕刻到硅中直到下面的玻璃層。然后，在玻璃側(cè)上對準第二掩模，并在玻璃中蝕刻較大反應(yīng)尺寸的孔，從而產(chǎn)生多阱通孔芯片，其中孔在各自末端處的尺寸不同。

本文描述的在每側(cè)具有不同尺寸開口的多阱通孔芯片首先用來在細胞尺寸的開口中捕獲單細胞。通過將PCR相容膜應(yīng)用到芯片來密封細胞大小的開口，從而產(chǎn)生多阱裝置，其中單細胞在形成的阱的底部處捕獲。然后，通過例如通過反應(yīng)尺寸的孔加入裂解和擴增試劑來使用如本文所述的多阱裝置。

在某些實施方案中，本文提供含有各自允許從細胞混合物中捕獲單細胞的多個細胞尺寸的點或凹坑(例如，微型阱)。在一些實施方案中，將細胞尺寸的凹坑蝕刻到基底(例如，由玻璃、硅、石英、或其組合構(gòu)成)中。在特定實施方案中，采用等離子體蝕刻。示例性方案如下。將基板掩模置于已經(jīng)涂覆有光致抗蝕劑(例如，Shipley 1818)的基底上并且暴露以產(chǎn)生凹坑。光掩模由諸如Heidelberg儀器的直接激光寫入器制造。一旦基底具有蝕刻的點/凹坑，就使細胞懸液在蝕刻的芯片上(例如，在流動池中)流動，并且在點/凹坑中捕獲單細胞。然后洗掉過量的細胞，并使捕獲芯片與如本文所述的多阱裝置對齊，以便捕獲芯片上的凹坑與多阱裝置的阱對齊。多阱裝置的阱可預(yù)填充有試劑，諸如裂解和/或擴增試劑。然后將配對裝置離心(或以其他方式攪拌)，以便多阱裝置中的試劑朝向凹坑中的細胞行進并且接觸凹坑中的細胞(例如，裂解細胞或以其他方式將細胞從與凹坑的任何附著中釋放)。然后將配對的裝置離心(或以其他方式在相反方向上攪拌)，以便細胞(或裂解的細胞內(nèi)容物)以相反方式行進到多阱裝置的阱中。然后移除捕獲芯片，并且在生物反應(yīng)(例如，在PCR或類似反應(yīng)中)處理具有各自含有單細胞(或單細胞內(nèi)容物)的阱的多阱裝置。

本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的另一個示例性實施方案如下。本發(fā)明的系統(tǒng)可由疏水性或超疏水性(例如，氟硅烷涂覆的)聚合物膜構(gòu)成，所述聚合物膜跨開放式框架拉伸并且通過激光或類似裝置鉆孔。選擇所產(chǎn)生的通道的直徑和膜的厚度，以便在每個通道中可容納一個單細胞。通道或模式的間距將與多阱裝置(諸如，可用來進行單細胞測定的WAFERGEN的5184SmartChip)上的孔的模式匹配。此聚合物膜由經(jīng)選擇具有小孔的剛性多孔泡沫支撐，所述小孔可為親水性或疏水性，但是將僅允許細胞懸液緩沖液穿過，但阻滯細胞本身。將此多層結(jié)構(gòu)組裝成使用戶能夠引入細胞懸浮液同時在泡沫后面施加負壓源的組件。此整個組件可定位在攪拌器或回轉(zhuǎn)器上，以移動聚合物膜上的細胞懸液，以使單細胞能夠由聚合物膜中的每個通道內(nèi)的負壓捕獲。單細胞不能穿過泡沫，只有懸浮液將穿過?？墒褂酶呔扔媮肀O(jiān)測負壓，以指示聚合物膜中的所有通道何時已被細胞封閉。因為聚合物膜是疏水的或涂覆有超疏水性涂層，諸如氟硅烷，所以懸浮細胞通常將不會自身單獨地或以團塊附著到表面。一旦認為已經(jīng)捕獲細胞，就可用無細胞緩沖液諸如PBS沖洗過量的細胞懸液以移除過量細胞，同時施加一定水平的負壓以阻止捕獲的細胞流走。在移除過量的細胞和細胞懸液緩沖液之后，在膜上將存在捕獲的單細胞，然后將多阱裝置(例如，SmartChip)面朝下放置在膜上，并且將組件置于離心機夾具中以將單細胞分別轉(zhuǎn)移到多阱裝置阱中。多裝置阱可以具有預(yù)加載的細胞緩沖液以保持細胞存活，或者可以用細胞裂解緩沖液預(yù)加載?，F(xiàn)在可以通過用于基因表達或測序的多樣品納米分配器，用各種測定試劑填充多阱裝置。

本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的另一個示例性實施方案如下。具體而言，可以在聚合物的表面上完成分離和捕獲細胞的另一種方法，所述聚合物具有在與多阱裝置(例如，Smartchip)相同的間距上鉆出的通道，但是所述通道的尺寸經(jīng)設(shè)計，以便單細胞可被捕獲但不會通過。細胞的捕獲可以通過在多孔泡沫后面施加的負壓來完成。此方法將不需要具有相同厚度(如上)的聚合物膜，因為細胞將在膜的表面上而不是膜的通道內(nèi)捕獲。這種表面捕獲的方法還將能夠有效地沖走過量的細胞，而捕獲的細胞將通過負壓保持在通道上的適當位置中。

轉(zhuǎn)移捕獲的細胞的另一種方法可以通過以下方式完成：通過將負壓反轉(zhuǎn)至正壓來從聚合物表面或膜中的通道推掉捕獲的細胞，并且使用細胞懸液緩沖液來將來自所述表面或所述通道的細胞沖到多阱裝置(例如，SmartChip)的阱中。

另一種可替代的示例性實施方案如下所述?？梢允褂脤⒆柚辜毎持某杷砻?例如，氟硅烷)來產(chǎn)生替代的分離方法。這種超疏水性表面可以具有聚多巴胺或其他親水性材料的小島，所述聚多巴胺或其他親水性材料的小島將允許細胞粘附到其上。因此，具有約為靶細胞大小的島的超疏水表面可以是流動池的一部分，在所述流動池中懸浮于懸液緩沖液中的目標細胞將在這種表面上流動，并且單細胞將在聚多巴胺或其他親水性材料的“島”上捕獲。島(或“點”)的模式和尺寸可以是這樣的，以便在已從諸如洗掉過量細胞后，多阱裝置諸如Smartchip可以使用簡單的銷對齊方案來面朝下放置，以便每個捕獲的單細胞的島將處于多阱裝置(例如，SMARTCHIP)的一個阱的中心。然后使用離心機，可將每個捕獲的單細胞轉(zhuǎn)移到多阱裝置(例如，SMARTCHIP)的阱中。

希望分離的單細胞的尺寸將決定采用的聚合物上的通道或親水性點的尺寸。聚合物中的通道需要至少略大于期望的細胞，以便在通道中捕獲細胞。如果人們希望在具有通道的聚合物表面上捕獲細胞，那么通道的直徑應(yīng)該至少略小于靶細胞。關(guān)于親水性點，這些點應(yīng)該為約靶細胞的尺寸。大多數(shù)人細胞的尺寸落在2-120微米的尺寸范圍內(nèi)。血小板為約2微米，紅細胞為約3微米x約8微米，嗜中性粒細胞為約8-10微米，淋巴細胞的尺寸為約6-12微米，外分泌細胞為約10微米，成纖維細胞為10-15微米，骨細胞為約10-20微米(包括突起)，軟骨細胞和肝細胞為約20微米，杯狀細胞和纖毛細胞為約50微米長和5-10微米寬，巨噬細胞為約20-80微米，造血干細胞為約30-40微米，并且填充有儲存脂質(zhì)的脂肪細胞的直徑通常為70-120微米(但在非常肥胖的人中可以高達六倍大)。神經(jīng)元的尺寸和形狀變化巨大，它們主體的直徑的范圍為4-120微米，軸突突起的直徑在約0.1-20微米之間變化，并且長度的范圍為幾微米至約1米；肌肉細胞(所有組織細胞中的約30％)的直徑也從10-100微米變化，并且長度可高達約50cm。本發(fā)明不受所采用的或聚合物上的通道和點被設(shè)計來配對的多阱裝置(例如，板或芯片)的類型限制。通常，所述裝置具有多個阱，所述多個阱容納或所述多個阱的尺寸被設(shè)計來容納液體(例如，在阱中捕獲以致于重力不能單獨使液體從阱中流出的液體)。一種示例性芯片為WAFERGEN的5184阱SMARTCHIP。在美國專利8,252,581；7,833,709；以及7,547,556中提供了其他示例性芯片，所有所述專利均以引用方式整體并入本文，包括例如對于芯片、阱、熱循環(huán)條件和其中所用的相關(guān)試劑的教導)。其他示例性芯片包括用于QUANTSTUDIO實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)中的OPENARRAY板。另一種示例性多阱裝置為96阱或384阱板。

多阱裝置的總尺寸可以變化，并且其厚度的范圍可為例如幾微米至幾厘米，并且寬度或長度的范圍可為幾毫米至50厘米。通常，整個裝置的尺寸的寬度和/或長度的范圍為約10mm至約200mm，并且厚度的范圍為約1mm至約10mm。在一些實施方案中，所述芯片為約40mm寬度X 40mm長度X 3mm厚度。

多阱裝置上的阱(例如，納米阱)的總數(shù)可根據(jù)待采用主題芯片的具體應(yīng)用而變化。芯片表面上的阱的密度可根據(jù)具體應(yīng)用而變化。阱的密度以及阱的尺寸和容積可根據(jù)期望的應(yīng)用和例如像待采用本發(fā)明方法的生物體的種類的此類因素而變化。

本發(fā)明不受多阱裝置中阱的數(shù)目限制。大量的阱可并入裝置中。在各種實施方案中，所述裝置上阱的總數(shù)為約100至約200,000，或約5000至約10,000。在其他實施方案中，所述裝置包括較小芯片，每個所述較小芯片均包括約5,000至約20,000個阱。例如，正方形芯片可包括125X 125個直徑為0.1mm的納米阱。

多阱裝置中的阱(例如，納米阱)可以任何實用的尺寸、形狀或體積制造。所述阱的長度為約100μm至約1mm，寬度為約100μm至約1mm，并且深度為約100μm至約1mm。在各種實施方案中，每個納米阱的縱橫比(深度與寬度比)為約1至約4。在一個實施方案中，每個納米阱的縱橫比為約2。橫截面區(qū)域可為圓形、橢圓形、卵形、圓錐形、矩形、三角形、多面或任何其他形狀。阱的任何給定深度處的橫向區(qū)域的尺寸和形狀也可變化。

在某些實施方案中，所述阱的容積為約0.1nl至約1μl。所述納米阱的容積通常小于1μl，優(yōu)選地小于500nl。所述容積可小于200nl，或小于100nl。在一個實施方案中，所述納米阱的容積為約100nl。當需要時，可以制造納米阱以增加表面積與容積比，從而促進通過單元的熱傳遞，這可以減少熱循環(huán)的斜坡時間。每個阱(例如，納米阱)的腔可以采取各種構(gòu)形。例如，阱內(nèi)的腔可以由線性或曲壁分隔以形成分開但是相鄰的隔室，或者由圓形壁分隔以形成內(nèi)部和外部環(huán)形隔室。

如果需要，具有高內(nèi)表面與容積比的阱可以涂覆有材料，以減少其中含有的反應(yīng)物可能與阱的內(nèi)表面相互作用的可能性。如果試劑傾向于不合需要地與內(nèi)表面相互作用或粘附到內(nèi)表面，那么涂層是特別有用的。根據(jù)反應(yīng)物的特性，可以選擇疏水性或親水性涂層。多種適當?shù)耐繉硬牧显诒绢I(lǐng)域中是可用的。一些材料可以共價粘附到表面，其他材料可以通過非共價相互作用附著到表面。涂層材料的非限制性實例包括硅烷化試劑諸如二甲基氯硅烷、二甲基二氯硅烷、六甲基二硅氮烷或三甲基氯硅烷、聚馬來酰亞胺，以及滲硅試劑，諸如氧化硅、AQUASIL和SURFASIL。另外的適合涂層材料為阻滯劑諸如氨基酸，或包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、聚腺苷酸和聚馬來酰亞胺的聚合物。某些涂層材料可以通過加熱、輻射以及通過化學反應(yīng)來交聯(lián)到表面。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道用于涂覆多阱裝置的納米阱的其他適合方法，或者將能夠確定所述方法，而無需過多的實驗。

示例性多阱裝置(例如，芯片)的厚度可為約0.625mm，阱具有長度和寬度為約0.25mm(250um)的尺寸。納米阱深度可為約0.525mm(525um)，在給定阱下方留下約0.1mm的芯片。納米阱開口可以包括任何形狀，諸如圓形、正方形、矩形或任何其他期望的幾何形狀。以舉例的方式，納米阱可包括約100μm與約1mm之間的直徑或?qū)挾?，約150μm與約1mm之間的間距或長度，并且約10μm至約1mm的深度。每個阱的腔可以采取各種構(gòu)形。例如，納米阱內(nèi)的腔可以由線性或曲壁分隔以形成分開但是相鄰的隔室。

可以使用例如公知的光刻技術(shù)來形成多阱裝置的阱(例如，納米阱)?？梢岳缡褂脻馣OH蝕刻技術(shù)、各向異性干蝕刻技術(shù)、機械鉆孔、注塑和/或熱成型(例如，熱壓花)來形成納米阱。

多阱裝置中的液體內(nèi)容納的試劑取決于待與沉積到每個阱中的單細胞一起進行的反應(yīng)。在一個實施方案中，所述阱含有用于進行核酸擴增反應(yīng)的試劑。試劑可為用于免疫測定、包括但不限于核酸擴增的核酸檢測測定的試劑。試劑可以在芯片的單元中處于干燥狀態(tài)或液體狀態(tài)。在一個實施方案中，所述阱含有以下試劑中的至少一種：探針、聚合酶和dNTP。在另一個實施方案中，所述阱含有包含探針、引物和聚合酶的溶液。在各種實施方案中，每個阱包含：(1)引物，所述引物用于所述標準基因組內(nèi)的多核苷酸靶標，以及(2)探針，如果引物與所述靶標結(jié)合，所述探針就與發(fā)出濃度相關(guān)信號的所述引物結(jié)合。在各種實施方案中，每個阱包含：引物，所述引物用于基因組內(nèi)的多核苷酸靶標，以及探針，如果引物與所述靶標結(jié)合，所述探針就與發(fā)出濃度相關(guān)信號的所述引物結(jié)合。在另一個實施方案中，芯片的至少一個阱含有包含正向PCR引物、反向PCR引物和至少一種FAM標記的MGB淬火PCR探針的溶液。在一個實施方案中，將引物對分配到阱中，然后諸如通過冷凍來干燥。然后，用戶可以選擇性地分配(諸如，納米分配)樣品、探針和/或聚合酶。

在本發(fā)明的其他實施方案中，所述阱可含有干燥形式的任何以上溶液。在此實施方案中，可將這種干燥形式涂覆到阱或引導到阱的底部。在分析之前，用戶可以向每個阱中添加水和捕獲的細胞的混合物。在此實施方案中，包含干燥的反應(yīng)混合物的芯片可以用襯墊密封、儲存或運送到另一個位置。

在每個阱中具有單細胞的多阱裝置可用于基因分型、基因表達或通過PCR進行的其他DNA測定。在板中進行的測定不限于DNA測定，諸如TAQMAN、TAQMAN金、SYBR金和SYBR綠，而且還包括其他測定，諸如受體結(jié)合、酶和其他高通量篩選測定。在一些實施方案中，ROX標記的探針用作內(nèi)標。

本公開的另一示例性實施例呈現(xiàn)于以下段落中，描述了使用聚合物捕獲膜捕獲單細胞的外殼組件的初始結(jié)構(gòu)和用途，以及用于處理每個捕獲的單細胞(例如，用于對每個捕獲的單細胞的mRNA進行測序)的多阱芯片的組件。此討論總體上是參考僅作為示例性實施方案提供的圖2-9。

可以通過組合通孔芯片和粘合劑密封膜以形成多阱芯片中的阱的底部來產(chǎn)生多阱芯片?？梢酝ㄟ^在平面的、相對硬的并且相對薄的材料(諸如，金屬(例如，鋁)、硅、陶瓷和相關(guān)材料)中鉆出多個孔來產(chǎn)生通孔芯片。材料的厚度取決于每個阱的期望深度，并且在一些實施例中可在1.0和9.0mm之間(例如，1.0...2.7...3.4...5.0...7mm)?？梢允褂萌魏螖?shù)量的適合技術(shù)，包括在可編程高速精密鉆孔機(例如，由Kern Precision,Inc.制造的Kern HSPC 25鉆孔機)上進行的機械鉆孔，來將孔鉆穿這種材料。例如，可以在可編程高速精密鉆孔機上對金屬基底(例如，鋁)進行機械鉆孔。通常，將3D CAD設(shè)計文件諸如STEP AP214轉(zhuǎn)換為適當?shù)臋C器指令，然后所述機器指令使用正確的直徑鉆子執(zhí)行鉆孔模式和深度。所鉆出的孔的直徑可以根據(jù)期望的最終阱的直徑而變化。在一些實施方案中，材料中鉆出的每個孔的直徑在0.20與2.5mm之間(例如，0.2…0.45…1.5…2.5mm)?？椎臄?shù)目取決于期望阱的數(shù)目。在某些實施方案中，所鉆出的孔的數(shù)目在2與30,000個之間(例如，2…15…50…96…386…1000…3000…5184…15,000…30,000個孔)。在特定實施方案中，將72×72的柵格編程到鉆孔機中以產(chǎn)生具有5184個孔的通孔芯片。在某些實施方案中，然后處理通孔，以便每個通道(其將變成阱)涂覆有疏水性涂層(例如，這種涂層的實例為聚對二甲苯保形涂層)，以使最終阱是生物相容的。最后，向通孔芯片的一側(cè)添加密封膜以形成每個阱的底部(例如，使用低粘性密封膜)。

可以通過以下描述的示例性實施方案來產(chǎn)生含有用于分離單細胞(用于與多阱芯片一起使用)的聚合物捕獲膜和相關(guān)部件的外殼組件。

外殼組件(例如，圖2中所示的外殼組件)內(nèi)的三個部件產(chǎn)生有與多阱芯片的阱對齊的孔。這三個部件包括雙面粘合劑、聚合物捕獲膜和膜支撐板(如果使用膜支撐板代替如圖1所示的多孔層)。在與通孔芯片相同的間距上對可具有兩個釋放層和中間的載體(例如，全部由聚酯制成)的雙面粘合劑(例如，3M 9965壓敏粘合劑)進行鉆孔(例如，激光鉆孔)。鉆出的孔通常比在對應(yīng)的通孔芯片中鉆出的孔小(例如，小5-50％)。在某些實施方案中，所鉆出的孔在0.10mm與4.0mm之間(例如，0.1…0.350…2.0…和4.0mm)。雙面粘合劑的鉆孔可以通過使用具有可編程X-Y工作臺的準分子激光器(例如，由Potomac Photonics制造)來完成。與上述精密鉆子類似，加載3D CAD文件以在與通孔芯片相同的間距上鉆孔。

聚合物捕獲膜中的孔可以與雙面粘合劑相同類型的方式，使用激光鉆，例如使用與通孔間距相同的間距來制成。所產(chǎn)生的孔的直徑是這樣的，以便單細胞將在孔(通道)的頂部附近或內(nèi)部捕獲。所述孔取決于分離的細胞的類型(例如，單細胞/通道)。示例性尺寸范圍為2至35微米(例如，2…4…25…或35微米)。所述膜可為任何類型的適合材料，包括惰性和疏水性聚合物(例如，聚酰亞胺膜，諸如來自DuPont的KAPTON膜、聚酯、聚乙烯、聚氨酯、TEFLON和/或PTFE；還參見Vladkova,T.G.(2010)“Surface engineered polymeric biomaterials with improved biocontact properties.”Int.J.Polym.Sci.,2010,1–22，所述文獻以引用方式整體并入本文，特別是關(guān)于其中論述的聚合物)。在某些實施方案中，所述膜的厚度在10um與50um之間(例如，10…25…35…和50um)。在特定實施方案中，縱橫比(孔的直徑比聚合物的厚度)為約5:1、6:1或7:1。

在某些實施方案中，膜支撐部件中的孔可使用與通孔芯片相同類型的方法、材料和裝置(參見上文)，使用與通孔芯片相同的間距來制成。在某些實施方案中，膜支撐部件中的孔的直徑與通孔芯片的孔的直徑相同或相似(參見上文)。例如，所述膜支撐部件的孔的直徑可在0.20與2.5mm之間(例如，0.2…0.45…1.5…2.5mm)。膜支撐部件可以具有與通孔芯片的厚度相似的厚度，或者可以更薄(例如，約0.9-1.1mm厚的鋁或其他金屬或材料)。

可以使用與聚合物捕獲膜中的孔相同的間距來制造具有多個狹槽(例如，等于聚合物捕獲膜中的通道/孔的行數(shù))的狹槽陣列部件(例如，圖2、5A和5B中的部分180)。在某些實施方案中，基于聚合物捕獲膜的尺寸設(shè)計狹槽陣列部件的尺寸，以便狹槽可將含有細胞的液體遞送到聚合物膜中的孔/通道的頂部。示例性尺寸為400um寬X 200um深。狹槽陣列部件可以通過注射模具制造和蒸汽拋光制造。在某些實施方案中，狹槽陣列由熱塑性聚合物(例如，聚碳酸酯)或其他類型的塑料制成。

示例性外殼組件可以與圖2所示的一些或所有部件一起組裝，并且用來在聚合物捕獲膜上捕獲單細胞。圖2示出具有示例性附著的樣品遞送部件(190)的示例性外殼組件(45)。除了圖2所示的圓形形狀和圖3所示的正方形形狀之外，還可以采用用于外殼組件的其他形狀。外殼組件可由任何適合材料(包括塑料)構(gòu)成。樣品遞送部件(190)在圖2中作為注射器示出，但是可以是可與入口端口(150)配對的其他裝置，諸如移液管或類似裝置。外殼組件(45)具有外殼基部(60)，外殼基部(60)具有內(nèi)部頂面(120)，內(nèi)部頂面(120)在其上具有兩個導向銷(100)。外殼基部(60)還具有液體儲器(80)、膜支撐凹部(70)和對應(yīng)的墊圈(85)，以及儲器(80)的底部中的真空連接端口(90)。外殼基部(60)還具有將外殼基部(60)連接到外殼頂部(140)的一對連接桿(110)。外殼頂部(140)具有入口端口(150)和出口端口(160)。入口端口(150)與此圖中作為注射器示出的樣品遞送部件(190)連接。外殼頂部(140)具有狹槽陣列(180)和一對連接桿接收器(170)，以連接到連接桿(110)。外殼頂部(140)還具有兩個導向銷接收器(105)。示例性外殼組件(45)還具有位于膜支撐部件(50)上的聚合物捕獲膜(10)。聚合物捕獲膜(10)具有一對膜導向部件(130)，膜導向部件(130)各自具有用于接收導向銷(100)的膜導向銷接收器(135)。所述膜導向部件可為來自聚合物捕獲膜的具有孔或其他附著部件的瓣片或其他突出物。膜支撐部件(50)被配置來位于膜支撐凹部(70)中，以便導向銷(100)插入膜導向銷接收器(135)中，從而使聚合物膜中的多個單獨的細胞捕獲通道與膜支撐部件(50)中的多個孔對齊。聚合物捕獲膜置于膜支撐部件之上，以便聚合物捕獲膜中的孔(例如4um)與膜支撐部件的400um孔在中心對齊。在其他實施方案中，使用多孔層(圖1中的部分20)代替膜狀支撐部件。

圖3A示出具有兩個導向銷(100)、聚合物捕獲膜(10)和膜導向部件(130)的示例性外殼基部(60)。在某些實施方案中，導向銷(100)為桿、錐形體或其他有用的形狀。圖3B示出具有外殼基部(60)和外殼頂部(140)的示例性外殼組件(45)。示出了具有入口端口(150)和出口端口(160)的外殼頂部(140)。入口端口(150)的形狀和尺寸被設(shè)計來適應(yīng)所選樣品遞送部件(190)。

圖4示出具有外殼組件(45)和擺臂(210)的示例性細胞捕獲儀(200)，擺臂(210)具有被設(shè)計來與出口端口(160)嚙合的排放端口(220)。所述細胞捕獲儀還具有用戶界面顯示器(240)。通常，用戶將外殼組件置于細胞捕獲儀中，并且啟動儀器中的軟件程序(例如，可操作地連接到控制各種部件的定時和功能的細胞捕獲儀的處理器和各種部件的軟件程序)。

圖5A示出具有擺臂(210)的示例性細胞捕獲儀(200)，擺臂(210)具有擺臂樣品遞送槽和排放端口(220)。示例性細胞捕獲儀(200)還具有真空泵(280)(可操作地連接到真空連接端口90)、第一廢物收集容器(270)(例如，用于從連接端口90接收液體)、隔膜泵(260)(例如，用于使含有細胞的液體在外殼組件中到處移動)以及第二廢物收集容器(290)(例如，充當液體的真空阱)。圖5B示出具有終止于一對狹槽陣列端板(185)的多個狹槽的狹槽陣列(180)。圖5C示出具有終止于狹槽陣列端板(185)的多個端板(此圖中示出的72個狹槽)的狹槽陣列(180)的特寫透視圖。狹槽陣列端板可操作地連接到入口端口(150)(例如，魯厄連接)。在某些實施方案中，狹槽陣列中的每個狹槽被設(shè)計來直接處于聚合物捕獲膜中的孔陣列之上。在某些實施方案中，每個狹槽在兩端處終止于用來補料狹槽或使所述狹槽排放的端板。通常，狹槽的目的是使細胞懸液直接在聚合物捕獲膜中的每行孔上流動，這幫助確保細胞通常不以隨機方式到處流動。因此，在某些實施方案中，由于這種類型的流動控制，細胞懸液可通過使入口和出口端口之間的壓力交替來來回移動(例如，以提高捕獲效率)。

回到圖5A，具有調(diào)節(jié)器的隔膜真空泵(260)通過液阱連接到出口端口(160)。當啟動程序時，擺臂在外殼組件上移動并將其夾下來。將具有緩沖液(例如，3ml的1x PBS)的10ml塑料注射器連接到入口端口。激活真空泵(280)以向外殼組件的底部提供負壓(例如，12”Hg負壓)，以使液體從注射器中向下移動，并且預(yù)濕聚合物捕獲膜中的捕獲孔。然后，真空停止，并將另一個填充有細胞懸液(例如，2x 10⁵個細胞)的10ml注射器連接到入口端口。連接到出口端口(160)的隔膜泵(260)在細胞懸液緩慢地注入入口端口(150)中時激活。使用在出口端口側(cè)的隔膜泵(例如，使用設(shè)定為4”Hg的真空)來將細胞牽拉穿過外殼組件(由慢陣列(180)引導)。隔膜泵停止，而真空泵(280)維持真空(例如，在4”hg處)，以通過聚合物捕獲膜捕獲細胞。此時，聚合物捕獲膜中的至少一些單獨通道/孔具有在通道/孔中的或在其頂上捕獲的單細胞(例如，參見圖1)。在約3-10分鐘(例如，約5分鐘)之后，移除注射器，然后將具有緩沖液(例如，10ml 1x PBS)的注射器引入入口端口中并且牽拉穿過用于初始清洗的組件。

圖6A示出在移除外殼頂部(140)、顯示出聚合物捕獲膜(10)的情況下的示例性細胞捕獲儀(200)。圖6B示出含有膜支撐部件(50)上的聚合物捕獲膜(10)的外殼基部(60)下方的離心機馬達(250)。接著，隨著捕獲循環(huán)完成，用于聚合物捕獲膜的真空仍然開啟(例如，在4”hg處)，擺臂向上移動并處于上方以允許接近外殼組件。然后移除外殼頂部(140)。

此時，使用圖6所示的離心機馬達(250)來離心外殼基部(具有聚合物捕獲膜)以移除任何過量的洗滌緩沖液?？梢詫⒕彌_液噴在膜上以完成過量細胞的清洗。離心還允許在聚合物捕獲膜上產(chǎn)生干燥表面，以具有用于將多阱芯片粘結(jié)到聚合物捕獲膜的干燥表面。

接著，使用如圖7A和7B所示的芯片對齊部件上的芯片對齊導向銷接收器(330)來將芯片對齊部件(310)置于聚合物捕獲膜之上。具有附著雙面粘合劑膜(350)(具有其中形成的孔)的多阱芯片(320)置于聚合物捕獲膜(10)上的芯片對齊部件(310)之內(nèi)。雙面粘合劑將多阱芯片粘結(jié)到聚合物捕獲膜，并將每個阱與其相鄰阱密封。圖8示出圖7中的布置的側(cè)視圖。具體而言，示出了多阱芯片由通孔芯片(370)和在多阱芯片中形成底部并且產(chǎn)生阱(360)的第一密封膜(340)構(gòu)成。示出了多阱芯片的頂面具有雙面粘合劑膜(350)，雙面粘合劑膜(350)允許多阱芯片附著到聚合物捕獲膜(10)，以便單個捕獲的細胞(40)與多阱芯片的阱(360)對齊。示出的具有捕獲的細胞(40)的聚合物捕獲膜(10)位于具有真空連接端口(90)的外殼基部(60)內(nèi)的膜支撐部件(50)上。

接著，如圖9A所示，擺臂(210)在上方并向下移動以向多阱芯片施加壓力，以便用聚合物捕獲膜密封所述多阱芯片。然后搖臂向上移動并處于上方以允許移除多阱芯片/聚合物捕獲膜組件。然后將此組件倒置，并將聚合物捕獲膜的底部吸干，并且用第二密封膜(380)(例如，PCR密封膜)密封。在某些實施方案中，向此密封組件中添加低滲緩沖液，并且將組件在–80C下冷凍30分鐘或過夜。此組件可以在室溫下解凍并用于任何類型的單細胞分析。冷凍和解凍程序(例如，在低滲溶液中)使細胞裂開，并且允許細胞裂解物處于多阱芯片的阱中的溶液中。然后將頂面上的聚合物膜(例如，臨時密封膜)剝離，并且可以將芯片用于任何類型的生物分析。在其他實施方案中，將捕獲的單細胞從聚合物膜中釋放和/或用變性劑諸如胍和尿素或用酶組合物來裂解。

作為處理的結(jié)果，現(xiàn)在多阱芯片的一些、大部分或所有阱具有來自溶液中的單細胞的細胞裂解物。可將用于任何適合類型的測定的試劑添加到多阱芯片的阱中(例如，使用多阱分配器，諸如來自WAFERGEN BIOSYSTEMS的多阱分配器)。在某些實施方案中，向阱中添加蛋白質(zhì)檢測測定組分(例如，基于抗體的測定)。在其他實施方案中，向阱中添加SNP檢測測定組分。在其他實施方案中，向阱中添加核酸測序測定組分。在某些實施方案中，采用了采用用于標記單獨mRNA分子和/或用于標記細胞/阱來源(例如，如果在測序分析之前合并阱)和/或用于標記特定多阱芯片(例如，如果在測序之前合并來自兩個或更多個多阱芯片的阱)的條形編碼的核酸序列測定組分。所述條形編碼方法和試劑的實例見于專利公布US2007/0020640、專利公布2012/0010091、美國專利8,835,358、美國專利8,481,292、Qiu等(Plant.Physiol.,133,475-481,2003)、Parameswaran等(Nucleic Acids Res.2007年10月；35(19):e130)、Craig等參考(Nat.Methods,2008年10月,5(10):887-893)、Bontoux等(Lab Chip,2008,8:443-450)、Esumi等(Neuro.Res.,2008,60:439-451)、Hug等,J.Theor.,Biol.,2003,221:615-624)、Sutcliffe等(PNAS,97(5):1976-1981；2000)、Hollas和Schuler(Lecture Notes in Computer Science Volume 2812,2003,第55-62頁)以及WO201420127；所有所述文獻均以引用方式整體并入本文，包括與核酸的條形編碼和測序有關(guān)的反應(yīng)條件和試劑。

在某些實施方案中，采用了WO2014201272(“SCRB-seq”方法)的條形編碼標記和測序方法。將用于SCRB-seq方法的必需試劑(例如，根據(jù)需要修改為小體積)添加到各自含有裂解的單細胞的多芯片阱中。簡言之，SCRB-seq方法擴增來自多阱板(如上所述)中的單細胞的初始mRNA樣品，在所述多阱板中每個阱具有單細胞。初始cDNA合成使用具有以下特征的第一引物：i)用于細胞/阱鑒定的N6，ii)用于特定分子鑒定的N10，iii)結(jié)合mRNA的多聚T延伸，以及iv)產(chǎn)生其中第二模板轉(zhuǎn)換引物將雜交的區(qū)的區(qū)。第二引物是具有多聚G 3’端和具有異堿基(iso-base)的5’端的模板轉(zhuǎn)換引物。cDNA擴增后，將標記的cDNA單細胞/阱樣品合并。然后，用兩種不同的引物進行全長cDNA合成，并且純化全長cDNA。接著，使用i7引物(添加12個i7標簽中的一個以鑒定特定的多阱板)和添加用于NEXTERA測序(將P7標簽添加到NEXTERA的另一端)的P5標簽的P5NEXTPT5來制備NEXTERA測序文庫。在凝膠上純化文庫，然后進行NEXTERA測序。作為非限制性實例，使用十二個i7板標簽和384個細胞/阱的特異性條形便碼，這允許一次完成總共4,608個單細胞轉(zhuǎn)錄組。此方法允許定量單細胞中的mRNA轉(zhuǎn)錄物，并且允許用戶對轉(zhuǎn)錄物分子/細胞的絕對數(shù)進行計數(shù)以從歸一化中去除任何變量。

本申請中提及的所有出版物和專利均以引用方式并入本文。本發(fā)明的描述的方法和組合物的各種修改和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見，而不背離本發(fā)明的范圍和精神。雖然已結(jié)合具體優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解的是，要求保護的本發(fā)明不應(yīng)不適當?shù)鼐窒抻谒鼍唧w實施方案。事實上，對于相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的用于進行本發(fā)明的描述的模式的各種修改旨在處于以下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。