一種快速檢測稗草抗藥性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測稗草抗藥性的方法，包括以下步驟：（1）收集稗草種子：收集對除草劑敏感的稗草種子作為材料；（2）稗草的培養(yǎng)：將步驟（1）收集的稗草種子打破休眠后，先用硝酸鉀浸泡催芽，再將發(fā)芽的稗草放入營養(yǎng)液中培養(yǎng)至2葉待用；（3）稗草的處理：將步驟（2）中培養(yǎng)至2葉的稗草粘在塑料板上，再放入不同梯度濃度的除草劑藥液中浸泡30分鐘，然后取出自然晾干，放入營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)15天，評估稗草在葉片顏色、新葉生長及根系發(fā)育的變化，調(diào)查稗草死亡率，獲取除草劑的甄別濃度，即能快速檢測出稗草是否對除草劑產(chǎn)生了抗藥性。本發(fā)明方法能一次性檢測大批量的稗草樣品，且具有時間短、準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點。
【專利說明】一種快速檢測稗草抗藥性的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物保護(hù)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種快速檢測稗草對除草劑是否產(chǎn)生抗藥性的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]蝸尊(Bchinochloa是世界性十大惡性雜草之一,也是我國主要作物上危害最嚴(yán)重的雜草之一。對水稻生產(chǎn)危害尤為嚴(yán)重，不僅危害面積大，而且造成水稻減產(chǎn)也最顯著。
[0003]目前化學(xué)防除仍然是防除稗草的最主要途徑。由于稗草在世界范圍內(nèi)的農(nóng)田中分布面積廣，危害大。因此，除草劑的開發(fā)大部分是以稗草為主要防除目標(biāo)，各種不同類型、不同作用機(jī)制的除稗劑相繼被開發(fā)。
[0004]但隨著使用年限的增加及選擇壓的增大，稗草對部分長期大量使用的除草劑均產(chǎn)生了抗藥性。尤其在湖南省的洞庭湖稻區(qū)，由于直播稻發(fā)展歷史悠久，除草劑的使用頻率高，選擇壓大，稗草抗藥性發(fā)展迅速。自1991年起，二氯喹啉酸在該地區(qū)大面積推廣使用，至2002年，該地區(qū)的稻田稗草已對二氯喹啉酸產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性。后來二氯喹啉酸停用，逐漸被三唑嘧啶磺酰胺類的五氟磺草胺所替代。近兩年據(jù)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民反應(yīng)，五氟磺草胺對稗草的防效急劇下降，翻倍增加使用劑量也很難湊效。此外，江西、安徽、江蘇、浙江、上海等省均發(fā)現(xiàn)稗草對二氯喹啉酸的抗藥性生物型。遼寧和廣東稻區(qū)的稗草對丁草胺和禾草丹也產(chǎn)生了明顯的抗藥性。
[0005]目前稗草抗藥性的檢測方法很多，最常用的方法是溫室整株植物測定法，基本步驟為，首先從長期單一使用過除草劑并懷疑有抗藥性的雜草種子采回，播種于溫室的盆內(nèi)，在播后苗前或苗后進(jìn)行常規(guī)施藥處理，藥劑設(shè)置不同濃度梯度，然后調(diào)查不同劑量下雜草的出苗率、發(fā)芽和死亡率、葉面積、干重等指標(biāo)，并與空白對照進(jìn)行比較，運(yùn)用不同的除草劑濃度處理抗性和敏感種子，并根據(jù)劑量與防效關(guān)系做出回歸曲線計算出ED5tl,以確定抗性倍數(shù)此方法技術(shù)簡便易行，大批量植株同時進(jìn)行，重復(fù)性好，常被利用。但該方法存在的一個大問題是整個試驗周期太長，花費(fèi)時間多，工作量極大。其它的還有諸多的方法，如靶標(biāo)酶活性測定法、葉綠體抗性測定法、熒光信號檢測法以及靶標(biāo)抗性分子檢測法等等。但有的方法用到的檢測儀器昂貴，如葉綠體抗性測定法和熒光信號檢測法。還有部分方法涉及到的試驗試劑貴，需要專業(yè)的技術(shù)人員才能完成，如靶標(biāo)抗性分子檢測法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速檢測稗草抗藥性的方法，該方法簡單可靠，能快速的檢測出大量稗草樣本對莖葉處理劑(如二氯喹啉酸、氰氟草酯和五氟磺草胺等)的抗藥性水平。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為:
一種快速檢測稗草抗藥性的方法，包括以下步驟: (1)收集稗草種子:收集對除草劑敏感的稗草種子作為材料；
(2)稗草的培養(yǎng):將步驟(I)收集的稗草種子用硝酸鉀浸泡催芽，再將發(fā)芽的稗草放入營養(yǎng)液中培養(yǎng)至2葉待用；
(3)稗草的處理:將步驟(2)中培養(yǎng)至2葉的稗草粘在塑料板上，放入不同梯度濃度的除草劑藥液中浸泡30分鐘，然后取出自然晾干，再放入營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)15天，評估稗草在葉片顏色、新葉生長及根系發(fā)育的變化，調(diào)查稗草死亡率，獲取除草劑藥液的甄別濃度。
[0008]優(yōu)選的，所述步驟(2)中稗草的培養(yǎng)具體是:將收集后的稗草種子打破休眠后，先用0.25%硝酸鉀常溫浸泡I天，然后過濾掉多余的水分，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其發(fā)芽后放入營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至I葉期時，將稗草苗10株貼于一張長15cm,寬7cm的塑料板上，再將塑料板放置于裝有營養(yǎng)液的杯中繼續(xù)生長至2葉。
[0009]優(yōu)選的，所述營養(yǎng)液為濃度0.526ml/ml的肥萬稼營養(yǎng)液，稗草培養(yǎng)時讓塑料板斜放于杯中，以保證植物根部浸入杯中營養(yǎng)液里。
[0010]優(yōu)選的，所述除草劑藥液的甄別濃度為稗草死亡率為95%時所對應(yīng)的除草劑濃度。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:
本發(fā)明的一種快速檢測稗草抗藥性的方法，能快速、大批量且準(zhǔn)確地檢測出稗草是否對除草劑產(chǎn)生了抗藥性，可及時掌握田間稗草對除草劑的抗藥性動態(tài)，為科學(xué)合理地使用除草劑提供理論依據(jù)。該方法適合于禾本科雜草稗草的抗藥性監(jiān)測。

【具體實施方式】
[0012]為了便于理解本發(fā)明，下文將結(jié)合較佳的實施例對本發(fā)明作更全面、細(xì)致地描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于以下具體的實施例。
[0013]一種快速檢測稗草抗藥性的方法的實施例，包括以下步驟:
(O收集稗草種子:收集對除草劑敏感的稗草種群種子，該敏感種群是由盆栽法確定的；
(2)稗草的培養(yǎng):將步驟(I)收集的稗草種子打破休眠后，先用0.25%硝酸鉀常溫浸泡I天，然后過濾掉多余的水分，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其發(fā)芽后放入經(jīng)摸索確定的濃度為0.526ml/ml的肥萬稼(設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)濃度，此濃度下稗草的生長最好)營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至I葉期時，將稗草苗10株貼于一張長15cm，寬7cm的塑料板上，再將塑料板斜放置于裝有肥萬稼營養(yǎng)液的杯中繼續(xù)生長，培養(yǎng)時保持植物根部浸入杯中營養(yǎng)液里，待稗草培養(yǎng)至2葉后，待用；
(3)稗草的處理:將步驟(2)中培養(yǎng)至2葉的稗草放入不同梯度濃度的除草劑藥液中浸泡30分鐘，然后取出自然晾干,再放入營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)15天，評估稗草在葉片顏色、新葉生長及根系發(fā)育的變化，調(diào)查稗草死亡率，獲取稗草死亡率為95%時所對應(yīng)的除草劑濃度，該濃度即為除草劑藥液的甄別濃度。
[0014]實施例一
稗草對二氯喹啉酸的抗藥性快速檢測方法
先將收集的稗草種子打破休眠后，用0.25%硝酸鉀常溫浸泡I天，過濾掉多余的水分，再置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其發(fā)芽后放入濃度為0.526ml/ml肥萬稼營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)至I葉期時，將稗草苗10株貼于一張長15cm，寬7cm的塑料板上，再將塑料板斜放置于裝有肥萬稼營養(yǎng)液的杯中繼續(xù)生長，培養(yǎng)時保持植物根部浸入水中，待稗草培養(yǎng)至2葉后,待用。
[0015]甄別濃度的篩選:
以二氯喹啉酸的田間劑量為參考，先以10倍量梯度設(shè)6個處理0，0.05，0.5，5，50，500，5000g a.1./hm2,每個處理重復(fù)3次，將粘有10株稗草的塑料板斜放入二氯喹啉酸藥液中浸泡30分鐘，取出讓其自然晾干，再放入營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)15天，評估稗草在葉片顏色、新葉生長及根系發(fā)育的變化，調(diào)查稗草死亡率。結(jié)果顯示:6個處理0，0.05，0.5，5，50，500，5000g a.1./hm2的死亡率分別為0，0，0，35%，65%，100%, 100%。確定第一次甄別濃度范圍在5_500g a.1./hm2 之間。
[0016]根據(jù)上述范圍5-500g a.1./hm2 第二次設(shè) 6 個處理 0，31.25，62.5，125，250，500ga.1./hm2,每個處理重復(fù)3次,稗草培養(yǎng)和處理同上。結(jié)果顯不:6個處理O, 31.25, 62.5,125，250，500g a.1./hm2 的死亡率分別為 0,41%, 72%, 100%, 100%, 100%。確定第二次甄別濃度范圍在62.5-125 g a.1./hm2之間。
[0017]根據(jù)上述范圍62.5-125 g a.1./hm2 第三次設(shè) 6 個處理 0，50，70，90，110，130 g
a.1./hm2,每個處理重復(fù)3次,稗草培養(yǎng)和處理同上。結(jié)果顯不:6個處理O, 50, 70,90,110,130g a.1./hm2的死亡率分別為0,67%,89%,98%, 100%, 100%。確定第三次甄別濃度范圍在70_90g a.1./hm2 之間。
[0018]根據(jù)上述范圍70-90g a.1./hm2 第四次設(shè) 6 個處理 0，60，70，80，90，10g a.1./hm2，每個處理重復(fù)3次，稗草培養(yǎng)同上，這次每塊板粘20株稗草，處理同上。結(jié)果顯示:6個處理 0，60，70，80，90，10g a.1./hm2 的死亡率分別為 O, 75%, 90%, 95%, 100%, 100%。確定第四次甄別濃度為80g a.1./hm2。
[0019]用第四次的甄別濃度80g a.1./hm2處理抗二氯喹啉酸的稗草樣品1、樣品2和樣品3 (用盆栽法確定的抗性倍數(shù)分別為397.1，125.7和95.8)結(jié)果發(fā)現(xiàn):3個樣品經(jīng)甄別濃度處理后死亡率分別為15%，37%和65%。與傳統(tǒng)的盆栽法結(jié)果一致。
[0020]實施例二
稗草對五氟磺草胺的抗藥性快速檢測方法
先將收集的稗草種子打破休眠后，用0.25%硝酸鉀常溫浸泡I天，過濾掉多余的水分，再置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其發(fā)芽后放入濃度為0.526ml/ml肥萬稼營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)至I葉期時，將稗草苗10株貼于一張長15cm，寬7cm的塑料板上，再將塑料板斜放置于裝有肥萬稼營養(yǎng)液的杯中繼續(xù)生長，培養(yǎng)時保持植物根部浸入水中，待稗草培養(yǎng)至2葉后,待用。
[0021]甄別濃度的篩選:
以五氟磺草胺的田間劑量為參考，先以10倍量梯度設(shè)6個處理0，0.0025,0.025，0.25，
2.5，25，250 g a.1./hm2，每個處理重復(fù)3次，將粘有10株稗草的塑料板斜放入五氟磺草胺藥液中浸泡30分鐘,取出讓其自然晾干,再放入營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)15天，評估稗草在葉片顏色、新葉生長及根系發(fā)育的變化，調(diào)查稗草死亡率。結(jié)果顯示:6個處理0，0.0025，0.025，
0.25，2.5，25，250 g a.1./hm2 的株防效分別為 0,0,0,0,55%, 100%, 100%。確定第一次的甄別濃度范圍在2.5-25 g a.1./hm2之間。
[0022]根據(jù)上述范圍2.5-25 g a.1./hm2 第二次設(shè) 6 個處理 O, 3.125,6.25，12.5,25,50g a.1./hm2,每個處理重復(fù)3次,稗草培養(yǎng)和處理同上。結(jié)果顯不:6個處理O, 3.125,6.25,12.5，25，50 g a.1./hm2 的死亡率分別為 O, 51%，63%，90%, 100%, 100%。確定第二次的甄別濃度范圍在12.5-25 g a.1./hm2之間。
[0023]根據(jù)上述范圍12.5-25 g a.1./hm2 第三次設(shè) 6 個處理 0，5，10，15，20，25 g a.1./hm2,每個處理重復(fù)3次，稗草培養(yǎng)和處理同上。結(jié)果顯不:6個處理0,5,10,15, 20, 25ga.1./hm2的死亡率分別為0，61%，87%，91%，100%, 100%。確定第三次甄別濃度范圍在15_20ga.1./hm2 之間。
[0024]根據(jù)上述范圍15_20g &.1./111112第四次設(shè)6個處理0，14，16，18，20，228 a.1./hm2,每個處理重復(fù)3次，稗草培養(yǎng)同上，這次每塊板粘20株稗草，處理同上。結(jié)果顯示:6處理0,14，16，18，20，22g a.1./hm2 的死亡率分別為 0,85%, 89%, 92%, 95%, 100%。確定第四次的聖瓦別濃度為20g a.1./hm2。
[0025]用第四次的甄別濃度20g a.1./hm2處理抗性稗草樣品1、樣品2和樣品3(用盆栽法確定的抗性倍數(shù)分別為354.7，119.7和112.1)結(jié)果發(fā)現(xiàn):3個樣品經(jīng)甄別濃度處理后死亡率分別為19.7%，36.2%和47.8%。與傳統(tǒng)的盆栽法結(jié)果一致。
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測稗草抗藥性的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)收集稗草種子:收集對除草劑敏感的稗草種子作為材料； (2)稗草的培養(yǎng):將步驟(I)收集的稗草種子用硝酸鉀浸泡催芽，再將發(fā)芽的稗草放入營養(yǎng)液中培養(yǎng)至2葉待用； (3)稗草的處理:將步驟(2)中培養(yǎng)至2葉的稗草粘在塑料板上，放入不同梯度濃度的除草劑藥液中浸泡30分鐘，然后取出自然晾干，再放入營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)15天，評估稗草在葉片顏色、新葉生長及根系發(fā)育的變化，調(diào)查稗草死亡率，獲取除草劑藥液的甄別濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測稗草抗藥性的方法，其特征在于，所述步驟(2)中稗草的培養(yǎng)具體是:將收集后的稗草種子打破休眠后，先用0.25%硝酸鉀常溫浸泡I天，然后過濾掉多余的水分，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其發(fā)芽后放入營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至I葉期時，將稗草苗10株貼于一張長15cm,寬7cm的塑料板上,再將塑料板放置于裝有營養(yǎng)液的杯中繼續(xù)生長至2葉。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測稗草抗藥性的方法，其特征在于，所述營養(yǎng)液為濃度0.526ml/ml的肥萬稼營養(yǎng)液，稗草培養(yǎng)時讓塑料板斜放于杯中，以保證植物根部浸入杯中營養(yǎng)液里。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測稗草抗藥性的方法，其特征在于，所述除草劑的甄別濃度為稗草死亡率為95%時所對應(yīng)的除草劑濃度。
【文檔編號】G01N33/00GK104267152SQ201410517531
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】馬國蘭, 李巳夫, 劉都才, 劉雪源, 唐濤, 彭亞軍 申請人:湖南省植物保護(hù)研究所