專利名稱：一種檢測tp抗體的磁性免疫層析試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域的一種檢測TP抗體的磁性免疫層析試紙條及其制備 方法。
背景技術(shù)：
梅毒的病原體是一種螺旋體，梅毒螺旋體是一種小而纖細的呈螺旋狀的微生物， 長度為5-20nm，直徑〈0. 2nm。梅毒患者的皮膚、粘膜中含梅毒螺旋體，未患病者在與梅毒 患者的性接觸中，皮膚或粘膜若有細微破損則可得病。極少數(shù)可通過輸血或其它途徑傳染。 獲得性梅毒(后天)早期梅毒病人是傳染源，95%是通過不潔性交傳染，少數(shù)通過接吻，握 手，輸血，接觸污染的內(nèi)衣濕毛巾，茶杯、煙斗、哺乳、尿布等傳染。胎兒梅毒(先天)孕婦 體內(nèi)螺旋體，一般在妊娠3-4月通過胎盤感染嬰兒。 潛伏梅毒雖無癥狀，介螺旋體繼續(xù)潛伏在體內(nèi)重要器官，數(shù)年乃至數(shù)十年后會出 現(xiàn)三期梅毒，如眼、鼻損害、心血管梅毒、神經(jīng)梅毒、精神失常等，甚至死亡。女性梅毒患者妊 娠后，梅毒螺旋體可以通過母血到胎盤，破壞胎盤后傳給胎兒。妊娠6-7周時胎兒即被傳
染，發(fā)生流產(chǎn)、死胎、早產(chǎn)等。胎傳梅毒兒，可有皮膚、骨骼、牙齒、肝脾等臟器梅毒損傷，在出 生2年后陸續(xù)表現(xiàn)出來，嚴重的可有眼盲、腦損害等。 梅毒血清試驗是診斷梅毒的主要方法。 一期梅毒硬不疳時，血清試驗可陰性此時 可取硬下疳的滲出液或腹溝淋巴穿剌液放玻璃片上，看螺旋體的運動狀態(tài)來診斷。到下疳 后半期，血清試驗陽性率很高。 目前的TP血清學(xué)診斷技術(shù)主要包括快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片實驗(RPR)，甲苯胺 紅不加熱血清試驗(TRUST)，病毒特異性抗體酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)，化學(xué)發(fā)光(CLIA)，免 疫層析法(膠體金或乳膠顆粒法)，熒光螺旋體抗體吸收實驗(FTA-ABS)，梅毒螺旋體血細 胞凝集試驗(TPHA)，梅毒螺旋體特異抗體試驗(TPPA)，免疫印跡法(WB)等，這些方法都有 各自的特點和使用對象。 RPR方法快速簡便，費用低，但由于結(jié)果判讀易受影B向，逐漸被TRUST實驗取代， 而TRUST實驗則不適用于大量血樣的篩查，ELISA法是目前臨床血液篩查中普遍使用檢測 技術(shù)，但是ELISA試驗操作程序復(fù)雜，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，且靈敏度低，CLIA與 ELISA方法類似，只是靈敏度提高了一些，并沒有根本解決ELISA存在的問題，并且二者都 存在操作繁瑣，反應(yīng)時間長的問題，而且都需要酶標儀或發(fā)光儀和洗板機以及溫箱等復(fù)雜 設(shè)備，而且不能單人份檢測，進一步限制了他們在一些基層醫(yī)院、診所的應(yīng)用。近幾年國內(nèi) 外出現(xiàn)了以膠體金或乳膠顆粒為代表的快速檢測試紙條，但是由于結(jié)果是肉眼目視觀察， 容易受觀察者主觀判斷的影響，靈敏度低，結(jié)果準確度不高。FTA-ABS， TPHA和TPPA以及WB 是目前臨床梅毒檢測的幾種確認方法，結(jié)果準確可靠，但是要么實驗過程復(fù)雜，需要昂貴的 儀器設(shè)備(如FTA-ABS)，要么試劑穩(wěn)定性差(如TPHA)要么技術(shù)難度大，全世界只有屈指可 數(shù)的幾家公司可以生產(chǎn)(如WB)，高昂的使用成本使得它們目前僅用于可疑標本的確認，而 很少用于血樣篩選。
磁性免疫層析(Mgnetic ImmunoChromatographic Test，MICT)是近年來出現(xiàn)的的 一種新一代單人份快速定量檢測技術(shù)。是以超順磁性顆粒(superPMPs)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的標記物 (膠體金，乳膠顆粒等)來進行免疫層析，通過檢測結(jié)合在超順磁性納米微粒上的生化物質(zhì) 來提供對生物樣品的定量檢測數(shù)據(jù)。通過檢測測量磁場強度來表達標記在樣品區(qū)域的量， 采用標記的免疫復(fù)合物-磁場強度的標準曲線，從而達到定量的目的。該技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)
相比具有下述優(yōu)勢1)分析靈敏度比各類目測快速診斷法靈敏10-100倍；2)分析速度 可在15秒內(nèi)測量到多達6個分析位點的數(shù)據(jù)；3)線形范圍在1-104的濃度范圍內(nèi)呈線 性；4)所用磁性檢測儀器采用固相元件，微型化設(shè)計自成一體，獨立運行，體積小，操作簡 便；5)超順磁性納米微粒由聚合物包被，不會隨時間而衰變；獨立的快速診斷色譜卡(MAR Cassette)可直接插入MAR檢測儀，為目前許多快速臨床診斷試劑的整合提供了廣泛的開 發(fā)空間；而且還避免了操作過程中人員或儀器可能發(fā)生的交叉污染，提高了分析和過程的 安全性。該技術(shù)繼承了傳統(tǒng)免疫層析法(膠體金，乳膠顆粒等)簡便快速，單人份操作的優(yōu) 點，又彌補了傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)靈敏度低，只能定性，不能定量的缺點，代表了當今即時檢 驗(Point of Care Test, P0CT)技術(shù)發(fā)展的方向和潮流， 一經(jīng)問世，發(fā)展迅速，目前已經(jīng)成 為替代傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)的首選。 目前常用的標記磁顆粒為超順磁顆粒(superPMPs)，沒有外加磁場的情況下不具 有任何磁性，只有在外加磁場作用下才會表現(xiàn)出磁性，商品化超順磁顆粒都經(jīng)過表面修飾， 大大方便了標記過程，標記簡便，重復(fù)性好。 生物素-親和素系統(tǒng)(BAS)是一種廣泛應(yīng)用的技術(shù)，將親和素包被固相，將生物素 標記抗原或抗體，利用生物素親和素之間極高的親和力以及一個親和素結(jié)合四個生物素的 特性，可以極大的提高反應(yīng)的靈敏度，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，目前親和素和生物素都出現(xiàn)了大 量衍生物，可以根據(jù)不同的需要選用，標記方法也很簡便，大大增加了他們的易用性。將生 物素親和素系統(tǒng)引入磁性免疫層析中，在極大地提高了檢測方法的靈敏度的同時，又提供 了一種極好的通用技術(shù)平臺，在規(guī)模化生產(chǎn)中減少了標記步驟，增加了工藝的通用性，減少 了可變因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即是將磁性免疫層析技術(shù)與生物素親和素系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用在TP免疫 分析中。將鏈親和素共價偶聯(lián)于超順磁顆粒上，將生物素化TP抗原和生物素化與之混合之 后作為檢測流動相，將TP抗原包被于硝酸纖維素膜上制成檢測線作為捕獲固相，按照常規(guī) 免疫層析法的原理進行標本的檢測，結(jié)合簡便易行的磁性檢測儀進行檢測，實現(xiàn)了高靈敏 度檢測，綜合了前述幾種方法的優(yōu)勢可以單人份檢測，也可以批量檢測，并且可以即時給 出可量化的結(jié)果，測量儀器簡單可靠，操作簡便，方便實用。 為達到上述的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明的檢測TP抗體的磁性免疫層 析試紙條是將包被膜、結(jié)合了 TP抗原的磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊、依次相互交錯2mm地粘 貼在底板上，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜而制成，其中所述的包被膜上預(yù)包被有TP抗 原的檢測線，以及生物素化牛血清白蛋白的質(zhì)控線。 選用的底板為透明塑料底板，包被膜為35mm寬度的硝酸纖維素膜，選用的吸水墊 為纖維素膜，磁顆粒墊為玻璃纖維墊，樣品墊為經(jīng)過樣品墊處理液預(yù)處理的纖維素膜。所述的樣品墊處理液是含有1% _5%酪蛋白(casein)和0. 1% _1%的聚乙烯醇(PVP)，以及
0. 01-0. 2%吐溫-20 (Tween-20)的0. 02M， pH7. 0-7. 6的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)。 檢測TP抗體的磁性免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟 A、抗原的處理選用商品化TP重組抗原(CTK公司TP融合抗原47-17， cat:
A4717);對20mM， pH7. 0-7. 6的PBS 4。C透析過夜; B、磁顆粒的制備選用直徑為100-300nm的超順磁顆粒，使用碳二亞胺(EDC)和琥 珀酰亞胺(NHS)共價偶聯(lián)的方式將鏈親和素標記到磁顆粒上，選用預(yù)活化生物素進行TP抗 原/的標記，將標記好的生物素化抗原以l : 2-1 : IO的比例(體積比)與鏈親和素化磁 顆粒混合，確保鏈親和素化磁顆粒過量； C、將制備好的磁顆粒使用定量噴液裝置以5 ii l/cm-20 y 1/cm的量噴涂于磁顆粒 墊上； D、包被膜的制備使用包被緩沖液分別將TP包被抗原和生物素化BSA稀釋到 0. 5-2mg/m的濃度，使用定量噴液裝置分別將二者以0. 5_1. Ocm的間隔于硝酸纖維素膜上， 晾干后于封閉液中浸泡10分鐘后于25-35t:烘干8小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆茫?
E、樣品墊的處理將樣品墊放入樣品墊處理溶液中浸泡處理1小時后取出 25-35t:烘干8小時； F、試紙條的組裝在透明塑料底板上依次相互交錯2mm貼上包被膜、磁顆粒墊、樣 品墊、吸水墊，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜，得到試紙板，根據(jù)要求寬度切割即得到試 紙條。
所述的步驟B包括以下三步 1)鏈親和素化磁顆粒的制備使用含有0. 1 % Tween-20的50mM， pH4. 5-5. 0的醋 酸鈉緩沖液洗滌磁顆粒，加入EDC和NHS使二者終濃度均為20mmo1，室溫反應(yīng)1小時，使用 含有0. 1% Tween-20的50mM，pH4. 5-5. 0的醋酸鈉緩沖液充分洗滌磁顆粒后加入鏈親和素 使鏈親和素與磁顆粒的分子比例為5 : 1(摩爾比)，室溫反應(yīng)3小時，加入含有0.5XBSA 的0. 02M，pH7. 0-7. 6的PBS室溫封閉30分鐘，洗滌磁顆粒，使用含有1% PVP， 1% Case in ， 0. 5% Tween-20，5X蔗糖的50mM pH8. 2-9. 0的硼酸保存緩沖液復(fù)溶磁顆粒，4"保存?zhèn)溆茫?
2)生物素化TP抗原的制備將TP抗原對0. 02M， pH7. 0_7. 6的PBS 4T透析過 夜，調(diào)整濃度為2mg/ml，將預(yù)活化生物素使用二甲基亞砜(DMSO)溶解，終濃度為50mM，以 10 : 1的分子比例向抗原或抗體溶液中加入所需量的生物素溶液，室溫反應(yīng)1小時，對 0.02M PBS 4。C透析過夜，加入等體積甘油后-2(TC保存?zhèn)溆茫?3)生物素化抗原與鏈親和素化磁顆粒的混合，以0. 5 1/mg磁顆粒的量向鏈親和 素化磁顆粒溶液中加入生物素化TP抗原，以O(shè). 25iU/mg磁顆粒的量加入生物素化，充分混 勻后使用保存緩沖液以l : 5-1 : 20的比例(體積比)將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊 使用。 所述的步驟C中，磁顆粒的噴涂方法是將制備好的磁顆粒使用定量噴膜裝置以 50iU/cm的量均勻噴涂于玻璃纖維上，冷凍干燥后加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?
所述的步驟D中，包被膜的制備方法是用包被緩沖液(0. 02M PB， pH7. 0_7. 6)將 TP抗原稀釋為0. 5mg/ml，生物素化BSA稀釋為lmg/ml，使用定量噴膜裝置以1 y 1/cm的量 將二者以0. 8cm的間隔噴印于硝酸纖維素膜上，室溫晾干30分鐘后于封閉液中浸泡10分
5鐘后于25-35t:烘干8小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?與現(xiàn)有快速檢測試紙條相比較，本發(fā)明具有以下優(yōu)點 1)以超順磁顆粒代替?zhèn)鹘y(tǒng)的膠體金及乳膠顆粒等免疫層析用示蹤物，運用到TP 的快速檢測試紙條中，運用磁性檢測儀來進行結(jié)果的判讀，依據(jù)檢測線與質(zhì)控線的磁性檢 測值比值來進行陰陽性判斷，降低了主觀性，結(jié)果準確、可靠。 2)通過在磁顆粒上引入生物素_親和素系統(tǒng)，在提高靈敏度的同時也使得試紙條 的制備過程大大簡化，適合大規(guī)模生產(chǎn)。 本發(fā)明操作簡便，適合大規(guī)模生產(chǎn)，檢測所需的便攜式設(shè)備也已經(jīng)上市，因此能廣 泛用于醫(yī)院、血站、防疫站、體檢等大批量使用單位以及一些采血現(xiàn)場、農(nóng)村和基層診所等 小批量或單人份使用的單位使用。對于TP的初篩定性診斷有著積極的意義。


圖1為本發(fā)明檢測TP抗體的磁性免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。 為進一步說明本發(fā)明檢測TP抗體的磁性免疫層析試紙條及其制備方法，特舉以
下的實施例進行說明，該實施例是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。
具體實施例方式
本發(fā)明所述的檢測血液中TP抗體的磁性免疫層析試紙條，如圖1所示，該試紙條 是在底板1)上依次相互交錯2mm地粘貼上包被膜2)、結(jié)合了 TP抗原的磁顆粒墊3)、樣品 墊4)、吸水墊5)，并在上層覆蓋透明塑料密封膜6)組裝而成的試紙條，包被膜2)上預(yù)包被 有TP抗原的檢測線和質(zhì)控線C(生物素化BSA)。 在具體實施例中，所采用TP抗原對為商品化抗原。利用雙抗原夾心檢測TP抗體 的原理檢測標本，當待測標本中含有TP抗體時，抗體會先和磁顆粒上結(jié)合的抗原結(jié)合，隨 著層析作用的進行，結(jié)合物向前移動到達檢測線T處，抗體會再次和包被抗原結(jié)合形成雙 抗原夾心復(fù)合物而聚集在T處。另外，未結(jié)合生物素化抗原的鏈親和素標記磁顆粒會繼續(xù) 前行到達質(zhì)控線C時，生物素化BSA會與鏈親和素標記磁顆粒結(jié)合從而在C線處同樣出現(xiàn) 磁顆粒聚集。整個反應(yīng)在30分鐘內(nèi)進行完全，一般反應(yīng)十五分鐘后即可使用磁性免疫層析 儀器讀卡，T線和C線都會產(chǎn)生相應(yīng)的磁性信號值，計算T/C的比值，根據(jù)預(yù)設(shè)的界限比值 即可判定結(jié)果的陰陽性。整個讀卡、計算、與預(yù)設(shè)界限值比對的過程已經(jīng)完全程序化，磁性 檢測儀會直接給出陰陽性結(jié)果。 本發(fā)明所述的檢測血液中TP抗體的磁性免疫層析試紙條的制備方法見以下實 例 實施例1 檢測血液中TP抗體的磁性免疫層析試紙條及試紙盒的制備方法
本實施例的試紙條及試紙盒的制備方法包括以下步驟 A、抗原和抗體的制備選用商品化的TP重組抗原，對20mM，pH7. 2(pH7. 0_7. 6均適 用)的PBS，4t:透析過夜備用。
B、包被膜的制備包被緩沖液的配制0. 02M pH 7. 2的磷酸緩沖液(PBS)為包被緩沖液，0. 22 y m微孔濾膜過濾除菌后置4t:保存?zhèn)溆?，有效期兩周?封閉液的配制含0. 5% BSA的0. 02M pH7. 2 (pH7. 0_7. 6均適用)的磷酸鹽緩沖 液(PBS) ， 0. 22 m微孔濾膜過濾除菌后置于fC保存?zhèn)溆茫行谝恢堋?
包被膜的制備用包被緩沖液(0. 02M pH7. 2 (pH7. 0_7. 6均適用)的PB)將TP抗原 稀釋為O. 5mg/ml，生物素化BSA稀釋為lmg/ml，使用定量噴膜裝置以1 iU/cm的量將二者 以0. 8cm的間隔均勻噴印于3. 5cm寬度硝酸纖維素膜上，室溫晾干30分鐘后于封閉液(含 有0. 5% BSA的0. 02M pH7. 2 (pH7. 0_7. 6均適用)的PBS，)中浸泡10分鐘后于25-35。C烘 干8小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?
C、磁顆粒的制備 醋酸鈉緩沖液的配制用雙蒸水和醋酸鈉及冰醋酸配制pH值為4. 7 (pH4. 5_5. 0均 適用)，濃度為50mM的醋酸緩沖液，加入Tween-20至終濃度為0. 1 % ， 0. 22 y m微孔濾膜過 濾除菌后4t:保存?zhèn)溆茫行趦芍堋?硼酸保存緩沖液的配制用雙蒸水，硼酸和硼砂配制pH為8. 5 (pH8. 2-9. 0均適 用)，終濃度為50mM的硼酸緩沖液，加入PVP， Casine， Tween-20，蔗糖，終濃度分別為1%， 1 % ， 0. 5 % ， 5 % ， 0. 22 ii m微孔濾膜過濾除菌后fC保存?zhèn)溆?，有效期一周?
鏈親和素化磁顆粒的制備使用含有0. 1 % Tween-20的50mM pH4. 7 (pH4. 5-5. 0 均適用)醋酸鈉緩沖液洗滌磁顆粒，加入EDC和NHS使二者終濃度均為20mmol，室溫反應(yīng) l小時，充分洗滌磁顆粒后加入鏈親和素使鏈親和素與磁顆粒的分子比例為5 : l(摩爾 比)，室溫反應(yīng)3小時，加入含有0. 5XBSA的0. 02M pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均適用)的PBS， 室溫封閉30分鐘，洗滌磁顆粒，使用含有1% PVP，1% Casein, 0. 5% Tween-20， 5%蔗糖的 50mmolpH8. 5(pH8. 2_9. 0均適用)的硼酸保存緩沖液復(fù)溶磁顆粒，fC保存?zhèn)溆谩?
生物素化TP抗原的制備將TP抗原對0. 02M pH7. 2 (pH7. 0_7. 6均適用)的 PBS 4t:透析過夜，調(diào)整濃度為2mg/ml，將預(yù)活化生物素使用匿SO溶解，終濃度為50mM， 以10 : 1的分子比例向抗原或抗體溶液中加入所需量的生物素溶液，室溫反應(yīng)1小時，對 0. 02MpH7. 2 (pH7. 0_7. 6均適用)的PBS 4。C透析過夜，加入等體積甘油后-2(TC保存?zhèn)溆谩?
生物素化抗原與鏈親和素化磁顆粒的混合以0. 5 1/mg的量向鏈親和素化磁顆 粒溶液中加入生物素化TP抗原，充分混勻后使用保存緩沖液以1 : 5比例將混合物稀釋待
噴涂玻璃纖維墊使用。 D、磁顆粒的噴涂與凍干 使用BioDot噴膜儀的專用噴頭將處理好的磁顆粒以25 y 1/cm的量均勻噴涂于 0. 8cm寬度玻璃纖維墊上，過夜冷凍干燥，加入干燥劑封存?zhèn)溆茫?
E、樣品墊的處理 將1. 8cm寬度樣品墊放入樣品墊處理溶液中浸泡處理1小時后取出25-35。C烘干 8小時。 樣品墊處理液是含有1% -5% Casein和O. 1% _1 %的PVA以及O. 01-0. 2% Tween-20的0. 02M pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均適用)的PBS溶液。
F、試紙條的組裝及切割 下述所有操作都必須在濕度小于20%，溫度20-25t:的房間內(nèi)進行。 試紙板的組裝使用BioDot LM5000型組裝儀按照要求將3. 5cm寬的包被膜，2. 5cm寬的吸水紙，0. 8cm寬的磁顆粒墊，1. 8cm寬的樣品墊組裝于9. 8cm寬度透明塑料底板 上，貼上上層透明塑料蓋板，組裝成試紙板。 試紙條的裁切使用BioDot CM4000型切條機將組裝好的試紙板切成0. 5cm寬的 成品試紙條。 G、試紙卡的組裝 將本發(fā)明所述的切割好的單人份試紙條置于塑料底卡上的卡槽內(nèi)，蓋上上蓋，使 用壓卡機將上下兩片塑料卡壓緊，確保整個試紙條處于繃緊狀態(tài)。加入干燥劑室溫封存?zhèn)?用。 H、確定該批次的二維碼信息
品名TP抗體磁性檢測卡 批次試紙卡的組裝日期，格式為年/月/日，XXXX/XX/XX 陰陽性判讀標準的確定取100份確認TP抗體陽性標本(強弱均有)，500份隨機 標本使用該批次試紙卡檢測，使用磁性檢測儀檢測結(jié)果，計算每個檢測卡的T/C值，使用統(tǒng) 計學(xué)方法計算均值和標準差，確定T/C < 0. 1為陰性。T/C > 0. 2為陽性，二者之間為灰 區(qū)。 1、二維碼的打印粘貼 將上述二維碼信息輸入二維碼打印機內(nèi)并打印，將二維碼粘貼于試紙卡的特定位 置，使用二維碼粘貼位置檢測器隨機抽檢2%確保二維碼粘貼無誤。
J、成品包裝 將貼好二維碼的單人份試紙卡與一包干燥劑密封于鋁箔袋內(nèi)，100人份為一個包 裝置于一個包裝盒內(nèi)，一盒一份說明書和1瓶10ml裝層析緩沖液，即制成試紙盒，該試紙 盒于室溫避光保存，保質(zhì)期為18個月。層析緩沖液配方為1% Tween-20，0. 5% Triton X-IOO， 1% NP-40，0. 05% NaN3，20mmo1 pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均適用)的PBS，。
實施例2 除了 ；鏈親和素化磁顆粒的制備的步驟中鏈親和素使鏈親和素與磁顆粒的比例 為1 : 2.5。其它步驟同實施例1，
實施例3 除了鏈親和素化磁顆粒的制備的步驟中鏈親和素使鏈親和素與磁顆粒的比例為 1:8。其它步驟同實施例1。
實施例4 除了生物素化TP抗原與鏈親和素化磁顆粒的混合步驟中充分混勻后使用保存
緩沖液以l : io的比例將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用，其它步驟同實施例i。 實施例5 除了生物素化TP抗原與鏈親和素化磁顆粒的混合步驟中充分混勻后使用保存 緩沖液以l : 20的比例將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用，其它步驟同實施例1。 實施例6 本發(fā)明的檢測卡的使用方法 1、加樣 從包裝盒中取出單人份的檢測卡，撕開鋁箔帶包裝，將試紙卡置于平整桌面上，用微量移液器取50ia樣本血清加入卡上的加樣孔內(nèi)，再加入50iil層析緩沖液，等待反應(yīng)進 行15分鐘。 2、測量及結(jié)果輸出 將MICT檢測儀預(yù)先開機，將檢測卡插入檢測儀的插卡口 ，運行儀器，儀器會自動 讀取卡上的二維碼信息并進行測量，即時打印測量結(jié)果，陰陽性結(jié)果會在打印結(jié)果中顯示。
權(quán)利要求
一種檢測TP抗體的磁性免疫層析試紙條，其特征在于該試紙條是將包被膜、結(jié)合了TP抗原的磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊依次相互交錯2mm地粘貼在底板上，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜組裝而成，其中所述的包被膜上預(yù)包被有TP抗原檢測線和質(zhì)控線。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測TP抗體的磁性免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于包括以下步驟1) 抗原的處理選用基因工程技術(shù)制備的商品化TP重組配對抗原，對20mM，pH7. 0_7. 6的PBS 4t:透析過夜；2) 包被膜的制備使用0. 02mM， pH7. 0_7. 6的PBS，分別將TP包被抗原和生物素化牛血清白蛋白稀釋到O. 5-1. 5mg/ml的濃度，使用定量噴液裝置分別將二者以0. 5_1. 2cm的間隔噴印于硝酸纖維素膜上，晾干后于封閉液中浸泡10分鐘后于25-35t:烘干8小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆茫?) 磁顆粒墊的制備A、 鏈親和素化磁顆粒的制備選用直徑為100-300nm的超順磁顆粒，使用含有0. 1%Tween-20的50mM， pH4. 5-5. 0的醋酸鈉緩沖液洗滌磁顆粒，加入碳二亞胺和琥珀酰亞胺使二者終濃度均為20mmol/L，室溫反應(yīng)1小時，使用含有0. 1% Tween-20的50mM，pH4. 5-5. 0的醋酸鈉緩沖液充分洗滌磁顆粒后加入鏈親和素使鏈親和素與磁顆粒的分子比例為5 : 1(摩爾比)，室溫反應(yīng)3小時，加入含有0. 5% BSA的O. 02M，pH7. 0-7. 6的PBS室溫封閉30分鐘，使用含有0. 1% Tween-20的50mM， pH4. 5_5. 0的醋酸鈉緩沖液洗滌磁顆粒，然后使用含有1% PVP， 1% casein, 0. 5% Tween-20， 5%蔗糖的50mM， pH8. 2-9. 0的硼酸保存緩沖液復(fù)溶磁顆粒，4t:保存?zhèn)溆?；B、 生物素化TP抗原的制備將TP抗原對0. 02M，pH7. 0_7. 6的PBS 4"透析過夜，調(diào)整濃度為2mg/ml，將預(yù)活化生物素使用二甲基亞砜溶解，終濃度為50mM，以10 : 1的分子比例向抗原或抗體溶液中加入所需量的生物素溶液，室溫反應(yīng)1小時，對O. 02M，pH7. 0-7. 6的PBS 4。C透析過夜，加入等體積甘油后-2(TC保存?zhèn)溆茫籆、 生物素化抗原與鏈親和素化磁顆粒的混合，以0. 25iU/mg磁顆粒的量向鏈親和素化磁顆粒溶液中加入生物素化TP抗原，以O(shè). 15iU/mg磁顆粒的量加入生物素化，充分混勻后使用保存緩沖液以l : 5-1 : 20的比例(體積比)將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用；D、 磁顆粒墊的制備將制備好的磁顆粒使用定量噴膜裝置以10iU/cm的量均勻噴涂于玻璃纖維上，冷凍干燥后加入干燥劑封存?zhèn)洌?) 樣品墊的處理將樣品墊放入樣品墊處理溶液中浸泡處理1小時后取出25-35t:烘干8小時；所述的樣品墊處理液是含有0. 5% -2. 5% BSA和0. 1 % -1 %的聚乙烯醇，以及0. 01-0. 2%吐溫-20的0. 02M， pH7. 0-7. 6的磷酸鹽緩沖溶液；5) 試紙條的組裝在透明塑料底板上依次相互交錯2mm貼上包被膜、磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜得到試紙板，根據(jù)要求的寬度切割即得到試紙條。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測血液中梅毒(TP)抗體的磁性免疫層析試紙條及其制備方法。該試紙條是將包被膜、結(jié)合了TP抗原的磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊依次相互交錯2mm地粘貼在底板上、然后在上層覆蓋透明塑料密封膜組裝而成的。包被膜上預(yù)包被有TP抗原檢測線和質(zhì)控線，本發(fā)明將磁性免疫層析技術(shù)和生物素親和素系統(tǒng)引入到TP抗體檢測中，大大提高了檢測靈敏度和結(jié)果準確度，縮短了檢測窗口期，降低了操作人員的勞動強度。
文檔編號G01N33/558GK101762693SQ20091008764
公開日2010年6月30日 申請日期2009年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日
發(fā)明者于尚永, 姚洪濤, 應(yīng)希堂, 李強, 胡國茂, 鄭金來 申請人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司