一種抗cuzd1抗體層析試紙條及其用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抗CUZD1抗體層析試紙條、制備方法及應(yīng)用。該試紙條包括樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、分析膜(3)、吸水墊(6)、底板(7)、檢測(cè)帶T線(xiàn)(4)和質(zhì)控帶C線(xiàn)(5)，所述底板(7)的上部貼合有分析膜(3)，所述分析膜(3)上部的兩端分別貼合有結(jié)合墊(2)和吸水墊(6)，結(jié)合墊(2)上部的一端貼合有樣品墊(1)，檢測(cè)帶T線(xiàn)(4)和質(zhì)控帶C線(xiàn)(5)設(shè)置在分析膜(3)上。本發(fā)明采用間接免疫檢測(cè)法，用CUZD1抗原蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中抗CUZD1抗體的高靈敏度、高特異性快速檢測(cè)，為臨床炎癥性腸病等自體免疫性疾病的輔助診斷提供依據(jù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種抗CUZD1抗體層析試紙條及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫分析檢測(cè)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)人胰腺腺泡CUZDl的自身抗體的免疫層析檢測(cè)試紙。

【背景技術(shù)】
[0002]炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種病因尚不十分清楚的慢性非特異性腸道炎性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn' s disease, CD)?？肆_恩病于 1932 年由 Crohn、Ginzterg 和 Oppenheime 最早描述，故得此名。1973年，世界衛(wèi)生組織醫(yī)學(xué)科學(xué)國(guó)際組織委員會(huì)將本病定名為Crohn病。其特點(diǎn)為病因未明，多見(jiàn)于青年人，表現(xiàn)為肉芽腫性炎癥病變，合并纖維化與潰瘍?？汕旨叭改c道的任何部位，包括口腔、肛門(mén)，病變呈節(jié)段性或跳躍性分布，并可侵及腸道以外，特別是皮膚。臨床表現(xiàn)因病變部位、范圍及程度不同而多樣化，病程緩慢，易復(fù)發(fā)。
[0003]IBD是北美和歐洲的常見(jiàn)病，近30年來(lái)日本IBD發(fā)病率亦呈逐步增高趨勢(shì)，我國(guó)雖尚無(wú)普通人群的流行病學(xué)資料，但近10多年來(lái)本病就診人數(shù)呈逐步增加趨勢(shì)則非常明顯。IBD的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，不僅有消化道癥狀，還可有腸外表現(xiàn)。由于癥狀為腹痛、腹瀉、便血等非特異性腸炎表現(xiàn)，CD與UC、以及IBD與結(jié)核性腸炎等其他腸道慢性疾病很難鑒別診斷，特別在缺乏組織學(xué)證據(jù)時(shí)，需有更多相對(duì)特異性的標(biāo)志物為診斷提供幫助。研究發(fā)現(xiàn)，多種非侵入性的生物活性標(biāo)志物對(duì)IBD的診斷及炎癥活動(dòng)性的評(píng)價(jià)具有重要意義。
[0004]CUB 帶狀瘡疫透明區(qū)樣域蛋白 I (The CUB, and zona pellucida-likedomains-containing protein 1,CUZD1)是近期發(fā)現(xiàn)的存在于胰腺中的一種自身免疫性抗原，它的自體免疫性抗體以網(wǎng)狀顆粒形式存在于IBD，尤其是CD患者體內(nèi)。據(jù)臨床研究分析，高于30%的CD患者體內(nèi)能夠用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)出CUZDl抗體的存在。大量研究反映出CUZDl自體免疫抗體與IBD尤其是CD具有高度的相關(guān)性。
[0005]目前CUZDl抗體的檢測(cè)方法多為酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbentassay, ELISA)及間接免疫突光(Indirect immunofluorescence assay, IFA)檢測(cè)技術(shù)。ELISA法檢測(cè)可用于高通量標(biāo)本測(cè)定，靈敏度也比較高，目前也被廣泛認(rèn)可，但其操作比較繁瑣，需要多次加樣洗滌及孵育步驟，完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要3小時(shí)左右，需要酶標(biāo)儀，對(duì)于實(shí)驗(yàn)人員專(zhuān)業(yè)技術(shù)要求比較高，同時(shí)受到各種環(huán)境條件的影響，對(duì)實(shí)驗(yàn)帶來(lái)諸多不便。
[0006]間接免疫熒光檢測(cè)技術(shù)是把抗原細(xì)胞固定在載玻片上，熒光染色用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，該技術(shù)具有高特異性，但由于顯微鏡觀察需要主觀判斷，對(duì)檢驗(yàn)人員的要求高，并且依賴(lài)于熒光顯微鏡，使用不便。
[0007]免疫層析法(Immunochromatography)是近幾年來(lái)興起的一種快速診斷技術(shù),其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的纖維素一端浸入樣品(尿液或血清)后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成肉眼可見(jiàn)的檢測(cè)帶?，F(xiàn)有的免疫層析試紙條產(chǎn)品常用的示蹤標(biāo)記粒子有納米金、納米硒、彩色膠乳等等，其中以納米金應(yīng)用最為廣泛，納米金也稱(chēng)為膠體金。
[0008]以膠體金作為失蹤標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)特稱(chēng)為免疫膠體金技術(shù)(Immunecolloidal gold technique,GICT)。膠體金是由氯金酸(HAuC14)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)而得名。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。
[0009]表面帶活性基團(tuán)的彩色膠乳微球也可以作為免疫層析的示蹤劑，與膠體金技術(shù)一樣，彩色膠乳標(biāo)記免疫層析技術(shù)也具有操作簡(jiǎn)便、試劑穩(wěn)定、快速出結(jié)果、可室溫保存等優(yōu)點(diǎn)。彩色膠乳標(biāo)記是將不同直徑范圍0.1 μ M?I μ M彩色膠乳微球與含有羧基、氨基、羥基等酯類(lèi)或其他大分子物質(zhì)共價(jià)結(jié)合，使這些大分子標(biāo)記上顏色，當(dāng)在檢測(cè)線(xiàn)或質(zhì)控線(xiàn)上富集停留后形成肉眼可見(jiàn)的彩色條帶。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)ELISA和IFA相比，免疫層析法檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)主要包括:(1)使用方便快速，便于基層使用和現(xiàn)場(chǎng)使用，所有反應(yīng)能在20分鐘內(nèi)完成；(2)成本低，不需要特殊的儀器設(shè)備；(3)應(yīng)用范圍廣，可適應(yīng)多種檢測(cè)條件；(4)可以進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)，若陽(yáng)性樣本比較難獲得，多項(xiàng)檢測(cè)可以節(jié)省樣品，降低成本；(5)標(biāo)記物穩(wěn)定，標(biāo)記樣品在4°C貯存兩年年以上，無(wú)信號(hào)衰減現(xiàn)象；(6)膠體金本身為紅色，不需要加入發(fā)色試劑，省卻了酶標(biāo)的致癌性底物及終止液的步驟，對(duì)人體無(wú)毒害。
[0011]在自體免疫性疾病診斷方面，已出現(xiàn)較多的免疫層析試紙，但基于抗CUZDl抗體檢測(cè)的免疫層析試紙?jiān)趪?guó)內(nèi)外市場(chǎng)上仍沒(méi)有問(wèn)世。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了克服現(xiàn)有方法的不足，將免疫層析法應(yīng)用到抗CUZDl抗體的檢測(cè)中，采用間接免疫法來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中的抗CUZDl抗體進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)把CUZDl抗原蛋白包被在結(jié)合墊或分析膜的檢測(cè)帶上，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中抗CUZDl抗體的高特異、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的檢測(cè)，快速篩查抗CUZDl抗體陽(yáng)性標(biāo)本，為臨床炎癥性腸病等自體免疫性疾病提供快速的輔助診斷。
[0013]本發(fā)明的目的之一在于提供一種快速、準(zhǔn)確的抗⑶ZDl抗體的免疫層析檢測(cè)試紙條及制備方法，目的之二是提供一種基于免疫層析技術(shù)的抗CUZDl抗體檢測(cè)方法。
[0014]作為本發(fā)明第一個(gè)方面的一種抗CUZDl抗體的免疫層析檢測(cè)試紙條，包括樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水墊和底板，分析膜上設(shè)置檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，所述底板的上部貼合有分析膜，分析膜上部的兩端分別貼合有結(jié)合墊和吸水墊，結(jié)合墊上部的一端貼合有樣品墊。
[0015]所述的結(jié)合墊(2)包被膠體金標(biāo)記物或彩色膠乳標(biāo)記物。
[0016]所述的結(jié)合墊為I層(圖1)或2層(圖2)，其中2層時(shí)錯(cuò)落與分析膜搭接。
[0017]所述抗⑶ZDl抗體的免疫層析檢測(cè)試紙條的制備方法，包括以下步驟:
[0018]步驟1.⑶ZDl抗原蛋白的制備
[0019]步驟2.結(jié)合墊⑵制備
[0020](I)納米金標(biāo)記物的制備:用20?40nm粒徑的納米金溶液標(biāo)記⑶ZDI抗原蛋白、抗人IgG抗體、葡萄球菌A蛋白(SPA)、鏈球菌G蛋白(Protein G)，以及其他與質(zhì)控帶C線(xiàn)能形成免疫復(fù)合物的蛋白。
[0021](2)彩色膠乳標(biāo)記物的制備:用帶活性氨基或羧基基團(tuán)的彩色膠乳標(biāo)記CUZDl抗原蛋白、抗人IgG抗體、葡萄球菌A蛋白(SPA)、鏈球菌G蛋白(Protein G)，以及其他與質(zhì)控帶C線(xiàn)能形成免疫復(fù)合物的蛋白。
[0022](3)結(jié)合墊(2)制備:玻璃纖維膜或聚脂膜作為結(jié)合墊，先用含BSA和糖的緩沖液預(yù)處理并烘干，將步驟(I)制備的納米金標(biāo)記物或膠乳標(biāo)記物，用噴涂?jī)x噴涂在預(yù)處理的玻璃纖維膜或聚脂膜上，干燥備用。
[0023]步驟3.分析膜(3)制備
[0024](I)檢測(cè)帶T線(xiàn)(4)制備:根據(jù)結(jié)合墊標(biāo)記蛋白類(lèi)型選擇檢測(cè)帶T線(xiàn)包被蛋白，如結(jié)合墊上的結(jié)合蛋白含CUZD1，檢測(cè)帶T線(xiàn)的包被蛋白是抗人IgG。如果結(jié)合墊上含有抗人IgG，檢測(cè)帶T線(xiàn)包被蛋白為⑶ZDI。
[0025](2)質(zhì)控帶C線(xiàn)(5)制備:根據(jù)結(jié)合墊的標(biāo)記蛋白類(lèi)型選擇質(zhì)控帶的包被蛋白，如結(jié)合墊標(biāo)記蛋白是單一的⑶ZD1，質(zhì)控帶C線(xiàn)的包被蛋白為抗⑶ZDl的抗體；如果結(jié)合墊標(biāo)記蛋白是單一的抗人IgG抗體，質(zhì)控帶C線(xiàn)的標(biāo)記蛋白為對(duì)應(yīng)的抗人IgG抗體的抗體；或者其他結(jié)合墊標(biāo)記蛋白形成免疫復(fù)合物的蛋白。
[0026]步驟4.樣品墊制備
[0027]將玻璃纖維膜或聚酯膜經(jīng)緩沖液浸潰烘干備用，或者直接使用。
[0028]步驟5.試紙條組裝
[0029]把步驟I?4所制作完成的材料，按圖1或圖2搭接，根據(jù)底板的規(guī)格切割成一定的長(zhǎng)度和寬度，安裝在底板和卡殼里。優(yōu)選地，試紙條長(zhǎng)度為6.5cm,寬度為3_或4_。
[0030]所述的⑶ZDl抗原蛋白是把全長(zhǎng)⑶ZDl基因或者含有重要抗原表位的基因序列，克隆到原核或真核表達(dá)載體里，表達(dá)純化獲得。
[0031]所述的⑶ZDI抗原蛋白是用多肽合成儀合成含有⑶ZDI重要抗原表位的⑶ZDI多肽，并偶聯(lián)到載體蛋白上而獲得。
[0032]所述的抗人IgG抗體為鼠源、兔源、羊源、馬源、駱駝源或豚鼠源中的一種或多種單克隆抗體或多克隆抗體。
[0033]所述的抗CUZDl的抗體是以CUZDl為免疫源，鼠源、兔源、羊源、馬源、駱駝源或豚鼠源中的一種或多種單克隆抗體或多克隆抗體。
[0034]所述的抗人IgG抗體的抗體是指能與該抗體形成免疫復(fù)合物的抗體，比如該抗人IgG抗體是鼠抗人IgG，它的抗體是羊抗鼠IgG的抗體或其他非鼠源的鼠IgG抗體。
[0035]在本發(fā)明的另一方面，提供一種抗CUZDl抗體檢測(cè)方法，用本發(fā)明第一方面方法及步驟所制備的抗CUZDl抗體免疫層析試紙條，對(duì)待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟:
[0036](I)樣本處理:取血清、血漿或全血樣本，用加樣緩沖液稀釋O?100倍；
[0037](2)把上述處理過(guò)的樣品滴加到試紙條的樣品墊上，靜置5?20分鐘，觀察T線(xiàn)和C線(xiàn)；
[0038](3)結(jié)果判讀:T線(xiàn)和C線(xiàn)均顯現(xiàn)，結(jié)果為陽(yáng)性；Τ線(xiàn)不顯現(xiàn)，C線(xiàn)顯現(xiàn)，結(jié)果為陰性；T線(xiàn)和C線(xiàn)均不顯現(xiàn)，提示試紙失效。
[0039]本發(fā)明的檢測(cè)原理:
[0040]選用金標(biāo)/膠乳等標(biāo)記CUZDl抗原蛋白或其他能與待檢樣品中目的物結(jié)合的蛋白，噴涂在結(jié)合墊上，制成結(jié)合墊；在檢測(cè)帶上包被能與標(biāo)記蛋白-目的物蛋白復(fù)合物發(fā)生免疫反應(yīng)的蛋白，當(dāng)把待檢樣本加樣到樣品墊上后，樣本中的CUZDl抗體與結(jié)合墊上的標(biāo)記蛋白形成免疫復(fù)合物，由于毛細(xì)管效應(yīng)，該復(fù)合物向吸水墊方向泳動(dòng)，此復(fù)合物與包被于檢測(cè)帶T線(xiàn)上的抗原蛋白發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，形成金標(biāo)/膠乳蛋白-抗CUZDl抗體-CUZDl抗原蛋白三聯(lián)體復(fù)合物而被截留在檢測(cè)線(xiàn)上，逐漸富集形成較深的紫紅色條帶或膠乳顏色；由于毛細(xì)效應(yīng)繼續(xù)泳動(dòng)向前，金標(biāo)/膠乳兔IgG與包被在質(zhì)控線(xiàn)上的羊抗兔IgG發(fā)生特異的免疫反應(yīng)被截留，逐漸富集在質(zhì)控線(xiàn)上形成較深的紫紅色條帶或膠乳顏色，多余的未結(jié)合的物質(zhì)繼續(xù)層析到吸水墊上，因此在檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)都出現(xiàn)條帶的判為陽(yáng)性結(jié)果；若血清樣品中不含有抗⑶ZDl抗體，標(biāo)記蛋白到達(dá)檢測(cè)線(xiàn)時(shí)，不與包被在檢測(cè)線(xiàn)上的相應(yīng)蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，因此在檢測(cè)線(xiàn)處沒(méi)有出現(xiàn)顯色帶，而金標(biāo)/膠乳兔IgG繼續(xù)泳動(dòng)向前與包被于質(zhì)控線(xiàn)處的相應(yīng)包被蛋白發(fā)生特異的免疫反應(yīng)而被截留，逐漸富集在質(zhì)控線(xiàn)上形成紫紅色條帶或膠乳顏色，因此僅在質(zhì)控上出現(xiàn)條帶判為陰性結(jié)果。
[0041]本發(fā)明首次將免疫層析技術(shù)應(yīng)用于抗CUZDl抗體檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了高特異性、高靈敏度的檢測(cè)性能。與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的ELISA和化學(xué)發(fā)光試劑盒相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要包括:檢測(cè)時(shí)間短(5?20min);不需要任何特殊儀器，可實(shí)現(xiàn)床邊檢測(cè)和門(mén)診即時(shí)檢測(cè)；操作簡(jiǎn)便，只需一步反應(yīng)，操作人員無(wú)需培訓(xùn)，檢測(cè)成本低；對(duì)溫度無(wú)特殊要求，無(wú)需冷凍，儲(chǔ)存運(yùn)輸方便，室溫可保存24個(gè)月。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1本發(fā)明的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖1。
[0043]圖2本發(fā)明的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖2。
[0044]圖3本發(fā)明檢測(cè)帶為I條時(shí)陽(yáng)性和陰性結(jié)果示意圖3。
[0045]其中3a是條市不思圖；3b為陽(yáng)性結(jié)果；3c為陰性結(jié)果；3d和3e表不試紙條失效。

【具體實(shí)施方式】
[0046]本發(fā)明所述的⑶ZDl抗體檢測(cè)免疫層析試紙，如圖1所示，該試紙是在底板(7)上由一側(cè)向另一側(cè)順次相互搭接地粘貼分析膜(3)、結(jié)合墊(2)、樣品墊(I)、吸水墊(6)。
[0047]結(jié)合墊(2)上噴涂有金標(biāo)/膠乳標(biāo)記蛋白，分析膜(3)上設(shè)置檢測(cè)帶(4)和質(zhì)控帶(5)，根據(jù)結(jié)合墊上標(biāo)記蛋白的不同，選用相應(yīng)的檢測(cè)帶包被蛋白和質(zhì)控帶包被蛋白。優(yōu)選地，在結(jié)合墊上噴涂的標(biāo)記蛋白為CUZDl抗原蛋白和鼠IgG，則檢測(cè)帶上的包被蛋白為抗人IgG抗體，質(zhì)控帶上的包被蛋白為抗鼠IgG。另一優(yōu)選，在結(jié)合墊上噴涂的標(biāo)記蛋白為抗人IgG抗體，則檢測(cè)帶上的包被蛋白為⑶ZDl抗原蛋白。
[0048]下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0049]實(shí)施例1.⑶ZDI抗原蛋白制備
[0050]I)試劑
[0051]大腸桿菌宿主菌DH5 a、BL21 (DE3)，克隆載體pCR2.lT-vector，表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)，DNA聚合酶rTaq，T4 DNA連接酶，DNA聚合酶rTaq、LA Taq以及限制性?xún)?nèi)切酶BamH I,Hind III 和 EcoR I,BamH I，DL2000 DNA Marker,T4 DNA 連接酶，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，DNA膠回收試劑盒，IPTG等
[0052]2)儀器
[0053]普通搖床SCS-24 ;隔水式恒溫電熱培養(yǎng)箱；B1photometer分光光度計(jì)、臺(tái)式冷凍離心機(jī)Centrifuge 5810R、臺(tái)式離心機(jī)MiniSpin ;高速冷凍離心機(jī)；蛋白質(zhì)電泳儀以及凝膠成像系統(tǒng)；PCR儀；超聲裂解儀；恒溫金屬??；HIS蛋白純化柱等。
[0054]3)實(shí)驗(yàn)方法
[0055]a.載體構(gòu)建:
[0056]設(shè)計(jì)引物CGC CAT ATG ATG GAG CTT GTA AGA AGG CTC 和 CGC GGA TCC TTA ATAGTT CTG CAG CTT CTGG從模板DNA中PCR擴(kuò)增出⑶ZDl片段，膠回收試劑盒回收片段后連接到pCR2.1克隆載體進(jìn)行測(cè)序鑒定。將鑒定正確的序列克隆至表達(dá)載體pET28a(+)中，酶切位點(diǎn)為EcoR 1、BamH I，同時(shí)載體上有6XHIS標(biāo)簽，便于后續(xù)的蛋白純化。
[0057]b.表達(dá)
[0058]將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，通過(guò)抗性篩選陽(yáng)性表達(dá)菌株。將篩選出來(lái)的陽(yáng)性菌液按1: 1000的比例接種加有Kan抗性的LB培養(yǎng)基中，每個(gè)菌接種兩管，一管用于誘導(dǎo)，另一管用于非誘導(dǎo)對(duì)照，同時(shí)要接種一管空質(zhì)粒菌作對(duì)照。37°C過(guò)夜培養(yǎng)至0D600值約為0.4-0.6時(shí)，誘導(dǎo)管和空質(zhì)粒對(duì)照管加入IPTG至終濃度為lmmol/L，非誘導(dǎo)對(duì)照不加，最終選擇表達(dá)能力高的兩個(gè)菌，用于大量的蛋白的表達(dá)。并按照常規(guī)的SDS-PAGE方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。
[0059]c.純化
[0060]將表達(dá)的產(chǎn)物用HIS蛋白純化柱純化蛋白，并透析脫鹽，經(jīng)測(cè)定純化后的蛋白濃度為 509mg/L。
[0061]⑶ZDl抗原蛋白制備方法2:篩選⑶ZDl重要抗原表位多肽2_5個(gè)，用多肽合成儀進(jìn)行從從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成，然后與載體蛋白偶聯(lián)，使分子量增大，便于結(jié)合在結(jié)合墊和分析膜上。常用的載體蛋白包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚賴(lài)氨酸(PLL)等。
[0062]實(shí)施例2抗體制備
[0063]結(jié)合墊及檢測(cè)帶包被抗體抗人IgG單克隆抗體和多克隆抗體，以及用于質(zhì)控帶和結(jié)合墊其他動(dòng)物來(lái)源的單克隆抗體和多克隆抗體，可通過(guò)免疫動(dòng)物獲得。
[0064]1、單克隆抗體制備的具體操作方法為:
[0065]I)通過(guò)將0.05mg?Img免疫制劑(分別針對(duì)山羊或小鼠或兔子)與I倍體積的弗氏完全佐劑混合得到注射溶液，將該注射溶液在動(dòng)物皮內(nèi)多部位注射；
[0066]2) 一個(gè)月后將動(dòng)物用的人IgG的弗氏完全佐劑混合液經(jīng)多部位動(dòng)物皮下注射而加強(qiáng)免疫。7?14天后將動(dòng)物放血，測(cè)定抗血清滴度。
[0067]3)對(duì)動(dòng)物加強(qiáng)免疫直至滴度達(dá)到平臺(tái)期。通過(guò)從被免疫的動(dòng)物回收脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，篩選后即可得到能穩(wěn)定表達(dá)目的抗體的雜交瘤細(xì)胞。
[0068]4)體外培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞，接種小鼠或大鼠腹腔，取腹水純化獲得單克隆抗體；或者從培養(yǎng)上清液中純化獲得單克隆抗體。
[0069]2、多克隆抗體制備:
[0070]同單克隆抗體步驟I)和2)，在獲得抗血清后，純化抗血清獲得多克隆抗體。
[0071]3、葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白制備
[0072]根據(jù)葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白的基因序列，可通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)克隆化基因來(lái)制備，具體操作方法可參見(jiàn)(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)，或?qū)嵤├?CUZDl的步驟。
[0073]實(shí)施例3膠體金液制備
[0074]I)將0.01 % (w/v)的HAuCl4溶液加熱至沸騰，迅速加入每10mL HAuCl4溶液加入適量的還原劑溶液，顏色從藍(lán)色，然后淺藍(lán)、藍(lán)色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸7?1min出現(xiàn)透明的橙紅色。再用超濾或微孔濾膜(0.45μΜ)過(guò)濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無(wú)沉淀和漂浮物，液面出現(xiàn)油狀物和大量黑色顆粒狀沉淀物雜質(zhì)時(shí)棄用。
[0075]2)其中所使用的還原劑可以為朽1檬酸三鈉、鞋酸-朽1檬酸三鈉、白磷,優(yōu)選使用朽1檬酸三鈉，更優(yōu)選地使用1% (w/v)檸檬酸三鈉。
[0076]3)其中所用玻璃容器應(yīng)絕對(duì)清潔，用前需經(jīng)酸洗。其水應(yīng)為去離子超純水，電阻率達(dá) 18.2ΜΩ。
[0077]4)膠體金溶液制備過(guò)程中，各溶液的配制方法如下=HAuCl4的配制:用超純水溶解氯金酸，配成I %溶液，置4°C備用，有效期三個(gè)月；100mLl % HAuCl4溶液配方:10gHAuCl4、超純水定容至100mL ;I %檸檬酸三鈉(Sodium Citrate)的配制:用超純水溶解Sodium Citrate,配成1%溶液,0.22 μ M膜濾過(guò),現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0078]實(shí)施例4金標(biāo)蛋白制備
[0079]1、金標(biāo)鼠或兔抗人IgG制備:用0.1M碳酸鈉調(diào)節(jié)膠體金pH 7.3?7.5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入5?25 μ G鼠/兔抗人IgG，混勻，靜置lOmin，然后加入BSA至終濃度1%，混勻，靜置5min, 3000rpm離心5min,去沉淀,將上層溶液轉(zhuǎn)至新管,9000rpm離心30min,去上清,加入重懸液至原量，將溶液移至新管，9000rpm再次離心30min,加入用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。
[0080]2、金標(biāo)羊/兔IgA及IgM制備:用0.1M碳酸鈉調(diào)節(jié)膠體金pH 7.5?8.0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8?25 μ G羊/兔IgA或IgM，混勻，靜置lOmin，然后加入BSA至終濃度1%，混勻，靜置5min, 3000rpm離心5min,去沉淀,將上層溶液轉(zhuǎn)至新管,9000rpm離心30min,去上清,加入重懸液至原量，將溶液移至新管，9000rpm再次離心30min,加入用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。
[0081]3、金標(biāo)⑶ZDl抗原蛋白制備:用0.1M碳酸鉀調(diào)節(jié)制備的膠體金pH 7.5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入?ο μ G⑶ZDl抗原蛋白，攪拌20min，然后加入BSA至終濃度I %，攪拌20min,離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。
[0082]4、金標(biāo)SPA和Protein G制備:用0.1M碳酸鉀調(diào)節(jié)制備的膠體金pH 8.0?9.0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入5?20 μ G SPA或Protein G,攪拌10?30min,然后加入BSA至終濃度0.5?I %，攪拌10?30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。
[0083]實(shí)施例5膠體金標(biāo)記抗⑶ZDl抗體檢測(cè)試紙I制備
[0084]試紙條I的結(jié)合墊結(jié)合蛋白為金標(biāo)鼠抗人IgG，檢測(cè)帶包被⑶ZDl抗原蛋白，質(zhì)控帶包被羊抗鼠IgG,試紙條長(zhǎng)度約6.5cm,寬4_。結(jié)合墊材質(zhì)為玻璃纖維膜,分析膜材質(zhì)為硝酸纖維素膜(NC)。制備步驟如下:
[0085]I)分析膜制備:
[0086]用包被緩沖液稀釋⑶ZDl抗原蛋白至濃度為0.8mG/mL，用劃膜噴金儀HM3035，距離結(jié)合墊Icm處，以lyL/cm噴涂于NC上，構(gòu)成檢測(cè)帶(4)。用包被緩沖液將羊抗鼠IgG稀釋到0.5mG/mL，距離檢測(cè)帶約5mm處，以I μ L/cm用劃膜噴金儀儀器噴涂于同一張NC膜上，構(gòu)成質(zhì)控帶，質(zhì)控帶同時(shí)距離吸水墊約1cm。分析膜37°C烘干,封裝備用。
[0087]所使用的包被緩沖液可以是硼酸鹽、碳酸鹽、磷酸鹽、Tris-HCl或Tris-磷酸鹽等，緩沖液的作用是提供一定PH和離子強(qiáng)度使蛋白牢固包被于NC膜，緩沖液pH值一般約為6?9.5范圍內(nèi)，優(yōu)選為6.5?7.5的中性緩沖范圍內(nèi)，且最優(yōu)選緩沖液的pH值為7.0?
7.4范圍內(nèi)。
[0088]本實(shí)施例所用緩沖液pH值7.2的0.0lM磷酸鹽緩沖液。
[0089]分析膜的材質(zhì)可選硝酸纖維素膜(NC)或者醋酸纖維素膜，商品化的硝酸纖維素膜包括 S&SAE99、whatman 8 μ m> millipore M135、sartorius CN140 等。使用哪種規(guī)格的具體NC膜或醋酸纖維素膜不是本發(fā)明的關(guān)鍵，但是在每次測(cè)定中，上述幾種NC膜可以作為優(yōu)選。不同廠家使用的含不同表面活性劑的不同緩沖液處理的膜，與所用檢測(cè)線(xiàn)抗體溶液親和力有不同程度的差距，也會(huì)很大程度造成線(xiàn)條不均勻，拖帶或是彌散的現(xiàn)象，因此運(yùn)用組裝試紙來(lái)選擇優(yōu)選的NC膜或醋酸纖維素膜。
[0090]2)結(jié)合墊制備
[0091]用結(jié)合墊緩沖液浸泡玻璃纖維膜約30分鐘，37°C烘干，將實(shí)施例4中制備的鼠抗人IgG金標(biāo)抗體用劃膜噴金儀儀器，以3 μ L/cm的用量噴涂在預(yù)處理的玻璃纖維膜上，370C烘干即構(gòu)成結(jié)合墊，置2?8°C備用。
[0092]結(jié)合墊緩沖液配方:0.0lM PBU% BSA,0.05% NaN3、0.1% TritonX、10%蔗糖。
[0093]3)樣品墊制備
[0094]用樣品墊處理液浸泡樣品墊，然后在37°C下Ih烘干，備用。
[0095]樣品墊緩沖液的組成為:pH為7.2的0.0lM PB緩沖溶液，含1% BSA, 10%蔗糖，
0.1 % Tween-20。
[0096]4)試紙裁剪及裝配
[0097]用裁切機(jī)將上述步驟制備并干燥的樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水紙分別剪切
1.7cm、0.8cm、2.5cm和1.5cm寬的窄條，按圖1方式搭接成大板，用切條機(jī)將大板切成單人份，每人份寬度根據(jù)底板卡殼的不同而異，本實(shí)施例選用4_寬度。將單人份已切好的試紙組裝在備好的試紙卡里，使加樣窗對(duì)應(yīng)試紙的樣品墊，結(jié)果顯示窗對(duì)應(yīng)檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，組裝溫度應(yīng)控制在25?37°C，濕度20%?30%。
[0098]實(shí)施例6膠體金標(biāo)記抗⑶ZDl抗體檢測(cè)試紙2制備
[0099]試紙條2的結(jié)合墊結(jié)合蛋白為金標(biāo)羊抗人IgG多克隆抗體和兔IgM，檢測(cè)帶包被⑶ZDl抗原蛋白，質(zhì)控帶包被鼠抗兔IgM單克隆抗體,試紙條長(zhǎng)度約6.5cm,寬3mm。結(jié)合墊材質(zhì)為聚酯膜，分析膜材質(zhì)為硝酸纖維素。制備步驟如下:
[0100]I)分析膜的制備
[0101]檢測(cè)帶制備:同實(shí)施例4方法把CUZDl抗原蛋白包被在分析膜的檢測(cè)帶上。
[0102]質(zhì)控帶制備:用包被緩沖液將鼠抗兔IgM稀釋到0.5?1.0mG/mL,以I μ L/cm用劃膜噴金儀儀器噴涂于醋酸纖維素膜上，距吸水墊1cm，與檢測(cè)帶距離5mm。
[0103]分析膜37 °C烘干，封裝備用。
[0104]2)結(jié)合墊的制備
[0105]結(jié)合墊選用聚酯膜，先用結(jié)合墊緩沖液浸泡聚酯膜約30分鐘，然后37°C烘干。用劃膜噴金儀把實(shí)施例4制備的金標(biāo)羊抗人IgG多克隆抗體和兔IgA分別涂布2層聚酯膜上，涂布量為4mm/cm。
[0106]結(jié)合墊緩沖液配方:Ph值7.5磷酸鹽緩沖液，含1% BSA、0.05% NaN3、0.1%Tween-20 和 15%鹿糖。
[0107]3)試紙裁剪及裝配
[0108]用裁切機(jī)將上述步驟制備并干燥的樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水紙分別剪切
1.7cm、0.8cm、2.5cm和1.5em寬的窄條，按圖2方式搭接成大板，用切條機(jī)將大板切成單人份，每人份寬度根據(jù)底板卡殼的不同而異，本實(shí)施例選用3_寬度。將單人份已切好的試紙組裝在備好的試紙卡里，使加樣窗對(duì)應(yīng)試紙的樣品墊，結(jié)果顯示窗對(duì)應(yīng)檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，組裝溫度應(yīng)控制在25?37°C，濕度20%?30%。
[0109]實(shí)施例7.膠體金標(biāo)記抗⑶ZDl抗體檢測(cè)試紙3制備
[0110]試紙條3的結(jié)合墊結(jié)合蛋白為金標(biāo)CUZDl抗原蛋白和兔IgG，檢測(cè)帶包被兔抗人IgG多克隆抗體，質(zhì)控帶包被羊抗兔IgG單克隆抗體,試紙條長(zhǎng)度約6.5cm,寬3mm。結(jié)合墊材質(zhì)為玻璃纖維膜，分析膜材質(zhì)為醋酸纖維素膜。制備步驟如下:
[0111]I)分析膜的制備
[0112]檢測(cè)帶制備:用包被緩沖液將鼠抗人IgG稀釋到1.0mG/mL,以I μ L/cm用劃膜噴金儀噴涂于醋酸纖維素膜上，距結(jié)合墊1cm。
[0113]質(zhì)控帶制備:用包被緩沖液將羊抗兔IgG稀釋到0.8mG/mL,以I μ L/cm用劃膜噴金儀噴涂于醋酸纖維素膜上，距吸水墊1cm，與檢測(cè)帶距離5mm。
[0114]分析膜37 °C烘干，封裝備用。
[0115]2)結(jié)合墊的制備
[0116]結(jié)合墊選用玻璃纖維膜，先用結(jié)合墊緩沖液浸泡約30分鐘，然后37°C烘干。用劃膜噴金儀，把實(shí)施例4制備的金標(biāo)CUZDl抗原蛋白和兔IgG分別涂布2層玻璃纖維膜上，涂布量為3.5 μ L/cm。
[0117]3)試紙裁剪及裝配
[0118]同實(shí)施例6。
[0119]實(shí)施例8.膠體金標(biāo)記抗⑶ZDl抗體檢測(cè)試紙4制備
[0120]試紙條4的結(jié)合墊結(jié)合蛋白為金標(biāo)⑶ZDl抗原蛋白，檢測(cè)帶包被豚鼠抗人IgG多克隆抗體，質(zhì)控帶包被鼠抗⑶ZDl單克隆抗體IgM,試紙條長(zhǎng)度約6.5cm,寬4mm。結(jié)合墊材質(zhì)為玻璃纖維膜，分析膜材質(zhì)為硝酸纖維素膜(NC)。制備步驟如下:
[0121]2)分析膜制備:
[0122]檢測(cè)帶制備:用包被緩沖液稀釋豚鼠抗人IgG單克隆抗體至濃度約為1.2mG/mL,用劃膜噴金儀HM3035，距離結(jié)合墊Icm處，以0.8 μ L/cm噴涂于NC上，構(gòu)成檢測(cè)帶(4)。
[0123]質(zhì)控帶制備:用包被緩沖液將鼠抗⑶ZDl單克隆抗體IgM稀釋至約0.8mG/mL,距離檢測(cè)帶約5mm處，以0.8 μ L/cm用劃膜噴金儀噴涂于同一張NC膜上,構(gòu)成質(zhì)控帶,質(zhì)控帶同時(shí)距離吸水墊約1cm。
[0124]分析膜37 °C烘干，封裝備用。
[0125]2)結(jié)合墊制備
[0126]用結(jié)合墊緩沖液浸泡玻璃纖維膜約30分鐘，37°C烘干，將實(shí)施例4中制備的金標(biāo)⑶ZDl抗原蛋白用劃膜噴金儀，以5μ L/cm的用量噴涂在預(yù)處理的玻璃纖維膜上，37°C烘干即構(gòu)成結(jié)合墊，置2?8°C備用。
[0127]3)樣品墊制備
[0128]用樣品墊處理液浸泡樣品墊，然后在37°C下Ih烘干，備用。樣品墊緩沖液的組成為:pH 為 7.2 的 1mM PB 緩沖溶液，含 1% BSA，10%蔗糖，0.1% Tween-20。
[0129]4)試紙裁剪及裝配
[0130]同實(shí)施例5。
[0131]實(shí)施例9.彩色膠乳標(biāo)記蛋白制備
[0132]I)彩色膠乳標(biāo)記液的制備
[0133]膠乳的共價(jià)活化:超聲波處理膠乳微球體30秒，調(diào)節(jié)膠乳微球體濃度為L(zhǎng)OXlO1VmL, 15000rpm離心10分鐘，離心后收集沉淀物用蒸餾水溶解，并用200W超聲波分散30秒；先加入50 μ L的50mg/mL EDC,振蕩混勻，再加入50 μ L的50mg/mL N-羥基硫代琥珀酰亞胺，振蕩混勻，室溫下平衡30分鐘后在15000rpm離心10分鐘，沉淀用50mM檸檬酸緩沖液溶解，靜置于4°C冰箱。
[0134]2)彩色膠乳標(biāo)記蛋白的制備
[0135]將活化后的膠乳于200W超聲波處理30秒，按照120 μ G蛋白/100 μ L彩色膠乳的比例加入待標(biāo)記的抗體或者蛋白，混勻室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí),離心洗漆,每次15000rpm下離心10分鐘，共洗滌3次，沉淀用PBS-TBN溶解并100W超聲波處理30秒，然后用PBS-TBN稀釋至離心前體積，4 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0136]實(shí)施例10.彩色膠乳標(biāo)記抗⑶ZDl抗體檢測(cè)試紙5制備
[0137]試紙條5的結(jié)合墊結(jié)合蛋白為紅色膠乳標(biāo)記的鼠抗人IgG，檢測(cè)帶包被⑶ZDl抗原蛋白，質(zhì)控帶包被羊抗鼠IgG的IgA單克隆抗體和SPA。試紙條長(zhǎng)度約6.5cm,寬4mm。結(jié)合墊材質(zhì)為聚酯膜，分析膜材質(zhì)為硝酸纖維素膜(NC)。制備步驟如下:
[0138]I)分析膜的制備
[0139]檢測(cè)帶制備:同實(shí)施例5。
[0140]質(zhì)控帶制備:用包被緩沖液將SPA和羊抗鼠IgA分別稀釋至到0.8mg/mL, 1:1混勻，以I μ L/cm用劃膜噴金儀噴涂于NC上靠近吸水墊(6)的質(zhì)控線(xiàn)(5)處,距吸水墊(6)約lcm，距離檢測(cè)線(xiàn)(4) 5mm，噴線(xiàn)應(yīng)粗細(xì)均勻。
[0141]分析膜37 °C烘干，封裝備用。
[0142]2)結(jié)合墊的制備
[0143]用結(jié)合墊緩沖液將聚脂膜浸泡30分鐘，37°C烘干，把實(shí)施例9中紅色膠乳標(biāo)記的⑶ZDl抗原蛋白用劃膜噴金儀，以3μ L/cm的用量噴涂在預(yù)處理的聚脂膜上，37°C干燥，置2?8°C備用。
[0144]3)樣品墊制備
[0145]用樣品墊處理液浸泡樣品墊，然后在37°C下Ih烘干，備用。
[0146]4)試紙裁剪及裝配
[0147]同實(shí)施例5。
[0148]實(shí)施例11彩色膠乳標(biāo)記抗⑶ZDI抗體檢測(cè)試紙6制備
[0149]試紙條6的結(jié)合墊結(jié)合蛋白為紫色膠乳標(biāo)記的CUZDl抗原蛋白和蘭色膠乳標(biāo)記的兔IgM,檢測(cè)帶包被兔抗人IgG單克隆抗體,質(zhì)控帶包被鼠抗兔IgM和Protein G,試紙條長(zhǎng)度約6.5cm,寬4mm。結(jié)合墊材質(zhì)為玻璃纖維膜,分析膜材質(zhì)為硝酸纖維素膜。制備步驟如下:
[0150]3)分析膜制備:
[0151]檢測(cè)帶制備:用包被緩沖液分別稀釋兔抗人IgG單克隆抗體至濃度約為1.0mG/mL,用劃膜噴金儀HM3035,距離結(jié)合墊Iem處，以I μ L/em噴涂于NC上,構(gòu)成檢測(cè)帶(4)。
[0152]質(zhì)控帶制備:用包被緩沖液分別將鼠抗兔IgA和Protein G稀釋至約2.0mG/mL,
I: I混合，把混合液距離檢測(cè)帶約5mm處，以I μ L/em用劃膜噴金儀噴涂于同一張NC膜上，構(gòu)成質(zhì)控帶(5),質(zhì)控帶同時(shí)距離吸水墊(6)約lcm。
[0153]分析膜37 °C烘干，封裝備用。
[0154]2)結(jié)合墊制備
[0155]用結(jié)合墊緩沖液浸泡玻璃纖維膜約30分鐘，37°C烘干，將實(shí)施例9中制備的紫色膠乳標(biāo)記的⑶ZDl抗原蛋白和藍(lán)色膠乳標(biāo)記的兔IgM分別用劃膜噴金儀，以3.5 μ L/em和3.0 μ L/em的用量噴涂在預(yù)處理的玻璃纖維膜上，37°C烘干即構(gòu)成結(jié)合墊，置2?8°C備用。
[0156]3)樣品墊制備
[0157]用樣品墊處理液浸泡樣品墊，在37°C下烘干I?2h，備用。
[0158]4)試紙裁剪及裝配
[0159]同實(shí)施例6。
[0160]實(shí)施例12彩色膠乳標(biāo)記抗⑶ZDI抗體檢測(cè)試紙6制備
[0161]試紙條7的結(jié)合墊結(jié)合蛋白為紫色膠乳標(biāo)記的CUZDl抗原蛋白和蘭色膠乳標(biāo)記的羊抗鼠IgG,檢測(cè)帶包被駱騎抗人IgG單克隆抗體,質(zhì)控帶包被SPA,試紙條長(zhǎng)度約6.5cm,寬4mm。結(jié)合墊材質(zhì)為聚酯膜，分析膜材質(zhì)為醋硝酸纖維素膜。制備步驟如下:
[0162]4)分析膜制備:
[0163]檢測(cè)帶制備:同實(shí)施例11。
[0164]質(zhì)控帶制備:用包被緩沖液分別將SPA稀釋至約1.5mG/mL，距離檢測(cè)帶約5mm處，以1μ L/cm用劃膜噴金儀噴涂于同一張NC膜上，構(gòu)成質(zhì)控帶(5)，質(zhì)控帶同時(shí)距離吸水墊
(6)約 lcm。
[0165]分析膜37 °C烘干，封裝備用。
[0166]2)結(jié)合墊制備
[0167]用結(jié)合墊緩沖液浸泡聚酯膜約30分鐘，37°C烘干，將實(shí)施例9中制備的紫色膠乳標(biāo)記的⑶ZDl抗原蛋白和藍(lán)色膠乳標(biāo)記的鼠IgG按1:1混勻，用劃膜噴金儀以5 μ L/cm的用量噴涂在預(yù)處理的玻璃纖維膜上，37°C烘干即構(gòu)成結(jié)合墊，置2?8°C備用。
[0168]3)樣品墊制備
[0169]用樣品墊處理液浸泡樣品墊，然后在37°C下Ih烘干，備用。
[0170]4)試紙裁剪及裝配
[0171]同實(shí)施例5。
[0172]實(shí)施例13樣本處理
[0173]血清樣本:取全血I?5mL于血清采集管中，靜置30min?2h，3000?5000g離心5?lOmin，取上清即得。根據(jù)試紙條的檢測(cè)精度，把樣本用加樣緩沖液稀釋0-100倍，取50-100 μ L滴加到試紙條的加樣孔中，靜置5?20分鐘后觀察結(jié)果。
[0174]血漿樣本:取全血I?5mL于枸櫞酸鈉或肝素鈉抗凝管中混勻，1000?3000g離心5?lOmin，取上清即得到血漿樣本。根據(jù)試紙條的檢測(cè)精度，把樣本用加樣緩沖液稀釋0-100倍，取50-100 μ L滴加到試紙條的加樣孔中，靜置5?20分鐘后觀察結(jié)果。
[0175]全血標(biāo)本:取指尖或耳垂新鮮血約50 μ L，滴加到加樣孔中，馬上用50 μ L加樣緩沖液滴加到加樣孔中稀釋?zhuān)o置5?20分鐘后觀察結(jié)果。
[0176]實(shí)施例14試紙條性能評(píng)估
[0177]本發(fā)明試劑條的性能包括穩(wěn)定性、批內(nèi)不精確度和批間不精確度評(píng)估。
[0178]1、4°C穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0179]將試紙條放置2?8°C冷庫(kù)，每月取出用質(zhì)控品和陰陽(yáng)性參考品各10份的陰陽(yáng)性符合率的批內(nèi)精密度來(lái)判斷試紙的穩(wěn)定性。12個(gè)月后結(jié)果顯示，質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果符合預(yù)期，各個(gè)陰陽(yáng)性參考品的陰陽(yáng)性符合率為100%。18個(gè)月后結(jié)果顯示，各個(gè)陰陽(yáng)性參考品的陰陽(yáng)性符合率仍為100%。24個(gè)月后檢測(cè)結(jié)果顯示，未出現(xiàn)假陰性。綜合以上結(jié)果說(shuō)明試紙?jiān)??8°C貯存，2年內(nèi)是穩(wěn)定的。
[0180]2、批內(nèi)不精確度
[0181]取實(shí)施例5?8各一個(gè)批次的金標(biāo)試紙條，和實(shí)施例10?12各一個(gè)批次的膠乳試紙條，分別用高、中、低三種陽(yáng)性血清和陰性血清各一份，每份血清分別用金標(biāo)試紙條和膠乳試紙條重復(fù)檢測(cè)10次，結(jié)果如下表所示，所有陽(yáng)性血清的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，所有陰性血清的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，提示本發(fā)明的膠體金試紙條和膠乳試紙條批內(nèi)不精確度符合標(biāo)準(zhǔn)。
[0182]
強(qiáng)陽(yáng)性血清中度陽(yáng)性血清弱陽(yáng)性血清陰性血清試紙條I陽(yáng)性結(jié)果數(shù)101010O
陰性結(jié)果數(shù)OOO10
試紙條2陽(yáng)性結(jié)果數(shù)101010O
陰性結(jié)果數(shù)00O10
試紙條3陽(yáng)性結(jié)果數(shù)101010O
陰性結(jié)果數(shù)00O10
試紙條4陽(yáng)性結(jié)果數(shù)101010O
陰性結(jié)果數(shù)OOO10
試紙條5陽(yáng)性結(jié)果數(shù)101010O
陰性結(jié)果數(shù)OGGIG
試紙條6陽(yáng)性結(jié)果數(shù)101010O
陰性結(jié)果數(shù)OOO10
試紙條7陽(yáng)性結(jié)果數(shù)101010O
陰性結(jié)果數(shù)00O10
[0183]3、批間不精確度
[0184]試紙條I和試紙條6各三個(gè)批次，用高、中、低三種陽(yáng)性血清和陰性血清檢測(cè)，每份血清檢測(cè)10條，10分鐘后觀察結(jié)果，如下表所示，試紙條I和試紙條6各三個(gè)不同批次的檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明批間不精確度符合標(biāo)本。
[0185]

【權(quán)利要求】
1.一種抗CUZDl抗體免疫層析試紙條，包括樣品墊(I)、結(jié)合墊(2)、分析膜(3)、吸水墊(6)、底板(7)、檢測(cè)帶T線(xiàn)(4)和質(zhì)控帶C線(xiàn)(5)，所述底板(7)的上部貼合有分析膜(3)，所述分析膜(3)上部的兩端分別貼合有結(jié)合墊(2)和吸水墊￠)，所述結(jié)合墊(2)上部的一端貼合有樣品墊(I)，所述檢測(cè)帶T線(xiàn)(4)和質(zhì)控帶C線(xiàn)(5)設(shè)置在分析膜(3)上，其特征在于，⑶ZDl抗原蛋白結(jié)合在結(jié)合墊(2)上或包被在檢測(cè)帶T線(xiàn)(4)上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其特征在于:所述的結(jié)合墊(2)包被膠體金標(biāo)記物或膠乳(乳膠)標(biāo)記物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CUZDl抗體檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述的結(jié)合墊為I層(圖1)或分上(2a)、下(2b)兩層與分析膜錯(cuò)落搭接(圖2)。
4.一種抗CUZDl抗體免疫層析試紙條的制備方法，包括如下步驟: 步驟1.⑶ZDl抗原蛋白的制備 步驟2.結(jié)合墊⑵制備 (1)膠體金標(biāo)記物的制備:用納米金溶液標(biāo)記⑶ZDl抗原蛋白、抗人IgG抗體、葡萄球菌A蛋白(SPA)、鏈球菌G蛋白(Protein G),以及其他與檢測(cè)帶T線(xiàn)和質(zhì)控帶C線(xiàn)能形成免疫復(fù)合物的蛋白。 (2)膠乳標(biāo)記物的制備:用帶活性基團(tuán)的膠乳微球標(biāo)記CUZDl抗原蛋白、抗人IgG抗體、葡萄球菌A蛋白(SPA)、鏈球菌G蛋白(Protein G)，以及其他檢測(cè)帶T線(xiàn)與質(zhì)控帶C線(xiàn)能形成免疫復(fù)合物的蛋白。 (3)結(jié)合墊(2)制備:玻璃纖維膜或聚脂膜作為結(jié)合墊，將步驟(I)制備的納米金標(biāo)記物或膠乳標(biāo)記物，噴涂在預(yù)處理的玻璃纖維膜或聚脂膜上，干燥備用。 步驟3.分析膜(3)制備 A.檢測(cè)帶T線(xiàn)(4)制備:根據(jù)結(jié)合墊標(biāo)記蛋白類(lèi)型選擇檢測(cè)帶T線(xiàn)包被蛋白，如結(jié)合墊上的結(jié)合蛋白含CUZD1，檢測(cè)帶T線(xiàn)的包被蛋白是抗人IgG抗體。如果結(jié)合墊上含有抗人IgG抗體，檢測(cè)帶T線(xiàn)包被蛋白為⑶ZDI。 B.質(zhì)控帶C線(xiàn)(5)制備:根據(jù)結(jié)合墊的標(biāo)記蛋白類(lèi)型選擇質(zhì)控帶的包被蛋白，如結(jié)合墊標(biāo)記蛋白是單一的⑶ZDl,質(zhì)控帶C線(xiàn)的包被蛋白為抗⑶ZDl的抗體；如果結(jié)合墊標(biāo)記蛋白是單一的抗人IgG抗體,質(zhì)控帶C線(xiàn)的標(biāo)記蛋白為對(duì)應(yīng)的抗人IgG抗體的抗體；結(jié)合墊標(biāo)記蛋白有2層時(shí)，質(zhì)控帶C線(xiàn)的包被蛋白是能與結(jié)合墊對(duì)應(yīng)層結(jié)合蛋白形成免疫復(fù)合物的蛋白。 步驟4.樣品墊制備 將玻璃纖維膜或聚酯膜經(jīng)緩沖液浸潰烘干備用，或者直接使用。 步驟5.試紙條組裝 把步驟I?4所制作完成的材料，按圖1或圖2搭接，根據(jù)底板的規(guī)格切割成一定的長(zhǎng)度和寬度，安裝在底板和卡殼里。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條，其特征在于:所述的CUZDl抗原蛋白是把全長(zhǎng)CUZDl基因或者含有重要抗原表位的基因序列，克隆到原核或真核表達(dá)載體里，表達(dá)純化獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條，其特征在于:所述的CUZDl抗原蛋白是用多肽合成儀合成含有CUZDl重要抗原表位的CUZDl多肽，并偶聯(lián)到載體蛋白上而獲得。載體蛋白包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚賴(lài)氨酸(PLL)等。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述的抗人IgG抗體為鼠源、兔源、羊源、馬源、駱駝源或豚鼠源中的一種或多種單克隆抗體或多克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述的抗CUZDl的抗體是以CUZDl為免疫源產(chǎn)生的單克隆或多克隆抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述的抗人IgG抗體的抗體是指能與該抗體形成免疫復(fù)合物的蛋白。
10.一種抗CUZDl抗體檢測(cè)方法，其特征在于，用權(quán)利要求1?9所述的免疫層析試紙條，對(duì)待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟包括: (1)樣本處理:取血清、血漿或全血樣本； (2)把樣品滴加到試紙條的樣品墊上，靜置5?30分鐘，觀察T線(xiàn)和C線(xiàn)； (3)結(jié)果判讀:T線(xiàn)和C線(xiàn)均顯現(xiàn)，結(jié)果為陽(yáng)性；Τ線(xiàn)不顯現(xiàn)，C線(xiàn)顯現(xiàn)，結(jié)果為陰性汀線(xiàn)和C線(xiàn)均不顯現(xiàn)或其他現(xiàn)象，提示試紙失效。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK104198698SQ201410414639
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月21日
【發(fā)明者】陳菲, 李振軍, 霍如松, 趙帥 申請(qǐng)人:蘇州和銳醫(yī)藥科技有限公司