抗CXCR1組合物和方法本申請是國際申請日為2009年11月11日、國際申請?zhí)枮镻CT/US2009/064041、進(jìn)入國家階段的申請?zhí)枮?00980153571.6、發(fā)明名稱為“抗CXCR1組合物和方法”的PCT申請的分案申請。相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2008年11月11日提交的美國臨時專利申請No.61/113,458的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容全文在此以引用的方式并入。關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明本發(fā)明的進(jìn)行根據(jù)NIH所授予的撥款號CA66233、CA101860和5P30CA46592得到政府的支持。政府具有本發(fā)明中的某些權(quán)利。技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，其通過單獨(dú)施用或與其它化療劑聯(lián)合施用IL8-CXCR1途徑抑制劑(例如，抗CXCR1抗體或Repertaxin)，從而殺死受試者的非致腫瘤性和致腫瘤性癌細(xì)胞來進(jìn)行。本發(fā)明還提供了用于檢測患者的實(shí)體瘤干細(xì)胞的存在和分離患者的實(shí)體瘤干細(xì)胞的組合物和方法(例如，基于CXCR1或FBXO21的存在)。

背景技術(shù)：
癌癥仍然是本國死亡率的第二原因，導(dǎo)致每年超過500,000例死亡。盡管在癌癥檢測和治療上有進(jìn)展，但癌癥死亡率仍然較高。盡管在了解癌癥的分子基礎(chǔ)上有顯著的進(jìn)步，但此知識尚未轉(zhuǎn)化為有效的治療策略。特別地，乳腺癌是美國女性中最常見的癌癥，九名女性中約有1名在其一生中患有乳腺癌。不幸的是，轉(zhuǎn)移性乳腺癌仍然是不治之癥。大多數(shù)患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的女性死于該疾病。傳統(tǒng)的治療方法(放射療法、化學(xué)療法和激素療法)雖然有用，但是已經(jīng)受到抗治療性癌細(xì)胞出現(xiàn)的限制。顯然，通常需要新的方法來鑒別用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌和癌癥的靶物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，其通過單獨(dú)施用或與其它化療劑聯(lián)合施用IL8-CXCR1途徑抑制劑(例如抗CXCR1抗體或Repertaxin)，從而殺死受試者的非致腫瘤性和致腫瘤性癌細(xì)胞來進(jìn)行。本發(fā)明還提供了用于治療患者的實(shí)體瘤干細(xì)胞和診斷患者的實(shí)體瘤干細(xì)胞的存在的組合物和方法(例如，基于CXCR1或FBXO21的存在)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，其包括：對受試者施用IL8-CXCR1途徑拮抗劑和其它化療劑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了減少或消除受試者的癌癥干細(xì)胞和非致腫瘤性癌細(xì)胞的方法，包括：在某些條件下對受試者施用Repertaxin或其衍生物，從而殺死至少部分癌癥干細(xì)胞和至少部分非致腫瘤性癌細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了減少或消除受試者的癌癥干細(xì)胞和非致腫瘤性癌細(xì)胞的方法，其包括：在某些條件下對受試者施用IL8-CXCR1途徑拮抗劑和其它化療劑，從而殺死至少一部分癌癥干細(xì)胞和至少一部分非致腫瘤性癌細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含IL8-CXCR1途徑拮抗劑和其它化療劑的組合物或試劑盒。在某些實(shí)施方案中，IL8-CXCR1途徑拮抗劑包含特異地阻斷IL8與CXCR1結(jié)合的藥劑。在一些實(shí)施方案中，所述藥劑結(jié)合CXCR1(對CXCR1特異的)，但是不結(jié)合CXCR2。在其它實(shí)施方案中，所述藥劑結(jié)合CXCR1。在具體的實(shí)施方案中，所述藥劑包含抗CXCR1抗體或抗體片段。在其它實(shí)施方案中，所述藥劑包含Repertaxin或其衍生物。在其它實(shí)施方案中，其它化療劑包含抗有絲分裂化合物。在某些實(shí)施方案中，抗有絲分裂化合物選自多西他賽(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、紫杉醇(paclitaxel)、氟尿嘧啶、長春新堿、長春堿、諾考達(dá)唑、秋水仙堿、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、斯的甘辛(steganacin)和考布他汀(combretastatin)。在其它實(shí)施方案中，抗有絲分裂化合物是長春花屬生物堿(例如，長春新堿和長春堿)；或苯并咪唑氨基甲酸酯類，諸如諾考達(dá)唑；或秋水仙堿或相關(guān)化合物，諸如鬼臼毒素、斯的甘辛或考布他?。换蜃仙纪?taxane)，諸如紫杉醇和多西他賽。在某些實(shí)施方案中，其它化療劑包含多西他賽。在具體的實(shí)施方案中，受試者患有一類癌癥，在用化療劑治療時，患者的IL-8生成水平升高(例如，這引起運(yùn)動性的癌癥干細(xì)胞數(shù)目增加)。在一些實(shí)施方案中，受試者患有選自以下疾病的一類癌癥：前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌和食管腺癌。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測實(shí)體瘤干細(xì)胞的方法，其包括：a)提供：i)自受試者的腫瘤采集的樣本，和ii)對CXCR1蛋白或FBXO21蛋白(或表1的其它蛋白質(zhì))特異的抗體或抗體片段(或其它結(jié)合分子)；以及b)在某些條件下使組織樣本與抗體或抗體片段接觸，從而檢測CXCR1+或FBXO21+實(shí)體瘤干細(xì)胞的存在與否。在具體的實(shí)施方案中，抗體或抗體片段與信號分子綴合。在其它實(shí)施方案中，信號分子包含熒光分子。在其它實(shí)施方案中，信號分子包含在存在比色底物的情況下能夠催化生色反應(yīng)的酶。在某些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使樣本與對抗體或抗體片段特異的二抗或二抗片段接觸。在其它實(shí)施方案中，二抗或二抗片段包含信號分子。在具體的實(shí)施方案中，沒有測定其它蛋白質(zhì)或核酸以確定所述CXCR1或FBXO21+實(shí)體瘤干細(xì)胞的存在與否。在其它實(shí)施方案中，腫瘤選自前列腺癌腫瘤、卵巢癌腫瘤、乳腺癌腫瘤、黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌腫瘤、小細(xì)胞肺癌腫瘤和食管腺癌腫瘤。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了富集實(shí)體瘤干細(xì)胞群的方法，其包括：a)解離實(shí)體瘤以產(chǎn)生解離的細(xì)胞；b)使解離的細(xì)胞與結(jié)合CXCR1或FBXO21(或表1的其它蛋白質(zhì))的藥劑接觸；以及c)在某些條件下選擇結(jié)合藥劑的細(xì)胞，從而產(chǎn)生實(shí)體瘤干細(xì)胞的富集群。在某些實(shí)施方案中，沒有采用其它藥劑來產(chǎn)生實(shí)體瘤干細(xì)胞富集群。在一些實(shí)施方案中，腫瘤選自前列腺癌腫瘤、卵巢癌腫瘤、乳腺癌腫瘤、黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌腫瘤、小細(xì)胞肺癌腫瘤和食管腺癌腫瘤。在其它實(shí)施方案中，藥劑是抗體或抗體片段(例如，F(xiàn)ab片段)。在其它實(shí)施方案中，藥劑與熒光染料或磁性顆粒綴合。在其它實(shí)施方案中，選擇細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)、熒光激活細(xì)胞分選、淘洗、親和柱分離或磁性選擇來進(jìn)行。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過本文中所描述的方法分離的實(shí)體瘤干細(xì)胞的富集群。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了癌癥干細(xì)胞的分離群，所述癌癥干細(xì)胞是：a)致腫瘤性的；且b)CXCR1+或FBXO21+。在某些實(shí)施方案中，癌癥干細(xì)胞是選自以下細(xì)胞的癌癥干細(xì)胞：前列腺癌干細(xì)胞、卵巢癌干細(xì)胞、乳腺癌干細(xì)胞、皮膚癌干細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞、小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞和食管腺癌干細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群包含至少60％癌癥干細(xì)胞和小于40％非致腫瘤性腫瘤細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，與未分級的非致腫瘤性腫瘤細(xì)胞相比，所述癌癥干細(xì)胞富集至少兩倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍，...10倍，...100倍，...1000倍)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于自腫瘤獲得包含癌癥干細(xì)胞和非致腫瘤性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞組合物的方法，其中至少60％是致腫瘤性干細(xì)胞，且40％或更少是非致腫瘤性腫瘤細(xì)胞，該方法包括：a)自腫瘤獲得腫瘤細(xì)胞的解離混合物；b)將腫瘤細(xì)胞的混合物分離成包含至少60％的癌癥干細(xì)胞和40％或更少的非致腫瘤性腫瘤細(xì)胞的第一組分和缺乏癌癥干細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞第二組分，其中通過使混合物與針對CXCR1或FBXO21的藥劑接觸進(jìn)行所述分離；以及c)通過i)連續(xù)注射到第一宿主動物來證明第一組分是致腫瘤性的，并通過連續(xù)注射到第二宿主動物來證明第二組分是非致腫瘤性的。在某些實(shí)施方案中，通過流式細(xì)胞術(shù)、熒光激活細(xì)胞分選(FACS)、淘洗、親和層析或磁性選擇來進(jìn)行分離。在一些實(shí)施方案中，通過熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)分析來進(jìn)行分離。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于為實(shí)體瘤患者選擇治療的方法，包括：(a)自患者獲得樣本；(b)確定樣本中CXCR1+或FBXO21+實(shí)體瘤干細(xì)胞的存在；以及(c)為患者選擇靶向CXCR1+或FBXO21+實(shí)體瘤干細(xì)胞的治療(例如，選擇使用抗CXCR1抗體或抗體片段)。在某些實(shí)施方案中，CXCR1+或FBXO21+實(shí)體瘤干細(xì)胞是選自以下細(xì)胞的癌癥干細(xì)胞：前列腺癌干細(xì)胞、卵巢癌干細(xì)胞、乳腺癌干細(xì)胞、皮膚癌干細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞、小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞和食管腺癌干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于篩選化合物的方法，其包括：a)將包含CXCR1+或FBXO21+癌癥干細(xì)胞的樣本暴露于候選抗腫瘤化合物，其中所述候選抗腫瘤化合物包含CXCR1或FBXO21拮抗劑或IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑；以及b)檢測響應(yīng)化合物的細(xì)胞中的變化。在某些實(shí)施方案中，樣本包含非黏附乳腺球(mammosphere)。在其它實(shí)施方案中，CXCR1或FBXO21拮抗劑或IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑包含抗體或抗體片段。在一些實(shí)施方案中，CXCR1拮抗劑是Repartaxin的衍生物。在其它實(shí)施方案中，所述檢測包括檢測致腫瘤性乳腺細(xì)胞的細(xì)胞死亡。在其它實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括將候選抗腫瘤劑鑒別為能夠殺死致腫瘤性細(xì)胞及非致腫瘤性癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測定測試化合物抑制實(shí)體瘤干細(xì)胞的腫瘤發(fā)生的能力的方法，其包括：a)獲得富集的實(shí)體瘤干細(xì)胞，其中所述實(shí)體瘤干細(xì)胞：i)與未分級的腫瘤細(xì)胞相比富集至少兩倍；以及ii)表達(dá)CXCR1或FBXO21；b)將第一組，而非第二組實(shí)體瘤干細(xì)胞暴露于測試化合物；c)將第一組實(shí)體瘤干細(xì)胞注射到第一宿主動物中，并將第二組實(shí)體瘤干細(xì)胞注射到第二宿主動物中；以及d)比較第一動物中的腫瘤(若存在的話)與第二動物中形成的腫瘤，以確定測試化合物是否抑制腫瘤形成。在具體的實(shí)施方案中，測試化合物是CXCR1或FBXO21抑制劑，或IL8-CXCR1抑制劑途徑抑制劑。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測定測試化合物抑制實(shí)體瘤干細(xì)胞的腫瘤發(fā)生的能力的方法，其包括：a)獲得包含至少60％實(shí)體瘤干細(xì)胞的樣本，其中所述實(shí)體瘤干細(xì)胞表達(dá)CXCR1或FBXO21；b)將實(shí)體瘤干細(xì)胞注射到第一和第二宿主動物中；c)用測試化合物治療第一宿主動物，而不用測試化合物治療第二宿主動物；以及d)比較第一動物中的腫瘤(若存在的話)與第二動物中形成的腫瘤，以確定測試化合物是否抑制腫瘤形成。在其它實(shí)施方案中，測試化合物是CXCR1或FBXO21抑制劑或IL8-CXCR1途徑抑制劑。附圖說明圖1示出來自乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-453、SUM159)的ALDEFLUOR陽性細(xì)胞群具有癌癥干細(xì)胞特性。A-B，G-H.對MDA-MB-453(A-B)和SUM159細(xì)胞(G-H)中的ALDH酶活性的代表性流式細(xì)胞術(shù)分析。如下述實(shí)施例1所描述，進(jìn)行ALDEFLUOR測定。(C，I)ALDEFLUOR陽性群能夠在NOD/SCID小鼠中生成腫瘤，這重現(xiàn)初始腫瘤的表型異質(zhì)性。(F，L)對所注射的不同數(shù)目的細(xì)胞(對于MDA-MB-453：50,000個細(xì)胞、5,000個細(xì)胞和500個細(xì)胞，而對于SUM159：100,000個細(xì)胞、10,000個細(xì)胞、和1,000個細(xì)胞)及對每個群(ALDEFLUOR陽性、ALDEFLUOR陰性、未分離的)繪制腫瘤生長曲線。腫瘤生長動力學(xué)與腫瘤形成的潛伏期和大小和ALDEFLUOR陽性細(xì)胞的數(shù)目有關(guān)(F，L)。(D，J)ALDEFLUOR陽性細(xì)胞的注射部位的H&E染色，揭示腫瘤細(xì)胞的存在(D：MDA-MB-453ALDEFLUOR陽性細(xì)胞注射部位，和J：SUM59ALDEFLUOR陽性細(xì)胞注射部位)。(E，K)ALDEFLUOR陰性細(xì)胞注射部位僅含有殘留的基質(zhì)膠、凋亡細(xì)胞和小鼠組織(E：MDA-MB-453ALDEFLUOR陰性細(xì)胞注射部位，和K：SUM59ALDEFLUOR陰性細(xì)胞注射部位)。數(shù)據(jù)表示均值±SD。圖2示出基于“癌癥干細(xì)胞標(biāo)簽(signature)”對自乳腺細(xì)胞系分離的ALDEFLUOR陽性和ALDEFLUOR陰性群進(jìn)行分類。圖2A?；?13種基因表達(dá)標(biāo)簽的16種樣本的分級聚類。每行數(shù)據(jù)矩陣表示基因，而每列表示樣本。注意到對于16種樣本中的15種，用413種基因分開ALDEFLUOR陽性(加下劃線的名稱)和陰性樣本(不加下劃線的名稱)。標(biāo)簽中包含的一些基因通過其HUGO縮寫來提及，如在“EntrezGene”中使用的(ALDEFLUOR陽性群中下調(diào)的基因以綠色標(biāo)記，而ALDEFLUOR陽性群中上調(diào)的基因以紅色標(biāo)記)。圖2B-C.為了確認(rèn)基因表達(dá)結(jié)果，在ALDEFLUOR表型方面分選的一組5種乳腺癌細(xì)胞系中，通過定量RT-PCR來測量ALDEFLUOR陽性群中過表達(dá)的5種辨別者基因(CXCR1/IL8RA、FBXO21、NFYA、NOTCH2和RAD51L1)的表達(dá)。此圖中呈現(xiàn)了CXCR1和FBXO21的定量RT-PCR表達(dá)水平。通過定量RT-PCR測量的基因表達(dá)水平確認(rèn)使用DNA微陣列獲得的結(jié)果，其中與ALDEFLUOR陰性群相比，ALDEFLUOR陽性群中的CXCR1和FBXO21mRNA水平升高(p＜0.05)。圖3示出IL8/CXCR1軸在調(diào)節(jié)乳腺癌干細(xì)胞中的作用。A.表達(dá)CXCR1的細(xì)胞包含在ALDEFLUOR陽性群中。通過FACS分離來自四種不同乳腺細(xì)胞系(HCC1954、SUM159、MDA-MB-453、BrCa-MZ-01)的ALDEFLUOR陽性和陰性群，固定，并通過免疫染色和FACS分析來分析CXCR1蛋白的表達(dá)。與ALDEFLUOR陰性群相比，ALDEFLUOR陽性細(xì)胞高度富集CXCR1陽性細(xì)胞。B.IL8處理對三種不同細(xì)胞系(HCC1954、SUM159、MDA-MB-453)的腫瘤球形成的影響。IL8處理以劑量依賴性方式提高原代和繼代腫瘤球的形成。C.IL8處理對黏附條件中培養(yǎng)的四種不同細(xì)胞系的ALDEFLUOR陽性群的影響。在所分析的四種細(xì)胞系之每種中，IL8以劑量依賴性方式增加ALDEFLUOR陽性群(*p＜0.05/**p＜0.01，與對照組在統(tǒng)計學(xué)上顯著性差異)。圖4示出LDEFLUOR陽性細(xì)胞展現(xiàn)出升高的轉(zhuǎn)移潛力。A.IL8/CXCR1軸參與癌癥干細(xì)胞侵襲。對三種不同細(xì)胞系(HCC1954、MDA-MB-453、SUM159)，使用血清或IL8作為引誘劑通過基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)來評估IL8/CXCR1軸在侵襲中的作用。ALDEFLUOR陽性細(xì)胞比ALDEFLUOR陰性細(xì)胞具有大6至20倍的侵襲性(p＜0.01)。在使用IL8(100ng/ml)作為引誘物時，觀察到與血清作為引誘物相比，通過基質(zhì)膠，顯著增加的ALDEFLUOR陽性細(xì)胞侵襲(p＜0.05)。比較而言，IL8對ALDEFLUOR陰性群的侵襲能力沒有影響。B-M。ALDEFLUOR陽性群表現(xiàn)出升高的轉(zhuǎn)移潛力。B-D.接種100,000個經(jīng)螢光素酶感染的來自每組(ALDEFLUOR陽性、ALDEFLUOR陰性、未分離的)的細(xì)胞后以每周的時間間隔測量的標(biāo)準(zhǔn)化光子通量的量化。E-J。利用生物發(fā)光成像軟件來檢測轉(zhuǎn)移(E、G、I：面朝下的小鼠；F、H、J：面朝上的小鼠)。接種有ALDEFLUOR陽性細(xì)胞的小鼠形成位于不同部位(骨、肌肉、肺、軟組織)的數(shù)個轉(zhuǎn)移，而且比接種有未分離的細(xì)胞的小鼠(每只小鼠形成不超過1個轉(zhuǎn)移)表現(xiàn)出更高的光子通量發(fā)射。比較而言，接種有ALDEFLUOR陰性細(xì)胞的小鼠僅形成偶發(fā)性小轉(zhuǎn)移，其局限于淋巴結(jié)。K-M.通過H&E染色，對由ALDEFLUOR陽性細(xì)胞注射導(dǎo)致的骨骼(K)、軟組織(L)和肌肉(M)中的轉(zhuǎn)移進(jìn)行的組織學(xué)確認(rèn)。圖5示出CXCR1抑制對腫瘤細(xì)胞存活力(圖5A)及對癌癥干細(xì)胞存活力的影響(圖5B)。圖6示出Repertaxin處理誘導(dǎo)由FAS/FAS配體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)，而且明確顯示了通過添加FAS拮抗劑挽救由Repertaxin處理誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制，而且用FAS激動劑處理的細(xì)胞與用Repertaxin處理的細(xì)胞表現(xiàn)出相似的細(xì)胞生長抑制。圖7示出在沒有Repertaxin處理(7A)和存在Repertaxin(7B)的情況中的FAK、AKT和FOXOA3活化。圖8示出Repertaxin、多西他賽或其組合對一種乳腺癌細(xì)胞系(8A，SUM159)和自三名患者生成的三種人乳腺癌異種移植物(8B，MC1；8C，UM2；和8D，UM3)的影響。圖9示出Repertaxin、多西他賽或組合處理對癌癥干細(xì)胞群的影響，如通過對多種細(xì)胞系進(jìn)行的ALDEFLUOR測定所評估，所述多種細(xì)胞系包括SUM159(9A)、MC1(9B)、UM2(9C)、UM3(9D)。圖10示出Repertaxin、多西他賽或組合對植入繼代NOD-SCID小鼠的乳腺脂肪墊中的連續(xù)稀釋的原發(fā)性腫瘤(10A.SUM159、10B.MC1、10C.UM2、10D.UM3)的影響。圖11示出Repertaxin治療降低SUM159細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移潛力。圖11A示出用心臟內(nèi)施用的SUM159細(xì)胞接種后以每周的時間間隔測量的標(biāo)準(zhǔn)化光子通量的量化。使用生物發(fā)光成像來監(jiān)測轉(zhuǎn)移形成(11B：用鹽水溶液治療的小鼠；11C：用Repertaxin治療的小鼠)。圖12示出SUM159細(xì)胞的ALDEFLUOR陽性亞群與CXCR1陽性亞群(上部)或CXCR2陽性亞群(下部)之間的重疊的表示。B-C.將SUM159細(xì)胞在黏附條件中培養(yǎng)，并用Repertaxin(100nM)或兩種對CXCR1(10μg/ml)或CXCR2(10μg/ml)特異的阻斷抗體處理。3天后，使用ALDEFLUOR測定(B)來分析對癌癥干細(xì)胞群的影響，處理5天后使用MTT測定(C)來評估細(xì)胞存活力。在用Repertaxin或抗CXCR1抗體處理后觀察到ALDEFLUOR陽性群和細(xì)胞存活力的顯著降低。比較而言，在抗CXCR2抗體的情況中沒有觀察到顯著的效果。D.處理4天后，利用TUNEL測定來評估凋亡細(xì)胞數(shù)目。與主要存在活細(xì)胞(染色為藍(lán)色)的對照相比，在經(jīng)Repertaxin處理的細(xì)胞中檢測出36％凋亡細(xì)胞(綠染色為綠色)。E-F.為了測定細(xì)胞死亡是否經(jīng)由旁觀者效應(yīng)介導(dǎo)。對CXCR1陽性和CXCR1陰性群進(jìn)行流式分選，并用多個濃度的Repertaxin處理每個群(D)。檢測出CXCR1陽性和未分選群中的細(xì)胞存活力的降低，而在CXCR1陰性群中沒有觀察到影響(E)。利用來自用Repertaxin處理三天的CXCR1陽性細(xì)胞的經(jīng)透析的條件化培養(yǎng)基(dCM)來處理分選的CXCR1陽性、CXCR1陰性或未分選的群。利用經(jīng)透析的條件化培養(yǎng)基的連續(xù)稀釋(對照、dCM1/4、dCM1/2、dCM3/4、dCM)。處理2天后，利用MTT測定來評估細(xì)胞存活力。在CXCR1陰性和未分離的群中都觀察到細(xì)胞存活力的大幅降低，而在CXCR1陽性群中沒有觀察到影響(F)。圖13示出來自SUM159細(xì)胞系的ALDEFLUOR陽性/CXCR1陽性和ALDEFLUOR陽性/CXCR1陰性細(xì)胞群的致腫瘤性。A.為所注射的不同數(shù)目的細(xì)胞(50,000個細(xì)胞、5，000個細(xì)胞、1，000個細(xì)胞和500個細(xì)胞)和每個群(ALDEFLUOR陽性/CXCR1陽性、ALDEFLUOR陽性/CXCR1陰性)繪制腫瘤生長曲線。這兩種細(xì)胞群都生成腫瘤。腫瘤生長動力學(xué)與腫瘤形成的潛伏期和大小及注射的細(xì)胞數(shù)目有關(guān)。B-C.由ALDEFLUOR陽性/CXCR1陽性群生成的腫瘤在連續(xù)傳代后重建初始腫瘤的表型異質(zhì)性，而ALDEFLUOR陽性/CXCR1陰性群引起僅含有ALDEFLUOR陽性/CXCR1陰性細(xì)胞的腫瘤。我們移植這兩種細(xì)胞群以用于三次傳代。圖14示出顯示了CXCR1阻斷對腫瘤球形成的影響。將SUM159和HCC1954細(xì)胞在黏附條件中培養(yǎng)，并用Repertaxin(100nM)、抗CXCR1阻斷抗體(10μg/ml)或抗CXCR2阻斷抗體(10μg/ml)處理三天。處理3天后，將細(xì)胞分開，并在懸浮液中培養(yǎng)。評估培養(yǎng)5天后形成的腫瘤球數(shù)目。這兩種細(xì)胞系觀察到相似的結(jié)果，其中與對照相比，在經(jīng)Repertaxin和經(jīng)抗CXCR1處理的條件中原代和繼代腫瘤球形成顯著減少。比較而言，抗CXCR2阻斷抗體對腫瘤球形成沒有影響。圖15示出Repertaxin處理對SUM159、HCC1954和MDA-MB-453細(xì)胞系的細(xì)胞存活力的影響。將三種不同細(xì)胞系(SUM159、HCC1954、MDA-MB-453)在黏附條件中培養(yǎng)，并用Repertaxin(100nM)處理。在處理1、3和5天后使用MTT測定來評估細(xì)胞存活力。處理3天后，SUM159和HCC1954細(xì)胞系觀察到細(xì)胞存活力的降低。然而，Repertaxin并不影響MDA-MB453細(xì)胞的存活力。圖16示出CXCR1阻斷對ALDEFLUOR陽性群的體外影響。A-B。將HCC1954(A)和MDA-MB-453(B)細(xì)胞在黏附條件中培養(yǎng)，并用Repertaxin(100nM)或兩種對CXCR1(10μg/ml)或CXCR2(10μg/ml)特性的阻斷抗體處理。3天后，使用ALDEFLUOR測定來分析對癌癥干細(xì)胞群的影響。對于HCC1954，在用Repertaxin或抗CXCR1抗體處理后觀察到ALDEFLUOR陽性群和細(xì)胞存活力的顯著降低。比較而言，在抗CXCR2抗體的情況中沒有觀察到顯著的影響(A)。對于MDA-MB-453，沒有觀察到對ALDEFLUOR陽性群的任何影響(B)。圖17示出Repertaxin處理誘導(dǎo)由FAS/FAS配體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)。A.為了測定由Repertaxin處理誘導(dǎo)的旁觀者殺死效應(yīng)是否由FAS配體介導(dǎo)，利用ELISA測定來測量培養(yǎng)基中的可溶性FAS配體水平。處理4天后，與未處理的對照相比，在用Repertaxin處理的細(xì)胞的培養(yǎng)基中檢測出可溶性FAS配體增加大于4倍。B.通過RT-PCR來測量FAS配體mRNA的水平，并確認(rèn)用Repertaxin處理后FAS配體生成增加。在用激活FAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的FAS激動劑處理4天后觀察到相似的結(jié)果，其中與對照相比，F(xiàn)AS配體mRNA增加5倍。C.將SUM159細(xì)胞在黏附條件中培養(yǎng)，并單獨(dú)用Repertaxin處理或用Repertaxin與抗FAS配體聯(lián)合處理?？笷AS配體的添加部分地挽救由Repertaxin處理誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制。用FAS激動劑處理的細(xì)胞表現(xiàn)出與單獨(dú)Repertaxin處理的細(xì)胞相似的細(xì)胞生長抑制。D-E.分析單獨(dú)用Repertaxin處理或用Repertaxin與抗FAS配體聯(lián)合處理和FAS激動劑處理對CXCR1陽性和ALDEFLUOR陽性群的影響?？笷AS配體沒有挽救由Repertaxin處理誘導(dǎo)的CXCR1陽性和ALDEFLUOR陽性群的大幅減少，而用FAS激動劑的處理分別產(chǎn)生10倍和3倍增加的CXCR1陽性和ALDEFLUOR陽性群的百分比。圖18示出FAS激動劑對CXCR1陽性和CXCR1陰性細(xì)胞的影響。對CXCR1陽性和CXCR1陰性群進(jìn)行流式分選，并用多個濃度的FAS激動劑處理每個群。檢測出CXCR1陰性和未分選群的細(xì)胞存活力降低，而在CXCR1陽性群中沒有觀察到影響。圖19示出對正常的乳腺干細(xì)胞/祖細(xì)胞群中的CXCR1蛋白表達(dá)的分析和IL-8處理對乳腺球形成的影響。A.通過FACS將來自從乳房復(fù)位成形術(shù)分離的正常乳房上皮細(xì)胞的ALDEFLUOR陽性和陰性群分離，固定，并通過免疫染色和FACS分析來分析CXCR1蛋白表達(dá)。與ALDEFLUOR陰性群相比，ALDEFLUOR陽性細(xì)胞高度富含CXCR1陽性細(xì)胞。B-C.IL8處理對乳腺球形成的影響。IL8處理以劑量依賴性方式提高原代乳腺球(B)和繼代乳腺球(C)的形成。圖20示出Repertaxin處理對正常的乳房上皮細(xì)胞的影響。A.將自乳房復(fù)位成形術(shù)分離的正常乳腺上皮細(xì)胞在黏附條件中培養(yǎng)，并用Repertaxin(100nM或500nM)或FAS激動劑(500ng/ml)處理。處理5天后，使用MTT測定來評估細(xì)胞存活力。即使在利用高濃度的Repertaxin(500nM)時，Repertaxin處理或FAS激動劑對黏附條件中培養(yǎng)的正常乳腺上皮細(xì)胞的存活力沒有影響。B.通過Elisa測定在用Repertaxin處理的正常乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中評估可溶性FAS配體的水平。處理4天后，在來自經(jīng)處理細(xì)胞的培養(yǎng)基中檢測出可溶性FAS配體的增加。C.通過FACS分析來分析正常乳腺上皮細(xì)胞中的FAS/CD95表達(dá)。在黏附條件中培養(yǎng)的正常乳腺上皮細(xì)胞中沒有檢測出FAS/CD95表達(dá)。D.Repertaxin處理對乳腺球形成的影響。將正常的乳房上皮細(xì)胞在黏附條件中培養(yǎng)，并在4、8、11和15天期間用Repertaxin(100nM)處理。Repertaxin處理后，將細(xì)胞分開，并在懸浮液中培養(yǎng)。在經(jīng)Repertaxin處理的條件中觀察到乳腺球起始細(xì)胞的顯著減少。圖21示出Repertaxin處理對FAK、AKT和FOXO3a活化的影響。為了評估Repertaxin處理對CXCR1下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，利用兩種不同病毒構(gòu)建體，一種經(jīng)由PTEN-siRNA來敲除PTEN表達(dá)，而另一種導(dǎo)致FAK過表達(dá)(Ad-FAK)。A.將SUM159對照、SUM159PTEN-siRNA和SUM159Ad-FAK細(xì)胞在黏附條件中在沒有或存在100nMRepertaxin的情況中培養(yǎng)2天，并通過Western印跡來評估FAK/AKT途徑的激活。Repertaxin處理導(dǎo)致FAKTyr397和AKTSer473磷酸化的降低，而PTEN刪除和FAK過表達(dá)阻斷Repertaxin處理對FAK和AKT活性的影響。B.利用對CXCR1陽性細(xì)胞的免疫熒光染色，我們確認(rèn)Repertaxin處理導(dǎo)致磷酸-FAK(膜染色為紅色)和磷酸-AKT表達(dá)(胞質(zhì)染色為紅色)的消失。用抗FOXO3A的免疫熒光染色揭示FOXO3a(以紅色)在未處理細(xì)胞中的胞質(zhì)位置，而Repertaxin處理誘導(dǎo)FOXO3A向細(xì)胞核的再定位。比較而言，具有PTEN刪除或FAK過表達(dá)的細(xì)胞在經(jīng)Repertaxin處理的和未處理的細(xì)胞中都表現(xiàn)出高水平的磷酸-FAK、磷酸-AKT和胞質(zhì)FOXO3A表達(dá)。在所有樣本中，用DAPI(藍(lán)色)對細(xì)胞核復(fù)染。C-D.分別利用MTT和ALDEFLUOR測定來評估Repertaxin對SUM159PTEN-siRNA和SUM159Ad-FAK細(xì)胞存活力及對癌癥干細(xì)胞群的影響。處理3天后，具有PTEN刪除或FAK過表達(dá)的細(xì)胞形成對Repertaxin的抗性(C)。Repertaxin處理沒有改變ALDEFLUOR陽性SUM159PTEN敲除細(xì)胞的比例(D)。圖22示出Repertaxin處理在HCC1954和MDA-MB-453細(xì)胞系中對FAK/AKT活化的影響。為了評估Repertaxin處理對CXCR1下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，我們利用經(jīng)由PTEN-siRNA敲除PTEN表達(dá)的慢病毒構(gòu)建體。A.將HCC1954對照和HCC1954PTEN-siRNA細(xì)胞在黏附條件中在沒有或存在100nMRepertaxin的情況中培養(yǎng)2天，并通過Western印跡來評估FAK/AKT途徑的激活。Repertaxin處理導(dǎo)致FAKTyr397和AKTSer473磷酸化的降低，而PTEN刪除阻斷Repertaxin處理對FAK和AKT活性的影響。B.Repertaxin處理對含有PTEN突變的MDA-MB-453細(xì)胞系的細(xì)胞存活力沒有任何影響。利用Western印跡分析，我們確認(rèn)Repertaxin處理不干擾FAK/AKT途徑。圖23示出Repertaxin對HCC1954PTEN-siRNA細(xì)胞存活力的影響，其利用MTT測定來評估。處理3天后，具有PTEN刪除的細(xì)胞形成對RepertaXin的抗性。圖24示出通過定量RT-PCR測量的多西他賽或Repertaxin處理后FAS配體和IL-8mRNA表達(dá)。A-B.用Repertaxin(100nM)、FAS激動劑(500ng/ml)或多西他賽(10nM)處理黏附條件中培養(yǎng)的SUM159細(xì)胞。處理3天后，收集細(xì)胞，并提取RNA。多西他賽在SUM159細(xì)胞中誘導(dǎo)FAS配體(A)和IL-8(B)mRNA。在FAS激動劑或多西他賽處理后檢測出升高4倍的IL-8mRNA水平(B)。圖25示出對三種不同乳腺癌異種移植物中PTEN/FAK/AKT活化的評估。Western印跡分析揭示，這兩種異種移植物呈現(xiàn)PTEN的表達(dá)和FAK/AKT途徑的激活，如通過FAKTyr397和AKTSer473磷酸化所顯示的。圖26示出Repertaxin處理對乳腺癌干細(xì)胞群的體內(nèi)影響。A-C.為了評估Repertaxin處理對腫瘤生長和癌癥干細(xì)胞群的體內(nèi)影響，利用乳腺癌細(xì)胞系(SUM159)和自三名患者生成的三種人乳腺癌異種移植物(MC1、UM2、UM3)。A.對于每種樣本，將50,000個細(xì)胞注射到NOD/SCID小鼠的人源化乳腺脂肪墊中，并監(jiān)測腫瘤大小。在腫瘤為約4mm時，開始Repertaxin(15mg/Kg)兩次/天的s.c.注射達(dá)28天或一次/周I.P.注射多西他賽(10mg/Kg)或組合(Repertaxin/多西他賽)。該圖顯示了每種指定的處理過程前和期間的腫瘤大小(箭頭，開始處理)。對每種樣本觀察到相似的結(jié)果，其中與對照相比，在經(jīng)單獨(dú)多西他賽處理或Repertaxin/多西他塞組合處理的組中腫瘤大小在統(tǒng)計學(xué)上顯著減小，而對照腫瘤和用單獨(dú)用Repertaxin處理的腫瘤的生長之間沒有觀察到差異。B-C.Repertaxin、多西他賽或組合處理對癌癥干細(xì)胞群的評估，如通過ALDEFLUOR測定(B)和再移植到繼代小鼠中(C)所評估的。與對照相比，經(jīng)多西他賽處理的腫瘤異種移植物顯示相似或增加百分比的ALDEFLUOR陽性細(xì)胞，而單獨(dú)Repertaxin處理的或與多西他賽組合處理產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)上顯著減少的ALDEFLUOR陽性細(xì)胞，其中與對照相比，癌癥干細(xì)胞減少65％至85％(p＜0.01)(B)。將自原發(fā)性腫瘤、未處理(對照)和經(jīng)處理的小鼠獲得的細(xì)胞的連續(xù)稀釋移植到不接受進(jìn)一步處理的繼代NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪墊中。對照和經(jīng)多西他賽處理的原發(fā)性腫瘤在所有稀釋度形成繼發(fā)性腫瘤，而僅較高數(shù)目的自用Repertaxin或與多西他賽組合處理的原發(fā)性腫瘤獲得的細(xì)胞能夠形成腫瘤。此外，腫瘤生長顯著延遲，而且所得的腫瘤在大小上顯著小于對照或經(jīng)多西他賽處理的腫瘤(C)。D.收集來自每組的異種移植物，并進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色以檢測磷酸-FAK、磷酸-AKT、FOXO3A和ALDH1的表達(dá)。在對照和經(jīng)多西他賽處理的腫瘤中檢測出膜磷酸-FAK表達(dá)和胞質(zhì)磷酸-AKT表達(dá)(箭頭)，而在單獨(dú)用Repertaxin處理的或與多西他賽組合處理的腫瘤中沒有檢測到表達(dá)。單獨(dú)用多西他賽或Repertaxin處理或組合處理的細(xì)胞中檢測出核FOXO3A表達(dá)(褐色)。與對照和經(jīng)多西他賽處理的腫瘤相比，在單獨(dú)用Repertaxin處理或組合處理的腫瘤中檢測出ALDH1表達(dá)的降低(箭頭)。圖27示出Repertaxin處理對乳腺癌干細(xì)胞群的體內(nèi)影響。A-C.為了評估Repertaxin處理對腫瘤生長和癌癥干細(xì)胞群的體內(nèi)影響，利用乳腺癌細(xì)胞系(SUM159，A)和自不同患者生成的三種人乳腺癌異種移植物。對于每種樣本，將50,000個細(xì)胞注射到NOD/SCID小鼠的人源化乳腺脂肪墊中，并監(jiān)測腫瘤大小。在腫瘤為約4mm時，開始Repertaxin(15mg/Kg)兩次/天的s.c.注射達(dá)28天或一次/周I.P.注射多西他賽(10mg/Kg)或組合(Repertaxin/多西他賽)。該圖顯示了每種指定的處理過程前和期間的腫瘤大小(箭頭，開始處理)。對每種樣本觀察到相似的結(jié)果，其中與對照相比，在經(jīng)多西他賽單獨(dú)處理或Repertaxin/多西他塞組合處理的組中腫瘤大小在統(tǒng)計學(xué)上顯著減小，而對照腫瘤和單獨(dú)用Repertaxin處理的腫瘤的生長之間沒有觀察到差異。通過ALDEFLUOR測定和再移植到繼代小鼠中來評估Repertaxin、多西他賽或組合處理對癌癥干細(xì)胞群的影響。與對照相比，經(jīng)多西他賽處理的腫瘤異種移植物顯示了相似或增加百分比的ALDEFLUOR陽性細(xì)胞，而單獨(dú)用Repertaxin處理或與多西他賽組合處理產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)上顯著性減少的ALDEFLUOR陽性細(xì)胞，其中與對照相比，癌癥干細(xì)胞減少65％至85％(p＜0.01)。將自原發(fā)性腫瘤、未處理(對照)和經(jīng)處理的小鼠獲得的細(xì)胞的連續(xù)稀釋移植到不接受進(jìn)一步處理的繼代NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪墊中。對照和經(jīng)多西他賽處理的原發(fā)性腫瘤在所有稀釋度形成繼發(fā)性腫瘤，而僅較高數(shù)目的自用Repertaxin或與多西他賽組合處理的原發(fā)性腫瘤獲得的細(xì)胞能夠形成腫瘤。腫瘤生長顯著延遲，而且所得的腫瘤在大小上顯著小于對照或經(jīng)多西他賽處理的腫瘤。圖28示出Repertaxin處理對乳腺癌干細(xì)胞群的影響，如通過CD44+/CD24-表型所評估。A-B.通過CD44+/CD24-細(xì)胞的存在評估Repertaxin、多西他賽或組合處理對癌癥干細(xì)胞群的影響。在單獨(dú)用多西他賽處理的殘留的腫瘤中，我們一致地觀察到百分比未改變或增加的CD44+/CD24-細(xì)胞，而單獨(dú)用Repertaxin處理或與多西他賽組合處理導(dǎo)致CD44+/CD24-細(xì)胞群的減少。A.呈現(xiàn)了UM3異種移植物的流程圖分析。B.對MC1、UM2和UM3觀察到相似的結(jié)果。幾乎所有SUM159細(xì)胞在所有處理?xiàng)l件下為CD44+/CD24-。圖29示出Repertaxin處理降低全身性轉(zhuǎn)移的形成。為了評估Repertaxin處理對轉(zhuǎn)移形成的影響，用表達(dá)螢光素酶的慢病毒感染HCC1954(A)、SUM159(B)、MDA-MB-453(C)乳腺癌細(xì)胞系，并經(jīng)由心臟內(nèi)注射將250,000個經(jīng)螢光素酶感染的細(xì)胞接種到NOD/SCID小鼠中。心臟內(nèi)注射后12小時通過在28天期間一天兩次s.c.注射鹽水溶液或s.c.注射Repertaxin(15mg/kg)來治療小鼠。使用生物發(fā)光成像來監(jiān)測轉(zhuǎn)移形成。接種后以每周的時間間隔測量的標(biāo)準(zhǔn)化光子通量的量化揭示對于接種有HCC1954或SUM159細(xì)胞的小鼠而言，與鹽水對照相比，Repertaxin治療的轉(zhuǎn)移形成在統(tǒng)計學(xué)上顯著降低(A-B)。比較而言，對于注射MDA-MB-453細(xì)胞的小鼠，Repertaxin治療對轉(zhuǎn)移形成沒有任何影響。(C).對未用Repertaxin治療的小鼠的骨和軟組織中的轉(zhuǎn)移通過H&E染色進(jìn)行組織學(xué)確認(rèn)(D)。圖30示出單獨(dú)用化學(xué)療法治療或與Repertaxin組合治療的癌癥干細(xì)胞中的IL-8/CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。A.代表癌癥干細(xì)胞中的潛在的IL-8/CXCR1細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。IL-8結(jié)合后的CXCR1活化誘導(dǎo)粘著斑激酶(FAK)的磷酸化?；钚訤AK使AKT磷酸化，并激活調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新的WNT途徑和調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的FOXO3A。FAK的活化通過抑制FADD(FAST信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種下游效應(yīng)物)來保護(hù)癌癥干細(xì)胞免于FAS配體/FAS介導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)。在存在化學(xué)療法的情況中，僅大量腫瘤細(xì)胞對處理敏感，并在凋亡過程中釋放高水平的IL-8和FAS配體蛋白。乳腺癌干細(xì)胞經(jīng)由IL-8介導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)被刺激，并且對經(jīng)由FAST配體介導(dǎo)的旁觀者殺死效應(yīng)有抗性。B.Repertaxin治療阻斷IL-8/CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且抑制乳腺癌干細(xì)胞自我更新和存活。當(dāng)組合Repertaxin治療與化學(xué)療法組合時，使癌癥干細(xì)胞對由FAS配體介導(dǎo)的旁觀者殺死效應(yīng)敏感。定義為了便于理解本發(fā)明，下文定義了許多術(shù)語和短語：如本文中所使用的，術(shù)語“抗癌劑”、“常規(guī)的抗癌劑”或“癌癥治療藥物”指癌癥治療(例如，在哺乳動物中)中使用的任何治療劑(例如，化療化合物和/或分子治療性化合物)、放射療法或手術(shù)干預(yù)。如本文中所使用的，術(shù)語“藥物”和“化療劑”指用于在生理系統(tǒng)(例如受試者、或體內(nèi)、體外或離體細(xì)胞、組織和器官)中診斷、治療或預(yù)防疾病或病理疾患的藥理學(xué)活性分子。藥物通過改變已經(jīng)接受藥物施用的活生物體、組織、細(xì)胞或體外系統(tǒng)的生理學(xué)來起作用。術(shù)語“藥物”和“化療劑”意在涵蓋抗過度增殖和抗腫瘤化合物及其它生物治療性化合物。“有效量”指足以實(shí)現(xiàn)有益的或期望的結(jié)果的量。有效量可以在一次或多次施用中施用。如本文中所使用的，術(shù)語“施用”指將藥物、前藥、抗體或其它藥劑、或治療性處理給予生理系統(tǒng)(例如，受試者或體內(nèi)、體外或離體細(xì)胞、組織和器官)的行為。對人體施用的示例性路徑可以經(jīng)由眼(眼的)、口(口服)、皮膚(經(jīng)皮)、鼻(鼻的)、肺(吸入的)、口腔粘膜(含服)、耳、通過注射(例如，靜脈內(nèi)、皮下、腫瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)等)等?！肮彩┯谩敝笇ι硐到y(tǒng)(例如，受試者或體內(nèi)、體外或離體細(xì)胞、組織和器官)施用不止一種化學(xué)劑或治療性處理(例如，放射療法)。各種化學(xué)藥劑(例如IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑和其它化療劑)的“共施用”可以是并發(fā)的，或者以任何時間次序或物理組合。如本文中所使用的，術(shù)語“消退”指與基礎(chǔ)的非病原示例性受試者、細(xì)胞、組織或器官相比患病的受試者、細(xì)胞、組織或器官返回到非病理學(xué)，或病理學(xué)較小的狀態(tài)。例如，腫瘤的消退包括腫瘤質(zhì)量降低及一個或多個腫瘤的完全消失。如本文中所使用的，術(shù)語“體外”指人工環(huán)境和人工環(huán)境內(nèi)發(fā)生的過程或反應(yīng)。體外環(huán)境可以包括但不限于試管和細(xì)胞培養(yǎng)物。術(shù)語“體內(nèi)”指天然環(huán)境(例如，動物或細(xì)胞)和天然環(huán)境內(nèi)發(fā)生的過程或反應(yīng)。如本文中所使用的，術(shù)語“細(xì)胞培養(yǎng)物”指細(xì)胞的任何體外培養(yǎng)物。此術(shù)語包括連續(xù)細(xì)胞系(例如，具有永生表型)、原代細(xì)胞培養(yǎng)物、有限細(xì)胞系(例如，未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)和體外維持的任何其它細(xì)胞群，包括卵母細(xì)胞和胚胎。如本文中所使用的，術(shù)語“受試者”或“患者”指要通過本發(fā)明的方法治療的生物體。此類生物體包括但不限于人和獸醫(yī)動物(犬、貓、馬、豬、牛、綿羊、山羊等)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“受試者”或“患者”一般指將要接受或者已經(jīng)接受治療的個體。如本文中所使用的，術(shù)語“診斷”指根據(jù)疾病的體征和癥狀或遺傳分析、病理學(xué)分析、組織學(xué)分析等對疾病的識別。如本文中所使用的，術(shù)語“反義”根據(jù)特定RNA序列(例如，mRNA)互補(bǔ)的核酸序列(例如，RNA，硫代磷酸DNA)而使用。此定義包括天然的或合成的反義RNA分子，包括調(diào)節(jié)基因表達(dá)的分子，諸如小干擾RNA或微小RNA。本發(fā)明可以采用的一類反義序列是對CXCR1mRNA特異的類型。術(shù)語“測試化合物”或“候選化合物”指可用于治療或預(yù)防疾病、病患、病癥或身體功能紊亂，或者以其它方式改變樣本的生理或細(xì)胞狀態(tài)的任何化學(xué)實(shí)體、藥劑、藥物等。測試化合物包含已知的和潛在的治療性化合物兩者。可以通過使用本發(fā)明的篩選方法來確定測試化合物為治療性的?！耙阎闹委熜曰衔铩敝敢呀?jīng)顯示(例如，經(jīng)由動物試驗(yàn)或?qū)θ耸┯玫默F(xiàn)有經(jīng)驗(yàn))在此類治療或預(yù)防中有效的治療性化合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，“測試化合物”是抗癌劑。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，“測試化合物”是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗癌劑。如本文中所使用的，術(shù)語“抗原結(jié)合蛋白”指結(jié)合特定抗原的蛋白質(zhì)?！翱乖Y(jié)合蛋白”包括但不限于免疫球蛋白，包括多克隆、單克隆、嵌合、單鏈和人源化抗體、Fab片段、F(ab’)2片段和Fab表達(dá)文庫。使用本領(lǐng)域中已知的多種方法來制備多克隆抗體。為了制備抗體，可以通過注射與期望的表位對應(yīng)的肽來使多種宿主動物免疫，所述宿主動物包括但不限于兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，將肽與免疫原性載體(例如，白喉類毒素、牛血清清白蛋白(BSA)或鑰孔傶血蘭蛋白(KLH))綴合。根據(jù)宿主物種，使用多種佐劑來提高免疫應(yīng)答，包括但不限于弗氏(完全的和不完全的)、礦物凝膠(諸如氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)(諸如溶血卵磷脂)、Pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、鑰孔傶血蘭蛋白、二硝基酚和潛在有用的人佐劑諸如BCG(卡介苗)和短小棒桿菌(Corynebacteriumparvum)。對于制備單克隆抗體，可以使用通過培養(yǎng)物中的傳代細(xì)胞系提供抗體分子生成的任何技術(shù)(參見例如Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY)。這些包括但不限于最初由和Milstein開發(fā)的雜交瘤技術(shù)(和Milstein，Nature，256：495-497(1975))，及三源雜交瘤(trioma)技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(參見例如Kozbor等，Immun0l.Today，4：72(1983))和用于制備人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy中，AlanR.Liss，Inc.，第77頁-第96頁(1985))。依照本發(fā)明，可以使所描述的用于制備單鏈抗體的技術(shù)(U.S.4,946,778；以引用的方式并入本文)適于根據(jù)需要制備特定的單鏈抗體。本發(fā)明的其它實(shí)施方案利用本領(lǐng)域中已知的用于構(gòu)建Fab表達(dá)文庫的技術(shù)(Huse等，Science，246：1275-1281(1989))以使得可以快速且容易地鑒別具有期望特異性的單克隆Fab片段?？梢酝ㄟ^已知的技術(shù)來產(chǎn)生含有抗體分子的獨(dú)特型(抗原結(jié)合區(qū))的抗體片段。例如，此類片段包括但不限于：可以通過抗體分子的胃蛋白酶消化而生成的F(ab’)2片段；可以通過還原F(ab’)2片段的二硫鍵而生成的Fab’片段；和可以通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子而生成的Fab片段。可以通過本領(lǐng)域中已知的方法來分離編碼抗原結(jié)合蛋白的基因。在抗體制備中，可以通過本領(lǐng)域中已知的技術(shù)(例如，放射性免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“三明治式”免疫測定法、免疫放射性測量測定、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定、原位免疫測定(例如，使用膠體金、酶或放射性同位素標(biāo)記物)、Western印跡、沉淀反應(yīng)、凝集測定(例如凝膠凝集測定、血細(xì)胞凝集測定等)、補(bǔ)體結(jié)合測定、免疫熒光測定、蛋白A測定、和免疫電泳測定等)等來實(shí)現(xiàn)期望抗體的篩選。如本文中所使用的，術(shù)語“調(diào)控”指化合物影響(例如，促進(jìn)或延遲)細(xì)胞功能(包括但不限于細(xì)胞生長、增殖、侵襲、血管發(fā)生、凋亡等)方面的活性。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，其通過單獨(dú)施用或與其它化療劑聯(lián)合施用IL8-CXCR1途徑抑制劑(例如，抗CXCR1抗體或Repertaxin)，從而殺死受試者的非致腫瘤性和致腫瘤性癌細(xì)胞來進(jìn)行。本發(fā)明還提供了用于治療患者的實(shí)體瘤干細(xì)胞和診斷患者的實(shí)體瘤干細(xì)胞的存在的組合物和方法(例如，基于CXCR1或FBXO21的存在)。I.致腫瘤性癌細(xì)胞、ALDH、CXCR1和CXCR1抑制正常細(xì)胞進(jìn)化成完全轉(zhuǎn)化的細(xì)胞需要多個細(xì)胞過程的反調(diào)節(jié)(1，2)。依照經(jīng)典的致癌作用模型，這些事件可以在任何細(xì)胞中發(fā)生。比較而言，“癌癥干細(xì)胞假說”認(rèn)為致癌轉(zhuǎn)化的優(yōu)先靶物是已經(jīng)獲得自我更新潛力的組織干細(xì)胞或早期祖細(xì)胞(3-6)。這些“腫瘤起始細(xì)胞”或“癌癥干細(xì)胞”(CSC)繼而通過其經(jīng)歷自我更新(即一種引導(dǎo)腫瘤發(fā)生和分化的過程)的能力來表征，這有助于腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性。已經(jīng)利用原發(fā)性人腫瘤的異種移植物產(chǎn)生了支持癌癥干細(xì)胞假說的最近證據(jù)。這些研究已經(jīng)表明腫瘤由癌癥干細(xì)胞組分引導(dǎo)形成的細(xì)胞層次構(gòu)成。另外，最近的數(shù)據(jù)表明源自鼠和人組織的永生化細(xì)胞系也可以含有表現(xiàn)干細(xì)胞特性的細(xì)胞群。大多數(shù)這些研究基于體外特性，包括產(chǎn)克隆潛能、球形成和多譜系分化潛能(7-10)。利用異種移植物中永生化細(xì)胞系的功能移植的更有限的研究也已經(jīng)表明此類層次的存在。這些研究一般利用Hoechst染料排除來鑒別所謂的“側(cè)群(sidepopulation)”(SP)(7，9，11)。另外，還利用了使用原發(fā)性腫瘤異種移植物限定的細(xì)胞表面標(biāo)志物(諸如CD44和CD133)來鑒別已建立細(xì)胞系中的相似群(7，8)。如下文實(shí)施例中所描述的，研究在源自人乳腺癌和未轉(zhuǎn)化的乳腺細(xì)胞的一系列33種細(xì)胞系中干細(xì)胞標(biāo)志物醛脫氫酶(ALDH)的表達(dá)。ALDH是負(fù)責(zé)氧化細(xì)胞內(nèi)醛的解毒酶，而且認(rèn)為其通過將視黃醛代謝成視黃酸而在干細(xì)胞分化中發(fā)揮作用(12，13)。通過熒光ALDEFLUOR測定所評估的ALDH活性已經(jīng)成功地被用于分離多發(fā)性骨髓瘤和急性髓細(xì)胞樣白血病(AML)中的癌癥干細(xì)胞以及從腦腫瘤中分離癌癥干細(xì)胞(14-16)。最近證明了，可以利用ALDH活性來從正常的人乳腺組織和乳腺癌中分離表現(xiàn)干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群(17)。自乳房復(fù)位成形術(shù)(reductionmammoplasty)組織中分離的ALDEFLUOR陽性群能夠在人源化NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪墊中重新組成導(dǎo)管肺泡樣結(jié)構(gòu)。此外，自人乳腺癌分離的ALDELFUOR陽性細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，如通過其在連續(xù)傳代后在NOD/SCID小鼠中重新組成腫瘤及產(chǎn)生初始腫瘤的表型異質(zhì)性的能力所表明(17)。在下文的實(shí)施例中，證明了大多數(shù)乳腺癌細(xì)胞系含有表現(xiàn)癌癥干細(xì)胞特性的具有獨(dú)特分子譜的ALDEFLUOR陽性群。如下文實(shí)施例中所描述的，本發(fā)明實(shí)施方案的開發(fā)過程中進(jìn)行的工作將CXCR1(其是炎性趨化因子IL8的受體)鑒別為癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物。僅Aldefluor陽性群內(nèi)的細(xì)胞表達(dá)CXCR1。此外，證明了此受體發(fā)揮功能性作用，因?yàn)橹亟MIL8能夠提高細(xì)胞系中的干細(xì)胞比例，如通過Aldefluor和球形成分析所測定。雖然已經(jīng)報告了IL8與侵襲性乳腺癌有關(guān)，而且在患有轉(zhuǎn)移性疾病的女性的血清中更高，但是認(rèn)為本發(fā)明首次顯示了IL8與其干細(xì)胞中的受體CXCR1之間的功能聯(lián)系。如下文實(shí)施例中進(jìn)一步所描述，證明了可以通過阻斷這些細(xì)胞中的CXCR1受體來選擇性靶向癌癥干細(xì)胞。在實(shí)施例中所描述的一種方法中，用針對CXCR1而非針對另一種IL8受體CXCR2的單克隆抗體處理乳腺癌細(xì)胞。如通過Aldefluor陽性群減少所表明，此類處理選擇性靶向癌癥干細(xì)胞。顯著地，發(fā)現(xiàn)，雖然CXCR1僅在非常小比例的細(xì)胞(例如，小于1％)中表達(dá)，但是所述CXCR1受體的阻斷在大多數(shù)其它癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，盡管它們?nèi)狈XCR1受體。已經(jīng)闡明了介導(dǎo)IL對癌癥干細(xì)胞的影響，并引起殺死其它細(xì)胞的此所謂“旁觀者效應(yīng)”的分子途徑。IL8通過結(jié)合CXCR1，CXCR1繼而激活粘著斑激酶Fak途徑來刺激干細(xì)胞自我更新。這導(dǎo)致驅(qū)動干細(xì)胞自我更新的Akt活化。在癌癥干細(xì)胞中阻斷此途徑時，Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的減少引起Foxo轉(zhuǎn)錄因子的胞質(zhì)隔離，導(dǎo)致Fas配體的合成增加。Fas配體由癌癥干細(xì)胞分泌，并在含有Fas受體的周圍細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。雖然本發(fā)明不限于任何具體的機(jī)制，而且對機(jī)制的了解對于實(shí)施本發(fā)明不是必要的，但是認(rèn)為CXCR1經(jīng)由包括Fak和Akt的途徑介導(dǎo)癌癥干細(xì)胞自我更新，而且阻斷此途徑在癌癥干細(xì)胞及周圍腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于中斷IL8-CXCR1途徑(例如，用抗CXCR1抗體、抗FAK抗體或其它藥劑)以治療癌癥的組合物和方法。因?yàn)镮L8是一種參與組織炎癥的趨化因子，所以先前在開發(fā)IL8信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑上有興趣。已經(jīng)開發(fā)出小分子抑制劑Repartaxin作為抗炎劑來潛在地減少心肌梗死和中風(fēng)的并發(fā)癥。Repartaxin已經(jīng)引入了I期和II期臨床試驗(yàn)中，而且已經(jīng)表明具有很少的毒性。如下文實(shí)施例中所顯示，Repartaxin(與抗CXCR1抗體一樣)能夠靶向癌癥干細(xì)胞并且通過旁觀者效應(yīng)在周圍細(xì)胞中誘導(dǎo)Fas配體fas介導(dǎo)的凋亡。重要的是，在腫瘤異種移植物中，Repartaxin加強(qiáng)了化學(xué)療法的效果。此外。與化學(xué)療法(其優(yōu)先破壞腫瘤中的分化細(xì)胞而避免腫瘤干細(xì)胞)不同，Repartaxin能夠靶向腫瘤干細(xì)胞。如實(shí)施例中所顯示，這通過經(jīng)Repartaxin治療的腫瘤中的Aldefluor群減少和這些經(jīng)治療的腫瘤細(xì)胞在小鼠中形成繼發(fā)性腫瘤的能力降低得到證明。還測試了Repartaxin對阻斷轉(zhuǎn)移的能力的影響。用螢光素酶標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，并將其注射到在實(shí)驗(yàn)用轉(zhuǎn)移模型中。引入腫瘤細(xì)胞后1天，將一組動物單獨(dú)置于Repartaxin上，而另一組沒有治療。Repartaxin顯著降低轉(zhuǎn)移的形成。本發(fā)明將IL8受體CXCR1鑒別為治療癌癥干細(xì)胞的靶物。小分子抑制劑Repartaxin抑制CXCR1和CXCR2。實(shí)施例證明，癌癥干細(xì)胞中最重要的受體正是CXCR1。此外，實(shí)施例表明，細(xì)胞毒性化學(xué)療法不能有效地治療已確定的癌癥可能不僅由于此療法不能靶向癌癥干細(xì)胞，另外還由于已證明腫瘤細(xì)胞毒性化學(xué)療法治療后IL8分泌升高。本實(shí)施例表明，CXCR1抑制劑的使用在能夠特異地靶向癌癥干細(xì)胞及阻斷由細(xì)胞毒性化學(xué)療法誘導(dǎo)的這些細(xì)胞的IL8刺激方面具有有益效果。靶向IL8-CXCR1途徑不限于乳腺癌，而是可以在任何類型的癌癥中采用。優(yōu)選地，治療的癌癥類型是其中有IL8生成增加(例如與化學(xué)療法有關(guān))的證據(jù)的類型。已經(jīng)顯示化療劑直接調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中的IL8轉(zhuǎn)錄。紫杉醇在卵巢、乳腺和肺癌細(xì)胞系中增加IL8轉(zhuǎn)錄和分泌(Uslu等，2005，Int.J.Gynecol.Cancer，15：240-245；及Collins等，2000，Can.Imm.Immuno.，49：78-84，二者以引用的方式并入本文)。還有，對乳腺癌細(xì)胞施用阿霉素和5-氟-2’-脫氧尿苷(DeLarco等，2001，Can.Res.61：2857-2861，以引用的方式并入本文)、對口腔癌細(xì)胞施加5-FU(Tamatani等，2004，Int.，J.Can.，108：912：921，以引用的方式并入本文)、對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞施加多柔比星(Shibakura等，2003，Int.J.Can.，103：380-386，以引用的方式并入本文)和對黑素瘤細(xì)胞施用達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)(Lev等，2003，Mol.，Can.Ther.，2：753-763，以引用的方式并入本文)都導(dǎo)致CXCL8表達(dá)增加。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于靶向IL-CXCR1的藥劑，其與化療劑(例如，諸如在上述參考文獻(xiàn)中所提及的那些)組合用于治療患有如下的一種癌癥的受試者，所述癌癥包括但不限于前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌和食管腺癌。本發(fā)明不限于治療的癌癥類型，反而包括但不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤(Ewing’stumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤(WiIms’tumor)、宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。II.實(shí)體瘤干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物的檢測在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物(例如CXCR1、FBXO21、NFYA、NOTCH2、RAD51L1、TBP和表1的其它蛋白質(zhì))表達(dá)的方法。在一些實(shí)施方案中，直接測量表達(dá)(例如，在RNA或蛋白質(zhì)水平)。在一些實(shí)施方案中，在組織樣本(例如，活檢組織)中檢測表達(dá)。在其它實(shí)施方案中，在體液(例如，包括但不限于血漿、血清、全血、粘液和尿液)中檢測表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于檢測標(biāo)志物的面板(panel)和試劑盒。在一些實(shí)施方案中，使用干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物的存在來向受試者提供預(yù)后。還使用所提供的信息來指導(dǎo)治療過程。例如，若發(fā)現(xiàn)受試者具有指示實(shí)體瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物(例如，CXCR1、FBXO21、NFYA、NOTCH2、RAD51L1、TBP和表1的其它蛋白質(zhì))，則可以在早期時間點(diǎn)開始其它療法(例如，放射療法)，此時這些療法很可能是有效的(例如，在轉(zhuǎn)移前)。另外，若發(fā)現(xiàn)受試者患有不響應(yīng)某些療法的腫瘤，則可以避免此類療法的費(fèi)用和不便。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于分析多種標(biāo)志物(例如，CXCR1或FBXO21與CD44、CD24和ESA中至少一種的組合)的面板。面板允許同時分析與致癌作用和/或轉(zhuǎn)移相關(guān)的多種標(biāo)志物。根據(jù)受試者，可以單獨(dú)或組合分析面板以提供最好的診斷和預(yù)后。使用任何合適的方法(包括但不限于描述于下面說明性實(shí)施例中的那些)通過篩選其預(yù)測值來選擇面板上包含的標(biāo)志物。1.RNA的檢測在一些實(shí)施方案中，通過測量組織樣本中相應(yīng)mRNA的表達(dá)來檢測實(shí)體瘤干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物?？梢酝ㄟ^任何合適的方法測定mRNA表達(dá)，這些方法包括但不限于在下文所公開的那些。人CXCR1核酸的登錄號是NM_000634(以引用的方式并入本文)，而人FBXO21的登錄號是NM_033624(以引用的方式并入本文)?？梢允褂眠@些序列來設(shè)計引物和探針(以及siRNA序列)。在一些實(shí)施方案中，通過Northern印跡分析來檢測RNA。Northern印跡分析涉及RNA的分離和互補(bǔ)的標(biāo)記探針的雜交。在又一些實(shí)施方案中，通過與寡核苷酸探針雜交來檢測RNA(或相應(yīng)的cDNA)。使用用于雜交和檢測的多種技術(shù)進(jìn)行的多種雜交測定是可用的。例如，在一些實(shí)施方案中，利用TaqMan測定(PEBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA；參見例如美國專利No.5,962,233和No.5,538,848，其中的每個以引用的方式并入本文)。在PCR反應(yīng)過程中進(jìn)行該測定。TaqMan測定利用AMPLITAQGOLDDNA聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性。PCR反應(yīng)中包含由具有5’-報告染料(例如，熒光染料)和3’-猝滅染料的寡核苷酸組成的探針。在PCR過程中，若探針結(jié)合其靶物，則AMPLITAQGOLD聚合酶的5’-3’核溶解活性在報告染料與猝滅染料之間切割探針。報告染料與猝滅染料的分離導(dǎo)致熒光性增加。信號隨每個PCR循環(huán)而積累并且可以用熒光計進(jìn)行監(jiān)測。在又一些實(shí)施方案中，使用逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)來檢測RNA的表達(dá)。在RT-PCR中，使用逆轉(zhuǎn)錄酶酶將RNA以酶促方式轉(zhuǎn)化成互補(bǔ)的DNA或“cDNA”。然后，使用cDNA作為PCR反應(yīng)的模板?？梢酝ㄟ^任何合適的方法來檢測PCR產(chǎn)物，所述方法包括但不限于凝膠電泳和用DNA特異性染料染色或與經(jīng)標(biāo)記的探針雜交。在一些實(shí)施方案中，利用定量逆轉(zhuǎn)錄酶PCR與標(biāo)準(zhǔn)化競爭性模板混合物法，其描述在美國專利5,639,606、5,643,765和5,876,978中(這些專利中的每個以引用的方式并入本文)。2.蛋白質(zhì)的檢測在其它實(shí)施方案中，通過測量相應(yīng)蛋白質(zhì)或多肽(例如CXCR1、FBXO21、NFYA、NOTCH2、RAD51L1、TBP和表1的其它蛋白質(zhì))的表達(dá)來檢測干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物的基因表達(dá)。可以通過任何合適的方法來檢測蛋白質(zhì)表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，通過免疫組織化學(xué)來檢測蛋白質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)通過其結(jié)合針對該蛋白質(zhì)的抗體來檢測。人CXCR1蛋白的登錄號是NP_000625(以引用的方式并入本文)，而人FBXO21的登錄號是NP_296373(以引用的方式并入本文)。下文描述了抗體的生成。通過本領(lǐng)域中已知的技術(shù)(例如放射性免疫測定法、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)、“三明治式”免疫測定法、免疫放射性測量測定、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定、原位免疫測定(例如，使用膠體金、酶或放射性同位素標(biāo)記物)、Western印跡、沉淀反應(yīng)、凝集測定(例如凝膠凝集測定、血細(xì)胞凝集測定等)、補(bǔ)體結(jié)合測定、免疫熒光測定、蛋白A測定和免疫電泳測定等)來檢測抗體結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，通過檢測一抗上的標(biāo)記物來檢測抗體結(jié)合。在另一個實(shí)施方案中，通過檢測二抗或藥劑與一抗的結(jié)合來檢測一抗。在又一個實(shí)施方案中，二抗是標(biāo)記的。本領(lǐng)域中已知許多用于在免疫測定中檢測結(jié)合的方法，并且它們在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，利用自動化檢測測定。用于免疫測定的自動化的方法包括描述在美國專利5,885,530、4,981,785、6,159,750和5,358,691中的那些，這些專利的每個以引用的方式并入本文。在一些實(shí)施方案中，結(jié)果的分析和呈現(xiàn)也是自動化的。例如，在一些實(shí)施方案中，利用基于與癌癥標(biāo)志物對應(yīng)的一系列蛋白質(zhì)的存在與否來產(chǎn)生預(yù)后的軟件。在其它實(shí)施方案中，免疫測定描述在美國專利5,599,677和5,672,480中；這些專利的每個以引用的方式并入本文。3.cDNA微陣列技術(shù)cDNA微陣列由點(diǎn)樣(通常使用機(jī)器人定位裝置進(jìn)行)于固體支持物(諸如玻璃顯微鏡載玻片)的已知位置上的多種(通常為數(shù)千種)不同cDNA組成。通常，通過質(zhì)粒文庫插入物的PCR擴(kuò)增來獲得cDNA，所述PCR擴(kuò)增使用與質(zhì)粒載體主鏈部分互補(bǔ)或者與序列已知的基因本身互補(bǔ)的引物進(jìn)行。適合于生成微陣列的PCR產(chǎn)物的長度通常在0.5和2.5kB之間。可以選擇來自任何目標(biāo)文庫的全長cDNA、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)或隨機(jī)選擇的cDNA。例如，如Hillier等，1996，6：807-828中所描述，EST是部分測序的cDNA。雖然一些EST對應(yīng)于已知的基因，但是除了少量的3’和/或5’序列和可能衍生EST的mRNA的起源組織外，經(jīng)?？色@得非常少的關(guān)于任何特定EST的信息或沒有該信息。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會的，一般地，cDNA含有足夠的序列信息以獨(dú)特地鑒別人基因組內(nèi)的基因。此外，一般地，cDNA具有足夠的長度以在實(shí)驗(yàn)的雜交條件下與從源自單一基因的mRNA獲得的cDNA選擇性、特異性或唯一地雜交。在典型的微陣列實(shí)驗(yàn)中，將微陣列與源自兩種不同樣本的差別標(biāo)記的RNA、DNA或cDNA群雜交。最通常地，自目標(biāo)細(xì)胞或組織分離RNA(總RNA或多聚A+RNA)，并將其逆轉(zhuǎn)錄以生成cDNA。通常在逆轉(zhuǎn)錄過程中通過在反應(yīng)混合物中摻入標(biāo)記的核苷酸來進(jìn)行標(biāo)記。雖然可以使用各種標(biāo)記物，但是最通常地，將核苷酸與熒光染料Cy3或Cy5綴合。例如，可以使用Cy5-dUTP和Cy3-dUTP。用一種熒光團(tuán)標(biāo)記源自一種樣本(代表例如特定的細(xì)胞類型、組織類型或生長條件)的cDNA，而用第二熒光團(tuán)標(biāo)記源自第二樣本(代表例如不同細(xì)胞類型、組織類型或生長條件)的cDNA。將相似量的來自兩種樣本的標(biāo)記材料與微陣列共雜交。在用Cy5(其發(fā)紅色熒光)和Cy3(其發(fā)綠色熒光)標(biāo)記樣本的微陣列實(shí)驗(yàn)的情況中，原始數(shù)據(jù)(使用能夠定量檢測熒光強(qiáng)度的檢測儀通過掃描微陣列來獲得)是熒光強(qiáng)度的比率(紅色/綠色，R/G)。這些比率表示與微陣列上呈現(xiàn)的cDNA雜交的cDNA分子的相對濃度，并且因此反映與微陣列上所呈現(xiàn)的每種cDNA/基因?qū)?yīng)的mRNA的相對表達(dá)水平。每項(xiàng)微陣列實(shí)驗(yàn)可以提供成千上萬個數(shù)據(jù)點(diǎn)，每個表示兩種樣本中的特定基因的相對表達(dá)。對數(shù)據(jù)的適當(dāng)組織和分析是至關(guān)重要的，而且已經(jīng)開發(fā)出并入標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計學(xué)工具的多種計算機(jī)程序以便于數(shù)據(jù)分析。一項(xiàng)用于組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)是將具有相似表達(dá)模式的基因一起集合成簇。用于對源自微陣列實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行層次聚類分析(hierarchicalclusteranalysis)和顯示的方法描述在Eisen等，1998，PNAS95：14863-14868。如其中所描述，聚類可以與原始數(shù)據(jù)的圖示組合，其中每個數(shù)據(jù)點(diǎn)用定量和定性表示所述數(shù)據(jù)點(diǎn)的顏色表示。通過將來自一大張數(shù)字表的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成可見形式，此過程有助于對數(shù)據(jù)的直觀分析。關(guān)于數(shù)學(xué)工具和/或聚類方法本身的其它信息和詳情可以參見例如Sokal和Sneath，Principlesofnumericaltaxonomy，xvi，359，W.H.Freeman，SanFrancisco，1963；Hartigan，Clusteringalgorithms，xiii，351，Wiley，NewYork，1975；Paull等，1989，J.Natl.CancerInst.81：1088-92；Weinstein等1992，Science258：447-51；vanOsdol等，1994，J.Natl.CancerInst.86：1853-9；及Weinstein等，1997，Science，275：343-9。本發(fā)明中使用的實(shí)驗(yàn)方法的更多詳情參見下文的實(shí)施例。描述用于制作和使用微陣列的方法的其它信息參見美國專利No.5,807,522，其以引用的方式并入本文。關(guān)于使用可商購的部件構(gòu)建微陣列硬件(例如陣列儀(arrayer)和掃描儀)的指令。微陣列技術(shù)的其它討論和用于制備樣本并進(jìn)行微陣列實(shí)驗(yàn)的方案參見例如，DNAarraysforanalysisofgeneexpression，MethodsEnzymol，303：179-205，1999；Fluorescence-basedexpressionmonitoringusingmicroarrays，MethodsEnzymol，306：3-18，1999；及M.Schena(編著)，DNAMicroarrays：APracticalApproach，OxfordUniversityPress，Oxford，UK，1999。4.數(shù)據(jù)分析在一些實(shí)施方案中，使用基于計算機(jī)的分析程序來將通過檢測測定產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)(例如，給定的一種或多種標(biāo)志物的存在、缺失或量)轉(zhuǎn)化為供臨床醫(yī)生用的有預(yù)測價值的數(shù)據(jù)。臨床醫(yī)生可以使用任何合適的手段來評估該預(yù)測數(shù)據(jù)。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了其它益處，即不可能進(jìn)行遺傳學(xué)或分子生物學(xué)方面的培訓(xùn)的臨床醫(yī)生不需要理解原始數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以其最有用的形式直接呈現(xiàn)給臨床醫(yī)生。然后，臨床醫(yī)生能夠立即利用信息以優(yōu)化受試者的護(hù)理。本發(fā)明設(shè)想能夠接受、加工和在進(jìn)行測定的實(shí)驗(yàn)室、信息提供者、醫(yī)學(xué)人員和受試者間傳輸信息的任何方法。例如，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，自受試者獲得樣本(例如活檢組織或血清或尿液樣本)，并將其提交給世界上任何地方(例如，在與受試者居住或信息最終使用的國家不同的國家)的譜分析服務(wù)(例如，醫(yī)學(xué)機(jī)構(gòu)的臨床實(shí)驗(yàn)室，基因組譜分析企業(yè)等)以產(chǎn)生原始數(shù)據(jù)。在樣本包含組織或其它生物學(xué)樣本的情況中，受試者可以訪問醫(yī)學(xué)中心以使樣本被獲得，并發(fā)送到譜分析中心，或者受試者可以自己收集樣本，并直接將其發(fā)送到譜分析中心。在樣本包含先前測定的生物學(xué)信息的情況中，受試者可以將信息直接發(fā)送到譜分析服務(wù)(例如，可以通過計算機(jī)掃描含有信息的信息卡，并使用電子通信系統(tǒng)將數(shù)據(jù)傳送到譜分析中心的計算機(jī))。一旦被譜分析服務(wù)接收，對樣本進(jìn)行處理，并產(chǎn)生譜型(例如表達(dá)數(shù)據(jù))，其對于受試者想要的診斷或預(yù)后信息是特定的。然后，治療臨床醫(yī)生以適合于解釋的形式準(zhǔn)備譜型數(shù)據(jù)。例如，準(zhǔn)備的形式可以代表對受試者的診斷或風(fēng)險評估連同特定治療選項(xiàng)的推薦，而不是提供原始表達(dá)數(shù)據(jù)(例如，檢查許多標(biāo)志物)。可以通過任何合適的方法向臨床醫(yī)生顯示數(shù)據(jù)。例如，在一些實(shí)施方案中，譜分析服務(wù)產(chǎn)生臨床醫(yī)生可以打印(例如，在護(hù)理點(diǎn))的或可以在計算機(jī)監(jiān)視器上向臨床醫(yī)生顯示的報告。在一些實(shí)施方案中，首先在護(hù)理點(diǎn)或在區(qū)域機(jī)構(gòu)分析信息。然后，將原始數(shù)據(jù)發(fā)送到中心處理機(jī)構(gòu)以進(jìn)一步分析和/或?qū)⒃紨?shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為對臨床醫(yī)生或患者有用的信息。中心處理機(jī)構(gòu)提供隱私(所有數(shù)據(jù)儲存于具有統(tǒng)一安全方案的中心機(jī)構(gòu))、速度和數(shù)據(jù)分析一致性的優(yōu)點(diǎn)。然后，中心處理機(jī)構(gòu)可以控制受試者治療后的數(shù)據(jù)的最終處理。例如，使用電子通信系統(tǒng)，中心機(jī)構(gòu)可以將數(shù)據(jù)提供給臨床醫(yī)生、受試者或研究者。在一些實(shí)施方案中，受試者能夠使用電子通信系統(tǒng)來直接評估數(shù)據(jù)。受試者可以基于結(jié)果來選擇進(jìn)一步的干預(yù)或咨詢。在一些實(shí)施方案中，使用數(shù)據(jù)進(jìn)行研究用途。例如，可以使用數(shù)據(jù)來進(jìn)一步優(yōu)化作為疾病的特定狀態(tài)或階段的有用指示物的標(biāo)志物的入選或排除。5.試劑盒在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測和表征癌癥(例如，用于檢測一種或多種標(biāo)志物，或者用于調(diào)控由一種或多種標(biāo)志物表達(dá)的肽的活性)的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，除檢測藥劑和緩沖液外，試劑盒還含有對癌癥標(biāo)志物特異的抗體。在其它實(shí)施方案中，試劑盒含有對于檢測mRNA或cDNA特異的試劑(例如，寡核苷酸探針或引物)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒含有進(jìn)行檢測測定所必需的和/或足以進(jìn)行檢測測定的所有成分，包括所有對照、用于進(jìn)行測定的指導(dǎo)和用于分析和呈現(xiàn)結(jié)果的任何必需的軟件。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括用于測試多核苷酸或蛋白質(zhì)的存在的試劑盒。試劑盒可以包含例如，用于檢測多肽的抗體或用于檢測多核苷酸的探針。另外，試劑盒可以包含參照或?qū)φ諛颖?；用于處理樣本、進(jìn)行測試和解釋結(jié)果的說明；和進(jìn)行測試所必需的緩沖液和其它試劑。在其它實(shí)施方案中，試劑盒包含用于檢測實(shí)體瘤干細(xì)胞基因標(biāo)簽的一種或多種基因的表達(dá)的引物對。在其它實(shí)施方案中，試劑盒包含用于檢測實(shí)體瘤干細(xì)胞基因標(biāo)簽的一種或多種基因的表達(dá)的cDNA或寡核苷酸陣列。6.體內(nèi)成像在一些實(shí)施方案中，使用體內(nèi)成像技術(shù)來顯現(xiàn)動物(例如，人或非人哺乳動物)中癌癥標(biāo)志物的表達(dá)。例如，在一些實(shí)施方案中，使用對癌癥標(biāo)志物特異的經(jīng)標(biāo)記抗體來標(biāo)記癌癥標(biāo)志物mRNA(例如，CXCR1或FBXO21mRNA)或蛋白質(zhì)(例如CXCR1或FBXO21蛋白)。可以使用體內(nèi)成像方法在個體中檢測特異性結(jié)合且經(jīng)標(biāo)記的抗體，所述體內(nèi)成像方法包括但不限于放射性核素成像、正電子成象術(shù)、計算機(jī)化軸向斷層攝影術(shù)、X-射線或磁共振成像法、熒光檢測和化學(xué)發(fā)光檢測。下文描述了用于生成針對本發(fā)明的癌癥標(biāo)志物的抗體的方法。本發(fā)明的體內(nèi)成像方法在診斷表達(dá)本發(fā)明的實(shí)體瘤干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物的癌癥中是有用的。使用體內(nèi)成像來顯現(xiàn)指示癌癥的標(biāo)志物的存在。此類技術(shù)允許不使用令人不快的活組織檢查的診斷。本發(fā)明的體內(nèi)成像方法也用于向癌癥患者提供預(yù)后。例如，可以檢測指示癌癥干細(xì)胞的標(biāo)志物的存在?？梢赃M(jìn)一步使用本發(fā)明的體內(nèi)成像方法來檢測身體其它部分中的轉(zhuǎn)移癌。在一些實(shí)施方案中，將對CXCR1或FBXO21特異的藥劑(例如抗體)進(jìn)行熒光標(biāo)記。將經(jīng)標(biāo)記的抗體導(dǎo)入受試者中(例如，口服或不經(jīng)腸道)。使用任何合適的方法(例如，使用美國專利6，198，107中所描述的裝置進(jìn)行，該專利以引用的方式并入本文)來檢測經(jīng)熒光標(biāo)記的抗體。在其它實(shí)施方案中，對抗體進(jìn)行放射性標(biāo)記。供體內(nèi)診斷用的抗體的使用是本領(lǐng)域中公知的。Sumerdon等，(Nucl.Med.Biol17：247-254[1990])已經(jīng)描述了一種經(jīng)優(yōu)化的抗體-螯合劑，使用銦-111作為標(biāo)記物用于進(jìn)行腫瘤放射免疫閃爍成像。Griffin等，(JClinOnc9：631-640[1991])已經(jīng)描述了此制劑在檢測懷疑患有胰腺癌的患者的腫瘤的用途。具有順磁性離子的相似制劑作為標(biāo)記物用于磁共振成像的用途是本領(lǐng)域中已知的(Lauffer，MagneticResonanceinMedicine22：339-342[1991])。所使用的標(biāo)記物將取決于所選擇的成像形態(tài)?？梢允褂梅派湫詷?biāo)記物(諸如銦-111、锝-99m或碘-131)進(jìn)行平面掃描或單光子發(fā)射計算斷層攝影術(shù)(SPECT)。也可以使用正電子發(fā)射標(biāo)記物(諸如氟-19)進(jìn)行正電子成象術(shù)(PET)。對于MRI，還可以使用順磁性離子，諸如釓(III)或錳(II)。半衰期為1小時至3.5天的放射性金屬可用于與抗體綴合，諸如鈧-47(3.5天)、鎵-67(2.8天)、鎵-68(68分鐘)、锝-99m(6小時)和銦-111(3.2天)，其中鎵-67、锝-99m和銦-111對于γ照相機(jī)成像是優(yōu)選的，鎵-68對于正電子成象術(shù)是優(yōu)選的。用此類放射性金屬標(biāo)記抗體的一種有用的方法借助于雙功能性螯合劑，諸如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)，如例如對于In-111和Tc-99m，由Khaw等(Science209：295[1980])，及由Scheinberg等(Science215：1511[1982])所描述的。也可以使用其它螯合劑，但是1-(對羧基甲氧基芐基)EDTA和DTPA的羧基碳酸酐是有利的，這是因?yàn)樗鼈兊氖褂迷试S基本上不影響抗體的免疫反應(yīng)性的情況下的綴合。用于將DPTA與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的另一種方法利用DTPA的環(huán)酐，如由Hnatowich等(Int.J.Appl.Radiat.Isot.33：327[1982])所描述的，用In-111標(biāo)記白蛋白，但是可以使其適合于用于標(biāo)記抗體。用Tc-99m標(biāo)記抗體的一種合適的方法是Crockford等，(美國專利No.4,323,546，其以引用的方式并入本文)的預(yù)錫化法，所述方法不使用與DPTA的螯合。用Tc-99m標(biāo)記免疫球蛋白的方法是由Wong等(Int.J.Appl.Radiat.Isot.，29：251[1978])所描述的方法，用于血漿蛋白質(zhì)，而且最近由Wong等(J.Nucl.Med.，23：229[1981])成功應(yīng)用于標(biāo)記抗體。在與特定抗體綴合的放射性金屬的情況中，同樣期望在不破壞其免疫特異性的情況下將盡可能高比例的放射性標(biāo)記物引入抗體分子中?？梢酝ㄟ^在本發(fā)明的特定干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物的存在下實(shí)現(xiàn)放射性標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步改進(jìn)，以確?？贵w上的抗原結(jié)合位點(diǎn)將得到保護(hù)。在又一些實(shí)施方案中，利用體內(nèi)生物光子成像(Xenogen，Almeda，CA)來進(jìn)行體內(nèi)成像。此實(shí)時體內(nèi)成像利用螢光素酶。將螢光素酶基因并入細(xì)胞、微生物和動物中(例如，作為具有本發(fā)明癌癥標(biāo)志物的融合蛋白)。在有活性時，它導(dǎo)致發(fā)射光的反應(yīng)。使用CCD照相機(jī)和軟件來捕捉圖像，并對其進(jìn)行分析。III.抗體和抗體片段本發(fā)明提供了針對CXCR1、FBXO21、NFYA、NOTCH2、RAD51L1、TBP和表1的其它蛋白質(zhì)的分離的抗體和抗體片段?？贵w或抗體片段可以是特異性識別這些蛋白質(zhì)的任何單克隆或多克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合CXCR1、FBXO21、NFYA、NOTCH2、RAD51L1、TBP和表1的其它蛋白質(zhì)的單克隆抗體或其片段。在一些實(shí)施方案中，單克隆抗體或其片段是特異性結(jié)合這些蛋白質(zhì)的嵌合或人源化抗體。在其它實(shí)施方案中，單克隆抗體或其片段是特異性結(jié)合這些蛋白質(zhì)的人抗體。針對CXCR1、FBXO21、NFYA、NOTCH2、RAD51L1、TBP和表1的其它蛋白質(zhì)的抗體在本文中所描述的實(shí)驗(yàn)、診斷和治療方法中得到應(yīng)用。在某些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的抗體來檢測生物樣本(諸如，例如患者活檢組織、胸腔積液或血液樣本)中癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白質(zhì)的表達(dá)?？梢詫⒒顧z組織切片，并使用例如免疫熒光或免疫組織化學(xué)來檢測蛋白質(zhì)?；蛘?，分離來自樣本的單個細(xì)胞，并通過FACS分析在固定的或活的細(xì)胞上檢測蛋白質(zhì)表達(dá)。此外，可以在蛋白質(zhì)陣列上使用抗體以檢測癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物例如在腫瘤細(xì)胞上、在細(xì)胞溶解產(chǎn)物中或在其它蛋白質(zhì)樣本中的表達(dá)。在其它實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的抗體來抑制腫瘤細(xì)胞生長，其通過在基于細(xì)胞的體外測定或體內(nèi)動物模型中使抗體與腫瘤細(xì)胞接觸來實(shí)現(xiàn)。在又一些實(shí)施方案中，使用抗體來治療人患者的癌癥，其通過施用治療有效量的針對癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物(例如，來自表1)的抗體來實(shí)現(xiàn)?？梢酝ㄟ^任何已知的方法來制備多克隆抗體。可以通過多次皮下或腹膜內(nèi)注射任選地與鑰孔傶血蘭蛋白(KLH)、血清白蛋白等綴合的相關(guān)抗原(純化的肽片段、全長重組蛋白質(zhì)、融合蛋白等)來使動物(例如兔、大鼠、小鼠、驢等)免疫，從而產(chǎn)生多克隆抗體，所述相關(guān)抗原在無菌鹽水中稀釋并與佐劑(例如，完全或不完全弗氏佐劑)組合以形成穩(wěn)定的乳劑。然后，從如此免疫的動物的血液、腹水等中回收多克隆抗體。使收集的血液凝結(jié)，并倒出血清，通過離心澄清，并測定抗體效價?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法從血清或腹水中純化多克隆抗體，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括親和層析、離子交換層析、凝膠電泳、透析等?？梢允褂弥T如由Kohler和Milstein(1975)Nature256：495所描述的那些雜交瘤方法來制備單克隆抗體。使用雜交瘤方法，如上文所描述的那樣使小鼠、倉鼠或其它合適的宿主動物免疫，以引發(fā)淋巴細(xì)胞生成將特異性結(jié)合免疫抗原的抗體?；蛘撸梢栽隗w外使淋巴細(xì)胞免疫。免疫后，將淋巴細(xì)胞分離，并使用例如聚乙二醇使其與合適的骨髓瘤細(xì)胞系融合以形成雜交瘤細(xì)胞，然后可以從未融合的淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞中選擇該雜交瘤細(xì)胞。然后，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的方法(Goding，MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice，AcademicPress，1986)在體外培養(yǎng)中或在動物體內(nèi)作為腹水瘤增殖雜交瘤細(xì)胞，所述雜交瘤細(xì)胞生成特異性針對選定抗原的單克隆抗體，如通過免疫沉淀、免疫印跡或通過體外結(jié)合測定(諸如放射性免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)所測定。然后，可以從培養(yǎng)基或腹水中純化單克隆抗體，如上文對多克隆抗體所描述的?；蛘?，如美國專利4，816,567中所描述，也可以使用重組DNA方法來生成單克隆抗體。使用特異性擴(kuò)增編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸引物，諸如通過RT-PCR從諸如成熟的B細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞中分離編碼單克隆抗體的多核苷酸，并使用常規(guī)的方法來測定其序列。然后，將編碼重鏈和輕鏈的分離的多核苷酸克隆至合適的表達(dá)載體中，當(dāng)將所述合適的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞(諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不另外產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的骨髓瘤細(xì)胞)中時，宿主細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體。還有，可以自噬菌體展示文庫中分離期望物種的重組單克隆抗體或其片段，如(McCafferty等，1990，Nature，348：552-554；Clackson等，1991，Nature，352：624-628；及Marks等，1991，J.Mol.Biol.，222：581-597)所描述?？梢允褂弥亟MDNA技術(shù)以多種不同的方式進(jìn)一步修改編碼單克隆抗體的一種或多種多核苷酸以生成備選抗體。在一個實(shí)施方案中，例如小鼠單克隆抗體的輕鏈和重鏈的恒定域可以1)被例如人抗體的那些區(qū)域取代以生成嵌合抗體，或2)被非免疫球蛋白多肽取代以生成融合抗體。在其它實(shí)施方案中，將恒定區(qū)截短或除去以生成單克隆抗體的期望抗體片段。此外，可以使用可變區(qū)的定點(diǎn)或高密度誘變來優(yōu)化單克隆抗體的特異性、親和力等。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，針對癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物的單克隆抗體是人源化抗體。人源化抗體是可變區(qū)內(nèi)含有來自非人(例如，鼠)抗體的最小限度序列的抗體。此類抗體在治療上用以在對人受試者施用時降低抗原性和HAMA(人抗小鼠抗體)應(yīng)答。實(shí)際上，人源化抗體通常是具有最小限度至沒有非人序列的人抗體。人抗體是由人生成的抗體或具有與由人生成的抗體對應(yīng)的氨基酸序列的抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的多種技術(shù)來生成人源化抗體。可以通過用具有期望特異性、親和力和性能(capability)的非人抗體(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠等)的CDR取代人抗體的CDR來使抗體人源化(Jones等，1986，Nature，321：522-525；Riechmann等，1988，Nature，332：323-327；Verhoeyen等，1988，Science，239：1534-1536)。可以通過取代Fv框架區(qū)中的和/或被取代的非人殘基內(nèi)的其它殘基來進(jìn)一步修改人源化抗體以改善并優(yōu)化抗體的特異性、親和力和/或性能?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的多種技術(shù)來直接制備人抗體?？梢陨审w外免疫的或自免疫個體分離的永生人B淋巴細(xì)胞，該免疫個體產(chǎn)生針對靶抗原的抗體(參見例如，Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，第77頁(1985)；Boemer等，1991，J.Immunol.，147(1)：86-95；及美國專利5,750,373)。還有，可以自噬菌體文庫選擇人抗體，其中所述噬菌體文庫表達(dá)人抗體(Vaughan等，1996，NatureBiotechnology，14；309-314；Sheets等，1998，PNAS，95；6157-6162；Hoogenboom和Winter，1991，J.Mol.Biol.，227：381；Marks等，1991，J.Mol.Biol.，222：581)。也可以在含有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠中生成人源化抗體，所述轉(zhuǎn)基因小鼠在免疫后能夠在沒有內(nèi)源性免疫球蛋白生成的情況中生成全部人抗體。此方法描述于美國專利5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016中。本發(fā)明還包括特異性識別癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物的雙特異性抗體。雙特異性抗體是能夠特異性識別并結(jié)合至少兩種不同表位的抗體。雙特異性抗體可以是完整的抗體或抗體片段。用于制備雙特異性抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域中常見的(Millstein等，1983，Nature305：537-539；Brennan等，1985，Science229：81；Suresh等，1986，MethodsinEnzymol.121：120；Traunecker等，1991，EMBOJ.10：3655-3659；Shalaby等，1992，J.Exp.Med.175：217-225；Kostelny等，1992，J.Immunol.148：1547-1553；Gruber等，1994，J.Immunol.152：5368；及美國專利5,731，168)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，例如，可能期望使用抗體片段，而非完整的抗體以提高腫瘤滲透。已知多種用于生成抗體片段的技術(shù)。傳統(tǒng)上，經(jīng)由對完整抗體的蛋白水解消化來產(chǎn)生這些片段(例如Morimoto等，1993，JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24：107-117及Brennan等，1985，Science，229：81)。然而，這些片段現(xiàn)在通常通過重組宿主細(xì)胞直接生成，如上文所描述的。因此，F(xiàn)ab、Fv和scFv抗體片段都可以在大腸桿菌或其它宿主細(xì)胞中表達(dá)，并自大腸桿菌或其它宿主細(xì)胞分泌，如此允許產(chǎn)生大量的這些片段。或者，此類抗體片段可以自上文所討論的抗體噬菌體文庫分離?？贵w片段也可以是線性抗體，例如美國專利5,641，870中所描述的，而且可以是單特異性的或雙特異性的。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對于熟練從業(yè)人員將是顯而易見的。特別在抗體片段的情況中，可能期望進(jìn)一步修改抗體以延長其血清半衰期。這可以通過以下來實(shí)現(xiàn)，即例如通過抗體片段中合適區(qū)域的突變將補(bǔ)救受體結(jié)合表位引入抗體片段中或者將表位引入肽標(biāo)簽中，然后將所述肽標(biāo)簽與抗體片段在任一末端或在中間融合(例如，通過DNA或肽合成來進(jìn)行)。本發(fā)明進(jìn)一步包括與本文中所提出的嵌合、人源化和人抗體或其抗體片段基本上同源的變體和等同物。這些可以含有例如保守取代突變，即用相似的氨基酸取代一個或多個氨基酸。例如，保守取代指一種氨基酸用相同通用種類內(nèi)的另一種氨基酸取代，諸如例如，一種酸性氨基酸用另一種酸性氨基酸取代，一種堿性氨基酸用另一種堿性氨基酸取代，或一種中性氨基酸用另一種中性氨基酸取代。保守氨基酸取代的意圖是本領(lǐng)域中公知的。本發(fā)明還屬于包含與細(xì)胞毒劑綴合的抗體的免疫綴合物。細(xì)胞毒劑包括化療劑、生長抑制劑、毒素(例如，細(xì)菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段)、放射性同位素(即放射性綴合物)等?？捎糜谏纱祟惷庖呔Y合物的化療劑包括例如，甲氨蝶呤、阿霉素、多柔比星、美法侖(melphalan)、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素或其它嵌合劑?？梢允褂玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀鞟鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、塑蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白質(zhì)、石竹素(dianthin)蛋白質(zhì)、垂序商陸(Phytolacaamericana)蛋白質(zhì)(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊諾霉素(neomycin)和單端孢霉毒素(tricothecenes)。多種放射性核素可用于生成放射性綴合的抗體，包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。使用多種雙功能性蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑生成抗體與細(xì)胞毒劑的綴合物，這些雙功能性蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑諸如3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(諸如鹽酸二甲基己二酰亞胺化物HCL)、活性酯(諸如雙琥珀酰亞胺辛二酸酯)、醛(諸如戊二醛)、二疊氮基化合物(諸如二(對疊氮苯甲?；?己二胺)、二重氮衍生物(諸如二-(對二重氮苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)來。也可以使用抗體與一種或多種小分子毒素(諸如卡奇霉素(calicheamicin)、類美坦素(maytansinoid)、單端孢霉烯族毒素(trichothene)和CC1065以及具有毒素活性的這些毒素的衍生物)的綴合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體含有人Fc區(qū)，其被修改以增強(qiáng)效應(yīng)器功能，例如抗原依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。這可以通過在抗體的Fc區(qū)中引入一種或多種氨基酸取代來實(shí)現(xiàn)。例如，可以在Fc區(qū)中引入一個或多個半胱氨酸殘基以使得在此區(qū)域中形成鏈間二硫鍵，從而改善補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)(Caron等，1992，J.ExpMed.176：1191-1195；Shopes，1992，Immunol.148：2918-2922)。也可以使用異雙功能的交聯(lián)劑來制備具有增強(qiáng)抗腫瘤活性的同二聚體抗體，如Wolff等，1993，CancerResearch53：2560-2565所描述。或者，可以設(shè)計具有雙Fc區(qū)的抗體(Stevenson等，1989，Anti-CancerDrugDesign3：219-230)。IV.藥物篩選在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物篩選測定(例如，以篩選抗癌藥物)。本發(fā)明的篩選方法利用干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物(例如，CXCR1、FBXO21、NFYA、NOTCH2、RAD51L1、TBP和表1的其它蛋白質(zhì))，其使用本發(fā)明的方法來鑒別。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了篩選CXCR1或FBXO21表達(dá)或活性改變(例如，提高或降低)的化合物的方法。在一些實(shí)施方案中，候選化合物是針對癌癥標(biāo)志物的反義制劑或siRNA制劑(例如，寡核苷酸)。在其它實(shí)施方案中，候選化合物是與本發(fā)明的干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物特異結(jié)合的抗體。在某些實(shí)施方案中，使用本文中所描述的方法來篩選小分子化合物的文庫。在一種篩選方法中，評估候選化合物改變干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物表達(dá)的能力，方式是使化合物與表達(dá)干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物的細(xì)胞接觸，然后測定候選化合物對表達(dá)的影響。在一些實(shí)施方案中，通過檢測細(xì)胞表達(dá)的癌癥標(biāo)志物mRNA水平來測定候選化合物對癌癥標(biāo)志物基因表達(dá)的影響?？梢酝ㄟ^任何合適的方法來檢測mRNA表達(dá)。在其它實(shí)施方案中，通過測量癌癥標(biāo)志物編碼的多肽水平來測定候選化合物對癌癥標(biāo)志物基因表達(dá)的影響?？梢允褂萌魏魏线m的方法來測量所表達(dá)的多肽水平，所述方法包括但不限于本文中所公開的那些。在一些實(shí)施方案中，檢測細(xì)胞生物學(xué)中的其它變化(例如，凋亡)。具體地，本發(fā)明提供了用于鑒別調(diào)控物，即候選或測試化合物或藥劑(例如，蛋白質(zhì)、肽、模擬肽、類肽、小分子或其它藥物)的方法，該調(diào)控物與本發(fā)明的癌癥標(biāo)志物結(jié)合或者改變與本發(fā)明的癌癥標(biāo)志物有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或功能、對例如干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物表達(dá)或癌癥標(biāo)志物活性具有抑制(或刺激)影響或者對例如癌癥標(biāo)志物底物的表達(dá)或活性具有刺激或抑制影響?？梢允褂萌绱髓b別的化合物在治療方案中直接或間接調(diào)控靶基因產(chǎn)物(例如，干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物基因，諸如CXCR1或FBXO21)的活性、完善靶基因產(chǎn)物的生物學(xué)功能或者鑒別破壞正常靶基因相互作用的化合物。抑制癌癥標(biāo)志物活性或表達(dá)的化合物可用于治療增殖性病癥，例如癌癥，特別是轉(zhuǎn)移性癌癥，或者消除或控制腫瘤干細(xì)胞以預(yù)防或降低癌癥風(fēng)險。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于篩選作為癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)或多肽或其生物活性部分的底物的候選或測試化合物的測定。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于篩選與癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)或多肽或其生物活性部分結(jié)合或調(diào)控癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)或多肽或其生物活性部分的活性的測定?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的組合文庫方法中的多種方法之任一種來獲得本發(fā)明的測試化合物，所述組合文庫方法包括生物學(xué)文庫；類肽文庫(具有肽功能性，但具有新的、非肽主鏈的分子的文庫，所述分子對酶促降解有抗性，但是然而其保留生物活性；參見例如Zuckennann等，J.Med.Chem.37：2678-85[1994])；空間可尋址平行固相或液相文庫；需要解卷積的合成文庫方法；“一珠一化合物”文庫方法；和使用親和層析選擇的合成文庫方法。生物學(xué)文庫和類肽文庫方法優(yōu)選與肽文庫一起使用，而其它四種方法可適用于化合物的肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文庫(Lam(1997)AnticancerDrugDes.12：145)?？稍诒绢I(lǐng)域找到用于合成分子文庫的方法的例子，例如：DeWitt等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909[1993]；Erb等，Proc.Nad.Acad.Sci.USA91：11422[1994]；Zuckermann等，J.Med.Chem.37：2678[1994]；Cho等，Science261：1303[1993]；Carrell等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33.2059[1994]；Carell等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061[1994]；及Gallop等，J.Med.Chem.37：1233[1994]?；衔锏奈膸炜梢源嬖谟谌芤褐?例如Houghten，Biotechniques13：412-421[1992])，或在珠上(Lam，Nature354：82-84[1991])、芯片上(Fodor，Nature364：555-556[1993])、細(xì)菌或孢子上(美國專利No.5,223,409；以引用的方式并入本文)、質(zhì)粒上(Cull等，Proc.Nad.Acad.Sci.USA89：18651869[1992])或噬菌體上(Scott和Smith，Science249：386-390[1990]；DevlinScience249：404-406[1990]；Cwirla等，Proc.NatI.Acad.Sci.87：6378-6382[1990]；Felici，J.Mol.Biol.222：301[1991])。在一個實(shí)施方案中，測定是一種基于細(xì)胞的測定，其中使表達(dá)干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)或其生物活性部分的細(xì)胞與測試化合物接觸，并測定測試化合物調(diào)控癌癥標(biāo)志物的活性的能力。可以通過監(jiān)測例如酶活性的變化來實(shí)現(xiàn)對測試化合物調(diào)控干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物活性的能力的測定。例如，細(xì)胞可以是哺乳動物起源的。也可以評估測試化合物調(diào)控與化合物(例如，干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物底物)結(jié)合的癌癥標(biāo)志物的能力。這可以如下實(shí)現(xiàn)，即例如使化合物(例如，底物)與放射性同位素或酶標(biāo)記物偶聯(lián)，從而可以通過檢測復(fù)合物中的被標(biāo)記的化合物(例如，底物)來測定化合物(例如，底物)與癌癥標(biāo)志物的結(jié)合。或者，使干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物與放射性同位素或酶標(biāo)記物偶聯(lián)以監(jiān)測測試化合物調(diào)控與復(fù)合物中的癌癥標(biāo)志物底物結(jié)合的癌癥標(biāo)志物的能力。例如，可以用125I、35S、14C或3H直接或間接地標(biāo)記化合物(例如，底物)，并通過放射性發(fā)射的直接計數(shù)或者通過閃爍計數(shù)來檢測放射性同位素?；蛘?，可以用例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或螢光素酶來對化合物進(jìn)行酶標(biāo)記，并通過測定合適底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物來檢測酶標(biāo)記物。可以評估化合物(例如干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物底物)在標(biāo)記或不標(biāo)記任何相互作用物的情況中與干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物相互作用的能力。例如，可以使用微生理計來檢測化合物在不標(biāo)記化合物或癌癥標(biāo)志物的情況中與癌癥標(biāo)志物的相互作用(McConnell等Science257：1906-1912[1992])。如本文中所使用的，“微生理計”(例如，細(xì)胞傳感儀)是使用光尋址電位傳感器(LAPS)測量細(xì)胞酸化其環(huán)境的速率的分析儀器?？梢允褂么怂峄俾实淖兓鳛榛衔锱c癌癥標(biāo)志物之間的相互作用的指標(biāo)。在又一個實(shí)施方案中，提供一種無細(xì)胞測定，其中使癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)或其生物活性部分與測試化合物接觸，并評估測試化合物與干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)或其生物活性部分結(jié)合的能力。要在本發(fā)明的測定中使用的癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)的生物活性部分包括參與與底物或其它蛋白質(zhì)的相互作用的片段，例如，具有高表面可能性得分(highsurfaceprobabilityscore)的片段。無細(xì)胞測定涉及制備靶基因蛋白質(zhì)與測試化合物的反應(yīng)混合物，其條件和時間足以允許兩種組分相互作用并結(jié)合，如此形成可以移除和/或檢測的復(fù)合物。也可以例如使用熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)來檢測兩個分子之間的相互作用(參見例如Lakowicz等，美國專利No.5,631,169；Stavrianopoulos等，美國專利No.4,968,103；這些專利的每個以引用的方式并入本文)。選擇熒光團(tuán)標(biāo)記物選擇使得第一供體分子發(fā)射的熒光能量會被第二“受體”分子上的熒光標(biāo)記物吸收，繼而，第二“受體”分子能夠由于吸收的能量而發(fā)熒光?；蛘?，“供體”蛋白質(zhì)分子可以僅利用色氨酸殘基的天然熒光能量。選擇如下的標(biāo)記物，其發(fā)射不同波長的光，使得“受體”分子標(biāo)記物可以與“供體”的分子標(biāo)記物區(qū)分。因?yàn)闃?biāo)記物間的能量轉(zhuǎn)移效率與分隔分子的距離有關(guān)，所以可以評估分子間的空間關(guān)系。在分子間發(fā)生結(jié)合的情況中，測定中的“受體”分子標(biāo)記物的熒光發(fā)射應(yīng)當(dāng)是最大的?？梢越?jīng)由本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)熒光測量檢測手段(例如，使用熒光計)來方便地測量FRET結(jié)合事件。在另一個實(shí)施方案中，可以使用實(shí)時生物分子相互作用分析(BIA)來實(shí)現(xiàn)測定干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)與靶分子結(jié)合的能力(參見，例如Sjolander和Urbaniczky，Anal.Chem.63：2338-2345[1991]及Szabo等Curr.Opin.Struct.Biol.5：699-705[1995])。“表面等離振子共振”或“BIA”在不標(biāo)記任何相互作用物(例如，BlAcore)的情況中實(shí)時檢測生物特異性相互作用。結(jié)合表面上的質(zhì)量變化(指示結(jié)合事件)導(dǎo)致表面附近的光折光率變化(表面等離振子共振(SPR)的光學(xué)現(xiàn)象)，這會產(chǎn)生可作為生物分子間的實(shí)時反應(yīng)的指標(biāo)的可檢測信號。在一個實(shí)施方案中，將靶基因產(chǎn)物或測試底物錨定到固相上。可以在反應(yīng)結(jié)束時檢測錨定到固相上的靶基因產(chǎn)物/測試化合物復(fù)合物。可以將靶基因產(chǎn)物錨定到固體表面上，并可以用本文中所討論的可檢測標(biāo)記物直接或間接地標(biāo)記測試化合物(其不被錨定)?？赡苄枰獙Ω杉?xì)胞癌癥標(biāo)志物、抗癌癥標(biāo)志物抗體或其靶分子進(jìn)行固定以便于分開復(fù)合與未復(fù)合形式的一種或兩種蛋白質(zhì)，以及適應(yīng)測定的自動化。測試化合物與干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)的結(jié)合，或癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)在存在和沒有候選化合物的情況中與靶分子的相互作用可以在任何適合于容納反應(yīng)物的容器中實(shí)現(xiàn)。此類容器的例子包括微量滴定板、試管和微離心管。在一個實(shí)施方案中，可以提供融合蛋白，其增加允許一種或兩種蛋白質(zhì)結(jié)合基質(zhì)的域。例如，可以將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-癌癥標(biāo)志物融合蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/靶融合蛋白吸附到谷胱甘肽Sepharose珠(SigmaChemical，St.Louis，MO)或源自谷胱甘肽的微量滴定板上，然后將其與測試化合物或測試化合物和未吸附的靶蛋白或癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)組合，并在有助于復(fù)合物形成的條件(例如，在鹽和pH方面的生理學(xué)條件)下溫育混合物。溫育后，清洗珠或微量滴定板孔以除去任何未結(jié)合的組分，在珠的情況中，使基質(zhì)固定，直接或間接測定復(fù)合物，例如如上文所描述的。或者，可以自基質(zhì)解離復(fù)合物，并使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)來測定癌癥標(biāo)志物結(jié)合水平或活性。用于將癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)或靶分子固定在基質(zhì)上的其它技術(shù)包括使用生物素與鏈霉抗生物素蛋白的綴合?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的技術(shù)(例如，生物素化試劑盒，PierceChemicals，Rockford，IL)由生物素-NHS(N-羥基-琥珀酰亞胺)制備生物素化的癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)或靶分子，并使其固定在經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白包被的96孔板(PierceChemical)的孔中。為了進(jìn)行測定，將非固定的組分添加至含有錨定成分的包被表面。反應(yīng)完成后，在各種條件下除去(例如，通過清洗進(jìn)行)未反應(yīng)的組分，使得所形成的任何復(fù)合物將會在固體表面上保持固定?？梢砸远喾N方式實(shí)現(xiàn)對錨定在固體表面的復(fù)合物的檢測。在預(yù)先標(biāo)記先前非固定組分的情況中，表面上檢測到固定的標(biāo)記物表面形成復(fù)合物。在不預(yù)先標(biāo)記先前非固定組分的情況中，可以使用間接的標(biāo)記物來檢測錨定在表面上的復(fù)合物；例如，使用對固定組分特異的經(jīng)標(biāo)記抗體(繼而，抗體可被直接標(biāo)記或者用例如經(jīng)標(biāo)記的抗IgG抗體間接標(biāo)記)。利用對干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)或靶分子有反應(yīng)性，但不干擾干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)與其靶分子結(jié)合的抗體進(jìn)行此測定?？梢詫⒋祟惪贵w衍生至平板的孔，并通過抗體綴合將未結(jié)合的靶物或癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)固定在孔內(nèi)。除了上文所描述的關(guān)于GST固定復(fù)合物的方法外，用于檢測此類復(fù)合物的方法包括使用對癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)或靶分子有反應(yīng)性的抗體對復(fù)合物進(jìn)行的免疫檢測，及依賴于檢測與癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)或靶分子有關(guān)的酶活性的酶聯(lián)測定?；蛘?，可以在液相中進(jìn)行無細(xì)胞測定。在此類測定中，通過多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)之任一種使反應(yīng)產(chǎn)物與未反應(yīng)的成分分離，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括但不限于：差速離心(參見例如Rivas和Minton，TrendsBiochemSci18：284-7[1993])；層析(凝膠過濾層析、離子交換層析)；電泳(參見例如Ausubel等編著CurrentProtocolsinMolecularBiology1999，J.Wiley：NewYork.)；以及免疫沉淀(參見例如Ausubel等編著CurrentProtocolsinMolecularBiology1999，J.Wiley：NewYork)。此類樹脂和層析技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見例如HeegaardJ.Mol.Recognit11：141-8[1998]；HageandTweedJ.Chromatogr.Biomed.Sci.Appl699：499-525[1997])。此外，如本文中所描述的，也可以方便地利用熒光能量轉(zhuǎn)移檢測結(jié)合，而不用從溶液進(jìn)一步純化復(fù)合物。測定可以包括使干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)或其生物活性部分和與癌癥標(biāo)志物結(jié)合的已知化合物接觸以形成測定混合物，使測定混合物與測試化合物接觸，并測定測試化合物與癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)相互作用的能力，其中測定測試化合物與癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)相互作用的能力包括與已知化合物相比，測定測試化合物優(yōu)先與癌癥標(biāo)志物或其生物活性部分結(jié)合，或調(diào)控靶分子活性的能力。就細(xì)胞癌癥標(biāo)志物能在體內(nèi)與一種或多種細(xì)胞或胞外大分子(諸如蛋白質(zhì))相互作用的方面來說，此類相互作用的抑制劑是有用的?？梢允褂猛N的測定來鑒別抑制劑。例如，制備預(yù)先形成的靶基因產(chǎn)物與相互作用的細(xì)胞或胞外結(jié)合配偶體產(chǎn)物的復(fù)合物，從而標(biāo)記靶基因產(chǎn)物或其結(jié)合配偶體，但是由標(biāo)記物產(chǎn)生的信號由于復(fù)合物形成而猝滅(參見，例如美國專利No.4,109,496，以引用的方式并入本文，該專利利用此方法進(jìn)行免疫測定)。加入與來自預(yù)先形成的復(fù)合物的種類之一競爭并將其取代的測試物質(zhì)會導(dǎo)致產(chǎn)生高于背景的信號。這樣，可以鑒別破壞靶基因產(chǎn)物-結(jié)合配偶體相互作用的測試物質(zhì)。或者，可以在雙雜交測定或三雜交測定中使用癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)作為“誘餌蛋白”(參見例如美國專利No.5,283,317；Zervos等，Cell72：223-232[1993]；Madura等，J.Biol.Chem.268.12046-12054[1993]；Bartel等，Biotechniques14：920-924[1993]；Iwabuchi等，Oncogene8：1693-1696[1993]；及BrentWO94/10300；每篇以引用的方式并入本文)，以鑒別與癌癥標(biāo)志物結(jié)合或與癌癥標(biāo)志物(“癌癥標(biāo)志物結(jié)合蛋白”或“癌癥標(biāo)志物-bp”)相互作用并參與癌癥標(biāo)志物活性的其它蛋白質(zhì)。通過癌癥標(biāo)志物蛋白質(zhì)或靶物，此類癌癥標(biāo)志物-bp可以是信號激活劑或抑制劑，例如作為癌癥標(biāo)志物介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游元件。也可以鑒別癌癥標(biāo)志物表達(dá)的調(diào)控劑。例如，使細(xì)胞或無細(xì)胞混合物與候選化合物接觸，并相對于沒有候選化合物情況中的干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)水平評估癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)。當(dāng)癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)在候選化合物存在下大于其缺乏時，將候選化合物鑒別為癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的刺激物。或者，當(dāng)癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)在候選化合物存在下小于(即，統(tǒng)計學(xué)上顯著小于)其缺乏時，將候選化合物鑒別為癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制劑?？梢酝ㄟ^本文中所描述的用于檢測癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白質(zhì)的方法來測定癌癥標(biāo)志物mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的水平。本發(fā)明進(jìn)一步屬于通過上文所描述的篩選測定鑒別的新藥劑(參見例如，下文關(guān)于癌癥療法的描述)。因而，在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，在合適的動物模型(諸如本文中所描述的那些)中進(jìn)一步使用如本文中所描述那樣鑒別的藥劑(例如，癌癥標(biāo)志物調(diào)控劑、反義癌癥標(biāo)志物核酸分子、siRNA分子、癌癥標(biāo)志物特異性抗體或癌癥標(biāo)志物結(jié)合配偶體)來測定用此類藥劑治療的功效、毒性、副作用或作用機(jī)制。此外，通過上文所描述的篩選測定鑒別的新藥劑可以例如用于如本文中所描述的治療(例如，治療患有癌癥的人患者)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明采用非黏附乳腺球來進(jìn)行各個篩選步驟，包括用于篩選CXCR1或FBXO21信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑的方法。非黏附乳腺球是一種體外培養(yǎng)系統(tǒng)，其允許原代人乳腺上皮干細(xì)胞和祖細(xì)胞以未分化狀態(tài)增殖，這基于其在懸浮液中作為球形結(jié)構(gòu)增殖的能力進(jìn)行。非黏附乳腺球先前描述于Dontu等GenesDev.2003年5月15日；17(10)：1253-70，及Dontu等，BreastCancerRes.2004；6(6)：R605-15，兩者都以引用的方式并入本文。這些參考的全文內(nèi)容都以引用的方式并入，特別是用于教導(dǎo)非黏附乳腺球的構(gòu)建和使用的內(nèi)容。如Dontu等所描述的，乳腺球的特征在于由能夠自我更新和多向分化的干細(xì)胞和祖細(xì)胞構(gòu)成。Dontu等還描述了乳腺球含有能夠在基質(zhì)膠中的重建3-D培養(yǎng)系統(tǒng)中無性繁殖生成復(fù)雜的功能性導(dǎo)管-肺泡樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，采用以下示例性篩選方法。對于體外研究，可以用表達(dá)對照或CXCR1或FBXO21候選siRNA的任一種腺病毒構(gòu)建體(m.o.i.為10至100)處理細(xì)胞3天或用小分子候選物(例如，PHA665752衍生物)(0.1-0.5uM)處理3天，并在未處理的和經(jīng)處理的細(xì)胞中比較CXCR1+或FBXO21+細(xì)胞形成腫瘤球的能力。對于體內(nèi)研究，可以用表達(dá)螢光素酶的慢病毒感染人乳腺癌細(xì)胞以監(jiān)測腫瘤生長。可以將表達(dá)螢光素酶的癌細(xì)胞注射到乳腺組織中，并可以建立大小約0.5-0.7cm的腫瘤，每組5只動物。然后，可以用候選CXCR1或FBXO21抑制劑(每天i.v.30mg/kg/天持續(xù)7天)或載體對照治療具有建立的腫瘤的動物。用表達(dá)對照或候選CXCR1或FBXO21siRNA的腺病毒(m.o.i.為100或500持續(xù)7天)的感染可用于進(jìn)行平行研究?？梢栽诘?天、第14天、第21天和第28天對動物成像以評估腫瘤大小，然后將其處死。可以在尸體解剖時進(jìn)一步評估腫瘤大小，并對腫瘤的一部分進(jìn)行染色以評估腫瘤組織學(xué)。可以收集剩余的腫瘤并分類以評估CXCR1或FBXO21陽性和CXCR1或FBXO21陰性細(xì)胞的百分比。為了驗(yàn)證候選CXCR1或FBXO21抑制劑的施用和候選CXCR1或FBXO21siRNA腺病毒感染抑制CXCR1或FBXO21信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，可以檢查下游介導(dǎo)物(諸如Gab-1和ERK)的磷酸化(參見Chistensen等，CancerRes.，2003；63：7345-7355，以引用的方式并入本文)。V.癌癥療法在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了癌癥療法。在一些實(shí)施方案中，療法靶向癌癥標(biāo)志物(例如，包括但不限于CXCR1或FBXO21和CXCR1或FBXO21信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的蛋白質(zhì))。在一些實(shí)施方案中，可以使用任何已知的或以后開發(fā)的癌癥干細(xì)胞療法。例如，癌癥干細(xì)胞治療劑描述于美國專利6，984，522和7，115，360及申請WO03/050502、WO05/074633和WO05/005601，這些專利和申請的全文以引用的方式并入本文?？贵w療法在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了靶向表達(dá)本發(fā)明的干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物的腫瘤的抗體?？梢栽诒疚闹兴_的治療方法中利用任何合適的抗體(例如，單克隆的、多克隆的或合成的)。在一些實(shí)施方案中，用于癌癥療法的抗體是人源化抗體。用于使抗體人源化的方法是本領(lǐng)域中公知的(參見例如，美國專利6,180,370、5,585,089、6,054,297和5,565,332；每個專利以引用的方式并入本文)。在一些實(shí)施方案中，治療性抗體包含針對本發(fā)明的干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物而生成的抗體，其中將抗體與細(xì)胞毒劑綴合。在此類實(shí)施方案中，生成腫瘤特異性治療劑，其不靶向正常細(xì)胞，因此降低傳統(tǒng)化學(xué)療法的許多有害副作用。對于某些應(yīng)用，預(yù)想治療劑將是會充當(dāng)對于附著抗體有用的藥劑的藥理劑，特別是細(xì)胞毒劑或在其它情況中為抗細(xì)胞劑，其具有殺死或抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長或細(xì)胞分裂的能力。本發(fā)明設(shè)想了可以與抗體綴合并以活性形式遞送的任何藥理劑的用途。示例性的抗細(xì)胞劑包括化療劑、放射性同位素和細(xì)胞毒素。本發(fā)明的治療性抗體可以包括多種細(xì)胞毒性部分，包括但不限于放射性同位素(例如，碘-131、碘-123、锝-99m、銦-111、錸-188、錸-186、鎵-67、銅-67、釔-90、碘-125或砹-211)；激素，諸如類固醇；抗代謝物，諸如胞嘧啶(例如阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤或氨基蝶呤；蒽環(huán)霉素；絲裂霉素C)；長春花生物堿(例如，秋水仙胺；依托泊苷；光神霉素)；和抗腫瘤烷化劑，諸如苯丁酸氮芥或美法侖。其它實(shí)施方案可以包括諸如凝血劑、細(xì)胞因子、生長因子、細(xì)菌內(nèi)毒素或細(xì)菌內(nèi)毒素的脂質(zhì)A部分之類的藥劑。例如，在一些實(shí)施方案中，治療劑將包括植物、真菌或細(xì)菌衍生的毒素，諸如A鏈毒素、核糖體滅活蛋白、α-帚曲霉素、曲霉菌素、局限曲菌素、核糖核酸酶、白喉毒素或假單胞菌外毒素，僅提及幾個例子。在一些實(shí)施方案中，利用脫糖基化蓖麻毒蛋白A鏈。在任何情況下，提出，若需要，諸如這些的藥劑可以以如下的方式與抗體成功地綴合，所述方式將允許它們在靶腫瘤細(xì)胞的位點(diǎn)處靶向、內(nèi)在化、向血液成分釋放或呈現(xiàn)，其根據(jù)需要使用已知的綴合技術(shù)來實(shí)現(xiàn)(參見例如Ghose等，MethodsEnzymol.，93：280[1983])。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了靶向本發(fā)明的干細(xì)胞癌癥標(biāo)志物的免疫毒素。免疫毒素是特異性靶向劑(通常為針對腫瘤的抗體或片段)與細(xì)胞毒劑(諸如毒素部分)的綴合物。靶向劑將毒素引導(dǎo)至攜帶靶抗原的細(xì)胞，并且由此選擇性地殺死所述細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，治療性抗體采用提供高體內(nèi)穩(wěn)定性的交聯(lián)劑(Thorpe等，CancerRes.，48：6396[1988])。在其它實(shí)施方案中，特別是涉及治療實(shí)體瘤的那些，將抗體設(shè)計為具有針對腫瘤血管系統(tǒng)的細(xì)胞毒性或抗細(xì)胞效果，其通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長或細(xì)胞分裂來實(shí)現(xiàn)。此攻擊意在導(dǎo)致腫瘤局部性血管崩潰(vascularcollapse)，這對腫瘤細(xì)胞，特別是那些遠(yuǎn)離血管系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞剝奪氧和養(yǎng)分，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和腫瘤壞死。在一些實(shí)施方案中，將基于抗體的治療劑配制為如下文所描述的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，施用本發(fā)明的抗體組合物導(dǎo)致癌癥的可測量降低(例如，腫瘤縮小或消除)。VI.治療組合物和施用可以通過任何有效的方法來施用含有依照本發(fā)明的腫瘤發(fā)生調(diào)節(jié)劑的藥物組合物。例如，可以通過任何有效的方法來施用IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑，或充當(dāng)IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)/應(yīng)答途徑中的蛋白質(zhì)的拮抗劑的其它治療劑。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，治療劑包含Repertaxin或其衍生物。在某些實(shí)施方案中，可以局部、眼內(nèi)、非腸道、口服、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或通過任何其它有效的手段施用含有有效濃度的IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑的生理學(xué)適當(dāng)溶液。特別是，可以通過針頭以有效治療靶組織的腫瘤細(xì)胞的量將IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑藥劑直接注射到靶癌癥或腫瘤中(例如，到乳腺組織中)?；蛘撸嬖谟隗w腔(諸如眼、胃腸道、生殖泌尿道(例如，膀胱)、肺和支氣管系統(tǒng)等)中的癌癥或腫瘤可以經(jīng)由用針頭直接注射或經(jīng)由置入患有癌癥或腫瘤的中空器官中的導(dǎo)管或其它遞送管來接受含有效濃度的IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑的生理學(xué)合適的組合物(例如，無菌的溶液，諸如鹽水或磷酸鹽緩沖液；懸浮液或乳劑)?？梢允褂萌魏斡行У某上裱b置(諸如X-射線、聲波圖或光纖顯現(xiàn)系統(tǒng))來定位靶組織，并引導(dǎo)針頭或?qū)Ч?。在另一個備選中，可以將含有有效濃度的IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑的生理學(xué)合適的溶液系統(tǒng)施用到全身血液循環(huán)中，以治療不能直接到達(dá)或結(jié)構(gòu)上分離的癌癥或腫瘤。此類操作共同的目的是使IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑與靶腫瘤充分接觸，以容許拮抗劑接觸、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞(這取決于藥劑的性質(zhì))。在一個實(shí)施方案中，可以通過將懸浮液輸注到充滿流體的中空器官中，或者通過使懸浮液噴霧或霧化到充滿空氣的中空器官中來治療存在于中空器官的表皮襯里(lining)中的實(shí)體瘤。因此，腫瘤細(xì)胞(諸如實(shí)體瘤干細(xì)胞)可以存在于肺支氣管樹的襯里、胃腸道的襯里、女性生殖道的襯里、生殖泌尿道、膀胱、膽囊中的上皮組織和易于與IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑接觸的任何其它器官組織之中或之間。在另一個實(shí)施方案中，實(shí)體瘤可以位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，諸如例如脊髓、脊髓根或腦的襯里之中或之上，使得腦脊液中灌注的IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑接觸并轉(zhuǎn)導(dǎo)所述空間中的實(shí)體瘤細(xì)胞。腫瘤學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員可以領(lǐng)會，可以通過直接注射到腫瘤中來對實(shí)體瘤施用拮抗劑，從而拮抗劑接觸并影響腫瘤內(nèi)部的腫瘤細(xì)胞。也可以使用由本發(fā)明所鑒別的致腫瘤細(xì)胞來生成抗癌細(xì)胞抗體。在一個實(shí)施方案中，方法涉及獲得致腫瘤細(xì)胞或分離的致腫瘤性細(xì)胞的富集群；處理該群以阻止細(xì)胞復(fù)制(例如，通過輻射進(jìn)行)；并以誘導(dǎo)對實(shí)體瘤干細(xì)胞的免疫應(yīng)答有效的量對人或動物受試者施用經(jīng)處理的細(xì)胞。關(guān)于要注射或口服的細(xì)胞的有效劑量的指導(dǎo)，參見美國專利No.6,218,166、No.6,207,147和No.6,156,305，這些專利以引用的方式并入本文。在另一個實(shí)施方案中，方法涉及獲得實(shí)體腫瘤肝細(xì)胞或分離的實(shí)體腫瘤肝細(xì)胞的富集群；使體外培養(yǎng)物中的腫瘤干細(xì)胞與來自要生成抗體的人受試者或宿主動物的免疫效應(yīng)器細(xì)胞混合(依照本領(lǐng)域中已知的免疫學(xué)方法進(jìn)行)；自培養(yǎng)物中移除免疫效應(yīng)器細(xì)胞；并將免疫效應(yīng)器細(xì)胞以足以在動物中刺激免疫應(yīng)答的劑量移植到宿主動物中。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的抗致腫瘤性治療劑(例如IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑)與其它抗腫瘤療法共施用。大量治療劑可以和本發(fā)明一起使用?？梢耘c本發(fā)明的藥劑共施用，或者與本發(fā)明的藥劑聯(lián)合的任何治療劑適合于在本發(fā)明的方法中使用。設(shè)想多種抗腫瘤例如，抗癌)劑用在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中。適合于與本發(fā)明一起使用的抗癌劑包括但不限于誘導(dǎo)凋亡的藥劑、抑制腺苷脫氨酶功能、抑制嘧啶生物合成、抑制嘌呤環(huán)生物合成、抑制核苷酸相互轉(zhuǎn)化、抑制核糖核苷酸還原酶、抑制胸苷一磷酸(TMP)合成、抑制二氫葉酸還原、抑制DNA合成、與DNA形成加合物、損壞DNA、抑制DNA修復(fù)、插入DNA、使天冬酰胺脫氨、抑制RNA合成、抑制蛋白質(zhì)合成或穩(wěn)定性、抑制微管形成或功能等的藥劑。在一些實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的組合物和方法的示例性抗癌劑包括但不限于：1)生物堿，包括微管抑制劑(例如，長春新堿、長春堿和長春地辛等)、微管穩(wěn)定劑(例如，紫杉醇(TAXOL)和多西他賽等)和染色質(zhì)功能抑制劑，包括拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑諸如表鬼臼毒素(例如，依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)等)和靶向拓?fù)洚悩?gòu)酶I的藥劑(例如喜樹堿和伊立替康(isirinotecan)(CPT-11)等)；2)共價DNA結(jié)合劑(烷化劑)，包括氮芥(例如，二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺和白消安(MYLERAN)等)、亞硝基脲(例如，卡莫司汀、洛莫司汀和司莫司汀等)和其它烷化劑(例如，達(dá)卡巴嗪、羥甲基三聚氰胺、塞替派和絲裂霉素等)；3)非共價DNA結(jié)合劑(抗腫瘤抗生素)，包括核酸抑制劑(例如，更生霉素(放線菌素D)等)、蒽環(huán)類(例如，柔紅霉素(daunorubicin)(道諾霉素和Cerubidine)、多柔比星(阿霉素)和伊達(dá)比星(idarubicin)(去甲氧柔紅霉素)等)、蒽二酮(例如，蒽環(huán)毒素類似物，諸如米托蒽醌等)、博來霉素(BLENOXANE)等和普卡霉素(光神霉素)等；4)抗代謝物，包括抗葉酸劑(例如甲氨蝶呤、FOLEX和MEXATE等)、嘌呤抗代謝物(例如，6-巰嘌呤(6-MP，PURINETHOL)、6-硫鳥嘌呤(6-TG)、硫唑嘌呤、無環(huán)鳥苷、更昔洛韋、氯脫氧腺苷、2-氯脫氧腺苷(CdA)和2’-脫氧助間型霉素(deoxycoformycin)(噴司他丁)等)、嘧啶拮抗劑(例如，氟嘧啶(例如5-氟尿嘧啶(ADRUCIL)、5-氟脫氧尿苷(FdUrd)(氟尿苷))等)和阿糖胞苷(例如CYTOSAR(ara-C)和氟達(dá)拉濱(fludarabine)等)；5)酶，包括L-門冬酰胺酶和羥基脲等；6)激素，包括糖皮質(zhì)素、抗雌激素(例如，他莫昔芬(tamoxifen)等)、非類固醇抗雄激素(例如，氟達(dá)拉濱(flutamide)等)和芳香酶抑制劑(例如，阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX)等)；7)鉑化合物(例如，順鉑和卡鉑(carboplatin)等)；8)與抗癌藥、毒素、和/或放射性核素綴合的單克隆抗體等；9)生物反應(yīng)修飾劑(例如，干擾素(例如，IFN-α等)和白介素(例如IL-2等)等)；10)過繼免疫療法；11)造血生長因子；12)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的藥劑(例如，全反式視黃酸等)；13)基因療法技術(shù)；14)反義療法技術(shù)；15)腫瘤疫苗；16)針對腫瘤轉(zhuǎn)移的療法(例如，巴馬司他(batimastat)等)；17)血管發(fā)生抑制劑；18)蛋白體抑制劑(例如，VELCADE)；19)乙?；?或甲基化的抑制劑(例如，HDAC抑制劑)；20)NFκB的調(diào)控劑；21)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的抑制劑(例如，CDK抑制劑)；22)p53蛋白功能的調(diào)控劑；和23)輻射。在癌癥療法背景中常規(guī)使用的任何溶瘤細(xì)胞劑(oncolyticagent)在本發(fā)明的組合物和方法中得到應(yīng)用。例如，美國食品藥物管理局(U.S.FoodandDrugAdministration)維持批準(zhǔn)在美國使用的溶瘤細(xì)胞劑處方集。U.S.F.D.A.的國際對應(yīng)局維持相似的處方集。表3提供了批準(zhǔn)在美國使用的示例性抗腫瘤劑的列表。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，所有美國批準(zhǔn)的化療劑上要求的“產(chǎn)品標(biāo)簽”描述了關(guān)于示例性藥劑的批準(zhǔn)的適應(yīng)癥、劑量信息、毒性數(shù)據(jù)等。表3在本發(fā)明中，抗菌治療劑也可以作為治療劑使用?？梢允褂媚軌驓⑺馈⒁种苹蛞云渌绞较魅跷⑸锷矬w功能的任何藥劑及預(yù)期具有此類活性的任何藥劑。抗菌劑包括但不限于單獨(dú)或組合使用的天然的和合成的抗生素、抗體、抑制性蛋白質(zhì)(例如，防御素)、反義核酸、膜破裂劑等。實(shí)際上，可以使用任何類型的抗生素，包括但不限于抗細(xì)菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑等。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與能夠特異地靶向特定細(xì)胞類型(例如，腫瘤細(xì)胞)的靶向劑結(jié)合的本發(fā)明化合物(和任何其它化療劑)。一般地，與靶向劑結(jié)合的治療性化合物經(jīng)由靶向劑與細(xì)胞表面部分的相互作用而靶向癌細(xì)胞，所述細(xì)胞表面部分經(jīng)由受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用而被納入細(xì)胞中。已知位于靶細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞)表面上的任何部分在本發(fā)明方面得到應(yīng)用。例如，針對此部分的抗體將本發(fā)明的組合物靶向含有所述部分的細(xì)胞表面。或者，靶向性部分可以是針對細(xì)胞表面上存在的受體的配體或者反之亦然。類似地，也可以使用維生素來將本發(fā)明的治療劑靶向至特定細(xì)胞。如本文中所使用的，術(shù)語“靶向性分子”指可用于將治療性化合物靶向至目標(biāo)細(xì)胞、組織和器官的化學(xué)基團(tuán)及其部分。設(shè)想與本發(fā)明一起使用的各種類型的靶向性分子，包括但不限于信號肽、抗體、核酸、毒素等。另外，靶向性部分可以另外促進(jìn)結(jié)合的化學(xué)化合物(例如，小分子)的結(jié)合或者促進(jìn)化合物進(jìn)入靶細(xì)胞、組織和器官中。優(yōu)選地，依照其將結(jié)合的化合物選擇性地遞送至受試者、組織或細(xì)胞(包括特定的亞細(xì)胞位置和細(xì)胞器)內(nèi)的靶位點(diǎn)的特異性、親和力和功效來選擇靶向性部分。各種效率問題影響著所有藥物且特別是高細(xì)胞毒性藥物(例如，抗癌藥)的施用。特別重要的一個問題是確保所施用的藥劑僅影響靶細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞)、組織或器官。高細(xì)胞毒劑向非靶定細(xì)胞的非特異性或非有意遞送可以引起嚴(yán)重的毒性問題。已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試以設(shè)計用于解決與非特異性藥物遞送有關(guān)的問題的藥物靶向方案。(參見例如，K.N.Syrigos和A.A.EpenetosAnticancerRes.，19：606-614(1999)；Y.J.Park等，J.ControlledRelease，78：67-79(2002)；R.V.J.Chari，Adv.DrugDeliv.Rev.，31：89-104(1998)；及D.Putnam和J.Kopecek，Adv.PolymerSci.，122：55-123(1995))。已經(jīng)使用了使靶向性部分諸如抗體和配體肽(例如，針對內(nèi)皮細(xì)胞的RDG)與藥物分子綴合以減輕與特定藥物有關(guān)的一些伴隨的毒性問題?；衔锖涂拱﹦┛梢栽谌魏螣o菌的生物相容性藥用載體中施用，所述生物相容性藥用載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖和水。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以含有一種藥劑(例如，抗體)。在其它實(shí)施方案中，藥物組合物含有至少兩種藥劑(例如，抗體和一種或多種常規(guī)的抗癌劑)的混合物。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物含有至少兩種藥劑，它們在下列一種或多種條件下對患者進(jìn)行施用：以不同周期性、以不同持續(xù)時間、以不同濃度、通過不同施用路徑等。在一些實(shí)施方案中，IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑在第二抗癌劑前施用，例如，抗癌劑施用前0.5、1、2、3、4、5、10、12或18小時，1、2、3、4、5或6天，1、2、3或4周。在一些實(shí)施方案中，IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑在第二抗癌劑后施用，例如，抗癌劑施用后0.5、1、2、3、4、5、10、12或18小時，1、2、3、4、5或6天，1、2、3或4周。在一些實(shí)施方案中，IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑和第二抗癌劑同時但按不同日程表施用，例如，每天施用IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑化合物，而一周一次、每兩周一次、每三周一次或每四周一次施用第二抗癌劑。在其它實(shí)施方案中，一周一次施用IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑，而每天、一周一次、每兩周一次、每三周一次或每四周一次施用第二抗癌劑。根據(jù)所治療的疾患，配制本藥物組合物的優(yōu)選實(shí)施方案，并將其在全身或局部施用。用于配制和施用的技術(shù)可參見“Remington’sPharmaceuticalSciences”(MackPublishingCo，EastonPa.)的最近版本。合適的路徑可以例如包括口服或經(jīng)粘膜施用及胃腸外遞送(例如，肌肉內(nèi)、皮下、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或鼻內(nèi)施用)。本發(fā)明設(shè)想依照可接受的藥物遞送方法和制備技術(shù)施用治療劑和在一些實(shí)施方案中施用一種或多種常規(guī)的抗癌劑。例如，可以對受試者靜脈內(nèi)施用藥學(xué)上可接受載體(諸如生理鹽水)中的治療性化合物和合適的抗癌劑。設(shè)想了用于細(xì)胞內(nèi)遞送藥劑的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，經(jīng)由脂質(zhì)體遞送)。此類方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的配制劑可用于胃腸外施用(例如，靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、髓內(nèi)和腹膜內(nèi))。一些設(shè)想的抗癌劑(例如，治療性多肽)的治療性共施用也可以使用基因治療劑和技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，對受試者單獨(dú)施用治療性化合物，或其與一種或多種常規(guī)的抗癌劑(例如，核苷酸序列、藥物、激素等)組合施用或以組分任選地與賦形劑或其它藥學(xué)上可接受載體混合的藥物組合物施用。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受載體是生物學(xué)惰性的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域中公知的藥學(xué)上可接受載體以適合于口服的劑量配制本發(fā)明的藥物組合物。此類載體使藥物組合物能夠配制為片劑、丸劑、膠囊、糖衣丸、液體、凝膠、糖漿劑、膏劑、溶液、懸浮液等，受試者分別進(jìn)行口或鼻攝取。口服使用的藥物制劑可以如下獲得，即組合活性化合物與固體賦形劑，任選地研磨所得的混合物，并在添加合適的助劑(若需要)后，將混合物加工成顆粒劑，以獲得片劑或糖衣丸核。合適的賦形劑是碳水化合物或蛋白質(zhì)充填劑諸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；來自玉米、小麥、稻、馬鈴薯等的淀粉；纖維素，諸如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或鈉羧甲基纖維素；樹膠，包括阿拉伯的和黃芪膠；和蛋白質(zhì)，諸如明膠和膠原。若需要，可以添加崩解或增溶劑，諸如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、藻酸或其鹽，諸如海藻酸鈉。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，臨床醫(yī)生或藥理學(xué)領(lǐng)域的其他技術(shù)人員根據(jù)公知的藥理學(xué)和治療考慮因素(包括但不限于期望的治療效果水平和可獲得的治療效果的實(shí)際水平)來改編劑量和施用方案。一般地，遵循用于施用化療劑的公知藥理學(xué)原理是可取的(例如，時間上超過50％且不超過每3-4個藥劑半衰期時不改變劑量一般是可取的)。對于具有相對較少或無劑量相關(guān)毒性考慮的組合物，且在期望最大功效(例如，破壞癌細(xì)胞)的情況中，超過平均要求劑量的劑量不是不常見的。用于劑量的此方法通常稱為“最大劑量”策略。在某些實(shí)施方案中，以每天1-40mg的劑量對受試者施用IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑(例如持續(xù)4-6周)。在某些實(shí)施方案中，對受試者施用15-70mg負(fù)荷劑量的IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，對受試者施用約35-45mg負(fù)荷劑量的IL8-CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑拮抗劑(例如經(jīng)皮下)，然后日劑量約10mg(例如經(jīng)皮下)，持續(xù)約4-6周。其它劑量考慮因素涉及為所施用的藥劑計算合適的目標(biāo)水平、藥劑的積累和潛在毒性、抗性的刺激、功效的缺乏和描述藥劑的治療指數(shù)范圍。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)想使用滴定藥劑施用的常規(guī)方法。一種常見的施用策略是在受試者中為藥劑設(shè)置合理的目標(biāo)水平。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在受試者的血漿中測量藥劑水平。然后，設(shè)計合適的劑量水平和頻率以實(shí)現(xiàn)期望的藥劑穩(wěn)態(tài)目標(biāo)水平。監(jiān)測(例如，每小時、每天、每周等)藥劑在受試者中的實(shí)際或平均水平，從而可以調(diào)節(jié)劑量水平或頻率以維持目標(biāo)水平。當(dāng)然，所施用的一種或多種特定藥劑的藥動學(xué)和藥效學(xué)(例如，生物利用度、清除或生物積累、生物分布、藥物相互作用等)可以潛在地影響什么是被認(rèn)為合理的目標(biāo)水平，并且如此影響劑量水平或頻率。目標(biāo)水平劑量方法通常依賴于建立合理的治療目的，其根據(jù)藥劑在受試者中期望的范圍(或治療范圍)限定。一般地，治療范圍的下限大致等于提供最大可能治療效果的約50％的藥劑濃度。治療范圍的上限通常根據(jù)藥劑的毒性而非其功效而確定。本發(fā)明設(shè)想，特定藥劑的治療范圍的上限會是小于5或10％的受試者表現(xiàn)出毒性副作用的濃度。在一些實(shí)施方案中，治療范圍的上限是下限的約兩倍或更小。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些劑量考慮因素是高度可變的，而且在某種程度上是個別化的(例如，基于遺傳素因、免疫學(xué)考慮因素、耐受性、抗性等)。因此，在一些實(shí)施方案中，藥劑在特定受試者中的有效目標(biāo)劑量水平可以比另一名受試者中的最佳值大1，...5，...10，...15，...20，...50，...75，...100，...200，...X％。相反，一些受試者在如下的劑量水平或頻率時可能經(jīng)受顯著的副作用和毒性相關(guān)健康問題，所述劑量水平或頻率遠(yuǎn)小于(1，...5，...10，...15，...20，...50，...75，...100，...200，...X％)通常在一些或大多數(shù)受試者中產(chǎn)生最佳治療水平的那些。在缺乏更具體信息的情況中，經(jīng)常在治療范圍中間設(shè)置目標(biāo)施用水平。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，臨床醫(yī)生基于已知的藥理學(xué)原理和等式來理性地設(shè)計個別化的劑量方案。一般地，臨床醫(yī)生基于藥劑的各種藥理學(xué)和藥代動學(xué)特性的知識及關(guān)于藥劑吸收和分布速率的信息來設(shè)計個別化的劑量方案，所述各種藥理學(xué)和藥代動學(xué)特性包括但不限于F(劑量的分?jǐn)?shù)生物利用度)、Cp(血漿中的濃度)、CL(清除/清除率)、Vss(穩(wěn)態(tài)時的藥物分布容積)、Css(穩(wěn)態(tài)時的濃度)和t1/2(藥物半衰期)。對于這些變量的進(jìn)一步解釋和說明個別化劑量方案的計算的全部等式，本領(lǐng)域技術(shù)人員參考許多公知的藥理學(xué)教材(例如，Goodman和Gilman，PharmaceuticalBasisofTherapeutics，第10版，Hardman等編著，2001)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會能夠預(yù)期這些變量在個別受試者中的可能變動。例如，對F、CL和Vss，觀察到的數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差通常分別為約20％、50％和30％?？赡艿膹V泛變化參數(shù)在個別受試者中的實(shí)際效果是受試者中95％達(dá)到Css的時間和在目標(biāo)水平的35和270％之間。對于具有低治療指數(shù)的藥物，這是不理想的寬范圍。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，一旦測量藥劑的Cp(血漿中的濃度)，便有可能直接估計F、CL和Vss的值。這使得臨床醫(yī)生可有效地微調(diào)特定受試者的劑量方案。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)想使用連續(xù)治療藥物監(jiān)測技術(shù)來進(jìn)一步調(diào)整個體的劑量方法和方案。例如，在一個實(shí)施方案中，使用Css數(shù)據(jù)來進(jìn)一步改進(jìn)CL/F的估計，并隨后使用已知的藥理學(xué)原理和等式來調(diào)整個體的維持劑量以實(shí)現(xiàn)期望的藥劑目標(biāo)水平。實(shí)際上，可以在劑量日程表期間的任何時間進(jìn)行治療藥物監(jiān)測。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在劑量過程中的多個時間點(diǎn)，且特別在施用間歇劑量時進(jìn)行檢測。例如，不論所采用的劑量方法如何，可以在施用藥劑的一秒、數(shù)秒、數(shù)分鐘、數(shù)小時、數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月等的分段內(nèi)附隨地進(jìn)行藥物監(jiān)測(例如，間歇的劑量、負(fù)荷劑量、維持劑量、隨機(jī)劑量或任何其它劑量方法)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，在藥劑施用后迅速取樣時，不可以容易地觀察藥劑效果和動力學(xué)的變化，因?yàn)樗巹┑难獫{濃度變化可能被延遲(例如，由于緩慢的分布速率或其它藥效學(xué)因素)。因而，藥劑施用后即刻獲得的受試者樣本可能獲得有限的或降低的值。在施用的預(yù)測穩(wěn)態(tài)目標(biāo)水平期間自受試者采集生物樣本的主要目的是基于隨后計算藥劑的CL/F比率的修正估值來修改個體的劑量方案。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，早期吸收后藥物濃度通常不反映藥劑清除。早期吸收后藥物濃度主要由藥劑的吸收速率、藥劑分布的中央(而不是穩(wěn)態(tài))容積和分布速率規(guī)定。在計算治療性長期維持劑量方案時，這些藥動學(xué)特征中的每一項(xiàng)具有有限的值。因而，在一些實(shí)施方案中，當(dāng)目的是治療性長期維持劑量時，在已經(jīng)施用先前的劑量后很久，且甚至更優(yōu)選地在施用下一計劃劑量前不久自目標(biāo)受試者、細(xì)胞或組織獲得生物樣本。在又一個實(shí)施方案中，在治療劑在各劑量間的時間間隔中被受試者幾乎完全清除的情況中，則本發(fā)明設(shè)想在上一次施用后的多個時間點(diǎn)時，且更優(yōu)選地在施用劑量后不久自受試者采集生物樣本。VII.Repertaxin和其它小分子CXCR1抑制劑在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法、試劑盒和組合物采用CXCR1的小分子抑制劑。一種示例性的藥劑是Repartaxin。在某些實(shí)施方案中，Repartaxin的體內(nèi)劑量在每千克3和60mg之間(例如3...30...50...60mg/kg)。在具體的實(shí)施方案中，Repartaxin的劑量是每千克約30mg。下面示出了Repartaxin的化學(xué)式：在其它實(shí)施方案中，采用Repertaxin的衍生物。其它小分子CXCR1拮抗劑包括SB265610(GlaxoSmithKlineBeecham；Benson等，2000，151：196-197)及SCH527123(2-羥基-N，N-二甲基-3-{2-[[(R)-1-(5-甲基呋喃-2-基)丙基]氨基]-3，4-二氧環(huán)丁-1-烯基氨基}苯甲酰胺(SCH527123)、口服生物利用性CXCR2/CXCR1受體拮抗劑(ScheringPlough))。其它小分子抑制劑可以通過上文所描述的篩選方法來鑒別。實(shí)施例提供了以下實(shí)施例以演示并進(jìn)一步例示本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方案和方面，并且不應(yīng)解釋為限制其范圍。實(shí)施例1CXCR1鑒別癌癥干細(xì)胞本實(shí)施例描述了將CXCR1及其它蛋白質(zhì)(例如，F(xiàn)BXO21)鑒別為癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物。細(xì)胞培養(yǎng)。乳腺細(xì)胞系(BCL)獲自ATCC(“http：//WWW.lgcpromochem-atcc.com/common/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfm”)或獲自S.Ethier(現(xiàn)在在“http：//WWW.asterand.com/asterand/BIOREPOSITORY/hbreastcancercelllines.aspx”上可獲得，SUM44、SUM52、SUM149、SUM159、SUM185、SUM190、SUM225、SUM229)、V.J.(BrCa-MZ-01)和V.Catros(S68)博士的實(shí)驗(yàn)室中開發(fā)的集合。除了MCF10A(其源自纖維囊性疾病)和HMEC衍生的184A1(其源自正常的乳腺組織)外，所測試的所有BCL源自癌瘤。使用推薦的培養(yǎng)條件來培養(yǎng)細(xì)胞系。用指數(shù)生長期的分匯合細(xì)胞進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)。ALDEFLUOR測定和通過FACS來分離ALDH陽性群。在代表人乳腺癌的主要分子亞型的33種BCL中評估ALDH活性。使用ALDEFLUOR試劑盒(StemCelltechnologies，Durham，NC，USA)來分離具有高ALDH酶活性的群(17)。將自胰蛋白酶消化后的分匯合細(xì)胞系或自新鮮解離的異種移植物獲得的細(xì)胞在含有ALDH底物(BAAA，每1x106個細(xì)胞為1μmol/l)的ALDEFLUOR測定緩沖液中懸浮，并于37℃溫育40分鐘。在每次實(shí)驗(yàn)中，在具有50mmol/L二乙基氨基苯甲醛(DEAB)(即一種特異的ALDH抑制劑)的相同條件下對細(xì)胞樣本染色，作為陰性對照。使用FACStarPLUS(BectonDickinson)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分選。以488nm激發(fā)ALDEFLUOR熒光，并使用標(biāo)準(zhǔn)的異硫氰酸熒光素(FITC)530/30帶通濾波器來檢測。對于異種移植的腫瘤，與抗H2Kd抗體(BDbiosciences，1/200，在冰上20分鐘)溫育，接著與用藻紅蛋白標(biāo)記的二抗(Jacksonlabs，1/250，在冰上20分鐘)溫育，以此來消除小鼠源的細(xì)胞。使用存活力方面經(jīng)PI染色的細(xì)胞、經(jīng)ALDEFLUOR染色的用DEAB處理的細(xì)胞和那些僅用二抗染色的細(xì)胞建立分類閘。在RNA序型分析或NOD/SCID小鼠注射前，使用BrCa-MZ-01和SUM159細(xì)胞系中的10,000個ALDEFLUOR陽性和陰性細(xì)胞的雙重分選來檢查分選群的純度。對于這兩種細(xì)胞系，分選的ALDEFLUOR陽性群含有超過98％的ALDEFLUOR陽性細(xì)胞，而在ALDEFLUOR陰性群中沒有檢測出ALDEFLUOR陽性細(xì)胞。NOD/SCID小鼠中的致腫瘤性。在NOD/SCID小鼠中評估ALDELFUOR陽性、陰性和未分離的SUM159、MDA-MB-453和BrCa-MZ-01細(xì)胞的致腫瘤性。在青春期前3周齡時將脂肪墊除去上皮，并通過注射人成纖維細(xì)胞(1∶1輻射的∶未輻射的，50,000個細(xì)胞/100μl基質(zhì)膠/脂肪墊)來使其人源化，如所描述的(17)。在腫瘤為最大直徑1.2cm時，依照脊椎動物研究用途條例(regulationsforuseofvertebrateanimalinresearch)對動物實(shí)施安樂死。將每個脂肪墊的一部分在福爾馬林中固定，并包埋在石蠟中以用于組織學(xué)分析。通過ALDEFLUOR測定，接著分選和連續(xù)移植來評估另一部分。貼壁不依賴性培養(yǎng)。將來自184A1、SUM149和SUM159的ALDEFLUOR陽性、陰性和未分離的細(xì)胞在超低附著板(Corning，Acton，MA)中以低密度(5000個活細(xì)胞/ml)鋪板為單細(xì)胞。在無血清乳腺上皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CambrexBioScience，Walkerville，MD)中將細(xì)胞培養(yǎng)3-7天，如所描述的(18)。在用向培養(yǎng)基中添加的不同劑量的IL8(GenWayBiotech，SanDiego，CA)處理后量化細(xì)胞形成球的能力。RNA提取。使用DNA/RNAAllPrepMaxi試劑盒依照制造商的說明(Qiagen，SampleandAssaytechnologies，TheNetherlands)自冷凍的ALDEFLUOR陽性和陰性細(xì)胞中提取總RNA。使用8種BCL進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析：184A1、BrCa-MZ-01、HCC1954、MDA-MB-231、MDA-MB-453、SK-BR-7、SUM149和SUM159。通過變性甲醛瓊脂糖凝膠電泳和微量分析(AgilentBioanalyzer，PaloAlto，CA)來控制RNA完整性。用DNA微陣列進(jìn)行的基因表達(dá)譜分析?；虮磉_(dá)分析使用AffymetrixU133Plus2.0人寡核苷酸微陣列，其含有超過47,000種轉(zhuǎn)錄物和變體，包括38,500種充分表征的人基因。進(jìn)行cRNA的制備、雜交、清洗和檢測，如供應(yīng)商所推薦的(http://WWW.affymetrix.com/index.affx)。使用Bioconductor及相關(guān)包(19)通過R中的RMA(穩(wěn)健多芯片平均(RobustMultichipAverage))方法來分析表達(dá)數(shù)據(jù)，如所描述的(20，21)。RMA進(jìn)行背景調(diào)整、分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化和每種基因11個寡核苷酸的匯總。分析前，過濾方法從數(shù)據(jù)集除去具有低的且測量較差的表達(dá)的基因，如通過所有16種樣本中次于100個單位的表達(dá)值所定義的，這保留25，285種基因/EST。應(yīng)用第二濾器(其基于標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)的強(qiáng)度)進(jìn)行無監(jiān)督分析以排除在分析間顯示低表達(dá)變化的基因。對經(jīng)log2轉(zhuǎn)化的數(shù)據(jù)計算SD，其中首先對最小數(shù)值壓低至最小數(shù)值100個單位，即背景強(qiáng)度，保留具有優(yōu)于0.5的SD的13，550種基因/EST。在13,550種基因上對16種ALDEFLUOR陽性、陰性細(xì)胞進(jìn)行無監(jiān)督分析。在分級聚類前，將經(jīng)過濾的數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化，并提交給聚類程序(22)，其使用基因上中值居中的數(shù)據(jù)、Pearson相關(guān)性作為相似性度量和形心聯(lián)接聚類來進(jìn)行。使用TreeView程序(22)來展示結(jié)果。為了鑒別并分級區(qū)別ALDEFLUOR陽性和陰性群的基因，將Mann和WhitneyU檢驗(yàn)應(yīng)用于25,285種基因/EST，并使用假發(fā)現(xiàn)率(FDR，(23)來修正多重檢驗(yàn)假設(shè)。通過分級聚類來分類樣本，從而說明辨別者標(biāo)簽的分類權(quán)(classificationpower)。應(yīng)用LOOCV以評估所鑒別分子標(biāo)簽的預(yù)測準(zhǔn)確性和監(jiān)督分析的有效性；一個接一個地排除每個樣本，并通過使用未排除樣本上限定的模型用線性判別分析(LDA，(24)來分類。實(shí)時RT-PCR。分選來自不同細(xì)胞系的ALDEFLUOR陽性和ALDEFLUOR陰性群后，使用RNeasyMini試劑盒(QIAGEN)來分離總RNA，并利用其在具有384孔區(qū)組模塊和自動化附屬物的ABI7900HT序列檢測系統(tǒng)(AppliedBiosystems)中進(jìn)行實(shí)時定量RT-PCR(qRT-PCR)測定。用于Taqman系統(tǒng)的引物和探針選自AppliedBiosystems網(wǎng)站。用于CXCR1、FBXO21、NFYA、NOTCH2、RAD51L1和TBP的PCR引物對和發(fā)熒光探針的序列在AppliedBiosystems網(wǎng)站上可獲得(CXCR1測定ID：Hs_00174146_mi；FBXO21測定ID：Hs_00372141_mi，NFYA測定ID：Hs_00953589_mi，NOTCH2測定ID：Hs_01050719_mi，RAD51L1測定ID：Hs00172522_mi，TBP測定ID：Hs_00427620_mi)。相對于內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TBP基因來計算CXCR1、FBXO21、NFYA、NOTCH2、RAD51L1的相對表達(dá)mRNA水平以標(biāo)準(zhǔn)化RNA質(zhì)量和輸入cDNA量的變化，如先前所描述(25)。侵襲測定。在用于12孔板(Corning，NY)的具有8um孔聚碳酸酯濾膜插入物的Transwell室中一式三份進(jìn)行測定。用DMEM/F12中的30ul冰冷的1∶6基底膜提取物(基質(zhì)膠，BD-Bioscience)包被濾膜，所述DMEM/F12于37℃溫育1小時。將細(xì)胞添加至200ul無血清培養(yǎng)基中的上室。對于侵襲測定，將5000個細(xì)胞接種在經(jīng)基質(zhì)膠包被的濾膜上，并用600ul補(bǔ)充有10％人血清的培養(yǎng)基(Cambrex)或600ul補(bǔ)充有IL8(100ng/mL)的無血清培養(yǎng)基裝滿下室。溫育48小時后，使用光學(xué)顯微術(shù)來計算濾膜下側(cè)上的細(xì)胞。血清條件下，將相對侵襲標(biāo)準(zhǔn)化為未分開的相應(yīng)細(xì)胞系。慢病毒感染。對于螢光素酶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，將來自HCC1954、MDA-MB-453和SUM159的70％匯合細(xì)胞與培養(yǎng)基中的1∶3沉淀的慢病毒上清液Lenti-LUC-VSVG(VectorCore，AnnArbor，MI)混合物一起溫育過夜。次日，通過胰蛋白酶/EDTA收獲細(xì)胞，并以1∶6的比率進(jìn)行傳代培養(yǎng)。溫育1周后，依照ALDEFLUOR表型來分選細(xì)胞，并如下在每個分選群(ALDEFLUOR陽性和ALDEFLUOR陰性)中驗(yàn)證螢光素酶表達(dá)，即在培養(yǎng)基中添加2mlD-螢光素0.0003％(Promega，Madison，WI)，并通過裝置照相機(jī)系統(tǒng)(Xenogen，Alameda，CA)來計算光子通量。心臟內(nèi)接種。用2％異氟烷/空氣混合物麻醉6周齡NOD/SCID小鼠，并在心臟左心室中注射100μL缺乏Ca2+和Mg2+的無菌杜伯科氏(Dulbecco’s)PBS中的100,000個細(xì)胞。對于三種細(xì)胞系(HCC1954、MDA-MB-453、SUM159)之每種及對于每個群(ALDEFLUOR陽性、ALDEFLUOR陰性和未分選的)，注射三只動物。生物發(fā)光檢測。在接種前及接種之后每周評估初始生物發(fā)光。用2％異氟烷/空氣混合物麻醉小鼠，并i.p.給予PBS中的單劑150mg/kgD-螢光素(Promega，Madison，WI)。然后，在施用D-螢光素后6分鐘，再次麻醉動物。對于光子通量計數(shù)，將電荷耦合裝置照相機(jī)系統(tǒng)(Xenogen，Alameda，CA)與鼻錐異氟烷遞送系統(tǒng)和用于維持體溫的加熱臺一起使用。在暴露2至12分鐘后使用具有Xenogen成像系統(tǒng)的LivingImage軟件來分析結(jié)果。信號強(qiáng)度量化為數(shù)據(jù)后處理過程中手工放置的目標(biāo)一致區(qū)域內(nèi)的所有檢出的光子通量計數(shù)的總和。標(biāo)準(zhǔn)化的光子通量代表接種后每周檢測出的光子通量與接種前檢測出的光子通量的比率。統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果呈現(xiàn)為對于每組的至少三個重復(fù)的單個實(shí)驗(yàn)的均值±SD。統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS軟件(第10.0.5版)。對獨(dú)立的樣本用Fisher精確檢驗(yàn)或單因素ANOVA或來計算樣本組與分子參數(shù)之間的相關(guān)性。認(rèn)為p值*0.05是顯著的。大多數(shù)乳腺細(xì)胞系含有ALDEFLUOR陽性群。使用ALDEFLUOR測定(17)從代表乳腺癌的多樣性分子亞型和特征的33種BCL中分離CSC(20)。發(fā)現(xiàn)，33種細(xì)胞系中有23種含有ALDEFLUOR陽性細(xì)胞群，其范圍為0.2至幾乎100％。所有16種基底/間充質(zhì)BCL含有ALDEFLUOR陽性群，而12種腔BCL中有7種不含任何可檢出的ALDEFLUOR陽性細(xì)胞(p＝0.0006，F(xiàn)ischer精確檢驗(yàn))。ALDEFLUOR陽性細(xì)胞具有腫瘤球形成能力。先前報告了，乳腺上皮干細(xì)胞和祖細(xì)胞能夠在貼壁不依賴性條件中存活并增殖，而且形成稱作乳腺球的漂浮的球形集落(18)。來自乳腺腫瘤及細(xì)胞系的數(shù)據(jù)已經(jīng)證明了，也可以分離癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞或癌癥起始細(xì)胞，并在相似的測定中以“腫瘤球”增殖(26)。正常人乳腺中的所有乳腺球起始細(xì)胞包含在ALDEFLUOR陽性群內(nèi)(17)。為了表征來自BCL的ALDEFLUOR陽性群，比較來自184A1、SUM149和SUM159的ALDEFLUOR陽性和陰性群形成腫瘤球的能力。在每種細(xì)胞系中，與ALDEFLUOR陰性細(xì)胞相比，ALDEFLUOR陽性群顯示升高的腫瘤球形成能力。ALDEFLUOR陽性BCL細(xì)胞在體內(nèi)具有癌癥干細(xì)胞特性。為了測定BCL的分級組織，分析MDA-MB-453、SUM159和BrCa-MZ-01細(xì)胞系的ALDEFLUOR陽性和陰性群的干細(xì)胞特性。這三種BCL的ALDEFLUOR陽性群構(gòu)成總細(xì)胞群的3.54±1.73％和5.49±3.36％之間(圖1A-B，G-H；圖2A-B)。如圖1F，L中所顯示的，腫瘤形成的大小和潛伏期與注射的ALDEFLUOR陽性細(xì)胞的數(shù)目相關(guān)。顯著地，來自MDA-MB-453的500個ALDEFLUOR陽性細(xì)胞和來自SUM159的1,000個ALDEFLUOR陽性細(xì)胞能夠形成腫瘤。在連續(xù)傳代過程中維持腫瘤生成能力，這表明這些細(xì)胞的自我更新能力。比較而言，ALDEFLUOR陰性細(xì)胞不能生成腫瘤，雖然在注射50,000個ALDEFLUOR陰性MDA-MB-453細(xì)胞時產(chǎn)生有限的生長。脂肪墊切片的H&E染色確認(rèn)由ALDEFLUOR陽性細(xì)胞形成的腫瘤含有惡性細(xì)胞，而在ALDELFUOR陰性細(xì)胞注射部位處僅看到殘留的基質(zhì)膠、凋亡細(xì)胞和小鼠組織(圖1E，K)。與具有癌癥干細(xì)胞特征的ALDEFLUOR陽性群一致，由此群形成的腫瘤以相似的ALDEFLUOR陽性和陰性細(xì)胞比率重現(xiàn)初始腫瘤的表型異質(zhì)性(圖1C，I)。這表明ALDEFLUOR陽性細(xì)胞能夠自我更新，生成ALDEFLUOR陽性細(xì)胞，并能夠分化，生成ALDEFLUOR陰性細(xì)胞。在將BrCa-MZ-01細(xì)胞分成ALDEFLUOR陽性和陰性組分時，這兩者都能夠生成腫瘤。由ALDEFLUOR陽性群生成的腫瘤由重現(xiàn)初始腫瘤的表型異質(zhì)性的ALDEFLUOR陽性和陰性細(xì)胞組成。比較而言，由ALDEFLUOR陰性細(xì)胞生成的腫瘤引起緩慢生長的腫瘤，其僅含有ALDEFLUOR陰性細(xì)胞。與要連續(xù)移植的ALDEFLUOR陽性細(xì)胞的能力形成對比，ALDEFLUOR陰性腫瘤的連續(xù)傳代產(chǎn)生降低的腫瘤生長，在三次傳代后沒有生長。這提示BrCa-MZ-01細(xì)胞的ALDEFLUOR陽性組分含有具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，而ALDEFLUOR陰性細(xì)胞含有能夠經(jīng)歷有限生長但不能自我更新的祖細(xì)胞。ALDELFUOR陽性和陰性細(xì)胞群的基因表達(dá)譜。為了測定自不同BCL分離的ALDEFLUOR陽性細(xì)胞是否表達(dá)共同的一組“癌癥干細(xì)胞”基因，使用Affymetrix全基因組寡核苷酸微陣列來分析自8種BCL(184A1、BrCa-MZ-01、HCC1954、MDA-MB-231、MDA-MB-453、SK-BR-7、SUM49和SUM159)分離的ALDEFLUOR陽性和陰性細(xì)胞群。非監(jiān)督分級聚類(其應(yīng)用于16種樣本和13,550種經(jīng)過濾基因/EST)沒有分開ALDEFLUOR陽性和陰性群。取而代之，ALDEFLUOR陽性和陰性群與親本細(xì)胞系一起聚類。這提示克隆細(xì)胞系之間的mRNA轉(zhuǎn)錄物差異代替ALDEFLUOR陽性和ALDEFLUOR陰性細(xì)胞之間的差異。這進(jìn)一步提示，僅有限數(shù)目的基因在推定的癌癥干細(xì)胞與其后代間差別表達(dá)。為了測定哪些基因區(qū)別ALDEFLUOR陽性和陰性群，將Mann和WhitneyU檢驗(yàn)應(yīng)用于除具有低的且測量較差的表達(dá)的那些基因外的所有基因，即25,285個探針組。此檢驗(yàn)在FDR修正后鑒別并分級區(qū)別ALDEFLUOR陽性與陰性細(xì)胞群的413種基因/EST。表1中顯示了28種與獨(dú)特基因?qū)?yīng)的過表達(dá)基因，而表2中顯示了最經(jīng)常表達(dá)不足的基因。表1上調(diào)基因表2下調(diào)基因通過用413種差別表達(dá)的基因/EST來分類16種ALDEFLUOR陽性和陰性樣本，從而說明此區(qū)別性標(biāo)簽的分類權(quán)。分級聚類分級16種樣本中的15種(圖2A)。已知在干細(xì)胞生物學(xué)中發(fā)揮作用的許多基因在ALDEFLUOR陽性群中受到上調(diào)(表1)，包括NFYA、NOTCH2、PCNX、RBM15、ST3GAL3和TPRXL。其它基因編碼在干細(xì)胞功能上具有推定的或未表征的作用的蛋白質(zhì)，諸如ARID1B、RAD51L1和趨化因子受體CXCR1/IL8RA(27)。ALDEFLUOR陽性群中表達(dá)不足的基因參與細(xì)胞分化、凋亡、RNA剪接和線粒體代謝。為了提高分析的嚴(yán)格性，將Mann和Whitney分析的閾值提高至風(fēng)險0.5，并獲得區(qū)別ALDELFLUOR陽性和陰性群的49種基因/EST的列表(表1-2中具有星號的基因)。憑借此列表，所有ALDEFLUOR陽性細(xì)胞(除了SK-BR-7外)聚集在一起。這49種基因/ESTS中，45種對應(yīng)于鑒別的獨(dú)特基因；這45種僅有3種在ALDEFLUOR陽性組中過表達(dá)，而42種表達(dá)不足。表征的過表達(dá)基因編碼F框蛋白FBXO21和CXCR1/IL8RA。表達(dá)不足的基因包括編碼線粒體蛋白質(zhì)(MRPL41、MRPL42、MRPL47、MRPL54、MRPS23、IMMP1L)及分化(NACA)和前mRNA剪接因子(LSM3、前mRNA加工因子PRPF39和PRPF4B)的那些。風(fēng)險為0.5％的棄一法交叉驗(yàn)證(LOOCV)評估鑒別者分子標(biāo)簽的預(yù)測準(zhǔn)確性，并且用此“癌癥干細(xì)胞標(biāo)簽”在正確的種類中預(yù)測88％的樣本，這確認(rèn)監(jiān)督分析。定量RT-PCR評估確認(rèn)ALDEFLUOR陽性細(xì)胞中的CXCR1和FBXO21的顯著增加。對ALDEFLUOR陽性群中過表達(dá)的5種鑒別基因(CXCR1/IL8RA、FBXO21、NFYA、NOTCH2和RAD51L1)進(jìn)行定量RT-PCR分析。通過ALDEFLUOR測定來分選譜分析中使用的3種細(xì)胞系(BrCa-MZ-01、MDA-MB-453、SUM159)和兩種另外的腔細(xì)胞系(MCF7、S68)，并分別處理ALDEFLUOR陽性和陰性群，用于定量RT-PCR分析。圖2B和C中呈現(xiàn)了CXCR1和FBXO21的定量RT-PCR表達(dá)水平。通過定量RT-PCR測定的基因表達(dá)水平確認(rèn)使用DNA微陣列獲得的結(jié)果，其中與ALDEFLUOR陰性群相比，ALDEFLUOR陽性群中的CXCR1和FBXO21mRNA水平升高(p＜0.05)。IL8促進(jìn)癌癥干細(xì)胞自我更新。譜研究提示，IL8受體CXCR1/IL8RA在ALDEFLUOR陽性細(xì)胞群中一致表達(dá)。為了確認(rèn)此關(guān)聯(lián)，在ALDEFLUOR陽性和陰性群中通過流式細(xì)胞術(shù)測量CXCR1/IL8RA的蛋白質(zhì)表達(dá)。將來自4種不同細(xì)胞系的ALDEFLUOR陽性和陰性群通過FACS來分離、固定，并用經(jīng)藻紅蛋白標(biāo)記的CXCR1單克隆抗體染色。如圖3A所示，與ALDEFLUOR陰性群相比，ALDEFLUOR陽性細(xì)胞在CXCR1陽性細(xì)胞中高度富集。為了測定IL8信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在干細(xì)胞功能中是否是重要的，用人重組IL8處理4種BCL以測定其對癌癥干細(xì)胞群的影響，如通過腫瘤球形成和通過ALDH酶活性所測量的。如圖3B所示，IL8的添加以劑量依賴性方式提高原代和繼代腫瘤球的形成。此外，IL8在4種所分析的BCL之每種中以劑量依賴性方式增加ALDEFLUOR陽性群(圖3C)。這說明“CSC標(biāo)簽”鑒別可在干細(xì)胞功能中發(fā)揮作用的途徑的能力。IL8/CXCR1軸參與癌癥干細(xì)胞侵襲。已經(jīng)報道IL8/CXCR1軸在癌癥干細(xì)胞侵襲中發(fā)揮作用(28，29)。使用血清作為引誘物，利用基質(zhì)膠侵襲測定以檢查來自三種不同細(xì)胞系(HCC1954、MDA-MB-453、SUM159)的ALDEFLUOR陽性和陰性細(xì)胞群的侵襲能力。如圖4A所示，表明ALDEFLUOR陽性細(xì)胞侵襲通過基質(zhì)膠比ALDEFLUOR陰性群高6至20倍(p＜0.01)。在作為化學(xué)引誘物使用時，IL8(100ng/ml)提高ALDEFLUOR陽性細(xì)胞的侵襲(p＜0.05)(圖4A)。與其對ALDEFLUOR陽性細(xì)胞的影響形成對比，IL8對ALDEFLUOR陰性細(xì)胞的侵襲能力沒有任何影響。這些結(jié)果表明，癌癥干細(xì)胞表現(xiàn)出侵襲行為，而且IL8促進(jìn)此過程。ALDEFLUOR陽性細(xì)胞具有提高的轉(zhuǎn)移潛力。已經(jīng)提出，CSC在癌癥轉(zhuǎn)移中發(fā)揮至關(guān)重要的作用(30，31)。上述實(shí)驗(yàn)證明，與ALDEFLUOR陰性細(xì)胞相比，ALDEFLUOR陽性細(xì)胞具有提高的侵襲能力。為了確定ALDEFLUOR陽性與轉(zhuǎn)移能力之間的關(guān)系，用螢光素酶慢病毒報告系統(tǒng)感染HCC1954、MDA-MB-453和SUM159。使用ALDEFLUOR測定來分選經(jīng)螢光素酶感染的細(xì)胞，并通過心臟內(nèi)注射導(dǎo)入NOD/SCID小鼠中。注射來自每個群的100,000個細(xì)胞的懸浮液，并通過生物發(fā)光成像來評估轉(zhuǎn)移。接種有ALDEFLUOR陽性細(xì)胞的小鼠在不同部位形成轉(zhuǎn)移，而且相比接種有未分離的細(xì)胞的小鼠(每只小鼠形成不超過一次轉(zhuǎn)移)或接種有ALDEFLUOR陰性細(xì)胞的小鼠(其僅形成限于淋巴結(jié)的偶發(fā)轉(zhuǎn)移)，接種有ALDEFLUOR陽性細(xì)胞的小鼠表現(xiàn)出更高的光子通量發(fā)射(圖4B-J)。組織學(xué)切片確認(rèn)這些部位處的轉(zhuǎn)移存在(圖4K-M)。如此，BCL的轉(zhuǎn)移能力主要由ALDEFLUOR陽性群中含有的CSC介導(dǎo)。腫瘤在由CSC驅(qū)動的細(xì)胞分級中組織的假設(shè)具有癌癥生物學(xué)的基礎(chǔ)含意及用于癌癥早期檢測、預(yù)防和治療的臨床含意。CSC的證據(jù)很大程度上依賴于初始和早期傳代異種移植物模型(32-34)。然而，建立乳腺腫瘤異種移植物的成功率特別對于某些分子亞型還是很低。與原發(fā)性腫瘤形成對比，細(xì)胞系以無限量獲得，而且僅為分子分析提供癌瘤性群，而沒有正常組織和間質(zhì)。在乳腺癌中，已經(jīng)生成了大量的永生化細(xì)胞系，其代表原發(fā)性人乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的不同分子亞型(2，20)。然而，關(guān)于這些細(xì)胞系能夠如何接近地重現(xiàn)人乳腺癌生物學(xué)的基礎(chǔ)問題仍然存在。細(xì)胞系中的干細(xì)胞的體內(nèi)證據(jù)。最近的研究已經(jīng)提示了，雖然可以通過克隆衍生細(xì)胞系，但是它們含有代表細(xì)胞分化的不同階段的細(xì)胞分級。數(shù)項(xiàng)研究已經(jīng)利用標(biāo)志物(諸如CD44+/CD24-)來鑒別乳腺癌細(xì)胞系內(nèi)的CSC。然而，其效用受到如下觀察結(jié)果的限制，即細(xì)胞系內(nèi)百分比較大的細(xì)胞經(jīng)常表達(dá)這些假定的干細(xì)胞標(biāo)志物。例如，基礎(chǔ)乳腺癌細(xì)胞系中大于90％的細(xì)胞表現(xiàn)CD44+/CD24-表型。實(shí)際上，CD44+/CD24-表型沒有分離這些細(xì)胞系的致腫瘤性群(Ginestier等Cell干細(xì)胞1：555-567.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入)。一種備選方法已經(jīng)使用來自細(xì)胞系的SP。然而，利用Hoechst染色的功能研究受到此藥劑的毒性限制(35)。還有SP內(nèi)不含功能性干細(xì)胞活性的證據(jù)(36)。通過ALDEFLUOR測定評估的ALDH活性自多種癌癥中分離具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞(14，37)。在本實(shí)施例中，證明33種BCL(主要是基底細(xì)胞系)中有23種含有ALDEFLUOR陽性群。ALDEFLUOR陽性群在一些腔BCL中的缺乏可以表明這些腔BCL源自ALDEFLUOR陰性祖細(xì)胞。本實(shí)施例利用NOD/SCID小鼠中的體內(nèi)測定來證明ALDEFLUOR陽性群的干細(xì)胞特性。通過NOD/SCID小鼠中的連續(xù)傳代來證明自我更新，而通過ALDEFLUOR陽性而非ALDEFLUOR陰性細(xì)胞再生初始腫瘤的細(xì)胞異質(zhì)性的能力來證明分化。乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)簽。利用8種乳腺細(xì)胞系，本實(shí)施例鑒別出413種基因，其表達(dá)區(qū)別ALDEFLUOR陽性和陰性細(xì)胞。此標(biāo)簽含有已知在干細(xì)胞生物學(xué)中發(fā)揮作用的許多基因。ALDEFLUOR陽性群中過表達(dá)的基因包括Notch同系物2(NOTCH2)(其調(diào)節(jié)乳腺干細(xì)胞的自我更新和分化(18，38))、NFYA(已知其調(diào)節(jié)干細(xì)胞的自我更新和分化(39，40))、pecanex同系物PCNX、RBM15/OTT(其在造血干細(xì)胞中發(fā)揮多效性作用(41)，而且經(jīng)由NOTCH信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來影響髓樣分化(42))、參與胚胎發(fā)育的同源框樣因子TPRXL、ST3GAL3(其編碼與胚胎發(fā)育及腎和胃致癌作用有關(guān)的階段特異性胚胎抗原-4合酶(43))。顯著地，階段特異性胚胎抗原-4蛋白(SSEA-4)在干細(xì)胞群中表達(dá)，諸如人臍帶血中的CXCR4+/CD133+/CD34+/lin-干細(xì)胞和靜止乳腺干細(xì)胞(44)。ALDEFLUOR陽性群中表達(dá)不足的基因參與細(xì)胞分化、凋亡和線粒體氧化。它們包括編碼下列蛋白質(zhì)的基因：與初生多肽相關(guān)的復(fù)合物α亞基NACA、編程性死亡蛋白PDCD5和PDCD10、線粒體核糖體蛋白L41(MRPL41)(其經(jīng)由BCL2和半胱天冬酶經(jīng)由P53依賴性和不依賴性方式誘導(dǎo)凋亡)和參與線粒體加工諸如線粒體中的氧化磷酸化(NDUFA2、ATP5J2、IMMP1L)和蛋白質(zhì)合成(MRPL42、MRPL47、MRPL54、MRPS23)的蛋白質(zhì)。CSC中的凋亡基因的下調(diào)可以在這些細(xì)胞對輻射和化學(xué)療法的抗性方面發(fā)揮作用(45，46)。ALDH1A1沒有鑒別為ALDEFLUOR陽性標(biāo)簽中的差別表達(dá)基因。然而，對個別BCL的基因表達(dá)譜的檢查揭示，雖然一些顯示ALDH1A1在ALDEFLUOR陽性群中的差別表達(dá)，但其它顯示ALDH1A3(即一種不同ALDH同種型)在此群中的差別表達(dá)。這提示不同ALDH同種型的表達(dá)可以有助于ALDEFLUOR陽性表型。從趨化因子至“干細(xì)胞因子(stemokine)”。CXCR1(一種IL8受體)的表達(dá)在多種癌癥中是升高的(47-50)。雖然IL8表達(dá)與ER陰性乳腺癌有關(guān)(51)，但是先前尚未報道此趨化因子在干細(xì)胞功能中發(fā)揮作用。其在調(diào)節(jié)生長和轉(zhuǎn)移方面的含義在雄激素依賴性前列腺癌中得到完善建立(52)。此外，IL8的表達(dá)水平經(jīng)由VEGF生成和血管生成與致腫瘤性和轉(zhuǎn)移有關(guān)(53，54)。以三種方式驗(yàn)證基因表達(dá)數(shù)據(jù)。第一種，定量RT-PCR分析確認(rèn)在來自譜分析中包含和不包含的細(xì)胞系的ALDEFLUOR陽性群中CXCR1mRNA顯著升高。第二種，使用流式細(xì)胞術(shù)證明，僅在ALDEFLUOR陽性群內(nèi)找到含有CXCR1的細(xì)胞。第三種，重組IL8提高乳腺球形成和ALDEFLUOR陽性細(xì)胞在BCL中的百分比。如此，IL8/CXCR1軸似乎調(diào)節(jié)乳腺干細(xì)胞增殖或自我更新。因?yàn)閮?nèi)皮和基質(zhì)細(xì)胞分泌IL8，所以此趨化因子似乎在介導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境間的相互作用中發(fā)揮作用。最近的研究已經(jīng)提示了白介素/趨化因子在調(diào)節(jié)CSC中的作用(55，56)。這包括IL6在乳腺CSC中和IL4在介導(dǎo)結(jié)腸CSC的化學(xué)抗性中的作用(56-59)。這些因子可能參與炎癥與癌癥之間的關(guān)聯(lián)。這還包括CCL5(RANTES)，即一種由間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的趨化因子的作用，其充當(dāng)旁分泌分子，而且增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動性、侵襲和轉(zhuǎn)移(55)。轉(zhuǎn)移的根源。CSC可能負(fù)責(zé)介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移。首先通過使用前列腺癌的轉(zhuǎn)基因小鼠模型和癌癥患者中的轉(zhuǎn)移性和原發(fā)性腫瘤的比較譜鑒別產(chǎn)生的11種基因標(biāo)簽中的干細(xì)胞基因來提示CSC與轉(zhuǎn)移之間的聯(lián)系(60)。此標(biāo)簽也是多種癌癥類型中的疾病復(fù)發(fā)、治療后死亡和遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的一種有力的預(yù)測物。本實(shí)施例已經(jīng)證明了，ALDEFLUOR陽性細(xì)胞比ALDEFLUOR陰性細(xì)胞更具轉(zhuǎn)移性，而且IL8(先前報道其在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用)促進(jìn)優(yōu)先表達(dá)IL8受體CXCR1的癌癥干細(xì)胞的侵襲和趨化性。自細(xì)胞系分離轉(zhuǎn)移癌干細(xì)胞的能力應(yīng)當(dāng)便于研究癌癥干細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。實(shí)施例2CXCR1抑制和組合療法本實(shí)施例描述了用于測試CXCR1抑制對腫瘤細(xì)胞的影響的多種方法，以及CXCR1抑制與抗有絲分裂劑(多西他賽)的組合。CXCR1抑制對細(xì)胞生長和對SUM159細(xì)胞系的ALDEFLUOR陽性群的影響。將SUM159細(xì)胞系在黏附條件中培養(yǎng)，并使用CXCR1/CXCR2抑制劑Repertaxin或兩種對CXCR1或CXCR2特異的阻斷抗體來處理細(xì)胞。處理4天后，使用MTT測定來分析對細(xì)胞生長的影響(圖5A)，并使用ALDEFLUOR測定來分析對癌癥干細(xì)胞群的影響(圖5B)。在用Repertaxin或CXCR1阻斷抗體處理的細(xì)胞中觀察到超過95％的細(xì)胞生長抑制，而對用CXCR2阻斷抗體處理的細(xì)胞沒有觀察到效果(圖5A)。有趣的是，對ALDEFLUOR陽性群觀察到相似的效果，其中用Repertaxin和CXCR1阻斷抗體處理的細(xì)胞中的ALDEFLUOR陽性群分別降低80％和50％(圖5B)。Repertaxin處理誘導(dǎo)由FAS/FAS配體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)將SUM159細(xì)胞系細(xì)胞在黏附條件中培養(yǎng)，然后單獨(dú)用Repertaxin處理或與FAS拮抗劑組合處理。有趣的是，通過Repertaxin處理誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制通過添加FAS拮抗劑(來自BDpharmingen的抗/Fas配體(產(chǎn)品目錄編號556371))而得到部分挽救。此外，用FAS激動劑處理的細(xì)胞與用Repertaxin處理的細(xì)胞表現(xiàn)出相似的細(xì)胞生長抑制。這些結(jié)果表明Repertaxin處理誘導(dǎo)由FAS/FAS配體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)。Repertaxin處理對FAK、AKT和FOXOA3活化的影響。為了評估Repertaxin處理對CXCR1下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，在2天期間內(nèi)，在沒有或存在100nMRepertaxin的情況中將SUM159細(xì)胞在黏附條件中培養(yǎng)，并用針對p-FAK、p-AKT和FOXOA3的抗體通過免疫熒光來染色。在未處理的細(xì)胞中(圖7A)，檢測出30％的表達(dá)p-FAK的細(xì)胞和10％的表達(dá)p-AKT的細(xì)胞表現(xiàn)失活，而用Repertaxin處理的細(xì)胞表現(xiàn)p-FAK和p-AKT的完全失活(圖7B)。未處理的SUM159細(xì)胞呈現(xiàn)80％的細(xì)胞的胞質(zhì)中FOXOA3呈陽性。有趣的是，用Repertaxin處理的SUM159細(xì)胞呈現(xiàn)80％的細(xì)胞的細(xì)胞核中FOXOA3呈陽性。從胞質(zhì)至細(xì)胞核的FOXOA3細(xì)胞定位變化表明FOXOA3蛋白的活化。用Repertaxin、多西他賽或組合治療后的腫瘤生長曲線使用一種乳腺癌細(xì)胞系(8A，SUM159)和自不同患者生成的三種人乳腺癌異種移植物(8B，MC1；8C，UM2；和8D，UM3)來評估Repertaxin、多西他賽或其組合的效果。對于每種樣本，將50,000個細(xì)胞注射到被監(jiān)測腫瘤大小的NOD-SCID小鼠的乳腺脂肪墊中。在腫瘤大小為約4mm時開始注射。將Repertaxin一天兩次注射(15mg/Kg)28天或一周一次注射，將多西他賽I.P.注射(10mg/Kg)，或者采用組合(Repertaxin/多西他賽)。圖8顯示了每種指定處理過程前和期間的腫瘤大小(箭頭，開始處理)。對每種樣本(SUM159、MC1、UM2、UM3)觀察到相似的結(jié)果，其中與對照相比，在單獨(dú)用多西他賽治療或組合Repertaxin/多西他賽治療時腫瘤大小在統(tǒng)計學(xué)上顯著降低(p＜0.01)，而在對照腫瘤和用Reperataxin治療的腫瘤的生長之間沒有觀察到顯著的差異。通過ALDEFLUOR測定評估Repertaxin、多西他賽或組合處理對癌癥干細(xì)胞群的影響通過ALDEFLUOR測定來評估ALDH活性，用于分析用Repertaxin、多西他賽或組合處理的每種腫瘤(9A.SUM159，9B.MC1，9C.UM2，9D.UM3)中的癌癥干細(xì)胞群大小。對每種樣本觀察到相似的結(jié)果。與對照相比，經(jīng)多西他賽處理的腫瘤異種移植物顯示相似或增加百分比的ALDEFLUOR陽性細(xì)胞，而與對照相比，單獨(dú)用Repertaxin或與多西他賽組合處理產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)上顯著減少的ALDEFLUOR陽性細(xì)胞及少65％至85％的癌癥干細(xì)胞(p＜0.01)。通過植入繼代小鼠評估Repertaxin、多西他賽或組合處理對癌癥干細(xì)胞群的影響。將自未處理(對照)和用Repertaxin、多西他賽或組合處理的原發(fā)性腫瘤獲得的細(xì)胞(10A.SUM159，10B.MC1，10C.UM2，10D.UM3)的連續(xù)稀釋植入繼代NOD-SCID小鼠的乳房脂肪墊中。經(jīng)對照和多西他賽處理的所有稀釋的原發(fā)性腫瘤形成繼發(fā)性腫瘤，而僅較高濃度的用Reperatxin或與多西他賽組合處理的原發(fā)性腫瘤能夠形成延遲的繼發(fā)性腫瘤，其在大小上比經(jīng)對照和多西他賽處理的腫瘤顯著更小(p＜0.01)。此外，對于4種樣本中的3種(SUM159、UM2、UM3)，1000和100個用組合初始處理的細(xì)胞不能形成繼發(fā)性腫瘤。Repertaxin處理降低SUM159細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移潛力用表達(dá)螢光素酶的慢病毒感染SUM159細(xì)胞系，并在NOD/SCID小鼠的心臟中接種250,000個經(jīng)螢光素酶感染的細(xì)胞。將小鼠分成兩組。心臟內(nèi)注射后12小時，通過在28天期間每天兩次s.c.注射鹽水溶液或s.c.注射Repertaxin(15mg/kg)來治療兩組小鼠。使用生物發(fā)光成像來監(jiān)測轉(zhuǎn)移形成(11B：用鹽水溶液治療的小鼠；11C：用Repertaxin治療的小鼠)。接種后以每周的時間間隔測量的標(biāo)準(zhǔn)化光子通量的量化揭示，與用Repertaxin治療的小鼠組相比，用鹽水溶液治療的小鼠組中的轉(zhuǎn)移形成在統(tǒng)計學(xué)上顯著升高(11A)。實(shí)施例3通過CXCR1阻斷來處理癌癥干細(xì)胞本實(shí)施例經(jīng)由體外測定和小鼠模型證明CXCR1抑制對腫瘤細(xì)胞的影響。乳腺組織的解離。將100-200g來自乳房復(fù)位成形術(shù)的正常乳腺組織用手術(shù)刀切碎，酶促解離，并將單細(xì)胞在懸浮液中培養(yǎng)以生成乳腺球或者在膠原基底上黏附條件中培養(yǎng)以誘導(dǎo)細(xì)胞分化(Dontu等GenesDev.17：1253-1270.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。細(xì)胞培養(yǎng)。使用推薦的培養(yǎng)條件來培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞系(Charafe-Jauffret等CancerRes.69：1302-1313.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。用Repertaxin(Sigma-Aldrich)、抗人CXCR1小鼠單克隆抗體(克隆42705，R&Dsystems)、抗人CXCR2小鼠單克隆抗體(克隆48311，R&Dsystems)、抗人CD95小鼠單克隆抗體(克隆DX2，BDPharmingen)(作為FAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激動劑)、抗人FAS配體小鼠單克隆抗體(克隆NOK-1，BDpharmingen)(作為FAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)拮抗劑使用)，或用多西他賽(Taxotere，Sanofi-Aventis)在黏附條件中處理乳腺癌細(xì)胞系。細(xì)胞存活力。對于MTT測定，將細(xì)胞以每孔5,000個細(xì)胞在黏附條件中分配在96孔板中。1天后，開始用Repertaxin處理。通過在每孔中添加20μlMTT溶液(5mg/mL在PBS中)在不同時間點(diǎn)時評估Repertaxin處理對細(xì)胞存活力的影響。然后，將細(xì)胞于37℃溫育1小時，接著將50μLDMSO添加至每孔。在熒光分析儀(Spectrafluor，Tecan)中以560nm測量吸光度。對于TUNEL測定，將細(xì)胞以每孔50,000個細(xì)胞在黏附條件中分配在6孔板中。1天后，開始用Repertaxin處理。4天處理后評估凋亡細(xì)胞的數(shù)目。將細(xì)胞在3.7％甲醛中固定，并利用TACSTdT試劑盒(R&Dsystems)來染色。用DAPI/antifade(Invitrogen)對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。用熒光顯微鏡(Leica，Bannockborn，IL，USA)檢查切片，其中凋亡細(xì)胞以綠色檢出。ALDEFLUOR測定。使用FACStarPLUS(BectonDickinson)，使用ALDEFLUOR試劑盒(StemCelltechnologies)來分離具有高ALDH酶活性的群，如先前所描述的(Ginestier等CellStemCell1：555-567.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。為了從異種移植的腫瘤中清除小鼠起源的細(xì)胞，用抗H2Kd抗體(BDbiosciences，1/200，在冰上20分鐘)對細(xì)胞群染色，接著用經(jīng)藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的二抗(Jacksonlabs，1/250，在冰上20分鐘)染色。ELISA測定。為了測量用或不用Repertaxin處理的細(xì)胞的培養(yǎng)基中分泌的可溶性FAS配體的水平，利用人sFAS配體Elisa(BenderMedsystems)。使用450nm作為主波長在分光光度計上讀取吸光度。Western印跡。將細(xì)胞在Laemmli緩沖液中溶解，并加載到SDS-聚丙烯酰胺凝膠上。將印跡與在TBST(含有0.1％Tween20和2％BSA)中稀釋的各自的一抗于4℃溫育過夜，或于室溫溫育2小時。清洗印跡，并與合適的二抗(GEHealthcare，UK)一起溫育，并使用SuperSignalWestPico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce)來檢測。免疫染色。對于免疫熒光染色，于-20℃用95％甲醇將分選的CXCR1陽性細(xì)胞固定10分鐘。在PBS中對細(xì)胞進(jìn)行再水合，并于室溫與各自的抗體一起溫育1小時。所使用的一抗是P-FAK(1∶50，CellSignalingTechnology)、P-AKT(1∶300，CellSignalingTechnology)和FOXO3a(1∶250，CellSignalingTechnology)。然后，清洗載玻片，并與綴合有PE的二抗(Jacksonlabs)一起溫育30分鐘。用DAPI/antifade(Invitrogen)對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染并蓋上蓋玻片。用熒光顯微鏡(Leica，Bannockborn，IL，USA)檢查切片。在石蠟切片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)以檢測ALDH1(1∶100，BDbiosciences)、P-FAK、P-AKT、FOXO3a表達(dá)(Ginestier等Am.JPathol.161：1223-1233.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。利用Histostainplus試劑盒(Zymedlaboratories)進(jìn)行染色。使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)或3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)作為色原，并用蘇木精對切片進(jìn)行復(fù)染色。動物模型。在NOD/SCID小鼠中評估ALDELFUOR陽性/CXCR1陽性和ALDEFLUOR陽性/CXCR1陰性SUM159細(xì)胞的致腫瘤性(Ginestier等Cell干細(xì)胞1：555-567.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。利用SUM159細(xì)胞系和自三名不同患者生成的3種原發(fā)性人乳腺癌異種移植物(MC1、UM2、UM3)來測定Repertaxin處理對腫瘤生長的功效(Ginestier等CellStemCell1：555-567.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。將來自這些腫瘤的細(xì)胞同位移植到NOD/SCID小鼠的人源化的清除過的脂肪墊(clearedfat-pad)中，而不進(jìn)行體外培養(yǎng)。如先前所描述的(Ginestier等CellStemCell1：555-567.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)制備脂肪墊。將來自每種異種移植物的50,000個細(xì)胞注射到NOD/SCID小鼠的人源化脂肪墊中，并監(jiān)測腫瘤生長。在腫瘤大小為約4mm時，開始單獨(dú)用Repertaxin(s.c.，15mg/Kg，一天兩次，在28天期間)、單獨(dú)用多西他賽(i.p.，10mg/Kg，一周一次，在4周期間)、組合(Repertaxin/多西他賽)治療或用鹽水注射對照組(i.p.，一周一次及s.c.一天兩次，在28天期間)。在腫瘤為最大直徑約1.5cm時，對動物實(shí)施安樂死，以避免腫瘤壞死，并依照脊椎動物研究用途條例。將所注射的每個脂肪墊的一部分在福爾馬林中固定，并在石蠟中包埋，用于組織學(xué)分析。將剩余部分的腫瘤細(xì)胞再移植到繼代NOD/SCID小鼠中。利用細(xì)胞的連續(xù)稀釋來進(jìn)行再移植，其中為每種經(jīng)處理的腫瘤注射10,000、1,000和100個細(xì)胞。貼壁不依賴性培養(yǎng)。將在黏附條件中經(jīng)Repertaxin(100nM)、抗CXCR1抗體(10μg/ml)或抗CXCR2(10μg/ml)處理的BCL解離，并在超低附著板(Corning，Acton，MA)中以低密度(5000個活細(xì)胞/ml)鋪板為單細(xì)胞。如先前所描述(Charafe-Jauffret等CancerRes.69：1302-1313.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)培養(yǎng)細(xì)胞。將解離原代腫瘤球后的隨后培養(yǎng)物在超低附著板上以5000個活細(xì)胞/ml的密度鋪板。在第一(原代腫瘤球)和第二(繼代腫瘤球)傳代后對細(xì)胞形成腫瘤球的能力進(jìn)行量化。RNA提取和qRT-PCR。處理SUM159細(xì)胞后，使用RneasyMini試劑盒(QIAGEN)來分離總RNA，并利用其在ABI7900HT序列檢測系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)時定量RT-PCR(qRT-PCR)測定。用于Taqman系統(tǒng)的引物和探針選自AppliedBiosystemswebsite(wwwdotappliedbiosystems.com)(FAS配體測定ID：Hs_00899442_mi；IL8測定ID：Hs_00174103_mi、TBP測定ID：Hs_00427620_mi)。相對于內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TBP基因來計算FAS配體和IL8的相對表達(dá)mRNA水平以標(biāo)準(zhǔn)化RNA質(zhì)量和輸入cDNA量的變化，如先前所描述的(Ginestier等Clin.CancerRes.12：4533-4544.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。流式細(xì)胞術(shù)分析。進(jìn)行CD44/CD24/Lin染色(Ginestier等CellStemCell1：555-567.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。利用經(jīng)抗CD95標(biāo)記的APC(1∶20，BDbiosciences)來進(jìn)行CD95/FAS染色。對于CXCR1和CXCR2染色，一抗抗CXCR1(1∶100，克隆42705，R&Dsystems)和抗CXCR2(1∶100，克隆48311，R&Dsystems)后，進(jìn)行經(jīng)PE標(biāo)記的二抗抗小鼠(稀釋1∶250，JacksonLabs)染色。用1μg/mlPI(Sigma)對新鮮細(xì)胞染色5分鐘以檢測存活力。病毒感染。生成兩種不同慢病毒構(gòu)建體，分別用于表達(dá)螢光素酶基因(Lenti-LUC-VSVG)(Charafe-Jauffret等CancerRes.69：1302-1313.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)和用于抑制PTEN表達(dá)(Lenti-PTEN-SiRNA-DsRed)(Korkaya等PLoSBiolog.7：e1000121.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。所有慢病毒構(gòu)建體均由密歇根大學(xué)載體(UniversityofMichiganVector)制備。還利用用于過表達(dá)FAK的腺病毒構(gòu)建體(Ad-FAK-GFP)(Luo等CancerRes.69：466-474.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。如先前所描述(Charafe-Jauffret等CancerRes.69：1302-1313.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)，用不同載體進(jìn)行細(xì)胞感染。通過測量DsRed或GFP表達(dá)細(xì)胞來驗(yàn)證感染效率。心臟內(nèi)接種。用2％異氟烷/空氣混合物麻醉6周齡NOD/SCID小鼠，并在心臟左心室中注射100μL缺乏Ca2+和Mg2+的無菌杜伯科氏PBS中的250,000個細(xì)胞。對于三種細(xì)胞系(HCC1954、MDA-MB-453和SUM159)中的每種及對于每種治療(鹽水或Repertaxin)，注射6只動物。心臟內(nèi)注射后12小時，按每天兩次對小鼠開始Repertaxin注射或?qū)φ兆⑸潲}水。生物發(fā)光檢測。在接種前和接種后每周評估初始生物發(fā)光。如先前所描述(Charafe-Jauffret等CancerRes.69：1302-1313.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)進(jìn)行生物發(fā)光檢測程序。標(biāo)準(zhǔn)化的光子通量代表接種后每周檢測出的光子通量與接種前檢測出的光子通量的比率。CXCR1表達(dá)將癌癥干細(xì)胞群細(xì)分。鑒別調(diào)節(jié)癌癥干細(xì)胞(CSC)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供細(xì)胞群中潛在的治療性靶物。已經(jīng)鑒別出基于基因表達(dá)譜的乳腺CSC標(biāo)簽，其含有可能參與乳腺CSC調(diào)節(jié)途徑的數(shù)種基因(Charafe-Jauffret等CancerRes.69：1302-1313.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。在乳腺CSC群中過表達(dá)的基因中，CXCR1，即結(jié)合促炎性趨化因子IL-8/CXCL8的一種受體，表現(xiàn)為一種有希望的候選物，因?yàn)橹亟MIL-8刺激乳腺CSC的自我更新(Charafe-Jauffret等CancerRes.69：1302-1313.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。利用流式細(xì)胞術(shù)，測量在乳腺CSC群中的CXCR1蛋白表達(dá)，如通過人乳腺癌細(xì)胞系HCC1954、MDA-MB-453和SUM159的ALDELFUOR測定所評估的。NOD/SCID小鼠異種移植物中具有功能性干細(xì)胞特性的細(xì)胞包含在ALDEFLUOR陽性細(xì)胞群內(nèi)(Charafe-Jauffret等CancerRes.69：1302-1313.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。CXCR1陽性群(其代表小于總?cè)旱?％)幾乎僅包含在ALDEFLUOR陽性群內(nèi)(參見圖12A和表4)。表4.還評估CXCR2表達(dá)。CXCR2是一種也能結(jié)合IL-8/CXL8的受體，盡管與CXCR1相比具有降低的親和力。與CXCR1陽性細(xì)胞形成對比，CXCR2陽性細(xì)胞在ALDEFLUOR陽性和ALDEFLUOR陰性群間均勻分布(參見圖12A)。為了根據(jù)CXCR1表達(dá)確定癌癥干細(xì)胞群的分級結(jié)構(gòu)，對ALDEFLUOR陽性/CXCR1陽性和ALDEFLUOR陽性/CXCR1陰性細(xì)胞群進(jìn)行分選，并注射到NOD/SCID小鼠中(參見圖13)。這兩種細(xì)胞群都生成腫瘤。腫瘤生長動力學(xué)與腫瘤形成的潛伏期和大小及所注射細(xì)胞的數(shù)目有關(guān)。由ALDEFLUOR陽性/CXCR1陽性群生成的腫瘤在連續(xù)傳代后重建初始腫瘤的表型異質(zhì)性，而ALDEFLUOR陽性/CXCR1陰性群生成僅含有ALDEFLUOR陽性/CXCR1陰性細(xì)胞的腫瘤。這些結(jié)果提示，CSC細(xì)胞分級依照CXCR1表達(dá)來組織，然而，這兩種細(xì)胞群表現(xiàn)出相似的致腫瘤性能力。CXCR1阻斷在體外降低乳腺癌干細(xì)胞群。用Repertaxin(100nM)，即一種CXCR1/2抑制劑，處理三種不同細(xì)胞系，以評估CXCR1阻斷對乳腺CSC群的影響(Bertini等Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA101：11791-11796.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。對于SUM159，在處理三天后，觀察到ALDEFLUOR陽性細(xì)胞的比例降低5倍(參見圖12B)。在用抗CXCR1阻斷抗體處理SUM159細(xì)胞后觀察到相似的效果。比較而言，在用抗CXCR2阻斷抗體處理后沒有觀察到效果，表明Repertaxin對ALDEFLUOR陽性群的效果是由CXCR1介導(dǎo)的。來自乳腺腫瘤及細(xì)胞系的數(shù)據(jù)表明也可以將癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞或癌癥起始細(xì)胞分離，并在懸浮培養(yǎng)中以“腫瘤球”增殖(Ponti等CancerRes.65：5506-5511.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。用Repertaxin或用抗CXCR1阻斷抗體處理三天后，在將細(xì)胞分開并在懸浮液中培養(yǎng)時，與對照相比，觀察到原代和繼代腫瘤球形成減少8倍。比較而言，抗CXCR2阻斷抗體對腫瘤球形成沒有影響(參見圖14)。出乎意料的是，在用Repertaxin處理5天后，如通過MTT測定所評估，我們觀察到整個細(xì)胞群的存活力的大幅降低，其中僅3％的細(xì)胞仍然存活(參見圖12C)。在抗CXCR1阻斷抗體而不是抗CXCR2阻斷抗體的情況中觀察到相似的結(jié)果，如此表明此效果依賴于CXCR1阻斷。Repertaxin的此效果被延遲，其中細(xì)胞存活力的損失在處理后三天開始(參見圖15A)。Repertaxin處理對HCC1954乳腺癌細(xì)胞系誘導(dǎo)相似的影響，而對含有PTEN突變的MDA-MB-453細(xì)胞沒有觀察到影響(Hollestelle等CancerRes.5：195-201.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)(參見圖14、圖15B-C和圖16)。利用TUNEL測定，在用Repertaxin處理4天后對SUM159細(xì)胞染色，并觀察到由于誘導(dǎo)凋亡，細(xì)胞存活力的大幅降低，其中在Repertaxin處理后檢測出36％的凋亡細(xì)胞(參見圖12D)。結(jié)果表明CXCR1阻斷導(dǎo)致乳腺CSC群的減少，接著在剩余的大量腫瘤群中誘導(dǎo)大幅凋亡。CXCR1阻斷經(jīng)由旁觀者效應(yīng)在CXCR1陰性細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。觀察結(jié)果，即Repertaxin或抗CXCR1阻斷抗體誘導(dǎo)大量細(xì)胞死亡，盡管CXCR1陽性群占總細(xì)胞群的小于2％，表明XCR1陽性細(xì)胞中的CXCR1阻斷經(jīng)由旁觀者效應(yīng)而誘導(dǎo)CXCR1陰性細(xì)胞死亡。用Repertaxin處理分選的CXCR1陽性和CXCR1陰性群(參見圖12E)。Repertaxin在3天內(nèi)降低CXCR1陽性群中的細(xì)胞存活力，而在CXCR1陰性群中沒有觀察到影響。Repertaxin在未分離的細(xì)胞中誘導(dǎo)大量細(xì)胞死亡。Repertaxin對未分離的和CXCR1陽性群的細(xì)胞存活力的影響是劑量依賴性的(參見圖12E)。結(jié)果與靶向CXCR1陽性群，繼而經(jīng)由旁觀者效應(yīng)誘導(dǎo)CXCR1陰性細(xì)胞死亡的Repertaxin處理一致。為了測定此效應(yīng)是否由Repertaxin誘導(dǎo)的可溶性因子介導(dǎo)，在Repertaxin處理三天后自CXCR1陽性群收集條件培養(yǎng)基，并利用具有3.5KDa排阻的膜對此培養(yǎng)基進(jìn)行透析以自培養(yǎng)基中除去Repertaxin，而保留大于3.5KDa的分子。透析的條件培養(yǎng)基在CXCR1陰性和未分離的群兩者中而不是在CXCR1陽性群中誘導(dǎo)細(xì)胞存活力的大幅降低(參見圖12F)。這些結(jié)果證明CXCR1陽性群中的CXCR1阻斷經(jīng)由可溶性不可透析的因子在CXCR1陰性群中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。雖然CXCR1陽性群對Repertaxin敏感，但是它對可透析的死亡因子有抗性。由CXCR1阻斷誘導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)是由FAS配體/FAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的。FAS配體/FAS相互作用在不同生理狀態(tài)(諸如乳腺退化)中或者在組織損傷(包括由化學(xué)療法誘導(dǎo)的)條件中激活(Chhipa等JCellBiochem.101：68-79.，Song等JClin.Invest106：1209-1220.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。使用ELISA測定來測定可溶性FAS配體在經(jīng)Repertaxin處理的SUM159細(xì)胞的培養(yǎng)基中的水平以評估FAS配體/FAS相互作用在介導(dǎo)由CXCR1阻斷誘導(dǎo)的凋亡旁觀者效應(yīng)中的作用。觀察到與未處理的細(xì)胞相比，用Repertaxin處理四天的細(xì)胞的培養(yǎng)基中的可溶性FAS配體升高超過5倍(參見圖17A)。通過RT-PCR確認(rèn)通過測量FAS配體mRNA水平得到的Repertaxin處理對FAS配體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(參見圖17B)。與未處理的細(xì)胞相比，觀察到經(jīng)Repertaxin處理的細(xì)胞中FAS配體mRNA水平升高4倍。用激活FAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的FAS激動劑處理后觀察到相似的結(jié)果，表明FAS配體是產(chǎn)生正反饋回路的FAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶物。如通過流式細(xì)胞術(shù)所測定，100％的SUM159細(xì)胞表達(dá)FAS蛋白。用FAS激動劑處理SUM159細(xì)胞再現(xiàn)在Repertaxin處理情況中觀察到的具有細(xì)胞存活力大幅降低的殺死效應(yīng)(參見圖17C)?？笷AS配體阻斷抗體部分地逆轉(zhuǎn)Repertaxin處理對細(xì)胞存活力的影響，其中與單獨(dú)用Repertaxin處理的情況中僅3％的細(xì)胞存活相比，44％的細(xì)胞在Repertaxin和抗FAS配體抗體處理后仍然存活(參見圖17C)。結(jié)果表明，由Repertaxin誘導(dǎo)的大量細(xì)胞死亡是歸因于FAS配體/FAS途徑介導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)。用FAS激動劑處理SUM159細(xì)胞導(dǎo)致CXCR1陽性和ALDEFLUOR陽性細(xì)胞的百分比分別增加10倍和3倍(參見圖17D/E和圖18)?？笷AS配體沒有挽救Repertaxin對這兩種群的影響(參見圖17D/E)，這表明含有CXCR1陽性群的ALDEFLUOR陽性群雖然對CXCR1阻斷直接敏感，這繼而誘導(dǎo)這些細(xì)胞的FAS配體生成，但是它對FAS配體/FAS促凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有抗性。比較而言，ALDEFLUOR陰性的大量細(xì)胞群不表達(dá)CXCR1，但是對FAS配體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡敏感。FAS配體/FAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在乳腺退化過程中發(fā)揮重要的作用(Song等JClin.Invest106：1209-1220.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。檢查CXCR1阻斷對自乳房復(fù)位成形術(shù)獲得的人正常乳腺上皮細(xì)胞的影響。如在乳腺癌細(xì)胞系中觀察到的，CXCR1陽性正常乳腺細(xì)胞幾乎僅包含在ALDEFLUOR陽性群內(nèi)(參見圖19A)。為了測定IL-8信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在正常的乳房干細(xì)胞/祖細(xì)胞功能中是否重要，用人重組IL-8處理懸浮培養(yǎng)的正常乳腺上皮細(xì)胞，并測定其對CSC群的影響，如通過乳腺球形成所測量的(Dontu等GenesDev.17：1253-1270.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。IL-8的添加以劑量依賴的方式提高原代和繼代乳腺球的形成(參見圖19B)，表明IL-8/CXCR1軸可能參與調(diào)節(jié)正常乳腺干細(xì)胞/祖細(xì)胞的增殖或自我更新。用Repertaxin或FAS激動劑處理對黏附條件中培養(yǎng)的正常乳腺上皮細(xì)胞的存活力沒有影響，即使是利用高濃度的Repertaxin(500nM)時(參見圖16A)。然而，如對乳腺癌細(xì)胞系所觀察到的，在用Repertaxin處理的正常乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中檢測出可溶性FAS配體的增加(參見圖20B)。此觀察結(jié)果可以通過這些條件下培養(yǎng)的正常上皮細(xì)胞中沒有FAS表達(dá)來解釋(參見圖20C)。這與證明FAS在乳腺中的表達(dá)僅發(fā)生在哺乳后的退化過程期間的研究一致(Song等JClin.Invest106：1209-1220.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。與其缺乏對正常乳腺上皮細(xì)胞的大量群的影響形成對比，Repertaxin顯著降低這些細(xì)胞的乳腺球形成(參見圖20C)。這些結(jié)果表明，IL-8/CXCR1軸在正常的和惡性的乳腺上皮干細(xì)胞/祖細(xì)胞群的調(diào)節(jié)和存活中發(fā)揮重要的作用。經(jīng)由由FAS配體介導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)影響大量細(xì)胞群的能力可以與這些細(xì)胞中的FAS表達(dá)水平有關(guān)。CXCR1阻斷對癌癥干細(xì)胞的影響是由FAK/AKT/FOXO3A途徑介導(dǎo)的。CXCR1經(jīng)由參與粘著斑激酶(FAK)磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來起作用，所述粘著斑激酶(FAK)磷酸化導(dǎo)致AKT的活化(Waugh等Clin.CancerRes.14：6735-6741.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文文)。為了評估CXCR1阻斷對FAK和AKT活化的影響，通過對三種不同細(xì)胞系進(jìn)行的Western印跡來測量FAK和AKT磷酸化蛋白質(zhì)的水平。對于SUM159和HCC1954，與未處理的細(xì)胞相比，我們在經(jīng)Repertaxin處理的細(xì)胞中檢測到FAKTyr397和AKTSer473磷酸化的降低，表明epertaxin效果可以由FAK/AKT途徑介導(dǎo)(參見圖21A和圖22)。MDA-MB453對Repertaxin處理有抗性的觀察結(jié)果可以通過存在激活PI3K/AKT途徑的PTEN突變(919G＞A)來解釋(Hollestelle等Mol.CancerRes.5：195-201.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。在MDAMB453細(xì)胞系中Repertaxin處理后沒有檢測到FAKTyr397和AKTSer473磷酸化的修飾(參見圖22)。為了確認(rèn)FAK/AKT途徑在介導(dǎo)CXCR1阻斷的效果中的功能性作用，使用兩種病毒構(gòu)建體，一種經(jīng)由PTENshRNA敲除PTEN表達(dá)，而另一種導(dǎo)致FAK過表達(dá)。PTEN經(jīng)由其脂質(zhì)磷酸酶而拮抗PI3-K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Vivanco等Nat.Rev.Cancer2：489-501.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。PTEN敲除導(dǎo)致AKT活化，如通過AKTSer473磷酸化升高所證明(參見圖21A和圖22)。PTEN敲除阻斷Repertaxin處理對FAK和AKT活性的影響，F(xiàn)AK過表達(dá)也阻斷Repertaxin的影響，而且誘導(dǎo)FAK和AKT的活化，其通過FAKTyr397和AKTSer473磷酸化的表達(dá)增加來測量。這些結(jié)果表明CXCR1阻斷效果是由FAK/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的。利用對CXCR1陽性細(xì)胞的免疫熒光染色確認(rèn)，與未處理的細(xì)胞相比，Repertaxin處理導(dǎo)致磷酸-FAK和磷酸-AKT表達(dá)的顯著降低(參見圖21B)。AKT經(jīng)由導(dǎo)致胞質(zhì)FOXO3A隔絕的磷酸化事件來調(diào)節(jié)forkhead轉(zhuǎn)錄因子FOXO3A的活性(Brunet等Mol.CellBiol.21：952-965.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。比較而言，未磷酸化形式的FOXO3A運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核，在那里它充當(dāng)調(diào)節(jié)FAS配體合成的轉(zhuǎn)錄因子(Jonsson等Nat.Med.11：666-671.)，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文。Repertaxin經(jīng)由FAS配體介導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；通過免疫熒光染色來檢查Repertaxin對此信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。FOXO3A以胞質(zhì)定位存在于未處理細(xì)胞中，但是在Repertaxin處理后穿梭到細(xì)胞核(參見圖21B)。這表明CxCR1阻斷經(jīng)由抑制FAK/AKT途徑來誘導(dǎo)FOXO3A活性。通過免疫熒光來檢測，具有PTEN刪除或FAK過表達(dá)的細(xì)胞在經(jīng)Repertaxin處理的和未處理的細(xì)胞中都表現(xiàn)出高水平的磷酸-FAK和磷酸-Akt表達(dá)。如通過FOXO3A的胞質(zhì)位置所顯示，Repertaxin處理在具有PTEN刪除或FAK過表達(dá)的細(xì)胞中沒有誘導(dǎo)FOXO3A活化(參見圖21B)。由于FAK/AKT途徑的組成性激活，具有PTEN刪除或FAK過表達(dá)的細(xì)胞表現(xiàn)出對Repertaxin處理的抗性。具有PTEN刪除或FAK過表達(dá)的細(xì)胞在Repertaxin處理的情況中沒有表現(xiàn)出任何細(xì)胞存活力降低。已經(jīng)提出，AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在CSC的生物學(xué)中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用(參見圖21B和圖22)(Dubrovska等Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA106：268-273.，Korkaya等PLoSBiolog.7：e1000121.，Yilmaz等Nature441：475-482.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。FAK/AKT途徑的激活阻斷Repertaxin對CSC群的影響，如通過用抑制劑處理后ALDELFUOR陽性群的維持所顯示(參見圖21B)。所有結(jié)果表明CXCR1阻斷直接影響FAK/AKT/FOXO3A途徑。Repertaxin處理抑制AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其對于CSC活性是至關(guān)重要的，而且隨后誘導(dǎo)由CSC生成的FAS配體介導(dǎo)的對大量腫瘤細(xì)胞的旁觀者效應(yīng)。Repertaxin處理在體內(nèi)減少乳腺癌干細(xì)胞群。最近的證據(jù)表明，乳腺CSC對化學(xué)療法和輻射是相對有抗性的，而且可能有助于治療后的腫瘤再生長(Phillips等JNatl.CancerInst.98：1777-1785.，Yu等Cell131：1109-1123.，Li等JNatl.CancerInst.100：672-679.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。CSC原理提示，臨床結(jié)果的顯著改善將要求有效地靶向CSC群(Reya等Nature414：105-111.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。在通過化學(xué)療法靶向大量腫瘤細(xì)胞時，在凋亡過程期間合成并分泌數(shù)種因子。在這些因子中，F(xiàn)AS配體通過介導(dǎo)旁觀者殺死效應(yīng)來放大化學(xué)療法效果(Chhipa等JCellBiochem.101：68-79.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)?；瘜W(xué)療法也可以在受損傷的細(xì)胞中誘導(dǎo)IL-8生成。常用的化療劑多西他賽在SUM159細(xì)胞中誘導(dǎo)IL-8和FAS配體mRNA(參見圖10a/B)。在FAS激動劑處理后我們也檢測到IL-8mRNA水平升高4倍(參見圖10B)。我們已經(jīng)顯示了IL-8能夠調(diào)節(jié)CSC群。這表明對細(xì)胞毒性化學(xué)療法增加Repertaxin可以阻斷此效果，而且靶向癌癥干細(xì)胞群。使用SUM159細(xì)胞系和自三名不同患者生成的三種原發(fā)性人乳腺癌異種移植物(MC1、UM2、UM3)來探測Repertaxin處理對腫瘤生長的功效。將來自這些腫瘤的細(xì)胞同位移植到NOD/SCID小鼠的人源化清潔脂肪墊中，而不進(jìn)行體外培養(yǎng)。對于這些異種移植物中的每種，CSC群僅包含在ALDEFLUOR陽性群內(nèi)(Ginestier等CellStemCell1：555-567.，Charafe-Jauffret等CancerRes.69：1302-1313.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。在每種腫瘤中，CXCR1陽性群幾乎僅包含在此ALDEFLUOR陽性群內(nèi)(參見表5)，而且PTEN/FAK/AKT途徑被激活(參見圖25)。表5將來自每種異種移植物的50,000個細(xì)胞注射到NOD/SCID小鼠的人源化脂肪墊中，并監(jiān)測腫瘤生長。在腫瘤大小為約4mm時，用單獨(dú)用Repertaxin(15mg/Kg，一天兩次，在28天期間)、單獨(dú)用多西他賽(10mg/Kg，一周一次，在4周期間)或用這兩種藥物的組合開始治療。與鹽水注射的對照比較腫瘤生長。對于每種異種移植物，觀察到由多西他賽治療或Repertaxin/多西他賽組合誘導(dǎo)的對腫瘤生長的顯著抑制(參見圖26A和圖27)。單獨(dú)用Repertaxin治療對腫瘤生長具有中度影響。在治療4周后，處死動物，并利用ALDEFLUOR測定來分析殘留的腫瘤。與未治療的對照相比，單獨(dú)用多西他賽治療的殘留的腫瘤含有百分比未改變或增加的ALDELFUOR陽性細(xì)胞(參見圖26B和圖27)。比較而言，單獨(dú)用Repertaxin治療或與多西他賽組合治療減少ALDEFLUOR陽性群超過75％(參見圖26B和圖27)。通過免疫組織化學(xué)來確認(rèn)不同異種移植物中的ALDH1表達(dá)的結(jié)果。與未治療的腫瘤相比，在經(jīng)Repertaxin治療的腫瘤中檢測出ALDH1陽性細(xì)胞的減少，而在用單獨(dú)用多西他賽治療的腫瘤中，ALDH1陽性細(xì)胞的百分比未改變或增加(參見圖26D)。評估CD44+/CD24-細(xì)胞在這些腫瘤中的存在。先前已顯示了乳腺癌干細(xì)胞中表達(dá)標(biāo)志物(AlHajj等Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA100：3983-3988.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。測量CD44+/CD24-表型與CXCR1表達(dá)之間的重疊。CXCR1陽性細(xì)胞存在于CD44+/CD24-細(xì)胞群和表達(dá)CD24或CD44陰性的細(xì)胞群中(參見表6)。表6在單獨(dú)用多西他賽治療的殘留的腫瘤中，觀察到百分比未改變或增加的CD44+/CD24-細(xì)胞，而單獨(dú)用Repertaxin治療或與多西他賽組合治療導(dǎo)致CD44+/CD24-細(xì)胞群減少(參見圖28)。功能性體內(nèi)測定提供了評估治療后剩余的CSC的腫瘤起始和自我更新能力的直接測試，所述功能體內(nèi)測定包括將來自經(jīng)治療的腫瘤的細(xì)胞再次移植到繼代NOD/SCID小鼠中。源自對照或經(jīng)多西他賽治療的動物的所有稀釋度的腫瘤細(xì)胞在繼代NOD/SCID小鼠中顯示相似的腫瘤再生長。比較而言，具有或沒有多西他賽的Repertaxin治療在繼代受體中降低腫瘤生長(參見圖26C)。在注射相等數(shù)目的細(xì)胞時，與來自對照或經(jīng)多西他賽治療的動物的細(xì)胞相比，那些來自經(jīng)Repertaxin治療的動物的細(xì)胞顯示腫瘤生長降低2-5倍(參見圖26C)。對于每種異種移植物模型，自用Repertaxin和多西他賽組合治療的動物獲得的1000或100個腫瘤細(xì)胞不能在NOD/SCID小鼠中形成任何繼發(fā)性腫瘤(參見圖26C、圖27和表7)。這些研究證明，Repertaxin治療特異性靶向并減少CSC群。表7Repertaxin治療抑制FAKMKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)且而在體內(nèi)活化FOXO3A。通過治療后的每種異種移植物的免疫組織化學(xué)來檢查磷酸-FAK和磷酸-AKT的表達(dá)。在來自對照和經(jīng)多西他賽治療的腫瘤的50％的細(xì)胞中檢測出膜性磷酸-FAK表達(dá)，而在單獨(dú)用Repertaxin治療或與多西他賽組合治療的腫瘤中消除磷酸-FAK表達(dá)(參見圖26D)。對磷酸-AKT表達(dá)觀察到相似的結(jié)果，其中在未治療的腫瘤中70％的細(xì)胞表達(dá)磷酸-AKT，在經(jīng)多西他賽治療的腫瘤中有20％的磷酸-AKT陽性細(xì)胞，而在單獨(dú)用Repertaxin治療或與多西他賽組合治療的腫瘤中完全抑制磷酸-AKT表達(dá)(參見圖26D)。在來自單獨(dú)用多西他賽治療、單獨(dú)用Repertaxin治療和用Repertaxin/多西他賽組合治療的腫瘤的細(xì)胞中檢測出核FOXO3A。這些體內(nèi)數(shù)據(jù)與體外數(shù)據(jù)一致，而且確認(rèn)Repertaxin治療抑制FAK/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且激活FOXO3A。Repertaxin治療降低全身性轉(zhuǎn)移的形成。為了測定Repertaxin是否降低全身性轉(zhuǎn)移，我們用螢光素酶慢病毒報告系統(tǒng)感染HCC1954、MDA-MB-453和SUM159乳腺癌細(xì)胞系，并通過心臟內(nèi)注射將細(xì)胞導(dǎo)入NOD/SCID小鼠中。注射每種細(xì)胞系的250,000個細(xì)胞的懸浮液，并通過生物發(fā)光成像每周一次監(jiān)測轉(zhuǎn)移形成。心臟內(nèi)注射后12小時，通過Repertaxin注射或?qū)φ兆⑸潲}水每天對小鼠進(jìn)行兩次治療。注射有HCC1954和SUM159細(xì)胞的小鼠的Repertaxin治療顯著降低轉(zhuǎn)移形成，其中與未治療的小鼠相比，經(jīng)治療的小鼠的光子通量發(fā)射更低(參見圖29A/B)。組織學(xué)切片確認(rèn)轉(zhuǎn)移存在于未治療動物中的數(shù)個部位(參見圖29D)。Repertaxin治療在注射有MDA-MB-453細(xì)胞的小鼠中對轉(zhuǎn)移形成沒有任何作用(參見圖29C)。光子通量發(fā)射和形成轉(zhuǎn)移的動物數(shù)目在經(jīng)Repertaxin治療和未治療的這兩組中是相似的。此結(jié)果與如下的數(shù)據(jù)一致，即所述數(shù)據(jù)將MDA-MB-453描述為由于PTEN突變的存在而對Repertaxin有抗性的細(xì)胞系。這些結(jié)果表明用藥劑(諸如Repertaxin)的CXCR1阻斷能夠降低由CSC群介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(Charafe-Jauffret等CancerRes.69：1302-1313.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。在本發(fā)明實(shí)施方案的開發(fā)過程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞組分驅(qū)動腫瘤生長和轉(zhuǎn)移(Visvader等Nat.Rev.Cancer8：755-768.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。依靠其對目前的治療形式的相對抗性，這些細(xì)胞可以促成治療抗性和復(fù)發(fā)(Reya等Nature414：105-111.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。本發(fā)明提供了一種基于阻斷CXCR1細(xì)胞因子受體(其在乳腺癌干細(xì)胞上表達(dá))以有效地靶向癌癥干細(xì)胞群并改善治療結(jié)果的方法。在本發(fā)明實(shí)施方案的開發(fā)過程中在許多系統(tǒng)中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要的作用。存在有這些細(xì)胞因子中的數(shù)種能調(diào)節(jié)干細(xì)胞行為的證據(jù)。IL-4能夠調(diào)節(jié)胰腺癌干細(xì)胞的自我更新，而IL-6能夠調(diào)節(jié)結(jié)腸癌和乳腺癌中的癌癥干細(xì)胞(Todaro等CellStemCell1：389-402.，Sansone等JClin.Invest117：3988-4002.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。先前已經(jīng)證明了IL-8在介導(dǎo)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用(Waugh和Wilson.CancerRes.14：6735-6741.，Inoue等Clin.CancerRes.6：2104-2119.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。另外，IL-8在腦中的傷口愈合過程中提高神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新(Beech等JNeuroimmunol.184：198-208.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。將肺癌干細(xì)胞描述為表達(dá)趨化因子受體CXCR1(Levina等PLoS.ONE.3：e3077.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。在本發(fā)明實(shí)施方案的開發(fā)過程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證明，CXCR1陽性群幾乎僅包含在乳腺癌細(xì)胞系和原代異種移植物及正常乳腺細(xì)胞中的ALDEFLUOR陽性群內(nèi)。趨化因子受體在ALDEFLUOR陽性乳腺癌細(xì)胞群中過表達(dá)(Charafe-Jauffret等CancerRes.69：1302-1313.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。在乳腺癌中，IL-8在腫瘤微環(huán)境中由多種細(xì)胞類型生成，所述多種細(xì)胞類型包括炎性細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(Waugh等Clin.CancerRes.14：6735-6741.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)這些細(xì)胞類型之間的相互作用，因此癌癥干細(xì)胞可以經(jīng)由IL-8受體CXCR1的阻斷來靶向。利用體外測定，證明CXCR1而不是CXCR2(一種備選的IL-8受體)阻斷減少乳腺癌干細(xì)胞群。然后誘導(dǎo)缺乏CXCR1表達(dá)的整個剩余細(xì)胞群中的凋亡。除CXCR1阻斷抗體外，在實(shí)施方案開發(fā)過程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證明Repertaxin(一種CXCR1/2抑制劑)通過靶向CXCR1陽性群來誘導(dǎo)相似的效果。與其對CXCR1表達(dá)癌癥干細(xì)胞群的直接影響形成對比，Repertaxin對缺乏CXCR1表達(dá)的大量腫瘤細(xì)胞群沒有直接影響。這表明CXCR1陽性細(xì)胞中的CXCR1阻斷經(jīng)由旁觀者效應(yīng)誘導(dǎo)CXCR1陰性細(xì)胞中的細(xì)胞死亡。本文中所描述的實(shí)驗(yàn)證明，F(xiàn)AS配體/FAS途徑是此旁觀者殺死效應(yīng)的介導(dǎo)物。此現(xiàn)象解釋Repertaxin治療在整個細(xì)胞群中誘導(dǎo)大量凋亡中的功效，盡管CXCR1陽性群代表細(xì)胞群的小于1％。通過抗FAS配體抗體對旁觀者殺死的有效阻斷來表明FAS配體的作用。在本發(fā)明實(shí)施方案的開發(fā)過程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，相似的細(xì)胞因子相互作用可以發(fā)生在暴露于細(xì)胞毒性化學(xué)療法的腫瘤中。化學(xué)療法可以在分化的腫瘤細(xì)胞中直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及誘導(dǎo)這些死亡中的細(xì)胞生成FAS配體，這繼而經(jīng)由FAS介導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)來誘導(dǎo)周圍腫瘤細(xì)胞的凋亡。伴隨FAS配體的生成，這些受損傷的細(xì)胞還在類似乳房退化或傷口愈合的過程中分泌升高水平的IL-8。退化的乳腺中通常就是這樣，此IL-8可以刺激乳腺癌干細(xì)胞及保護(hù)它們免于凋亡。這可有助于臨床前模型(4)和新輔助臨床試驗(yàn)(5)中在化學(xué)療法后觀察到的癌癥干細(xì)胞的相對增加。圖30中顯示了化學(xué)療法對腫瘤的凋亡和自我更新途徑的影響。為了測定CXCR1阻斷是否可以在內(nèi)體靶向乳腺癌干細(xì)胞，比較Repertaxin和細(xì)胞毒劑多西他賽對NOD/SCID小鼠中的癌癥干細(xì)胞區(qū)室和腫瘤生長的影響。多西他賽是目前用于治療患有乳腺癌的女性的最有效的化療劑之一。通過ALDEFLUOR測定和NOD/SCID小鼠中的連續(xù)移植來評估癌癥干細(xì)胞群。利用這些測定，確定單獨(dú)化學(xué)療法治療導(dǎo)致癌癥干細(xì)胞群無變化或相對增加。比較而言，單獨(dú)用Repertaxin治療或與化學(xué)療法一起治療顯著減少癌癥干細(xì)胞群。盡管腫瘤起始群顯著減少，單獨(dú)使用Repertaxin沒有導(dǎo)致顯著的腫瘤縮小。Repertaxin和化學(xué)療法的組合導(dǎo)致腫瘤大小及癌癥干細(xì)胞群的顯著減小。將這些藥劑組合以靶向癌癥干細(xì)胞和大量腫瘤細(xì)胞群使這些治療的功效最大化。為了闡明Repertaxin的作用機(jī)制，分析CXCR1的下游途徑。確認(rèn)CXCR1、FAK與AKT之間的相互作用。CXCR1阻斷經(jīng)由FAK和AKT活化而特異性起作用。在本發(fā)明實(shí)施方案開發(fā)過程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，AKT活化經(jīng)由GSK3β的磷酸化來調(diào)節(jié)正常的和惡性的乳腺干細(xì)胞自我更新，所述GSK3β的磷酸化導(dǎo)致WNT途徑的激活(Korkaya等PLoSBiolog.7：e1000121，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。這些結(jié)果表明具有PTEN敲除的細(xì)胞為什么對Repertaxin有抗性。AKT的其它功能是經(jīng)由forkhead轉(zhuǎn)錄因子FOXO3A的磷酸化來調(diào)節(jié)細(xì)胞存活。FOXO3A的AKT磷酸化導(dǎo)致其胞質(zhì)隔離。比較而言，證明CXCR1阻斷導(dǎo)致AKT活化降低，這導(dǎo)致FOXO3A在細(xì)胞核中的移位，其中FOXO3A在細(xì)胞核中誘導(dǎo)許多基因，包括FAS配體(Jonsson等Nat.Med.11：666-671.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。經(jīng)由CXCR1阻斷誘導(dǎo)的FAS配體繼而造成觀察到的旁觀者殺死效應(yīng)(參見圖30)。除了其在CXCR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用外，F(xiàn)AK經(jīng)由整聯(lián)蛋白受體來介導(dǎo)細(xì)胞與胞外基質(zhì)組分的相互作用(Waugh等Clin.CancerRes.14：6735-6741.，通其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。FAK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在轉(zhuǎn)基因模型中在調(diào)節(jié)正常的和惡性的小鼠乳腺干細(xì)胞的自我更新中發(fā)揮作用(Luo等CancerRes.69：466-474.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。FAK活化還通過阻斷FADD和RIP介導(dǎo)的凋亡來促進(jìn)細(xì)胞存活(Kurenova等Mol.CellBiol.24：4361-4371.，Xu等JBiol.Chem.275：30597-30604.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。這為癌癥干細(xì)胞群對FAS/FAS配體誘導(dǎo)的凋亡的抗性提供了一種解釋。已經(jīng)證明了，乳腺癌干細(xì)胞在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用(Croker等JCellMol.Med.2008，Charafe-Jauffret等CancerRes.69：1302-1313.，其內(nèi)容全文以引用的方式并入本文)。本文中顯示，IL-8和CXCR1也在這些過程中發(fā)揮重要的作用。利用Repertaxin分析CXCR1阻斷對實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移的形成的影響。表明繼心臟內(nèi)注射乳腺癌細(xì)胞之后施用時，CXCR1阻斷降低轉(zhuǎn)移形成。利用Repertaxin的臨床研究已經(jīng)證明了毒性的缺乏。針對干擾細(xì)胞因子調(diào)節(jié)環(huán)(諸如IL-8和CXCR1)的策略代表用于靶向乳腺癌干細(xì)胞的方法。參考文獻(xiàn)下列參考文獻(xiàn)的內(nèi)容全文以引用的方式并入本文，如同完全在本文中提出。1.HanahanDandWeinbergRA.Thehallmarksofcancer.Cell2000；100：57-70.2.NeveRM，ChinK，F(xiàn)ridlyandJetal.Acollectionofbreastcancercelllinesforthestudyoffunctionallydistinctcancersubtypes.CancerCell2006；10：515-527.3.BonnetDandDickJE.Humanacutemyeloidleukemiaisorganizedasahierarchythatoriginatesfromaprimitivehematopoieticcell.Nat.Med.1997；3：730-737.4.GlinskyGV.Stemcelloriginofdeath-from-cancerphenotypesofhumanprostateandbreastcancers.StemCellRev.2007；3：79-93.5.JaiswalS，TraverD，MiyamotoT，AkashiK，LagasseE，andWeissmanIL.ExpressionofBCR/ABLandBCL-2inmyeloidprogenitorsleadstomyeloidleukemias.Proc.Natl.A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