一種廣譜鑒定β-受體激動劑類藥物的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種廣譜鑒定β-受體激動劑類藥物的方法，涉及藥物檢測領(lǐng)域。通過應(yīng)用超高效液相色譜-四級桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜設(shè)備，得到與β-受體激動劑類藥物特征性化學(xué)結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)的質(zhì)譜信號，根據(jù)β-受體激動劑質(zhì)譜信號特征和解離規(guī)律，構(gòu)建β-受體激動劑類藥物特征圖譜信息庫。通過質(zhì)譜采集的高通量數(shù)據(jù)與特征圖譜庫數(shù)據(jù)比對，鑒定樣品中存在的已知藥物，并且通過對質(zhì)譜信號的模式識別，預(yù)測樣品可能存在的新型未知藥物。最終形成β-受體激動劑類藥物廣譜性鑒定方法，實(shí)現(xiàn)對未知樣品中β-受體激動劑類藥物的快速鑒定。本發(fā)明提供的方法具有良好的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】一種廣譜鑒定β-受體激動劑類藥物的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物檢測領(lǐng)域，具體的，涉及一種廣譜性鑒定β-受體激動劑類藥物 的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 獸藥、添加劑及有害化合物殘留是影響我國動物性產(chǎn)品安全的重要因素，國內(nèi)外 在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)非法使用β-受體激動劑類藥物（俗稱"痩肉精"）已經(jīng)造成多起食品安全事 件，成了困擾世界范圍內(nèi)食品安全的難題。它不僅威脅著人類的健康，具有致畸、致突變和 致癌等作用；同時嚴(yán)重影響畜禽產(chǎn)品的出口貿(mào)易，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國政府從1997 年起就已明令禁止在動物養(yǎng)殖過程中使用"瘦肉精"，經(jīng)過多年治理，成效顯著。但受利益驅(qū) 使，少部分不法經(jīng)營者仍在違法使用，"瘦肉精"問題始終難以根除，對我國的食品安全構(gòu)成 極大威脅。
[0003] 監(jiān)管技術(shù)落后是"瘦肉精"屢禁不止的一個重要因素。如目前檢測β-受體激動 劑類藥物的技術(shù)通常只能同時監(jiān)測十幾種，但已有報道或研究的β -受體激動劑類藥物卻 有幾十種甚至上百種，而且不斷有新合成的類似物出現(xiàn)，而現(xiàn)有的方法根本檢測不到，這樣 會使很多有類似效果的β -受體激動劑類藥物被摻雜在飼料中進(jìn)入動物體內(nèi)，嚴(yán)重制約了 "痩肉精"監(jiān)管工作的開展。
[0004] 另外，現(xiàn)有技術(shù)（如ELISA、HPLC-MS/MS或GC-MS)在檢測飼料、組織、血液或尿液 中是否存在β-受體激動劑類藥物藥物時，遇到兩方面的限制，一方面如ELISA、試紙條等 快速檢測技術(shù)一次只能實(shí)現(xiàn)對已知一種或兩種藥物的篩選，陽性樣品還需用質(zhì)譜進(jìn)一步確 證和定量；另一方面如用HPLC-MS/MS或GC-MS檢測未知樣品中是否含有β -受體激動劑類 藥物時，現(xiàn)有技術(shù)的做法是需要將所有已知的β-受體激動劑類藥物的標(biāo)準(zhǔn)品全部窮盡檢 測，再與檢測結(jié)果一一對比篩選其中是否含有β-受體激動劑或含有哪種β-受體激動劑， 而這類藥物標(biāo)準(zhǔn)品種類多、價格昂貴，且不易獲得，這無疑增加了檢測的工作量和難度。所 以，亟待開發(fā)出一種不需要檢測標(biāo)準(zhǔn)品，即能夠?qū)崿F(xiàn)在動物飼料及動物產(chǎn)品中廣譜性篩查 和確證β-受體激動劑類藥物是否存在的一步完成法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種廣譜鑒定β受體激動劑類藥物的方法以 彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
[0006] 本發(fā)明首先提供了 β-受體激動劑類藥物質(zhì)譜庫的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0007] 1)對β -受體激動劑類藥物進(jìn)行一級二級質(zhì)譜掃描；所述β -受體激動劑類藥物 包括標(biāo)準(zhǔn)品藥物和非標(biāo)準(zhǔn)品藥物；
[0008] 2)將掃描得到的所有β-受體激動劑類藥物的一級、二級質(zhì)譜信息導(dǎo)入軟件中， 建立基于β-受體激動劑類藥物一級二級質(zhì)譜庫。
[0009] 上述質(zhì)譜庫的構(gòu)建方法還包括將現(xiàn)有技術(shù)中已知的其他β -受體激動劑類藥物 的質(zhì)譜信息添加入質(zhì)譜庫中。
[0010]其中步驟1)采用超高效液相色譜-四級桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀 UPLC-Q-Extractive system(UPLC, Waters ACQUITY UPLC Η-Class Bio System； MS, ThermoFisher Q-Exactive)進(jìn)行掃描。
[con]步驟1)質(zhì)譜掃描的條件為：
[0012] a)檢測方式：正離子模式 [0013] b)離子源：電噴霧離子源
[0014] c)噴霧電壓：3500-4000V，優(yōu)選 3500V [0015] d)霧化溫度：350°C
[0016] e)傳輸毛細(xì)管溫度：320°C
[0017] e)鞘氣流速：30L/min
[0018] f)輔助氣流速：10L/min
[0019] g)反吹氣流速：5L/min
[0020] h)碰撞能：25. 0-35. 0V,優(yōu)選 30. 0V
[0021] 1)掃描模式：?11111113/(1(111182(全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描）
[0022] j)掃描范圍：50-750Μ/Ζ
[0023] k)分辨率：70000/17500 (Fullms/ddms2)
[0024] 1)最大掃描時間：100ms
[0025] m)動態(tài)排除：l〇.〇s
[0026] 其中步驟2)的軟件為Trace Finder。
[0027] 上述方法制備得到的受體激動劑類藥物質(zhì)譜庫也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0028] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種廣譜鑒定β-受體激動劑類藥物的方法，包括以下 步驟：
[0029] 1)采用上述方法構(gòu)建β -受體激動劑類藥物質(zhì)譜圖庫和32種β -受體激動劑類 藥物信息庫，包括化合物分子離子m/z、保留時間、同位素峰、二級碎片離子m/z ;
[0030] 2)待測樣品的前處理；
[0031] 3)利用UPLC-QE對前處理后的樣品進(jìn)行分離和質(zhì)譜檢測，質(zhì)譜掃描采用 Fullms+ddms2模式，得到樣品中所有化合物的質(zhì)譜信息；
[0032] 4)將所得質(zhì)譜信息導(dǎo)入Trace Finder軟件，建立分析質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)的處理方法，然 后將分析得到的所有化合物分別與步驟1)所建質(zhì)譜圖庫中質(zhì)譜圖相似度以及32種β-受 體激動劑類藥物信息庫中化合物母離子m/z、保留時間、同位素峰、二級碎片離子m/z進(jìn)行 比對，若五項(xiàng)信息全部匹配，則該物質(zhì)被認(rèn)為是β -受體激動劑類藥物。
[0033] 所述32種β -受體激動劑類藥物分別為班布特羅、溴布特羅、西布特羅、西馬特 羅、克倫普羅、氯丙那林、馬布特羅、特布他林、妥布特羅、齊帕特羅、丁酚胺、菲諾特羅、異丙 腎上腺素、異舒普林、奧西那林、苯乙醇胺Α、利托君、克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、皮布 特羅、嗎噴特羅、拉貝特羅、異克倫潘特、噴布特羅、福莫特羅、沙美特羅、異他林、腎上腺素、 凈特羅、丙卡特羅、多巴酚丁胺等。
[0034] 本發(fā)明的廣譜性鑒定β -受體激動劑類藥物的方法中，步驟2)的前處理方法為：
[0035] ①提?。篴.若待測樣品為飼料：稱取2-5g待測飼料樣品置于干凈容器中，精確至 O.Olg，加入20-50ml鹽酸甲醇或20-50ml 1.0%甲酸提取液，震蕩10-20min后，然后于4t； 條件下7〇00-12000rpm離心5-lOmin，取上清液備用；或
[0036] b.若待測樣品為尿液：準(zhǔn)確取1份體積尿液樣品約2-5ml，置于干凈容器中，加入 3份體積ρΗ5· 2的乙酸銨緩沖液，渦旋混勻后,7000-l2000rpm離心lOmin,取上清液備用； 或
[0037] c.若待測樣品為血漿：準(zhǔn)確取1份體積血漿樣品約2-5ml置于干凈容器中，加入 3倍體積？115.2的乙酸銨緩沖液，混勻，加入同血漿體積的6%髙氯酸，7000-12000印111離心 lOmin，取上清液備用；或
[0038] d.若待測樣品為組織：準(zhǔn)確稱取2-5g組織樣品置于千凈容器中，加入6-l〇mL pH5· 2的乙酸銨緩沖液，再加入用乙酸銨緩沖液稀釋5倍的150 U 1葡萄糖醛甘酸或硫酸酯 酶，組織勻漿機(jī)勻漿，65Γ震蕩酶解1. 5_2h,加入2-5ml的6%高氯酸，8000-12000rpm離心 lOmin，取上清液備用；對于眼睛和脂肪樣品，在加入高氯酸沉淀離心之后取上清液，加入 6-15mL正己焼，3000r/min離心lOmin，去下層液體重復(fù)萃取，然后再進(jìn)行固相萃取凈化過 程；
[0039] ②凈化：用3mL甲醇，3ml超純水活化混合型陽離子交換萃取小柱，準(zhǔn)確吸取步驟 ①得到的3-5ml離心后的上清加入固相萃取小柱，令其自然流速流出，然后用3mL超純水， 3ml甲醇淋洗，待其全部流出，吹干柱中殘留的液體，再用3mL 2%或5%氨水甲醇溶液洗 脫，用衍生小瓶收集全部的洗脫液。在40°C條件下氮?dú)獯登?，最后?. 4-lml液相初始流動 相復(fù)溶，過〇· 1或0.22 μ m濾膜（對于個別比較難過濾的樣品可以用0.45 μ m濾膜），濾液 上機(jī)待測。
[0040] 上述方法中，步驟3)液相色譜條件為：色譜柱:Waters Atlantis· T3column， 2· 1 X 150mm，3 μ m ;進(jìn)樣量：5ul ;流動相：A :0· 1 %甲酸+10mM乙酸銨水；B :0· 1 %甲酸乙腈； 洗脫梯度：
[0041] 時W 流速__ 祕 1% 0.0 0?3 95 5 3.0 0.3 70 30 1.0 0 3 1Q 90 11J 03 10 90 11*6 0.3 95 5 IS.5 0.3 95 5 。
[0042] 上述方法中，步驟3)質(zhì)譜條件為：
[0043] a)檢測方式：正離子模式
[0044] b)離子源：電噴霧離子源
[0045] c)噴霧電壓：35〇〇-4000V，優(yōu)選 3500V ;
[0046] d)霧化溫度：35〇°C
[0047] e)傳輸毛細(xì)管溫度：320 °C
[0048] e)鞘氣流速：30L/min
[0049] f)輔助氣流速：l〇L/min
[0050] g)反吹氣流速：5L/min
[0051] h)碰撞能：25. 0-35. OV,優(yōu)選 30. OV
[0052] i)掃描模式：FullmS/ddmS2 (全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描）
[0053] j)掃描范圍：50-750M/Z
[0054] k)分辨率：70000/17500(Fullms/ddms2)
[0055] 1)最大掃描時間：100ms
[0056] m)動態(tài)排除：10. Os
[0057] 本發(fā)明提供的廣譜鑒定β受體激動劑類藥物的方法可實(shí)現(xiàn)對待測樣品中β受體 激動劑類藥物的廣譜性快速篩選，以及樣品中未知的β受體激動劑類藥物的定性和定量， 為動物食品安全提供有效的監(jiān)管手段，有利于保障人民食品安全，具有良好的社會效益和 經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明方法檢測時不需要同時測定β受體激動劑類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，即可以同步 檢測飼料、血、尿以及組織樣品中的32種β -受體激動劑類藥物，此譜庫還能根據(jù)文獻(xiàn)報 道或該類藥物的質(zhì)譜解析規(guī)律，不斷進(jìn)行擴(kuò)建和完善，進(jìn)而能鑒定更多的β -受體激動劑 類藥物或類似物。據(jù)統(tǒng)計(jì)本方法在飼料中的檢出限為〇· 04-2. 18ng/kg，尿液中的檢出限為 0. 06-0. 30ng/ml，血液中的檢出限為0. 007-0. 07ng/ml，而國標(biāo)以及有文獻(xiàn)報道的方法在飼 料中的檢出限為10ng/kg，血尿中的檢出限位0. lng/ml ;另外一個重要的優(yōu)勢是本方法中 所用的質(zhì)譜為最新出現(xiàn)的高分辨率質(zhì)譜，對藥物的質(zhì)荷比能精確到小數(shù)點(diǎn)后5位，而常用 的低分辨質(zhì)譜其質(zhì)荷比只能精確到小數(shù)點(diǎn)后2位，因此對比而言，本發(fā)明方法的檢測靈敏 度和準(zhǔn)確性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于文獻(xiàn)報道的方法。同時本方法的線性范圍為0· 20-500ng/ml，線性范圍 與其他方法相比也要廣得多。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0058] 圖1為32種β -受體激動劑類藥物（Ing/mL)總離子流圖。
[0059] 圖2為詞料樣品克倫特羅質(zhì)譜圖與譜庫中標(biāo)準(zhǔn)品克倫特羅質(zhì)譜圖的相似度比較 圖。該圖由上到下分別為樣品實(shí)際質(zhì)譜圖、實(shí)際樣品質(zhì)譜圖與譜庫質(zhì)譜圖差異和譜庫中與 之匹配質(zhì)譜圖。通過這項(xiàng)手動比對可以驗(yàn)證Trace Finder軟件處理結(jié)果的可靠性，以及去 除一些假陽性和假陰性結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0060] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0061] 以下實(shí)施例使用到的溶液配制如下：
[0062] 鹽酸-甲醇提取溶液：取〇· 1M鹽酸8〇OmL，加入甲醇2〇〇mL，混勻。甲醇：色譜純。 5%氨水甲醇溶液：取5mL氨水與95mL甲醇混合。0· 2%甲酸/水溶液：取2此甲酸，加水定 容到1000mL
[0063] 液相流動相：水相：取lmL色譜純甲酸，0· 7708g乙酸銨，加水定容到1〇〇〇mL ;有機(jī) 相：取lmL色譜純甲酸，用色譜純乙腈定容到lOOOmL。 '
[0064] 液相系統(tǒng)所用甲醇和乙腈（HPLC級）購自美國Sigma公司，純水（HPLC級）購自 美國Fisher公司，甲酸（9 9.0%HPLC級）和乙酸銨（99.5%HPLC級）購自北京迪科馬科 技有限公司。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水，由Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)以去離子水為 進(jìn)水制的。
[0065] 標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，置于15ml離心管中，然后加入適量的 HPLC級甲醇進(jìn)行溶解,配置成1. Omg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，潤旋lmin以保證樣品充分溶解，不 易溶解的標(biāo)樣可置于超聲儀中超聲l〇min以加速溶解，于-20?條件下避光保存。
[0066] 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：用移液槍分別準(zhǔn)確移取等量的單標(biāo)儲備液置于15ml離心管中， 再用HPLC級甲醇稀釋至lppm。
[0067] 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：在繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時，用1:1甲醇水進(jìn)行逐級稀釋。
[0068] 本發(fā)明所用儀器為：超高效液相色譜：Waters ACQUITY UPLC H-Class，美國 Waters公司；四級桿-軌道講高分辨質(zhì)譜：Q-Exactive,美國Waters公司Thermo Fisher 公司；混合型陽離子交換柱：Oasis'?系列MCX(3cc，60mg)，美國Waters公司；固相萃取裝 置：美國Ameritech Scientific有限公司；氮吹儀：美國Ameritech Scientific有限公司； 離心機(jī)：美國Beckman公司。
[0069] 本發(fā)明所用標(biāo)準(zhǔn)品包括包括32種，分別為班布特羅、溴布特羅、西布特羅、西馬特 羅、克倫普羅、氯丙那林、馬布特羅、特布他林、妥布特羅、齊帕特羅、丁酚胺、菲諾特羅、異丙 腎上腺素、異舒普林、奧西那林、苯乙醇胺A、利托君、克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、皮 布特羅、嗎噴特羅、拉貝特羅、異克倫潘特、噴布特羅、福莫特羅和沙美特羅、異他林、腎上腺 素、凈特羅、丙卡特羅、多巴酚丁胺等，這些標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國Sigma公司。
[0070] 實(shí)施例1β受體激動劑類藥物質(zhì)譜庫的構(gòu)建
[0071] (1)利用Q-E質(zhì)譜儀對每種標(biāo)樣進(jìn)行一級二級質(zhì)譜掃描。
[0072]用已有的32種標(biāo)準(zhǔn)品，包括常用的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等β1， β 2，β 3-受體激動劑類藥物，采用高分辨質(zhì)譜UPLC-Q-Extractive systemOJPLC，Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio System ;MS，ThermoFisher Q-Exactive)進(jìn)行。
[0073]其前處理方法、液相條件、和質(zhì)譜條件的優(yōu)化：前處理方法優(yōu)化主要包括兩個方 面，首先是飼料提取液的確定，分別使用1. 0%甲酸水和鹽酸甲醇提取飼料樣品，經(jīng)檢測發(fā) 現(xiàn)1.0 %甲酸水的提取效率為6〇 % _7〇 %，而鹽酸甲醇的提取效率大于80 %，所以最終確 定鹽酸甲醇為飼料樣品提取液；另一方面在用氨水甲醇進(jìn)行洗脫時，分別用2%和5%氨水 甲醇進(jìn)行洗脫，用2%氨水甲醇進(jìn)行洗脫時，克倫特羅的回收率為60% -70%，用5%氨水 甲醇洗脫時回收率為8〇%左右,所以后期實(shí)驗(yàn)中使用5%氨水甲醇作為洗脫液。液相條件 優(yōu)化包括流動相組成、洗脫梯度的改變,實(shí)驗(yàn)過程中分別采用〇_ 1 %甲酸水和甲醇、0. i % 甲酸水和乙腈、〇· 1%甲酸10mM乙酸銨水和乙腈為流動相進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)最終以〇· 1%甲 酸lOmM乙酸銨水和乙腈為流動相，并使用?色譜柱進(jìn)行分離時色譜峰的峰形和32種 β -受體激動劑類藥物的分離度得到明顯改善。所以，本發(fā)明最終采用Waters Ailantk@ ^column (2. 1X l5〇ram，3 μ m)，梯度洗脫。得到32種β -受體激動劑類藥物的總離子流圖， 見圖1。并在飼料、血、尿等中做添加回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明所有標(biāo)樣的檢出限為0 001η以 mL-0. Ing/mL，在樣品中添加的回收率為60% -120%，其中本發(fā)明方法對非常常見的兩種 β -受體激動__在各種顏巾_觀、驗(yàn)率見下m 表1克倫特羅和沙丁胺醇在飼料、血、尿中的回收率定性限等性能參數(shù)。
[00川」況明方法條件包括前處理和儀器參數(shù)

【權(quán)利要求】
1. β -受體激動劑類藥物質(zhì)譜圖庫的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 對β-受體激動劑類藥物進(jìn)行一級二級質(zhì)譜掃描；所述β-受體激動劑類藥物包括 標(biāo)準(zhǔn)品藥物和非標(biāo)準(zhǔn)品藥物； 2) 將掃描得到的所有β-受體激動劑類藥物的一級、二級質(zhì)譜信息導(dǎo)入軟件中，建立 基于β-受體激動劑類藥物一級二級質(zhì)譜庫。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括將已知的其他β-受體激動劑類藥物 的質(zhì)譜信息添加入質(zhì)譜庫中。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)采用超高效液相色譜-四級桿-軌 道阱高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行掃描。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)質(zhì)譜掃描的條件為：檢測方式： 正離子模式；離子源：電噴霧離子源；噴霧電壓：3500-4000V;霧化溫度：350°C ;傳輸毛 細(xì)管溫度：320°C ;鞘氣流速：30L/min ;輔助氣流速：10L/min ;反吹氣流速：5L/min ;碰撞 能：25. 0-35. 0V ;掃描模式：全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描；掃描范圍：50-750m/z ;分辨率： 70000/17500 ;最大掃描時間：100ms ;動態(tài)排除：3· 0-10. Os。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)的軟件為Trace Finder。
6. -種廣譜鑒定β_受體激動劑類藥物的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 采用權(quán)利要求1-5任一所述的方法構(gòu)建β -受體激動劑類藥物質(zhì)譜圖庫； 2) 待測樣品的前處理； 3) 利用UPLC-QE對前處理后的樣品進(jìn)行分離和質(zhì)譜檢測，質(zhì)譜掃描采用FullmS+ddms2 模式，得到樣品中所有化合物的質(zhì)譜信息； 4) 將所得質(zhì)譜信息導(dǎo)入Trace Finder軟件后進(jìn)行組分分析，將分析得到的所有組分 分別與步驟（1)所建質(zhì)譜圖庫中二級質(zhì)譜圖以及32種β-受體激動劑類藥物信息庫中化 合物母離子m/z、保留時間、同位素峰、二級碎片離子m/z進(jìn)行比對，若五項(xiàng)信息全部匹配， 則該組分被認(rèn)為是β_受體激動劑類藥物。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)的前處理方法為： ①提取： a. 若待測樣品為飼料：稱取2-5g待測飼料樣品置于干凈容器中，精確至O.Olg，加 入20-50ml鹽酸甲醇或20-50ml 1.0%甲酸提取液，震蕩10-20min后，然后于4°C條件下 7000_12000rpm離心5-10min，取上清液備用；或 b. 若待測樣品為尿液：準(zhǔn)確取1份體積尿液樣品約2-5ml，置于干凈容器中，加入3份 體積pH5. 2的乙酸銨緩沖液，渦旋混勻后，7000-12000rpm離心lOmin，取上清液備用；或 c. 若待測樣品為血漿：準(zhǔn)確取1份體積血漿樣品約2-5ml置于干凈容器中，加入3倍體 積口冊.2的乙酸銨緩沖液，混勻，加入同血楽體積的6%高氯酸，7000-12000印111離心10111；[11， 取上清液備用；或 d. 若待測樣品為組織：準(zhǔn)確稱取2-5g組織樣品置于干凈容器中，加入6-10mL pH5. 2的 乙酸銨緩沖液，再加入用乙酸銨緩沖液稀釋5倍的150 μ 1葡萄糖醛甘酸或硫酸酯酶，組織 勻漿機(jī)勻漿，65°C震蕩酶解1. 5-2h，加入2-5ml的6%高氯酸，8000-12000rpm離心lOmin， 取上清液備用；對于眼睛和脂肪樣品，在加入高氯酸沉淀離心之后取上清液，加入6-15mL 正己烷，3000r/min離心10min，去下層液體重復(fù)萃取，然后再進(jìn)行固相萃取凈化過程； ②凈化：用3mL甲醇，3ml超純水活化混合型陽離子交換萃取小柱，準(zhǔn)確吸取步驟①得 到的3-5ml離心后的上清加入固相萃取小柱，令其自然流速流出，然后用3mL超純水，3ml甲 醇淋洗，待其全部流出，吹干柱中殘留的液體，再用3mL 2% -5%氨水甲醇溶液洗脫，用衍 生小瓶收集全部的洗脫液。在40°C條件下氮?dú)獯蹈桑詈笥?. 4-lml液相初始流動相復(fù)溶， 過0. 1或0. 22 μ m或0. 45 μ m濾膜，濾液上機(jī)待測。
8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟3)液相色譜條件為：色譜柱： Waters Atlantis? T3column，2. 1 X 150mm，3 μ m ;進(jìn)樣量：5-10 μ 1 ;流動相：A :0· 1 % 甲酸 +10mM乙酸銨水；B :0. 1 %甲酸乙腈；洗脫梯度： 時間 流速（ml/min) A% B% 0.0 0.3 95 5 3.0 0.3 70 30 8.0 0.3 10 90 11.5 0.3 10 90 11.6 0.3 95 5 15.5 0.3 95 5 。
9. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟3)質(zhì)譜條件為：檢測方式：正離子模 式；離子源：電噴霧離子源；噴霧電壓：3500V ;霧化溫度：350°C;傳輸毛細(xì)管溫度：320°C;鞘 氣流速：30L/min ;輔助氣流速：10L/min ;反吹氣流速：5L/min ;碰撞能：30. 0V ;掃描模式： 全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描；掃描范圍：50-750m/z ;分辨率：70000/17500 ;最大掃描時間： 100ms ;動態(tài)排除：3· 0-10. Os。
10. 權(quán)利要求1-5任一所述方法制備得到的β受體激動劑類藥物質(zhì)譜庫。
【文檔編號】G01N30/88GK104297406SQ201410563021
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月21日
【發(fā)明者】賀平麗, 李婷婷, 李溱, 曹晶晶 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)