一種電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種電化學(xué)免疫傳感器，其電極表面的中心有抗蘇氨酸磷酸裂合酶的抗體，所述抗體優(yōu)選單克隆抗體，所述傳感器優(yōu)選含有雙層納米金膜，其電極優(yōu)選玻碳電極，是以殼聚糖為橋聯(lián)劑固定第一層納米金于玻碳電極并吸附固定抗蘇氨酸磷酸裂合酶的抗體，以滴電極方式將硫堇-殼聚糖/納米金-辣根過氧化物酶(HRP)復(fù)合物固定于電極，并吸附抗蘇氨酸磷酸裂合酶的抗體，構(gòu)建雙層納米金修飾的蘇氨酸磷酸裂合酶電化學(xué)免疫傳感器。該傳感器可用于檢測食品中沙門氏菌和/或志賀氏菌，其靈敏度高，特異性強(qiáng)，能夠?qū)ι抽T氏菌和/或志賀氏菌實(shí)現(xiàn)快速定量檢測。
【專利說明】一種電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物免疫檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種電化學(xué)免疫傳感器及其制備 方法和應(yīng)用；優(yōu)選地，所述電化學(xué)免疫傳感器為蘇氨酸磷酸裂合酶雙層納米金膜電化學(xué)免 疫傳感器。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著單克隆抗體雜交瘤技術(shù)日益廣泛的應(yīng)用，需要對獲得的單克隆抗體（McAb) 進(jìn)行系統(tǒng)地分析鑒定，以確定其在各種免疫學(xué)試驗(yàn)中的價(jià)值。除了對McAb的免疫球蛋白鏈 理化性質(zhì)進(jìn)行分析外，測定McAb結(jié)合抗原的特異性、解離平衡常數(shù)KD、結(jié)合親和力K m及解 離速率常數(shù)Kdis對選擇合適的McAb用于某一特定目的十分重要。生物分子相互作用儀采 用生物薄膜干涉（Bio-Layer Interferometry，BLI)技術(shù)，無需標(biāo)記，具有高靈敏度、高通量 等特點(diǎn)，可以作為檢測抗原抗體之間親和力的工具。自2004年問世以來，在抗原與抗體互 作、小分子與蛋白互作、蛋白分子與蛋白分子互作及藥物篩選等方面發(fā)展迅速，受到越來越 多的關(guān)注。
[0003] 沙門氏菌（Salmonella)是一種可以引起沙門氏菌病的革蘭氏陰性菌，是最常見 的人畜共患型食源性致病菌之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在世界各國的種類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌 引起的食物中毒常列榜首。志賀氏菌（Shigella)也是一類具有高度傳染性的腸道致病菌。 根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)有1. 647億人感染痢疾，1. 1萬人死亡，其中多數(shù)為5歲以下的兒童。在成年 患者中，10?lOOcfu志賀氏菌就可通過感染腸道致病，引發(fā)炎癥反應(yīng)。目前，食品中沙門 氏菌的檢測方法仍采用傳統(tǒng)的國標(biāo)法GB4789. 4-2010,食品中志賀氏菌的檢測方法采用傳 統(tǒng)的國標(biāo)法GB4789. 5-2012,上述方法是目前世界各國普遍接受的標(biāo)準(zhǔn)方法，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確 可靠。但是由于菌種有上千種血清型，生化特性各異，使其檢驗(yàn)程序十分復(fù)雜繁瑣，由于檢 測時(shí)需要反復(fù)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，因此至少需要4?7d才可得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。近年來，國 內(nèi)外對于沙門氏菌、志賀氏菌的檢測有了一些新的進(jìn)展，主要為基于光學(xué)表面等離子共振 (Surface Plasmon Resonance，SPR)技術(shù)、生物薄膜干涉（BioLayer Interferometry，BLI) 技術(shù)、PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)和酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA)等的快速檢測方法。但PCR、SPR、 BLI儀器設(shè)備要求精度高、價(jià)格昂貴，不能實(shí)現(xiàn)在線檢測，且對試驗(yàn)操作人員要求嚴(yán)格；而 熒光標(biāo)記技術(shù)及ELISA只能進(jìn)行定性或半定量，再加上數(shù)據(jù)處理和加樣方式的限制，要實(shí) 現(xiàn)即時(shí)、準(zhǔn)確定量和在線檢測幾乎是不可能的。電化學(xué)分析具有不受樣品的濁度、顏色的影 響，所需設(shè)備儀器相對簡單的特點(diǎn)以及酶促反應(yīng)的高效性、免疫分析無需對樣品進(jìn)行純化、 富集等預(yù)處理的特點(diǎn)，可以較好成為沙門氏菌及志賀氏菌的檢測平臺(tái)。
[0004] 蘇氨酸憐酸裂合酶（phosphothreonine lyase)是以 SpvC(Salmonella plasmid virulence C)為代表的（包括Outer shigella protein F，OspF) -類新的酶效應(yīng)蛋白家 族，由沙門氏菌及志賀氏菌通過III型分泌系統(tǒng)特異性分泌，因此可以作為檢測兩種菌的標(biāo) 志物。當(dāng)它注入到宿主細(xì)胞后，不可逆滅活宿主絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，破壞宿主的先天免疫防線，導(dǎo)致的急性炎癥。研究發(fā)現(xiàn)在導(dǎo)致細(xì) 菌性痢疾的菌種都能通過III型分泌系統(tǒng)分泌SpvC。本發(fā)明擬以蘇氨酸磷酸裂合酶為抗原制 備抗-Spvc單克隆抗體，利用抗原抗體之間特異性結(jié)合作用檢測蘇氨酸磷酸裂合酶，從而 間接達(dá)到檢測沙門氏菌及志賀氏菌的目的；本發(fā)明擬通過BSI篩選出與抗原蛋白親和力更 強(qiáng)的抗-SpvC單克隆抗體株以用于免疫傳感器的制備。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為解決現(xiàn)有技術(shù)中所存在的缺陷，發(fā)明的一種靈敏度高、特異性 強(qiáng)、快速定量測定沙門氏菌及志賀氏菌的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種電化學(xué)免疫傳感器，所述傳感器的電極 表面的中心有抗蘇氨酸磷酸裂合酶的抗體。
[0007] 所述抗體為多克隆抗體。
[0008] 所述抗體為單克隆抗體。
[0009] 所述傳感器含有雙層納米金膜。
[0010] 所述電極為玻碳電極。
[0011] 所述傳感器以殼聚糖為橋聯(lián)劑固定第一層納米金于玻碳電極并吸附固定抗蘇氨 酸磷酸裂合酶的抗體。
[0012] 所述傳感器以滴電極方式將硫堇-殼聚糖/納米金-辣根過氧化物酶（HRP)復(fù)合 物固定于電極，并吸附抗蘇氨酸磷酸裂合酶的抗體，構(gòu)建雙層納米金修飾的蘇氨酸磷酸裂 合酶電化學(xué)免疫傳感器。
[0013] 一方面，本發(fā)明還提供所述的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，包括如下步驟：
[0014] 1)抗蘇氨酸磷酸裂合酶的抗體的制備；
[0015] 2)玻碳電極的預(yù)處理；
[0016] 3)納米金溶膠的制備；
[0017] 4)硫堇/殼聚糖（Thi/Chit)共聚物的制備；
[0018] 5)納米金吸附辣根過氧化物酶的制備；
[0019] 6)蘇氨酸磷酸裂合酶雙層納米金膜電化學(xué)免疫傳感器的制備。
[0020] 所述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。
[0021] 一方面，本發(fā)明還提供所述的電化學(xué)免疫傳感器檢測食品中沙門氏菌和/或志賀 氏菌的檢測方法。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0023] 本發(fā)明以殼聚糖為橋聯(lián)劑固定第一層納米金于玻碳電極并吸附固定抗蘇氨酸磷 酸裂合酶的抗體；以滴電極方式將硫堇-殼聚糖/納米金-辣根過氧化物酶（HRP)復(fù)合物 固定于上述電極，并吸附抗蘇氨酸磷酸裂合酶的抗體（所述抗體優(yōu)選單克隆抗體），構(gòu)建了 雙層納米金修飾的蘇氨酸磷酸裂合酶電化學(xué)免疫傳感器，于此形成的良好的信號(hào)放大系統(tǒng) 使其靈敏度高，特異性強(qiáng)，能夠?qū)ι抽T氏菌和/或志賀氏菌實(shí)現(xiàn)快速定量檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明的納米金溶膠電鏡照片，左上角標(biāo)尺為50nm，右上角標(biāo)尺為20nm，左 下角標(biāo)尺為l〇nm，右下角標(biāo)尺為5nm。
[0025] 圖2為本發(fā)明的蘇氨酸磷酸裂合酶雙層納米金膜電化學(xué)免疫傳感器的制備示意 圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0027] 實(shí)施例1傳感器的制備
[0028] 1、抗蘇氨酸磷酸裂合酶單克隆抗體株的篩選
[0029] 首先，采用常規(guī)單克隆抗體制備方法，將來源于沙門氏菌的SpvC蛋白抗原注射 Balb/C小鼠，得到單克隆抗體株，再腹腔注射Balb/C小鼠，純化腹水即得抗蘇氨酸磷酸裂 合酶單克隆抗體。
[0030] 然后，進(jìn)行抗蘇氨酸磷酸裂合酶單克隆抗體株的篩選：采用美國ForteBio公司 生產(chǎn)的生物分子相互作用儀Octet Red96進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)：取五只Protein A傳感器A3、B3、 C3、D3、E3,五個(gè)濃度梯度蘇氨酸磷酸裂合酶蛋白抗原與之一一對應(yīng)，濃度分別是：4μΜ， 1. 33 μ Μ，0· 44 μ Μ，0· 1481 μ Μ，0 μ Μ。所用五株 SpvC 單克隆抗體分別為：Α2-Ε2 (1. 129 μ Μ); Α3-Ε3(0·91μΜ) ;Α4-Ε4(0·91μΜ) ;Α5-Ε5(1·755μΜ) ;Α6-Ε6(1μΜ)結(jié)果如下表。
[0031] 表1不同抗體株的解離平衡常數(shù)、結(jié)合常數(shù)和解離常數(shù)
[0032]

【權(quán)利要求】
1. 一種電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于，所述傳感器的電極表面的中心有抗蘇氨酸磷 酸裂合酶的抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于，所述抗體為多克隆抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于，所述抗體為單克隆抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于，所述傳感器含有 雙層納米金膜。
5. 根據(jù)前述任一項(xiàng)的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于，其電極為玻碳電極。
6. 根據(jù)前述任一項(xiàng)的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于，以殼聚糖為橋聯(lián)劑固定第一層 納米金于玻碳電極并吸附固定抗蘇氨酸磷酸裂合酶的抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于，以滴電極方式將硫堇-殼聚糖/ 納米金-辣根過氧化物酶（HRP)復(fù)合物固定于電極，并吸附抗蘇氨酸磷酸裂合酶的抗體，構(gòu) 建雙層納米金修飾的蘇氨酸磷酸裂合酶電化學(xué)免疫傳感器。
8. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，包括如下步驟： 1) 抗蘇氨酸磷酸裂合酶的抗體的制備； 2) 玻碳電極的預(yù)處理； 3) 納米金溶|父的制備； 4) 硫堇/殼聚糖（Thi/Chit)共聚物的制備； 5) 納米金吸附辣根過氧化物酶的制備； 6) 蘇氨酸磷酸裂合酶雙層納米金膜電化學(xué)免疫傳感器的制備。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的制備方法，其中，所述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。
10. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的電化學(xué)免疫傳感器檢測食品中沙門氏菌和/或志賀氏 菌的檢測方法，其特征在于，將所述傳感器用于檢測食品。
【文檔編號(hào)】G01N27/26GK104089997SQ201410233971
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】龐廣昌, 魯丁強(qiáng), 耿利華 申請人:北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司