反相-高效液相色譜對人體血液和尿液中草酸濃度的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種反相-高效液相色譜測定人體血液和尿液中草酸濃度的方法,屬于用色譜法分析材料領域,本發(fā)明包括血液和尿液的預處理、血液和尿液的衍生處理、高效液相色譜操作條件、草酸工作曲線的制備以及血液和尿液中草酸含量的測定。本發(fā)明以鄰苯二胺為衍生劑,與尿液與血液中草酸反應,生成具有強紫外吸收化合物——2,3-二羥基喹喔啉,此衍生物在314nm有強吸收峰,且與草酸具有一一對應的濃度關系,草酸的保留時間為7.2min,此峰高與濃度具有良好的線性關系,因而能準確測定人體尿液與血液中草酸的含量。本發(fā)明方法簡單快速,數(shù)據(jù)準確可靠,為檢測草酸濃度提供了良好的檢測手段。
【專利說明】[0001] 反相-高效液相色譜對人體血液和尿液中草酸濃度的測定 方法
【技術領域】
[0002] 本發(fā)明屬于用色譜法分析材料領域,具體涉及一種反相-高效液相色譜對人體血 液和尿液中草酸濃度的測定方法。
【背景技術】
[0003] 草酸,即乙二酸,是最簡單的有機二元酸之一,結構簡式為H00CC00H。它一般是無 色透明結晶,對人體有害,會使人體內(nèi)的酸堿度失去平衡,影響兒童的發(fā)育等。草酸遍布于 自然界,常以草酸鹽形式存在,幾乎所有的植物都含有草酸鹽。
[0004] 據(jù)Doseh 1979年總結,人體體液內(nèi)草酸濃度檢測方法有氧化滴定法、比色法、原 子吸收光譜法、酶分析法、極譜描記法、同位素稀釋法、離子特異性電極法和各種色譜法等。 而高效液相色譜法(HPLC)憑借其靈敏度高、操作簡單、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢特點而倍受研究者 的青睞,尤其對大量樣本的檢測高效液相色譜法可能是更好的選擇。
[0005] 對將要使用高效液相色譜法檢測成分的樣本是有一定要求的,必須除去樣本中大 量的蛋白等雜質,一般使用流動相溶解樣本并必須過〇.45um或更細的膜,否則會對柱子造 成損害,甚至無法完成實驗。無論尿中、血中抑或其它物質中的草酸,如果選定了正確的方 法學,只是將各樣本前期處理好,均可采用此方法進行監(jiān)測。近幾年有關草酸測定的文獻, 不乏使用離子色譜法、分光光度色譜法等監(jiān)測草酸。而使用高效液相色譜法測定草酸流動 相一般使用磷酸二氫鉀,由于該流動相從柱子上洗脫的成分較多,故出峰繁雜。而要測定的 目標成分草酸出峰情況并不明顯,只是夾雜在諸峰之中,無法達到非常精確的要求。同時, 由于雜質峰較多故出峰時間較長,實驗一個樣本需要30分鐘以上。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術中存在的高效液相色譜法測定草酸出峰情況并不明顯、 雜峰多且出峰時間較長的缺點而提出的,其目的是提供一種反相-高效液相色譜測定人體 血液和尿液中草酸濃度的方法。
[0007] 本發(fā)明的技術方案是: 一種反相-高效液相色譜對人體血液和尿液中草酸濃度的測定方法,包括以下步驟: a. 樣品預處理 ① 血液預處理,禁食12h后上肢靜脈血3ml,加入肝素抗凝后,4°C離心,取上層血漿 lml,加入lml乙睛和50 μ 1 pH = 7. 0的磷酸鹽緩沖液,混旋,離心,37°C的N2氣流將上層 液中的乙睛蒸發(fā)掉,用去離子水補足液體至lml ; ② 尿液預處理,24h尿液與濃鹽酸按體積比100:1酸化尿液,置于4°C中備用; b. 樣品衍生處理 ① 血液衍生處理,取經(jīng)預處理的血漿上清液0. 5ml于帶蓋離心管中,加入5 μ 1濃鹽酸 和0. 5ml 10g/L的鄰苯二胺標準液,140°C加熱30min,室溫冷卻,用5mol/L NaOH溶液調節(jié) 其pH值為5-6,離心后的上清液經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過濾后,上機測定; ② 尿液衍生處理,取經(jīng)預處理的尿液lml于帶蓋離心管中,加入5μ 1濃鹽酸和0. 5ml l〇g/L的鄰苯二胺標準液,140°C加熱30min,室溫冷卻,用5mol/L NaOH溶液調節(jié)其pH值 為5-6,離心后的上清液過0. 22 μ m微孔濾膜過濾后,上機測定; c. 高效液相色譜操作條件 儀器:Aligent 1100型高效液相色譜儀;色譜柱:150_X4. 6_,5 μ m,Agilent XDBC18 ;予頁柱:4. 6mmX 12. 5mm, 5 μ m, Agilent Zorbax extend- C18 ; 流動相組成體積比:甲醇:醋酸胺水溶液=15:85 ;流速:1. 2ml ;檢測器:紫外可 見光多波長檢測器;柱溫:26. 3°C ;進樣量:50 μ L ;草酸的保留時間:7. 2min ; d. 草酸工作曲線的制備 取正常人經(jīng)預處理的血漿,另取正常人經(jīng)衍生處理的尿液,分別制成草酸血漿溶液 以及草酸尿溶液,濃度均分別為 125 mg/L,62.5 mg/L,31.25 mg/L,15.625 mg/L,7.813 mg/L,1.953mg/L;對各個濃度的草酸血漿溶液、草酸尿溶液、空白血漿、空白尿液進行衍 生處理后,進行色譜分析,以峰面積A對濃度C進行線性回歸,得血液中草酸工作曲線: A=12. 8289C+3. 239, r=0. 9995 ;尿液中草酸工作曲線:A=11. 343C+56. 599, r=0. 9993 ; e. 血液和尿液中草酸含量的測定 將經(jīng)過衍生處理的待測血液和尿液樣品上機測定,根據(jù)待測血液和尿液樣品的對應峰 面積由工作曲線計算出待測血液和尿液樣品中草酸的濃度。
[0008] 所述磷酸鹽選自磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀中的一種或 其混合物。
[0009] 所述血液和尿液樣品制備時是在2000-2300r/min離心10-15min條件下進行的。
[0010] 所述步驟流動相中醋酸胺水溶液的濃度為〇. lmol/L。
[0011] 所述紫外可見光多波長檢測器的檢測波長314nm。
[0012] 所述血液中草酸工作曲線和尿液中草酸工作曲線均在1.953?125 mg .171范圍 內(nèi),峰面積與草酸濃度呈線性關系,按照信噪比3/1,最低檢測濃度為0. 5 mg/L。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是: 本發(fā)明以鄰苯二胺為衍生劑,與尿液與血液中草酸反應,生成具有強紫外吸收化合 物--2, 3-二羥基喹喔啉,此衍生物在314nm有強吸收峰,且與草酸具有--對應的濃度 關系,草酸的保留時間為7. 2min,此峰高與濃度具有良好的線性關系,因而能準確測定人體 尿液與血液中草酸的含量。本發(fā)明方法簡單快速,數(shù)據(jù)準確可靠,為檢測草酸濃度提供了良 好的檢測手段。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014] 圖1是利用本發(fā)明的檢測方法所得尿液草酸標準液色譜圖; 圖2是利用本發(fā)明的檢測方法所得人體尿液中草酸色譜圖; 圖3是利用本發(fā)明的檢測方法所得血漿草酸標準液色譜圖; 圖4是利用本發(fā)明的檢測方法所得人體血漿中草酸色譜圖。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細說明: 一種反相-高效液相色譜測定人體血液和尿液中草酸濃度的方法,采用反相-高效液 相色譜衍生法,以鄰苯二胺為衍生劑,包括以下步驟: a.樣品預處理 ①血液預處理: 禁食12h后抽取上肢靜脈血3ml,加入肝素抗凝后,立即以2300r/min于4°C離心 lOmin,取上層血漿lml,向其中加入lml乙睛和50 μ 1 pH = 7.0的磷酸鹽緩沖液,混旋后再 以2000r/min離心15min,37°C的N2氣流將上層液中的乙睛蒸發(fā)掉,用去離子水補足液體至 lml ; pH = 7. 0的磷酸鹽緩沖液的配制:取磷酸二氫鉀0. 68g,加0. lmol/L氫氧化鈉溶液 29. lml,用水稀釋至100ml,即得。
[0016] ②尿液預處理: 收集24h尿液,按照尿液與濃鹽酸的體積比100 :1酸化尿液,酸化完成的尿液置于4°C 中備用; 濃鹽酸為市售質量分數(shù)為37. 5%的鹽酸。
[0017] b.樣品衍生處理 ① 血液衍生處理,取經(jīng)預處理的血漿上清液0. 5ml,于帶蓋離心管中,加入5 μ 1濃鹽 酸和0. 5ml 10g/L的鄰苯二胺標準液,旋緊蓋子于140°C加熱30min,室溫冷卻,用5mol/L NaOH溶液調節(jié)其pH值為5-6,再以2000r/min離心15min,離心后的上層清液經(jīng)0. 22 μ m微 孔濾膜過濾后,即可上機進行測定; ② 尿液衍生處理,取經(jīng)預處理的尿液lml,于帶蓋離心管中,加入5μ 1濃鹽酸和0. 5ml l〇g/L的鄰苯二胺標準液,旋緊蓋子于140°C加熱30min,室溫冷卻,用5mol/L NaOH溶液調 節(jié)其pH值為5-6,再以2300r/min離心15min,離心后的上層清液過0. 22 μ m微孔濾膜過濾 后,即可上機進行測定; c. 高效液相色譜操作條件 儀器:Aligent 1100型高效液相色譜儀; 色譜柱:150mmX 4. 6mm,5 μ m,Agilent XDBC18 ; 予頁柱:4. 6mmX 12. 5mm,5 μ m,Agilent Zorbax extend- C18 ; 流動相組成體積比:甲醇:醋酸胺水溶液=15:85 ; 其中醋酸胺水溶液的濃度為〇. lmol/L ; 流速:1. 2ml · mirT1 ; 檢測器:紫外可見光多波長檢測器,紫外檢測波長314nm ; 柱溫:26. 3°C ; 進樣量:50yL ; d. 草酸工作曲線的制備 ①血液中草酸工作曲線的制備,取正常人經(jīng)預處理的血漿8ml,用血漿制成濃度分別為 125 mg/L,62.5 mg/L,31.25 mg/L,15. 625 mg/L,7.813 mg/L,1.953mg/L 草酸溶液;對各個 濃度的草酸溶液和空白血漿進行衍生處理后,進行色譜分析; 以峰面積A對濃度C進行線性回歸,得工作曲線:A=12. 8289C+3. 239, r=0. 9995 ; 在1. 953?125 mg/L范圍內(nèi),峰面積與草酸濃度呈線性關系 按信噪比3/1得最低檢測濃度為0. 3 mg/L ; ②尿液中草酸工作曲線的制備 取正常人經(jīng)衍生處理的尿液,用尿液制成濃度分別為125mg/L,62. 5mg/L,31. 25mg/L, 15. 625mg/L,7. 813mg/L和1. 953 mg/L草酸溶液;對各個濃度的草酸溶液和空白尿液進行 衍生處理后,進行色譜分析; 以峰面積A對濃度C (mg/L)進行線性回歸,得工作曲線:A=11. 343C+56. 599, r=0. 9993 ; 在1. 953?125 mg/L范圍內(nèi),峰面積與草酸濃度呈線性關系; 按照信噪比3/1,最低檢測濃度為0. 5 mg/L; e.血液和尿液中草酸含量的測定 將經(jīng)過衍生處理的待測血液和尿液樣品上機測定,根據(jù)待測血液和尿液樣品的對應峰 面積由工作曲線計算出待測血液和尿液樣品中草酸的濃度。
[0018] 檢測結果: 一、色譜分離圖 (一)尿液中草酸色譜分離圖 分別對草酸標準液,人體尿液進行色譜分離,結果見附圖1和2。從圖中所示可知:草 酸的分離均能達到基線分離,而且尿樣中草酸的測定無明顯雜質干擾。草酸的保留時間為 7. 2min〇
[0019] (二)血液中草酸色譜分離圖 分別對草酸標準液,人體血漿進行色譜分離,見附圖3和4。從圖中所示可知:草酸的 分離均能達到基線分離,血中草酸的測定無明顯雜峰干擾,草酸的保留時間為7. 2min。
[0020] 二、精密度試驗 (一) 尿液中草酸精密度試驗 按樣本處理法操作,對尿樣本進行重復性實驗(η = 5),并經(jīng)統(tǒng)計學處理。結果顯示:樣 本測定重復性均較好,見表1. 表1尿液中草酸精密度實驗
【權利要求】
1. 一種反相-高效液相色譜對人體血液和尿液中草酸濃度的測定方法,其特征在于: 包括以下步驟: a. 樣品預處理 ① 血液預處理,禁食12h后上肢靜脈血3ml,加入肝素抗凝后,4°C離心,取上層血漿 lml,加入lml乙睛和50 μ 1 pH = 7. 0的磷酸鹽緩沖液,混旋,離心,37°C的N2氣流將上層 液中的乙睛蒸發(fā)掉,用去離子水補足液體至lml ; ② 尿液預處理,24h尿液與濃鹽酸按體積比100:1酸化尿液,置于4°C中備用; b. 樣品衍生處理 取經(jīng)預處理的血漿上清液0. 5ml,另取經(jīng)預處理的尿液lml,分別置于帶蓋離心管中進 行衍生處理,所述衍生處理是向離心管中加入5 μ 1濃鹽酸和0. 5ml 10g/L的鄰苯二胺標準 液,140°C加熱30min,室溫冷卻,用5mol/L NaOH溶液調節(jié)其pH值為5-6,離心后的上清液 經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過濾后,上機測定; c. 高效液相色譜操作條件 儀器:Aligent 1100型高效液相色譜儀;色譜柱:150_X4. 6_,5 μ m,Agilent XDBC18 ;予頁柱:4. 6mmX 12. 5mm, 5 μ m, Agilent Zorbax extend- C18 ; 流動相組成體積比:甲醇:醋酸胺水溶液=15:85 ;流速:1. 2ml ;檢測器:紫外可 見光多波長檢測器;柱溫:26. 3°C ;進樣量:50 μ L ;草酸的保留時間:7. 2min ; d. 草酸工作曲線的制備 取正常人經(jīng)預處理的血漿,另取正常人經(jīng)衍生處理的尿液,分別制成草酸血漿溶液 以及草酸尿溶液,濃度均分別為 125 mg/L,62.5 mg/L,31.25 mg/L,15.625 mg/L,7.813 mg/L,1.953mg/L;對各個濃度的草酸血漿溶液、草酸尿溶液、空白血漿、空白尿液進行衍 生處理后,進行色譜分析,以峰面積A對濃度C進行線性回歸,得血液中草酸工作曲線: A=12. 8289C+3. 239, r=0. 9995 ;尿液中草酸工作曲線:A=11. 343C+56. 599, r=0. 9993 ; e. 血液和尿液中草酸含量的測定 將經(jīng)過衍生處理的待測血液和尿液樣品上機測定,根據(jù)待測血液和尿液樣品的對應峰 面積由工作曲線計算出待測血液和尿液樣品中草酸的濃度。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種反相-高效液相色譜測定人體血液和尿液中草酸濃度的 方法,其特征在于:所述磷酸鹽選自磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀中 的一種或其混合物。
3. 根據(jù)權利要求1所述的一種反相-高效液相色譜測定人體血液和尿液中草酸濃度的 方法,其特征在于:所述血液和尿液樣品制備時是在2000-2300r/min離心10-15min條件下 進行的。
4. 根據(jù)權利要求1所述的一種反相-高效液相色譜測定人體血液和尿液中草酸濃度的 方法,其特征在于:所述步驟流動相中醋酸胺水溶液的濃度為0. lmol/L。
5. 根據(jù)權利要求1所述的一種反相-高效液相色譜測定人體血液和尿液中草酸濃度的 方法,其特征在于:所述紫外可見光多波長檢測器的檢測波長314nm。
6. 根據(jù)權利要求1所述的一種反相-高效液相色譜測定人體血液和尿液中草酸濃度 的方法,其特征在于:所述血液中草酸工作曲線和尿液中草酸工作曲線均在1. 953?125 mg · Γ1范圍內(nèi),峰面積與草酸濃度呈線性關系,按照信噪比3/1,最低檢測濃度為0. 5 mg/
【文檔編號】G01N30/89GK104101679SQ201410355066
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月24日 優(yōu)先權日:2014年7月24日
【發(fā)明者】劉宏勝, 徐新女, 吳勝群, 王玉亮, 王樹森, 劉濤 申請人:天津市第一中心醫(yī)院