應用液質-質聯(lián)用儀測定淡水池塘底泥中氯霉素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種應用液質-質聯(lián)用儀測定淡水池塘底泥中氯霉素的方法，包括步驟有：(1)養(yǎng)殖池塘底泥樣品采集；(2)樣品的提??；(3)正己烷凈化；(4)水飽和乙酸乙酯溶液提??；(5)氮氣吹干提取液，乙腈－水(5+95)溶解得備用液；(6)固相萃取柱洗脫；(7)水飽和乙酸乙酯溶液提取，氮氣吹干；(8)甲醇水(50+50)溶液溶解，渦旋后經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后用液質-質聯(lián)用儀上機測定。本發(fā)明方法通過對淡水池塘底泥進行前處理，去除基體干擾物，提高了靈敏度，優(yōu)化了前處理過程，并且樣品無需衍生化，簡化了操作步驟，可為污染來源排查及評價生態(tài)環(huán)境對健康養(yǎng)殖的影響提供可靠的檢測手段。
【專利說明】應用液質-質聯(lián)用儀測定淡水池塘底泥中氯霉素的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分析化學、生態(tài)環(huán)境安全【技術領域】，特別是一種應用液質-質聯(lián)用儀 測定淡水池塘底泥中氯霉素的方法。

【背景技術】
[0002] 氯霉素（CAP)是一種廣譜抗生素，對需氧、厭氧菌以及衣原體、支原體、立克次體 等均有效。由于價格便宜且效果顯著，常被作為藥物用于畜禽及水產品的疾病治療和預防。 但是，氯霉素存在嚴重的毒副作用，能抑制人體骨髓造血功能，容易造成再生障礙性貧血、 粒狀白細胞缺乏癥和灰嬰綜合征等。因此，為保障動物源食品安全，確保該藥不對人類帶來 危害，世界各國都對其做出了嚴格規(guī)定，嚴禁氯霉素在食用動物上使用，歐盟規(guī)定動物源食 品中氯霉素殘留的最低要求執(zhí)行限為（MRPL)O. g/kg，我國農業(yè)部235號公告中把氯霉 素列為了禁用藥物。
[0003] 由于傳統(tǒng)的水產養(yǎng)殖模式，導致氯霉素已經(jīng)被廣泛應用，盡管現(xiàn)在水產養(yǎng)殖中違 禁使用情況很少了，但其已對環(huán)境造成了嚴重污染，尤其是氯霉素在表層沉積物中富集，當 受污染的淡水池塘進行再次養(yǎng)殖生產時，底泥中的禁用藥物氯霉素會不斷向水體進行緩慢 釋放，成為其二次污染的主要來源，因此評估養(yǎng)殖池塘底泥中的氯霉素藥物殘留狀況，建立 相應的檢測方法，對于水產品中氯霉素污染來源的排查具有積極的意義。
[0004] 經(jīng)過中國學術期刊網(wǎng)絡出版總庫、中文科技期刊數(shù)據(jù)庫、中國學術會議論文全文 數(shù)據(jù)庫、中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫、國家科技成果網(wǎng)、中國專利數(shù)據(jù)庫、中國科技項目創(chuàng)新 成果鑒定意見數(shù)據(jù)庫、中國優(yōu)秀碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫、中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫、 中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫、http://www. baidu. com等文獻檢索及國外的相關資料檢索，目 前，淡水池塘中底泥中的氯霉素檢測方法，只報道了應用氣相色譜儀法測定淡水池塘中底 泥中的氯霉素，而液質-質聯(lián)用儀測定淡水池塘底泥中氯霉素方法未見報道。
[0005] 液質-質聯(lián)用技術（LC - MS/MS)具有快速、靈敏度高、專一性好、不受噪聲干擾等 特點，尤其是通過多反應監(jiān)測模式（MRM)能進一步提高檢測的靈敏度和選擇性，大大降低 了檢測限并很大程度上減少了假陽性的出現(xiàn)。
[0006] 由于淡水養(yǎng)殖池塘底泥中的成份復雜，各種雜質多，對分析干擾大，氣液相色譜儀 檢測方法需要進行衍生化，對樣品的凈化要求較高，整個操作步驟繁瑣、耗時長，氣相色譜 儀器檢測易形成相似峰干擾，熱穩(wěn)定差，不利于準確定性和定量分析，因此研制出干擾小， 穩(wěn)定性高，數(shù)據(jù)準確的檢測方法十分必要。


【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對檢測底泥中氯霉素現(xiàn)有技術的不足，而提出一種對淡水池塘 底泥中氯霉素樣品采集、提取、濃縮，優(yōu)化了前處理過程，應用液質-質聯(lián)用儀，能夠快速準 確檢測出淡水池塘底泥中殘存的痕量氯霉素的檢測方法。
[0008] 本發(fā)明解決其技術問題是采取以下技術方案實現(xiàn)的：
[0009] -種應用液質-質聯(lián)用儀測定淡水池塘底泥中氯霉素的方法，包括步驟如下：
[0010] (1)養(yǎng)殖池塘底泥樣品采集，用采泥器取表層沉積物，放在廣口瓶中在-18°C冰箱 保存；
[0011] ⑵樣品的提取，稱取樣品5. OOg置50ml離心管中，加入2ml水潤濕，加入500 ill 濃度為10. 〇ng/ml的氯霉素內標溶液、5ml乙腈及4%氯化鈉溶液5ml，漩潤振蕩2min，超聲 萃取20min后，靜置IOmin,用轉速為15000r/min的離心機離心IOmin,提取上清液至于另 一 50ml離心管中；
[0012] (3)重復上述步驟（2)的提取過程，合并兩次提取液，在合并的提取液中加入正己 燒5ml，漩潤振蕩2min，用轉速為5000r/min的離心機離心IOmin,棄去正己燒層溶液，重復 一次，得提取液；
[0013] (4)在上述（3)步所得提取液中加入水飽和乙酸乙酯溶液5ml，漩渦振蕩2min，用 轉速為5000r/min的離心機離心lOmin，上層液轉移到15ml離心管中，重復提取1次，將兩 次所得上層液合并；
[0014] (5)將上述（4)步所得提取液用氮氣吹干，用乙腈一水（5+95)溶液3ml溶解氮氣 吹干后殘留物得備用液；
[0015] (6)將固相萃取柱依次用甲醇10ml，水IOml預洗，然后取上述備用液過柱，用水 5ml洗柱，用5ml甲醇水（50+50)溶液洗脫，以lml/min的速度將樣品洗脫入15ml離心管 中；
[0016] (7)將上述洗脫液中加入水飽和乙酸乙酯溶液5ml，渦旋振蕩2min，5000r/min，離 心5min，取上層液，重復提取1次，合并提取液氮氣吹干，得吹干殘留物；
[0017] (8)用ImL甲醇水（50+50)溶液溶解上步殘留物，旋渦后經(jīng)0. 22 m微孔濾膜過濾 后用液質-質聯(lián)用儀上機測定。
[0018] 而且，所述步驟（8)中用液質-質聯(lián)用儀上機測定時，檢測中各項條件設定為：
[0019] ①色譜柱：Shim-Pack XR-ODS C8 色譜柱，5 u m，75mmX 2. Omm(內徑），柱溫 40°C， 流動相為A-水，B-甲醇，流速為0. 30mL/min，進樣量5 ii L ;
[0020] ②梯度洗脫條件如表1 :
[0021] 表1梯度洗脫條件
[0022]

【權利要求】
1. 一種應用液質-質聯(lián)用儀測定淡水池塘底泥中氯霉素的方法，其特征在于包括步驟 如下： (1)養(yǎng)殖池塘底泥樣品采集，用采泥器取表層沉積物，放在廣口瓶中在-18°C冰箱保 存； ⑵樣品的提取，稱取樣品5.OOg置50ml離心管中，加入2ml水潤濕，加入500yl濃 度為10.Ong/ml的氯霉素內標溶液、5ml乙腈及4%氯化鈉溶液5ml，漩潤振蕩2min，超聲萃 取20min后，靜置lOmin，用轉速為15000r/min的離心機離心lOmin，提取上清液至于另一 50ml離心管中； (3) 重復上述步驟（2)的提取過程，合并兩次提取液，在合并的提取液中加入正己烷 5ml，漩潤振蕩2min，用轉速為5000r/min的離心機離心10min，棄去正己燒層溶液，重復一 次，得提取液； (4) 在上述（3)步所得提取液中加入水飽和乙酸乙酯溶液5ml，漩渦振蕩2min，用轉速 為5000r/min的離心機離心10min，上層液轉移到15ml離心管中，重復提取1次，將兩次所 得上層液合并； (5) 將上述（4)步所得提取液用氮氣吹干，用乙腈一水（5+95)溶液3ml溶解氮氣吹干 后殘留物得備用液； (6) 將固相萃取柱依次用甲醇10ml,水10ml預洗，然后取上述備用液過柱，用水5ml洗 柱，用5ml甲醇水（50+50)溶液洗脫，以lml/min的速度將樣品洗脫入15ml離心管中； (7) 將上述洗脫液中加入水飽和乙酸乙酯溶液5ml，渦旋振蕩2min，5000r/min，離心 5min，取上層液，重復提取1次，合并提取液氮氣吹干，得吹干殘留物； (8) 用lmL甲醇水（50+50)溶液溶解上步殘留物，旋渦后經(jīng)0. 22pm微孔濾膜過濾后用 液質-質聯(lián)用儀上機測定。
2. 根據(jù)權利要求1所述的應用液質-質聯(lián)用儀測定淡水池塘底泥中氯霉素的方法，其 特征在于所述步驟（8)中用液質-質聯(lián)用儀上機測定時，檢測中各項條件設定為： ① 色譜柱：Shim-PackXR-ODSC8 色譜柱，5ym，75mmX2. 0mm(內徑），柱溫 40°C，流動 相為A-水，B-甲醇，流速為0. 30mL/min，進樣量5iiL; ② 梯度洗脫條件如表1 : 表1梯度洗脫條件
③ 其他各項設定：離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應 監(jiān)測（MRM);電噴霧電壓：-4500V;氣簾氣：20PSI;輔助氣：50PSI;去簇電壓：-80V及碰撞 電壓：-l〇V，離子源溫度：500°C; ④ 化合物的多反應監(jiān)測離子對及質譜相關參數(shù)如表2所示； 表2化合物的多反應監(jiān)測離子對及質譜相關參數(shù)
其中*為定量尚子； ⑤ 梯度標準品溶液及內標質量的確定；采用不含目標待測物的基質空白溶液配制梯度 標準品溶液（〇, 〇? 5,1. 0, 2. 0,4. 0,8. 0,10.Ong/mL)加入氯霉素-D5內標質量為5.Ong; ⑥ 確定檢測限為〇. 1Ug/kg，定量限為0. 3yg/kg;儀器檢出限及方法定量限見表3， 表3線性范圍、標準曲線方程、檢出限和定量限
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【文檔編號】G01N30/88GK104407085SQ201410719313
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月1日 優(yōu)先權日:2014年12月1日
【發(fā)明者】張素青, 陳永平, 李春青, 葉紅梅, 高麗娜, 李連慶, 時文博, 王秀芹, 王德興, 王寶峰, 馬丹, 王娟娟, 易偉, 李兆千, 張玲 申請人:農業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產品質量監(jiān)督檢驗測試中心(天津)