基于金黃色葡萄球菌的生物探針、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物病原檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種基于金黃色葡萄球菌的生物探針、制備方法及其應(yīng)用。該基于金黃色葡萄球菌的生物探針，包括：金葡菌載體以及標(biāo)記在所述金葡菌載體的表面A蛋白上，且能夠與被檢測(cè)抗原特異性結(jié)合的抗體；其中，所述金葡菌載體被四唑氯化物染料染至紅色。本發(fā)明提供的這種基于金黃色葡萄球菌的生物探針，兼具乳膠微球和紅細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)，顆粒均一、穩(wěn)定，與抗原結(jié)合能力以及凝集性能強(qiáng)，顏色鮮明，使得凝集結(jié)果非常易于判定。與現(xiàn)有技術(shù)相比，該體系的凝集反應(yīng)的分辨率、靈敏度和特異性都得到了很大的提高，因此，可有效地應(yīng)用到免疫學(xué)檢測(cè)中。
【專利說明】基于金黃色葡萄球菌的生物探針、制備方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物病原檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種基于金黃色葡萄球菌的生物探針、制備方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]典型的金葡菌(金黃色葡萄球菌)為球型，直徑0.8 μ m左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金葡菌無芽胞、鞭毛，大多數(shù)無莢膜，革蘭氏染色陽性。金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococal Protein A, SPA),或簡稱表面A蛋白，占整個(gè)細(xì)胞壁蛋白成分的6.7%,通過胞壁肽聚糖以共價(jià)鍵與之結(jié)合。
[0003]多數(shù)表面A蛋白呈一側(cè)面稍凹的橢球形結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、均一，長約為40.88±1.58nm，寬約為 20.82±0.68nm，高約為 10.51 ±0.28nm。
[0004]表面A蛋白由亮、纈、脯、丙、蘇、甘、絲、谷丙、天門冬及賴氨酸等十種氨基酸組成。由于其不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以無二硫鍵。紫外光譜和吸收系數(shù)為A275nm% =
1.65,等電點(diǎn)為pH5.1。表面A蛋白十分穩(wěn)定,用4mol/L尿素、硫氰鹽酸、6mol/L的鹽酸胍和pH2.5的酸性條件，以及加熱煮沸均不影響其活性。
[0005]表面A蛋白能與人及多種哺乳動(dòng)物血清IgG分子中的Fe片段結(jié)合，結(jié)合的親和性次序依次是豬、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠及牛；對(duì)大白鼠、綿羊的親和力差；對(duì)馬、犢牛、山羊等無親和力；對(duì)所有的魚類、兩棲類、爬行類、鳥類(除少數(shù)例外)均不能與之結(jié)合?；诮瘘S色葡萄球菌A蛋白的免疫學(xué)性質(zhì)，預(yù)示著其可以作為載體并與已知的標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行修飾吸附，進(jìn)而獲得吸附有抗體的載體，通過進(jìn)行協(xié)同凝集反應(yīng)并應(yīng)用到檢測(cè)相應(yīng)的未知抗原中。雖然，上述的方式其檢測(cè)未知抗原的特異性和敏感性均較好，但是，相關(guān)技術(shù)中，由于對(duì)金黃色葡萄球菌沒有進(jìn)行特定的處理，因此，在鑒定其協(xié)同凝集后的凝集產(chǎn)物時(shí)，其分辨率差(常需要借助大型的儀器進(jìn)行分析辨別)，因此，不易判定其凝集結(jié)果，進(jìn)而嚴(yán)重影響了其在免疫學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0006]綜上，提供一種便于觀測(cè)凝集結(jié)果的金黃色葡萄球菌的生物探針并應(yīng)用到抗原檢測(cè)中是本領(lǐng)域亟待解決的一個(gè)技術(shù)問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種基于金黃色葡萄球菌的生物探針；以解決上述的問題。本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供一種上述生物探針的制備方法，并實(shí)現(xiàn)其應(yīng)用。
[0008]在本發(fā)明的實(shí)施例中提供了一種基于金黃色葡萄球菌的生物探針，包括:金葡菌載體以及標(biāo)記在所述金葡菌載體的表面A蛋白上，且能夠與被檢測(cè)抗原特異性結(jié)合的抗體；其中，所述金葡菌載體被四唑氯化物染料染至紅色。
[0009]本發(fā)明提供的這種基于金黃色葡萄球菌的生物探針，金黃色葡萄球菌作為基本的結(jié)構(gòu)組成，由于其細(xì)胞壁上含有一定量結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的表面A蛋白，而該表面A蛋白則可以和多種動(dòng)物血清中的IgG分子中的Fe片段結(jié)合，即其表面A蛋白可以和標(biāo)記有被檢測(cè)抗原特異性結(jié)合的抗體，通過抗體與未知抗原的特異性結(jié)合以及發(fā)生的協(xié)同凝集反應(yīng)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗原的檢測(cè)。更為重要的，由于金葡菌載體是被四唑氯化物染料染至紅色的，具體的，四唑氯化物染料可被金葡菌內(nèi)部所含的各類氧化還原酶作用，生成紅色的不溶物(在細(xì)菌內(nèi)部發(fā)生)，進(jìn)而使得整個(gè)金葡菌顯現(xiàn)出紅色，即得到紅色的金葡菌載體。因此，該紅色的載體與相應(yīng)的抗體標(biāo)記之后(生物探針)，其與特定的抗原發(fā)生協(xié)同凝集反應(yīng)時(shí)，生物探針兼具乳膠微球和紅細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)，顆粒均一、穩(wěn)定，與抗原結(jié)合能力以及凝集性能強(qiáng)，顏色鮮明，使得凝集結(jié)果非常易于判定。與現(xiàn)有技術(shù)相比，該體系的凝集反應(yīng)的分辨率、靈敏度和特異性都得到了很大的提高，因此，可有效地應(yīng)用到免疫學(xué)檢測(cè)中。
[0010]可選的，四唑氯化物染料具體為5-氰基-2，3- 二(4-甲基苯基)四唑氯化物。
[0011]一種上述的生物探針的制備方法，包括以下步驟:
[0012]I)、利用LB平板劃線分離出金葡菌，再利用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到0D600為0.5-1.5的金葡菌懸液；
[0013]2)、在所述金葡菌懸液中加入四唑氯化物染料，并使得所述四唑氯化物染料的終濃度達(dá)到Ι-lOmM，染色10-30min，得到紅色菌懸液；
[0014]3)、將所述紅色菌懸液依次進(jìn)行離心收集菌體、緩沖液清洗、重懸以及滅活，得到紅色的金葡菌載體懸液；
[0015]4)、將紅色的所述金葡菌載體懸液與能夠和被檢測(cè)的抗原特異性結(jié)合的抗體混合后依次進(jìn)行孵育、離心收集沉淀、緩沖液清洗以及重懸，得到標(biāo)記有抗體的菌懸液；
[0016]5)、將所述標(biāo)記有抗體的菌懸液中加入封閉劑后顛倒混勻，進(jìn)行封閉處理，得到紅色的生物探針。
[0017]可選的，在步驟4)中，所述抗體包括單克隆抗體或多克隆抗體；在步驟5)中，所述封閉劑包括脫脂奶粉或牛血清蛋白。
[0018]可選的，在步驟I)中:所述擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為35-39°C，轉(zhuǎn)速為160_200rpm。
[0019]可選的，在步驟3)中:所述離心的轉(zhuǎn)速為3800-4200rpm,時(shí)間為3_7min ;所述清洗以及重懸均采用濃度為0.1Μ、ρΗ為8.0的Tris-HCl，且所述清洗的次數(shù)為2_3次。
[0020]可選的，在步驟3)中:所述滅活具體包括:在將所述重懸處理后的紅色菌懸液中加入終濃度為1%的甲醛處理10-30min ;或，將所述重懸處理后的紅色菌懸液在60_75°C溫育 15_50mino
[0021]可選的，在步驟4)中:能夠和被檢測(cè)的抗原特異性結(jié)合所述抗體的濃度為
0.l_5mg/ml，且所述金葡菌載體懸液與所述抗體的體積比為1:50-500 ;所述孵育的溫度為37°C，時(shí)間為30min，轉(zhuǎn)速為180rpm ;所述離心收集沉淀中，離心的溫度為4°C，轉(zhuǎn)速為4000rpm,時(shí)間為5min ;所述清洗以及重懸均采用濃度為0.1M，pH為8.0的Tris-HCl。
[0022]可選的，在步驟5)中--每100毫升的所述標(biāo)記有抗體的菌懸液加入的封閉劑的質(zhì)量為0.1-5克。
[0023]上述制備方法獲得的生物探針在腸出血性大腸桿菌0157:H7檢測(cè)中的應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]為了更清楚地說明本發(fā)明【具體實(shí)施方式】或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)【具體實(shí)施方式】或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。
[0025]圖1為本發(fā)明實(shí)施例二提供的紅色生物探針的制備流程圖；
[0026]圖2為本發(fā)明實(shí)施例二中未染色的金葡菌懸液和染色后的紅色菌懸液對(duì)比圖；
[0027]圖3為本發(fā)明實(shí)施例二中紅色的金葡菌載體懸液未滅活/滅活后72小時(shí)培養(yǎng)結(jié)果對(duì)比圖；
[0028]圖4為本發(fā)明實(shí)施例二中滅活前的金葡菌載體懸液和滅活后的金葡菌載體懸液負(fù)染透射電鏡結(jié)果圖；
[0029]圖5為本發(fā)明實(shí)施例二中以金葡菌為基礎(chǔ)的生物探針凝集試驗(yàn)靈敏度評(píng)價(jià)圖；
[0030]圖6為本發(fā)明實(shí)施例二中金葡菌為基礎(chǔ)的紅色生物探針與0157:H7凝集反應(yīng)產(chǎn)物負(fù)染透射電鏡觀察圖；
[0031]圖7為現(xiàn)有技術(shù)中未染色探針凝集試驗(yàn)靈敏度評(píng)價(jià)圖；
[0032]圖8為本發(fā)明實(shí)施例二中3次以金葡菌為基礎(chǔ)的紅色生物探針重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果圖；
[0033]圖9為本發(fā)明實(shí)施例二中以金葡為基礎(chǔ)的0157:H7生物探針特異性評(píng)價(jià)圖；
[0034]圖10為本發(fā)明實(shí)施例二中紅色生物探針檢測(cè)0157:H7穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果圖；
[0035]圖11示出了本發(fā)明實(shí)施例二制備的紅色生物探針凝集檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的示意流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0036]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述，基于本發(fā)明中的【具體實(shí)施方式】，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所得到的所有其它實(shí)施方式，都屬于本發(fā)明所保護(hù)的范圍。
[0037]實(shí)施例一
[0038]本實(shí)施例提供了一種基于金黃色葡萄球菌的生物探針，包括:金葡菌載體以及標(biāo)記在所述金葡菌載體的表面A蛋白上，且能夠與被檢測(cè)抗原特異性結(jié)合的抗體；其中，所述金葡菌載體被四唑氯化物染料染至紅色；具體的，四唑氯化物染料具體為5-氰基-2，3-二(4-甲基苯基)四唑氯化物；5-氰基-2，3-二(4-甲基苯基)四唑氯化物(5-cyano_2, 3-ditolyl tetrazolium chloride, CTC)是一種氧化還原型染料，一定濃度的該染料可以被細(xì)菌或者細(xì)胞內(nèi)部的氧化還原酶還原成不溶物質(zhì)，從而將細(xì)菌和細(xì)胞染色。由于反應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行，因此，該染色的過程不影響金葡菌表面A蛋白的活性，表面A蛋白與抗體(包括單克隆抗體或多克隆抗體)的結(jié)合不受影響；另外，該染色反應(yīng)時(shí)間快，操作簡單。
[0039]本發(fā)明提供的這種基于金黃色葡萄球菌的生物探針，四唑氯化物染料可被金葡菌內(nèi)部所含的各類氧化還原酶作用，生成紅色的不溶物(在細(xì)菌內(nèi)部發(fā)生)，進(jìn)而使得整個(gè)金葡菌顯現(xiàn)出紅色，即得到紅色的金葡菌載體。因此，該紅色的載體與相應(yīng)的抗體標(biāo)記之后(生物探針)，其與特定的抗原發(fā)生協(xié)同凝集反應(yīng)時(shí)，生物探針兼具乳膠微球和紅細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)，顆粒均一、穩(wěn)定，與抗原結(jié)合能力以及凝集性能強(qiáng)，顏色鮮明，使得凝集結(jié)果非常易于判定。與現(xiàn)有技術(shù)相比，該體系的凝集反應(yīng)的分辨率、靈敏度和特異性都得到了很大的提高，因此，可有效的應(yīng)用到免疫學(xué)檢測(cè)中。
[0040]為了使得本發(fā)明實(shí)施例一的金葡菌生物探針得到更好的應(yīng)用，更加有效應(yīng)用到微生物學(xué)、生物材料和生化檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】中，本發(fā)明還在上述實(shí)施例一的基礎(chǔ)之上提供了實(shí)施例二，實(shí)施例二為根據(jù)實(shí)施例一所舉的生物探針給出了具體的制備方法，請(qǐng)參考圖1-圖11:
[0041]實(shí)施例二
[0042]請(qǐng)參考圖1，本實(shí)施例提供的這種生物探針的制備方法，具體包括以下步驟:
[0043]步驟101:利用LB平板劃線分離出金葡菌，再利用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到0D600為0.5-1.5的金葡菌懸液；
[0044]具體的，在該步驟中，利用LB平板劃線分離出金葡菌(優(yōu)選金葡菌N315)，然后再挑選單克隆至LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，優(yōu)選的，擴(kuò)大培養(yǎng)的條件為:溫度為35-39°C，轉(zhuǎn)速為160-200rpm(具體操作時(shí)，參數(shù)取中間值，即溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為180rpm)，進(jìn)而獲得0D600為0.5-1.5的金葡菌懸液(平板計(jì)數(shù)結(jié)果推算菌濃度為IX 18 CFU/ml_2X 19 CFU/ml) ο
[0045]步驟102:在所述金葡菌懸液中加入四唑氯化物染料，并使得所述四唑氯化物染料的終濃度達(dá)到Ι-lOmM，染色10-30min，得到紅色菌懸液；
[0046]通過在金葡菌懸液中加入既定終濃度的四唑氯化物染料，染料具體為5-氰基-2，
3-二(4-甲基苯基)四唑氯化物；其在染色的過程中需要將四唑氯化物染料的終濃度控制在Ι-lOmM，染色時(shí)間控制在10-30min，這樣即可保證該染料在金葡菌內(nèi)的氧化還原酶的作用下生成紅色顆粒物，進(jìn)而保證在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)較好的染色效果。
[0047]在本實(shí)施例中，對(duì)于染料的選取是非常關(guān)鍵的，能夠明顯地將金葡菌染色是首先需要考慮的因素，其次，還要保證該染料不能影響金葡菌的生物活性，尤其是不能影響其表面A蛋白與相應(yīng)的抗體結(jié)合的性能，另外，還需要綜合考慮染色時(shí)間以及操作步驟是否繁瑣等因素。在染料選取的過程中，通過對(duì)比姬姆薩染色以及多種染料的染色效果，才獲得了能夠滿足上述染色需求的四唑氯化物染料，具體為5-氰基-2，3-二(4-甲基苯基)四唑氯化物，其染色鮮明，費(fèi)時(shí)短，而且操作簡單，更為重要的，其不影響金葡菌表面A蛋白與不同來源IgG(豬、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠及牛等)的Fe片段的結(jié)合，為實(shí)現(xiàn)該紅色生物探針的制備奠定了基礎(chǔ)。
[0048]如圖2所示，染色前(A)和染色后(B)的金葡菌懸液懸液。制備后的載體懸液呈紅色。進(jìn)一步的，得到的紅色菌懸液需要進(jìn)行離心、清洗、重懸等操作進(jìn)而實(shí)現(xiàn)金葡菌載體的制備。
[0049]步驟103:將所述紅色菌懸液依次進(jìn)行離心收集菌體、緩沖液清洗、重懸以及滅活，得到紅色的金葡菌載體懸液；
[0050]在該步驟103中，為了實(shí)現(xiàn)菌體的收集效果，優(yōu)選的，所述離心的轉(zhuǎn)速為3800-4200rpm、時(shí)間為3_7min(更優(yōu)選的，轉(zhuǎn)速為4000rpm，時(shí)間為5min);所述清洗以及重懸均采用濃度為0.1M、pH為8.0的Tris-HCl，且所述清洗的次數(shù)為2_3次。
[0051]另外，如圖3所示，為了分析此種載體(金葡菌載體)的生物安全性，對(duì)該載體在滅活前和滅活后的菌體進(jìn)行平板劃線，監(jiān)測(cè)顯示，此種載體的生物安全型是滿足要求的。在圖3中，A為未滅活紅色金葡平板劃線72h結(jié)果，B為滅活紅色金葡平板劃線72h結(jié)果。
[0052]如圖4所示，將此生物載體制備前和制備后在溶液里的狀態(tài)進(jìn)行了透射電鏡表征，結(jié)果顯示制備后的新型載體分散性好，顆粒均勻。其中，在圖4中，A為金葡菌滅活前負(fù)染透射電鏡結(jié)果。B為所制備的以金葡為基礎(chǔ)的紅色生物探針滅活后負(fù)染透射電鏡結(jié)果。
[0053]通過圖3和圖4可知，滅活前，染色后的菌保持了很好的活性，在平板上長出許多菌落。而經(jīng)過甲醛或溫育滅活后的金葡菌都沒有生長。進(jìn)而提示所制備的紅色生物載體雖然是由金葡菌制備而來，但是滅活后不能生長，保證了紅色載體的生物安全性。電鏡圖片顯示(圖4)，滅活后的載體呈單顆粒，且大小均一，而未滅活的菌為葡萄球菌的典型葡萄串分布，聚集在一起。
[0054]另外，在滅活處理的過程中，為了實(shí)現(xiàn)便于操作的同時(shí)，盡可能的不減少操作對(duì)金葡菌載體特異結(jié)合抗體的能力，優(yōu)選的，所述滅活過程具體包括:在將所述重懸處理后的紅色菌懸液中加入終濃度為0.1-5% (優(yōu)選1% )的甲醛處理10-30min ;或，將所述重懸處理后的紅色菌懸液在60_75°C溫育15_50min。
[0055]步驟104:將紅色的所述金葡菌載體懸液與能夠和被檢測(cè)的抗原特異性結(jié)合的抗體混合后依次進(jìn)行孵育、離心收集沉淀、緩沖液清洗以及重懸，得到標(biāo)記有抗體的菌懸液；
[0056]在該步驟中，抗體的選擇是多樣的，只要滿足其能夠與被檢測(cè)抗原特異結(jié)合的條件即可。常用的，其可以是單/多克隆抗體，但是，優(yōu)選的，在本實(shí)施例中，采用單克隆抗體。
[0057]金葡菌載體懸液制備完成后，以大腸桿菌0157:H7的檢測(cè)為例，利用金葡菌表面A蛋白的免疫學(xué)性質(zhì)，將0157:H7的H抗原的鼠源IgG單克隆抗體標(biāo)記在紅色滅活的金葡菌載體上。
[0058]具體步驟如下:
[0059]取紅色的金葡菌載體懸液，按體積比1:50-1:500加入H抗原的鼠源IgG單克隆抗體(lmg/ml)，37°C、180rpm孵育30min后,4°C, 4000rpm, 5min收集沉淀,上清可回收再利用。用相同體積0.1MTris-HCl (ρΗ8.0)緩沖液洗3遍后，相同體積0.1M Tris-HCl (ρΗ8.0)重懸，得到標(biāo)記有單克隆抗體的菌懸液。
[0060]步驟105:將所述標(biāo)記有抗體的菌懸液中加入封閉劑后顛倒混勻，進(jìn)行封閉處理，得到紅色的生物探針。
[0061]得到標(biāo)記有單克隆抗體的菌懸液后，為了保證該生物探針在檢測(cè)抗原時(shí)，生物探針上的抗體能夠特異性地與抗原的相應(yīng)部位結(jié)合，以防止發(fā)生非特異性吸附，優(yōu)選的，需要將獲得的標(biāo)記有單克隆抗體的菌懸液加入封閉劑后進(jìn)行封閉處理，具體的，每100毫升的所述標(biāo)記有單克隆抗體的菌懸液加入的封閉劑的質(zhì)量為0.1-5克，然后顛倒溶解，實(shí)現(xiàn)封閉處理的效果，即可得到能夠檢測(cè)0157:Η7紅色生物探針。優(yōu)選的，為了得到較好的封閉效果，在本實(shí)施例中，選用脫脂奶粉或者牛血清蛋白(BSA)作為封閉劑。
[0062]0157:Η7 是腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.coli, EHEC)的一個(gè)主要菌型，其致病力強(qiáng)，對(duì)人類健康構(gòu)成重大威脅。0157:H7是革蘭氏陰性兩端鈍圓的短桿菌，大小
0.5X1?3微米。周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無芽孢。目前對(duì)0157:H7的檢測(cè)方法包括生化反應(yīng)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、血清學(xué)以及毒素等多個(gè)方面的檢測(cè)。其中免疫學(xué)方法中的乳膠凝集試驗(yàn)是本發(fā)明的基礎(chǔ)之一，該方法比較成熟，市場(chǎng)上已有診斷試劑盒可供選擇，但特異性及靈敏度均有待提高。因此，在本發(fā)明的應(yīng)用中，主要以0157:H7檢測(cè)為例，通過獲得易于判定凝集效果的紅色生物探針，進(jìn)而提高該致病菌的檢測(cè)靈敏度。
[0063]另外，請(qǐng)參考圖11，在圖11中，示出了本發(fā)明實(shí)施例的這種紅色生物探針凝集檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的示意流程圖。
[0064]需要指出的是，在本實(shí)施例中，獲得了紅色生物探針之后，為了檢測(cè)其是否滿足應(yīng)用需求，還對(duì)其靈敏度進(jìn)行了評(píng)價(jià)，具體的，包括以下步驟:
[0065]SI:LB平板劃線分離0157:H7后，挑取單克隆至LB液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱以37°C，180rpm條件將菌液擴(kuò)大培養(yǎng)后，利用平板計(jì)數(shù)確定菌濃度。取IXlO8 CFU/ml500μ 1，于 10000rpm，2min 收集菌液，IXPBS 洗 3 遍后，用 500μ I 0.1M Tris-HCl (ρΗ8.0)緩沖液重懸菌液。
[0066]S2:用 0.1M Tris-HCl (ρΗ8.0)緩沖液 10 倍梯度稀釋 I X 108CFU/ml 菌 0157:H7。
[0067]S3:取 1X108、1X107、5X106、1X106、1X105、1X104、1X103、1X102 CFU/ml 的0157:H7以及空白對(duì)照0.1M Tris-HCl (pH8.0)各10 μ I滴在潔凈載玻片上后，取20 μ I2X107-2X101CI個(gè)/ml的新型生物探針懸液與其混合，5?15min后肉眼觀察結(jié)果。結(jié)果如圖5所示，其中每個(gè)反應(yīng)的大腸桿菌0157:H7含量為(CFU)A.1O6、B.105、C.5XlO4, D.104、E.103、F.102、G.101、H.10°、1.空白對(duì)照。
[0068]為了方便判讀凝集結(jié)果，制定了陽性標(biāo)準(zhǔn)，即出現(xiàn)明顯紅色凝集塊和絮狀沉淀，溶液變透明為強(qiáng)陽性。結(jié)合這一標(biāo)準(zhǔn)，圖4的靈敏度可達(dá)到5X 14 CFU/反應(yīng)。另外，將上述產(chǎn)生的明顯凝集溶液輕柔重懸后，利用透射電鏡進(jìn)行了表征。圖6示出了以金葡菌為基礎(chǔ)的紅色生物探針與0157:Η7凝集反應(yīng)產(chǎn)物負(fù)染透射電鏡觀察圖，進(jìn)一步證實(shí)了凝集反應(yīng)的結(jié)果。
[0069]在本實(shí)施例中，還將這種新型生物探針與未染色的生物探針進(jìn)行了比較。未染色的基于金葡菌的生物探針沒有用染料染色，其他制備方法和凝集試驗(yàn)與該新型生物探針相同;2Χ108 個(gè)/ml 的無色生物探針 20 μ I 與 I X 107、I X 106、I X 105、I X 104、I X 103、I X 12CFU/ml的0157:H7以及空白對(duì)照0.1M Tris-HCl (ρΗ8.0)各10 μ I的凝集試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示傳統(tǒng)的基于金葡菌的協(xié)同凝集反應(yīng)結(jié)果，肉眼判定非常不明確，各不同濃度的差異不明顯，所以，凝集反應(yīng)的結(jié)果很難判斷。在圖6中，每個(gè)反應(yīng)的0157:Η7含量為(CFU).A.106、B.105、C.104、D.ΙΟ3、Ε.102、F.1O1, G.10' H.Blank。
[0070]另外，如圖8所示，按照本實(shí)施例提供的方法重復(fù)制備3次基于金葡菌的紅色生物探針并和IX 105CFU/ml的0157:H7單克隆凝集試驗(yàn)結(jié)果一致，說明該凝集試驗(yàn)體系可重復(fù)性強(qiáng)，可以應(yīng)用到0157:H7的檢測(cè)中。
[0071]為了檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例提供的這種紅色生物探針與被檢測(cè)抗原是否能夠特異性結(jié)合。在本發(fā)明中，還對(duì)這種新型生物探針檢測(cè)0157:H7的特異性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，具體的操作步驟如下:
[0072]I)、將大腸桿菌0157、091、097、0100、0149、BL21 (DE3)、腸炎沙門以及豬鏈球菌分別接種至LB液體培養(yǎng)基，將銅綠假單胞菌接種至BHI+5%小牛血清液體培養(yǎng)基后，37°C、180rpm過夜擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0073]2)、通過平板計(jì)數(shù)確定0157:H7濃度后，將上述菌各取500 μ 1，IXPBS洗3遍，500 μ I IXPBS重懸菌液。將0157:Η7兩倍梯度稀釋至5個(gè)梯度，各取100 μ I上述菌懸液測(cè)量0D600，通過0157:Η7，的5個(gè)梯度的方程大致測(cè)算其他菌液濃度。
[0074]3)、各取 10 μ I IXlO7 CFU/ml 大腸桿菌 0157、091、097、0100、0149、BL21 (DE3)、腸炎沙門、豬鏈球菌、銅綠假單胞菌以及10μ I IXlO7 CFU/ml 0157:h7與ΙΟμΙ IXlO7CFU/ml大腸桿菌0100、腸炎沙門、豬鏈球菌、銅綠假單胞菌的混懸液滴于潔凈載玻片上。再取20μ1 2Χ 101°個(gè)/ml的新型生物探針懸液與其混合，5 — 15min后肉眼觀察結(jié)果。結(jié)果如圖9，其中，六.091、8.097、(:.0100、0.01493.81^21、卩.腸炎沙門、G.豬鏈球菌、H.銅綠假單胞菌、1.0157、J.0 157+0100、K.0157+腸炎沙門、L.0157+豬鏈球菌、M.0157+銅綠假單胞菌、N.Blank。
[0075]結(jié)果顯示，這種新型生物探針在應(yīng)用于0157:H7的凝集反應(yīng)檢測(cè)時(shí)，特異性較好。
[0076]最后，基于本發(fā)明實(shí)施例所提供的這種紅色生物探針，公開其對(duì)檢測(cè)0157:H7的的穩(wěn)定性檢測(cè)試驗(yàn)的步驟:
[0077]I)、取2份所制備的紅色生物探針各200 μ I置于1.5ml EP管。
[0078]2)、一份放置于4°C，一份放置于室溫，一個(gè)月后，進(jìn)行凝集試驗(yàn)，挑取LB平板分離的0157: H7單克隆2個(gè)，并分別與20 μ I步驟I)中所給出的生物探針懸液混合，5?15min后，結(jié)果如圖10所示，其中，A為4°C放置一個(gè)月穩(wěn)定性結(jié)果，B為室溫放置一個(gè)月穩(wěn)定性結(jié)果。通過圖10顯示，兩者的凝集現(xiàn)象明顯，證明該生物探針穩(wěn)定性較好。
[0079]綜上，本發(fā)明實(shí)施例所制備的金葡菌生物探針實(shí)現(xiàn)了在0157:H7協(xié)同凝集檢測(cè)上的應(yīng)用。通過將所制備的金葡菌紅色載體與0157:H7鞭毛抗原(H Antigen)的鼠源IgG單抗共孵育，將抗體標(biāo)記到紅色滅活金葡菌表面，經(jīng)脫脂奶粉等封閉后，得到能檢測(cè)0157:H7的生物探針。而且，使用該生物探針的凝集試驗(yàn)對(duì)0157:H7的檢測(cè)限達(dá)到5 X 14 CFU/反應(yīng)，凝集結(jié)果肉眼易于觀察，整個(gè)過程不需要大型儀器且一般操作人員容易掌握。基于上述的啟示，該生物探針可以通過標(biāo)記不同種類的單抗或者多克隆抗體，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)與其特異性結(jié)合的抗原的檢測(cè)，為免疫學(xué)檢測(cè)病原提供了有效的幫助。
[0080]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于金黃色葡萄球菌的生物探針，其特征在于，包括: 金葡菌載體以及標(biāo)記在所述金葡菌載體的表面A蛋白上，且能夠與被檢測(cè)抗原特異性結(jié)合的抗體； 其中，所述金葡菌載體被四唑氯化物染料染至紅色。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物探針，其特征在于，所述四唑氯化物染料具體為5-氰基-2，3-二(4-甲基苯基)四唑氯化物。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物探針的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)、利用LB平板劃線分離出金葡菌，再利用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到0D600為0.5-1.5的金葡菌懸液； 2)、在所述金葡菌懸液中加入四唑氯化物染料，并使得所述四唑氯化物染料的終濃度達(dá)到Ι-lOmM，染色10-30min，得到紅色菌懸液； 3)、將所述紅色菌懸液依次進(jìn)行離心收集菌體、緩沖液清洗、重懸以及滅活，得到紅色的金葡菌載體懸液； 4)、將紅色的所述金葡菌載體懸液與能夠和被檢測(cè)的抗原特異性結(jié)合的抗體混合后依次進(jìn)行孵育、離心收集沉淀、緩沖液清洗以及重懸，得到標(biāo)記有抗體的菌懸液； 5)、將所述標(biāo)記有抗體的菌懸液中加入封閉劑后顛倒混勻，進(jìn)行封閉處理，得到紅色的生物探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物探針的制備方法，其特征在于，在步驟4)中，所述抗體包括單克隆抗體或多克隆抗體； 在步驟5)中，所述封閉劑包括脫脂奶粉或牛血清蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物探針的制備方法，其特征在于，在步驟I)中:所述擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為35-39°C，轉(zhuǎn)速為160-200rpm。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物探針的制備方法，其特征在于，在步驟3)中: 所述離心的轉(zhuǎn)速為3800-4200rpm，時(shí)間為3_7min ； 所述清洗以及重懸均采用濃度為0.1M、pH為8.0的Tris-HCl，且所述清洗的次數(shù)為2-3 次。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物探針的制備方法，其特征在于，在步驟3)中: 所述滅活具體包括:在將所述重懸處理后的紅色菌懸液中加入終濃度為I %的甲醛處理 10-30min ； 或，將所述重懸處理后的紅色菌懸液在60-75°C溫育15-50min。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7任一項(xiàng)所述的生物探針的制備方法，其特征在于，在步驟4)中: 能夠和被檢測(cè)的抗原特異性結(jié)合所述抗體的濃度為0.l_5mg/ml，且所述金葡菌載體懸液與所述抗體的體積比為1:50-500 ； 所述孵育的溫度為37°C，時(shí)間為30min，轉(zhuǎn)速為180rpm ； 所述離心收集沉淀中，離心的溫度為4°C，轉(zhuǎn)速為4000rpm，時(shí)間為5min ； 所述清洗以及重懸均采用濃度為0.1M，pH為8.0的Tris-HCl。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物探針的制備方法，其特征在于，在步驟5)中: 每100毫升的所述標(biāo)記有抗體的菌懸液加入的封閉劑的質(zhì)量為0.1-5克。
10.權(quán)利要求3-7任一項(xiàng)所述制備方法獲得的生物探針在腸出血性大腸桿菌0157:H7檢測(cè)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104198737SQ201410462482
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月11日
【發(fā)明者】危宏平, 胡偉, 楊航, 余軍平 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所