本發(fā)明涉及土壤中硝態(tài)氮的測定，具體的說是一種改進土壤硝態(tài)氮的測定方法。

背景技術：

土壤中無機氮可分為水溶態(tài)、交換態(tài)及固定態(tài)等。測定土壤中的銨態(tài)、硝態(tài)及亞硝態(tài)氮素，通常是測定水溶態(tài)及交換態(tài)兩者總量。交換態(tài)為可被中性鹽溶液交換提取的部分(中性鹽溶液為氯化鉀或氯化鈉)。中性鹽溶液與土壤混合、震蕩，將土壤吸附的銨態(tài)氮交換浸出，其中也包含水溶態(tài)。此提取物經(jīng)過濾，濾液再進行各種形態(tài)氮的測定。常用的測定銨態(tài)氮方法有蒸餾法和靛酚藍比色法，然而測定硝態(tài)氮的方法卻有很多，包括蒸餾法，酚二磺酸法，鎘還原法和雙波長紫外分光光度法(文獻1：魯如坤，土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法，北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2000：156-165)。

需要說明的是亞硝態(tài)氮也屬于交換態(tài)氮，在作物生長過程中，作為有效氮肥為作物提供養(yǎng)分，即使其含量及低，不足硝態(tài)氮的5％。上述測定土壤硝態(tài)氮的方法中測定的值均可含有亞硝態(tài)氮。在這里我們所涉及的是測定土壤硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮總和的方法。

常用的測定硝態(tài)氮方法有以下缺點：蒸餾法需要特定裝置，能源消耗大，且定氮合金很難磨細過100目篩；酚二磺酸法操作步驟過于繁瑣、土壤浸提液水分蒸發(fā)時間長、費能源且多種物質(zhì)存在干擾；鎘柱還原法雖然干擾少、精度高，但操作繁瑣且鎘是高毒性的重金屬，易污染環(huán)境；雙波長紫外分光光度法中測定波長沒有統(tǒng)一標準(文獻2：涂常青，溫欣榮，雙波長紫外分光光度法測定土壤硝態(tài)氮，土壤肥料，2006(1)：50-51)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單，不添加任何試劑，重復性好，重現(xiàn)性高的測定土壤硝態(tài)氮的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：

一種測定土壤硝態(tài)氮的方法，

1)以2mol/L KCl為溶劑配制濃度為0.1–20mg N/L范圍內(nèi)的6個以上不同濃度的硝態(tài)氮溶液，分別用紫外-可見分光光度計在220nm和275nm波長處測定各個所配制溶液吸光度A₂₂₀和A₂₇₅；用A₂₂₀–2×A₂₇₅的計算方法求得吸光度，以硝態(tài)氮濃度為橫坐標，計算的吸光度值為縱坐標制作標準曲線；

2)土壤浸提液制備：將土壤樣品用4倍重量體積(g/ml)的2mol/L KCl溶液振蕩浸提1h以上，過濾，得浸提液；

3)將浸提液直接置于紫外-可見分光光度計中測定220nm和270nm吸光度值，用A₂₂₀–2×A₂₇₅的計算方法求得吸光度，通過求得的吸光度于步驟1)制作的標準曲線中查詢獲得浸提液中硝態(tài)氮濃度；

4)將紫外分光光度法法測定值校正成為蒸餾法測定值，公式為y＝1.021x-0.223，其中x為紫外分光光度法的土壤硝態(tài)氮濃度測定值，y為蒸餾法的土壤硝態(tài)氮濃度測定值。

所述步驟1)配制硝態(tài)氮溶液的具體過程為：以2mol/L KCl為溶劑配制濃度為0.1–20mg N/L范圍內(nèi)的6個以上不同濃度的硝態(tài)氮溶液，其中包括0.1mg N/L和20mg N/L二個端值濃度的硝態(tài)氮溶液，以及大于0.1mg N/L至小于20mg N/L的4個以上不同濃度的硝態(tài)氮溶液。

所述步驟1)配制硝態(tài)氮溶液的具體過程為：以2mol/L KCl為溶劑配制濃度為0.1–15mg N/L范圍內(nèi)的6個以上不同濃度的硝態(tài)氮溶液，其中包括0.1mg N/L和15mg N/L二個端值濃度的硝態(tài)氮溶液，以及大于0.1mg N/L至小于15mg N/L的4個以上不同濃度的硝態(tài)氮溶液。

所述步驟1)的具體過程為：分別吸取濃度為100mg N/L的硝態(tài)氮溶液0.05、0.25、0.5、2.5、5.0、7.5mL于50mL容量瓶中，加入2mol/L KCl至50mL刻度線，搖勻，用紫外-可見分光光度計在220nm和275nm波長處測定吸光度；用A₂₂₀–2×A₂₇₅的計算方法求得吸光度，以硝態(tài)氮濃度為橫坐標，計算的吸光度值為縱坐標制作標準曲線，標準曲線線性范圍為0.1–15mg N/L，標準曲線一般為多項式方程。

所述配制硝態(tài)氮溶液采用的溶質(zhì)為硝酸鉀。

具體過程可為：一種測定土壤硝態(tài)氮的方法，

1)制作標準曲線：吸取100mg N/L硝態(tài)氮溶液(2mol/L KCl配制)0.05，0.25，0.5，2.5，5.0，7.5mL于50mL容量瓶中，加入2mol/L KCl定容，搖勻，用紫外-可見分光光度計在220nm和275nm波長測定吸光度，用A₂₂₀–2×A₂₇₅的計算方法求得吸光度，以硝態(tài)氮濃度為橫坐標，計算的吸光度值為縱坐標制作標準曲線；

2)土壤浸提液制備：將土壤樣品用4倍重量體積(g/ml)的2mol/L KCl溶液振蕩浸提1h，過濾，得浸提液；

3)將浸提液直接置于紫外-可見分光光度計中測定220nm和270nm吸光度值，用A₂₂₀–2×A₂₇₅的計算方法求得吸光度，查詢標準曲線計算浸提液中硝態(tài)氮濃度；

4)將紫外分光光度法法測定值校正成為蒸餾法測定值，公式為y＝1.021x-0.223(R²＝0.9722，n＝20)，其中x為紫外分光光度法法測定值，y為蒸餾法測定值。

使用該方法測定土壤中硝態(tài)氮含量，有如下優(yōu)點：

1.該方法操作簡便，步驟少，不用添加任何試劑，直接進行浸提液的紫外吸收測定，人為誤差小。

2.該方法省事。原有的蒸餾法或者比色法一天測定硝態(tài)氮不超過100個，相同時間內(nèi)可用該方法測定1000個，效率提高9倍。

3.使用該方法測定的土壤硝態(tài)氮濃度與蒸餾法測定值相關性極好(R²＝0.9722，n＝20)，因此可以將測定值校正后與蒸餾法測定銨態(tài)氮相結合，建立一套完整、高效、準確的土壤有效態(tài)無機氮測定方法體系。

本發(fā)明方法重復性好，重現(xiàn)性高，簡單易行。

附圖說明

圖1硝態(tài)氮測定標準曲線-1；

圖2硝態(tài)氮測定標準曲線-2；

圖3蒸餾法和紫外分光光度法測定土壤硝態(tài)氮結果比對；

圖4驗證蒸餾法和紫外分光光度法測定硝態(tài)氮的相關性。

具體實施方式

實施例1

建立紫外分光光度法測定硝態(tài)氮標準曲線

由于土壤浸提液中硝態(tài)氮濃度是不經(jīng)任何操作直接測定，因此硝態(tài)氮濃度應 全部落在標準曲線線性范圍中，否則測定結果不準確。經(jīng)計算，當土壤溶液中硝態(tài)氮濃度為15mg N/L時，土壤硝態(tài)氮含量約為66kg/mg，相當于氮肥施用量158kg N/ha(0-20cm土壤容重為1.2g/cm³)，因此標準曲線中硝態(tài)氮最大濃度設置為15m N g/L(如果需要，也可以設置為20mg N/L)，完全可以滿足實驗需要。

經(jīng)測定，紫外分光光度法測定硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮都在220nm處出現(xiàn)較強的吸收峰，因此該方法的測定結果包含了亞硝態(tài)氮含量，這與蒸餾法測定的硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮總和相匹配，成為將該法與蒸餾法相互驗證的實驗基礎。另外，土壤亞硝態(tài)氮是土壤硝化作用的中間過程，含量極低，在測定過程中通常忽略不計，因此標準曲線溶液不加入標準亞硝態(tài)氮，其吸光度對照硝態(tài)氮計算。

具體過程如下：

1)配制硝態(tài)氮儲備液：準確稱取7.216g烘干硝酸鉀，加入2mol/L KCl溶解，定容至1L容量瓶中，此溶液含有硝態(tài)氮1000mg/L。將此儲備液按10倍數(shù)稀釋，2mol/L KCl定容，得到濃度為100mg N/L的溶液；

2)制作標準曲線：吸取上述硝態(tài)氮溶液0.05，0.25，0.5，2.5，5.0，7.5mL于50mL容量瓶中，加入2mol/L KCl至刻度線，搖勻，用紫外-可見分光光度計在220nm和275nm波長處測定吸光度。用A₂₂₀–2×A₂₇₅的計算方法求得吸光度，以硝態(tài)氮濃度為橫坐標，計算的吸光度值為縱坐標制作標準曲線。結果如圖1所示，標準曲線符合多項式方程，R²＝0.998(n＝7)。

實施例2

紫外分光光度法與蒸餾法測定硝態(tài)氮濃度比對

具體實施過程：

1)土壤浸提液制備：將土壤樣品(共n＝44個土壤樣品)分別用4倍重量體積(g/ml)的2mol/L KCl溶液振蕩浸提1h，過濾，得浸提液。此浸提樣品分成兩部分，一部分(共n＝20個土壤樣品)用來確定兩種方法測定硝態(tài)氮濃度的相關性，剩余樣品(共n＝24個土壤樣品)用于驗證該相關性的準確性；

2)制作標準曲線：吸取濃度為100mg N/L的硝態(tài)氮溶液0.05，0.25，0.5，2.5，5.0，7.5mL于50mL容量瓶中，加入2mol/L KCl至刻度線，搖勻，用紫外-可見分光光度計在220nm和275nm波長處測定吸光度。用A₂₂₀–2×A₂₇₅的計算方法求得吸光度，以硝態(tài)氮濃度為橫坐標，計算的吸光度值為縱坐標制作標準曲線(圖2)；標準曲線一般為多項式方程；

3)紫外分光光度法測定浸提液中硝態(tài)氮濃度：將步驟1)中浸提液(共n＝20個土壤樣品)分別直接置于紫外-可見分光光度計中測定220nm和270nm吸光度值A₂₂₀和A₂₇₅，用A₂₂₀–2×A₂₇₅的計算方法求得吸光度，查詢上述標準曲線計算浸提液中硝態(tài)氮濃度；

4)蒸餾法測定浸提液中硝態(tài)氮濃度：分別取上述測定步驟3)同樣的浸提液(共n＝20個土壤樣品)50mL于蒸餾瓶中，同時于一蒸餾瓶中做空白組(內(nèi)裝有50mL 2mol/L KCl溶液)進行對照，分別加入1g氧化鎂，置于蒸餾裝置中，立即分別向浸提液和空白組中通入水蒸汽進行加熱蒸餾，至冷凝管下端接收餾出液的三角瓶中餾出液體積達100mL時，終止蒸餾，移去接收餾出液的三角瓶，此步驟目的為去除銨態(tài)氮。將接收餾出液的三角瓶換成一個盛有15mL重量濃度為2％的硼酸加一滴(0.05mL)混合指示劑(0.066g甲基紅和0.099g溴甲酚綠用體積濃度95％乙醇定容至100ml)的接收瓶于冷凝管下端，繼續(xù)分別向蒸餾瓶中加入0.2g定氮合金(合金組成：Cu 50％，Al 45％，Zn 5％)，繼續(xù)分別向蒸餾 瓶中通入水蒸汽進行蒸餾，至接收瓶中的餾出液體積達100mL時，終止蒸餾，移去接收瓶。用0.003mol·L^-1硫酸標準溶液進行滴定，當溶液由灰色中顯現(xiàn)紅色時即為滴定終點。根據(jù)樣品消耗的硫酸量計算硝態(tài)氮含量(文獻1：魯如坤，土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法，北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2000：156-165)；

測定結果見圖3，隨機選取的土壤浸提液硝態(tài)氮濃度變異較大，范圍從0.1-3.7mg/L，代表性強。兩種方法的相關系數(shù)R＝0.986，說明兩種方法的相關性較好，可以用紫外分光光度法取代繁瑣的蒸餾法，用于測定土壤硝態(tài)氮含量。

5)取剩下的24個土壤浸提液，按照上述3)-4)步驟所述，使用兩種方法對其硝態(tài)氮濃度進行測定，并將紫外分光光度法測定結果按照公式y(tǒng)＝1.021x-0.223校正，所得結果與蒸餾法測定結果進行比對，結果如圖4所示。結果表明兩種方法相關性極好，特別是濃度很低的樣品，測定結果依然很吻合，說明操作簡單的紫外分光光度法完全可以取代操作繁瑣的蒸餾法，成為測定土壤硝態(tài)氮的重要方法。