本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測腸道屏障功能的試劑盒，更具體地說，涉及一種檢測血液中D-乳酸、二胺氧化酶和細菌內(nèi)毒素的試劑盒。

背景技術(shù)：
腸道屏障功能障礙主要表現(xiàn)為腸黏膜屏障受損、腸微生態(tài)紊亂和腸道動力障礙。腸屏障功能障礙是各種原因引起的腸黏膜損傷、萎縮，腸通透性增加，腸菌群失調(diào)，從而導致細菌和(或)內(nèi)毒素易位，并可誘發(fā)和(或)加重全身炎癥反應和多器官功能障礙。腸屏障功能障礙對危重疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸有重要影響。腸屏障功能障礙在危重病患者中較常見，但目前尚缺乏較為客觀的臨床診斷標準與統(tǒng)一的治療方案。腸粘膜屏障是指腸道能防止腸腔內(nèi)的有害物質(zhì)如細菌和毒素穿過腸粘膜進入體內(nèi)其他組織器官和血液循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能的總和。它包括：腸粘膜上皮、腸粘液、腸道菌群、分泌性免疫球蛋白、腸道相關(guān)淋巴組織(Gut-associatedlymphoidtissue，GALT)、膽鹽、激素和胃酸等。腸道粘膜時常受到各種刺激性物質(zhì)和損傷性因素的攻擊和侵蝕，但在正常情況下腸粘膜仍能有效地發(fā)揮分泌、吸收等生理功能，并保持其結(jié)構(gòu)的完整性。但是，在嚴重燒傷、創(chuàng)傷、手術(shù)等應激狀態(tài)下，上述腸粘膜屏障作用受到破壞，可出現(xiàn)腸粘膜水腫，腸絨毛高度降低，腸系膜血管收縮，血流減少，細胞凋亡加速，嚴重者甚至造成細菌和毒素移位發(fā)展成為腸源性敗血癥，并可導致多臟器功能衰竭(MOF)而危及生命。通?？梢酝ㄟ^檢測腸道通透性、腸粘膜的損傷情況以及細菌是否易位等來檢測腸道屏障功能是否發(fā)生障礙。在臨床上，通常可用各種核素標記腸道不吸收的大分子物質(zhì)(如DTPA或EDTA等)，通過檢測尿中核素標記物的排泄量來確定腸道通透性是否增高；以非代謝性的低聚糖為探針的腸道通透性檢測方法在臨床最為常用，其中又以乳果糖/甘露醇雙糖分子探針為代表和最常用，尿中兩者比值增高表明腸道通透性增高，粘膜機構(gòu)屏障功能受損。但是此種方法操作繁瑣，同時需要病人服用相應的不易吸收的物質(zhì)，而且需要相應的檢測儀器，在臨床上較難推廣。細菌易位常用的診斷方法有細菌培養(yǎng)，通常是在無菌條件下取腸系膜淋巴結(jié)等進行細菌培養(yǎng),培養(yǎng)到細菌即為陽性，但是此種方法有相當大的創(chuàng)傷性，難以在臨床上開展。目前，在臨床上急需一種簡便、快捷的方法來迅速對住院病人的腸道屏障功能是否發(fā)生障礙做出較為全面準確的判斷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種腸道屏障功能的檢測試劑盒。本試劑盒中的三項指標中D-乳酸代表腸道通透性的變化，二胺氧化酶代表腸黏膜的損傷程度，細菌內(nèi)毒素代表腸道是否發(fā)生細菌易位。本試劑盒將三項指標綜合在一起測定，分別從三個方面綜合而且全面的反映了腸道的屏障功能。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種檢測腸道屏障功能的試劑盒，其包括：1)反應裝置所述反應裝置包括血漿分離器和反應基板，反應基板包含空白對照孔、二胺氧化酶反應孔、D-乳酸反應孔和細菌內(nèi)毒素反應孔；2)一種或多種顯色液；3)一種或多種稀釋液。前述試劑盒，所述的血漿分離器每個孔內(nèi)設有血漿分離膜。前述試劑盒，所述的空白對照孔內(nèi)放有空白墊。前述試劑盒，所述的二胺氧化酶反應孔從孔底部起依次放有底物墊和顯色墊。其中，所述底物墊由底物溶液滴加在載體上制備而成；所述的底物溶液以100-1000mmol/LpH6.0-8.0的緩沖液為溶劑，包括0.0001-0.01g/mL的二胺氧化酶底物、10-10000U/mL的過氧化物酶、0.005％-50％的穩(wěn)定劑和0.005％-50％的表面活性劑；其中，所述底物為腐胺、組胺、尸胺或者氨基丁烯，優(yōu)選所述底物為腐胺和尸胺；其中，所述100-1000mmol/LpH6.0-8.0的緩沖液為磷酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液、Tris-HCl緩沖液或PIPES緩沖液的一種或幾種，優(yōu)選所述緩沖液為600-800mmol/LpH6.5-7.0的磷酸鈉和磷酸鉀緩沖液；其中，所述穩(wěn)定劑為D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β-環(huán)糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、聚乙二醇、明膠、肌醇、木糖或阿拉伯糖醇中的一種或幾種，優(yōu)選所述穩(wěn)定劑為D-海藻糖；其中，所述表面活性劑為吐溫80、吐溫20、TritonX-100、NP40或山梨醇中的一種或多種，優(yōu)選所述表面活性劑為吐溫80。其中，所述顯色液以水為溶劑，包括0.00001-10mg/mL的顯色劑和0.01-100g/L穩(wěn)定劑；優(yōu)選所述顯色液包括1-5mg/mL的顯色劑和10-20g/L穩(wěn)定劑；所述顯色劑為3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、鄰聯(lián)茴香胺、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物(MBTH)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N,N-雙(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二鈉鹽、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲基氨基)-二苯胺鈉鹽(DA-64)、10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-雙(二甲基氨基)吩噻嗪鈉鹽(DA-67)或10-乙酰基-3,7-二羥基吩惡嗪(AmplifluRed)中的一種或多種，優(yōu)選所述顯色劑為TOOS、DA-67和AmplifluRed；所述穩(wěn)定劑為D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β-環(huán)糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、聚乙二醇、明膠、肌醇、木糖、阿拉伯糖醇、馬來酸、酒石酸或者檸檬酸中的一種或多種，優(yōu)選所述穩(wěn)定劑為蔗糖和D-海藻糖。前述試劑盒，所述的D-乳酸反應孔從孔底部起依次放有酶墊和顯色劑墊。所述酶墊由酶液滴加在載體上制備而成；所述的酶液以水為溶劑，包括10-1000U/mL的D-乳酸脫氫酶，5-500mmol/LpH6.0-9.0的緩沖液，0.005％-50％的穩(wěn)定劑；其中，所述5-500mmol/LpH6.0-9.0的緩沖液為磷酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液、Tris-HCl緩沖液或PIPES緩沖液中的一種或多種，優(yōu)選所述的緩沖液為200-300mmol/LpH8.0-9.0的Tris-HCl和PIPES緩沖液；其中，所述酶穩(wěn)定劑為D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β-環(huán)糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、聚乙二醇、明膠、肌醇、木糖或阿拉伯糖醇中的一種或多種；優(yōu)選所述的酶穩(wěn)定劑為牛血清白蛋白和肌醇。其中，所述顯色劑墊由顯色液滴加在載體上制備而成；所述的顯色液以水為溶劑，包括0.01-10mmol/L的氧化型輔酶、0.01-100mmol/L的電子傳遞體、0.1-100mg/mL的顯色劑和0.005％-50％的穩(wěn)定劑；其中，所述氧化型輔酶為NAD、NADP、thio-NAD或thio-NADP中的一種或多種；優(yōu)選所述氧化型輔酶為NAD；所述電子傳遞體為黃遞酶或者N-甲基吩嗪硫酸鹽(PMS)；所述顯色劑為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、碘硝基四唑紫(INT)、3,3'-[1-(苯氨?；?-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉(XTT)或氯化硝基四氮唑藍(NBT)的一種或幾種；優(yōu)選所述顯色劑為MTT；所述穩(wěn)定劑為D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β-環(huán)糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、聚乙二醇、明膠、肌醇、木糖或阿拉伯糖醇中的一種或幾種；優(yōu)選所述穩(wěn)定劑為牛血清白蛋白和肌醇。前述試劑盒，所述細菌內(nèi)毒素反應孔放有底物墊；所述底物墊由底物溶液滴加在載體上制備而成；所述的底物溶液以水為溶劑，包括0.02-20mg/mL的底物、0.01-10mol/LpH6.0-9.0的緩沖液、0.1-10％的激活劑和0.005％-50％的穩(wěn)定劑；其中，所述底物為甘氨酰-L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、精氨酰-精氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、甘氨酰-精氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、精氨酰-精氨酸-β-萘胺、甘氨酰-L-脯氨酸-β-萘胺、亮氨酰-甘氨酸-4-甲氧基-β-萘胺的一種或多種；優(yōu)選所述底物為精氨酰-精氨酸-4-甲氧基-β-萘胺；所述緩沖液為磷酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液、Tris-HCl緩沖液或PIPES緩沖液中的一種或多種；所述激活劑為K+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Li+、Na+、Co2+、TritonX-100、吐溫20或吐溫80中的一種或多種，優(yōu)選所述激活劑為TritonX-100；所述穩(wěn)定劑為D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β-環(huán)糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、聚乙二醇、明膠、肌醇、木糖或阿拉伯糖醇中的一種或多種，優(yōu)選為D-海藻糖和牛血清白蛋白。前述試劑盒，所述載體為濾紙、玻璃纖維或者層析紙。前述試劑盒，所述顯色液以水為溶劑，包括0.00001-10mg/mL的顯色劑和0.01-100mmol/L穩(wěn)定劑；其中，所述顯色劑為固藍B、固紅B、固藍BB和固藍RR、固紫B、對二甲基肉桂醛中的一種或多種，優(yōu)選所述顯色劑為固藍B和固紫B；其中，所述穩(wěn)定劑為D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β-環(huán)糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、聚乙二醇、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、K+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Li+、Na+、Co2+、明膠、肌醇、木糖、阿拉伯糖醇、馬來酸、酒石酸或者檸檬酸中的一種或多種，優(yōu)選所述穩(wěn)定劑為Zn2+。前述的試劑盒，所述稀釋液以水為溶劑，包括0.00001-10mg/mL的激活劑和pH6.0-9.0、0.01-100mmol/L緩沖液；其中，所述激活劑為乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、K+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Li+、Na+、Co2+、TritonX-100、吐溫20或吐溫80中的一種或多種，優(yōu)選為Mn2+；所述緩沖液為磷酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液、Tris-HCl緩沖液或PIPES緩沖液；優(yōu)選為PIPES緩沖液。前述的試劑盒，所述顯色劑墊、酶墊和底物墊的載體均為濾紙、玻璃纖維或者層析紙。本發(fā)明將酶液、顯色液和各種底物液滴加在載體上制備成相應地反應墊，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，考慮到試劑盒保存的需要，所制備的反應墊必須具備相當高的穩(wěn)定性，發(fā)明人在大量實驗研究的基礎上，確定了上述酶液、顯色液和各種底物液的組成及其配方，使得試劑盒具有理想的穩(wěn)定性，能夠在實際應用中推廣。本發(fā)明中，D-乳酸指標用來衡量腸道通透性的變化，如果D-乳酸濃度≥5μg/mL，則表示腸道的通透性增加；二胺氧化酶指標用來衡量腸粘膜是否受損，如果二胺氧化酶濃度≥10U/L，則表示腸粘膜已經(jīng)受損，隨著酶活性的逐漸升高，腸粘膜的損傷程度越來越嚴重；細菌內(nèi)毒素指標用來衡量細菌是否發(fā)生易位，如果細菌內(nèi)毒素濃度≥5U/L，則表示有可能已經(jīng)發(fā)生了細菌易位，隨著酶活性的增加，細菌易位的程度逐漸加深?；谶@些研究結(jié)果，本發(fā)明建立了一種簡便、快速的腸道屏障功能的測定試劑盒，包括D-乳酸濃度的檢測、二胺氧化酶和細菌內(nèi)毒素活性的檢測。采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明的優(yōu)點在于：1.腸道屏障功能檢測試劑盒通過對血液中D-乳酸濃度的測定以及對二胺氧化酶和細菌內(nèi)毒素活性的測定，從腸道通透性的變化、腸黏膜的損傷程度和腸道是否發(fā)生細菌易位三個方面綜合而且全面的反映了腸道的屏障功能，從而直接檢測出被檢測者腸道屏障功能是否發(fā)生障礙，指導合理的臨床用藥，該方法操作簡便快速，準確性高，適用于臨床常規(guī)檢測特別是臨床病人床旁檢測使用。2.具有自動分離血漿的功能。本試劑盒不需要真空采血管，只采用末梢血做樣本，不用儀器設備，操作簡便，可在醫(yī)院急診室、基層醫(yī)療與保健單位及病人家庭使用，尤其適合于醫(yī)院的床旁快速檢測。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1腸道屏障功能檢測試劑盒的制備本實施例提供腸道屏障功能檢測試劑盒的制備，制備方法如下：1)反應基板的制備：反應基板優(yōu)選但并不限于由ABS工程塑料制成，其上設有空白對照孔、二胺氧化酶反應孔、D-乳酸反應孔和細菌內(nèi)毒素反應孔，在每個反應孔中填入下述相應的反應墊；空白對照孔和反應孔的尺寸可為優(yōu)選2)血漿分離器的制備：血漿分離器中血漿分離膜的結(jié)構(gòu)為現(xiàn)有技術(shù)習用的即可，本發(fā)明對此不作特別限定，將全血滴加在血漿分離膜上，實現(xiàn)血清和紅細胞的分離。3)二胺氧化酶反應孔中底物墊的制備：底物溶液：底物0.1g；過氧化物酶100單位；穩(wěn)定劑0.005％；表面活性劑0.01％；100mmol/LpH7.0的Tris-HCl緩沖液10mL；將底物溶液1μL滴加在層析紙上，避光條件下，25℃流動空氣干燥4小時后，密封保存在2-8℃。顯色液：顯色劑10mg；穩(wěn)定劑2mg；蒸餾水10mL；將顯色溶液1μL滴加在層析紙上，避光條件下，25℃流動空氣干燥4小時后，密封保存在2-8℃。4)D-乳酸反應孔中酶墊和顯色劑墊的制備：酶墊的制備：酶液：D-乳酸脫氫酶10000單位；穩(wěn)定劑1％；100mmol/LpH8.0的磷酸緩沖液10mL；將1μL酶液滴加在層析紙上，避光條件下，25℃流動空氣干燥4小時后，密封保存在2-8℃。顯色劑墊的制備：顯色液：顯色劑1000mg；氧化型輔酶10mmol/L；電子傳遞體0.01mmol/L；穩(wěn)定劑5％；蒸餾水10mL；將1μL顯色液滴加在層析紙上，避光條件下，25℃流動空氣干燥4小時后，密封保存在2-8℃。5)細菌內(nèi)毒素反應孔中底物墊的制備：底物溶液：底物200mg；激活劑0.01mmol/L；穩(wěn)定劑1％；10mmol/LpH8.0的Tris-HCl緩沖液10mL；將底物溶液1μL滴加在層析紙上，避光條件下，25℃流動空氣干燥4小時后，密封保存在2-8℃。6)將2)～5)制備的反應墊填入相應的反應孔中，用沖壓機壓實，然后裝上帶有血漿分離膜的血漿分離器，裝入鋁箔袋中，即得反應裝置。7)顯色液的制備：顯色劑10g；穩(wěn)定劑0.01mmol/L；蒸餾水1000mL；充分混勻后，分裝在深色瓶中保存或進行凍干保存。8)稀釋液的制備穩(wěn)定劑2％；2mmol/LpH7.5Tris-HCl緩沖液1000mL；充分混勻后，分裝在深色瓶中保存或進行凍干保存。實施例2腸道屏障功能檢測試劑盒的使用方法本實施例提供腸道屏障功能檢測試劑盒的使用方法，具體為：用采血針從指尖采取微量全血后，直接加到裝置的血漿分離器內(nèi)，全血經(jīng)血漿分離膜分離后，血清到達裝置的各反應孔，在二胺氧化酶和D乳酸反應孔內(nèi)加入一滴(約10μL)稀釋液，在細菌內(nèi)毒素反應孔內(nèi)加入一滴(約10μL)顯色液。將反應裝置放在干化學檢測儀器上面反應15min。通過干化學分析儀進行定量判讀，可以定量得到被測物濃度。實施例3腸道屏障功能檢測試劑盒的應用本試劑盒是提供一種腸道屏障功能的檢測試劑盒，對臨床上病人的血液樣本進行檢測，檢查病人的腸道屏障功能是否發(fā)生障礙，以輔助病人進行腸道屏障功能的重建。試劑盒的具體使用方法如下：1)在使用時，首先將試劑盒從2℃～8℃取出，平衡到室溫開始使用。2)撕掉鋁箔包裝，取出反應裝置。3)用采血管從指尖采取全血，直接加到裝置的每個反應孔的血液進樣孔內(nèi)；如果樣品為血清或血漿，則需將血漿分離裝置撕掉，在每個反應孔加入4μL樣品即可。4)靜置片刻待血全部滲入后揭去血漿分離器。5)在二胺氧化酶和乳酸孔中加入10μL稀釋液，在細菌內(nèi)毒素孔加入10μL顯色液。6)將反應裝置放在JY-DLT腸道屏障檢測儀的反應孔內(nèi)反應15min，待儀器發(fā)出報警聲后，將反應裝置從反應孔內(nèi)取出，放入檢測孔，即可打印或上傳檢測結(jié)果。如果檢測結(jié)果符合二胺氧化酶≤10U/L，D-乳酸≤15mg/L，細菌內(nèi)毒素≤20U/L，則認為此人腸道屏障功能良好，其余情況則認為腸道屏障功能發(fā)生障礙。