對細胞進行原位標記的方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種對細胞進行原位標記的方法，包括如下步驟：（1）制備含有膽堿類似物的細胞培養(yǎng)液；（2）對細胞進行原位標記。本發(fā)明提供的對細胞進行原位標記的方法先采用含有膽堿類似物的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，然后用報告分子追蹤標記在細胞上的膽堿類似物。本發(fā)明利用膽堿類似物上標記的疊氮與報告分子上標記的二苯并環(huán)丁烯之間的特異性反應對細胞進行原位標記，該方法簡單易行，不僅能夠快速、高靈敏高分辨率地對細胞膜、細胞器膜上的膽堿類似物進行定位和示蹤，而且對細胞毒性低，且對細胞形態(tài)、細胞活性以及存活率影響小。此外，本發(fā)明提供了一種膽堿類似物在制備細胞原位檢測試劑盒中的應用。
【專利說明】對細胞進行原位標記的方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體涉及對細胞進行原位標記的方法和應用。
【背景技術】
[0002]膽堿(Cho)是細胞膜結構和脂蛋白構成上的重要組成部分。在真核生物中，磷脂頭端最普遍的基團是膽堿，含磷脂膽堿是細胞膜中最豐富的磷脂，也是細胞膜的主要結構成分，在細胞代謝和信號傳導中起著至關重要的作用Adrian Salic課題組利用膽堿在細胞中的代謝途徑，通過對膽堿的末端修飾炔基，并用帶疊氮的染料通過click銅催化對細胞內膽堿的代謝行為進行示蹤分析。然而，在該方法采用的疊氮-炔基Husigen [3+3]環(huán)加成反應需要銅作為催化劑，催化劑銅的存在會引起細胞的毒性，因而在活細胞乃至活體的應用中受到很大的限制。
[0003]因此，有必要提供一種對細胞毒性低、影響小的細胞原位示蹤方法。

【發(fā)明內容】

[0004]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種對細胞進行原位標記的方法和應用。
[0005]本發(fā)明提供的對細胞進行原位標記的方法采用疊氮修飾的膽堿與報告分子之間反應對細胞進行原位標記，該方法對細胞毒性低，且對細胞形態(tài)、細胞活性以及存活率影響小，能夠快速、高靈敏高分辨率地對細胞膜上的膽堿類似物進行定位和示蹤。
[0006]第一方面，本發(fā)明提供了一種對細胞進行原位標記的方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0007](I)制備含有膽堿類似物的細胞培養(yǎng)液
[0008]提供不含血清的細胞培養(yǎng)液，加入膽堿類似物至所述膽堿類似物的終濃度為100μΜ~1000 μ Μ，其中，所述膽堿類似物的結構式如Pl所示:
[0009]
【權利要求】
1.一種對細胞進行原位標記的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)制備含有膽堿類似物的細胞培養(yǎng)液 提供不含血清的細胞培養(yǎng)液，加入膽堿類似物至所述膽堿類似物的終濃度為100μΜ~1000 μ Μ，其中，所述膽堿類似物的結構式如Pl所示:
2.如權利要求1所述的對細胞進行原位標記的方法，其特征在于，所述待標記細胞為人類胚腎細胞、人乳腺癌細胞、人肺腺癌細胞或人卵巢癌細胞。
3.如權利要求1所述的對細胞進行原位標記的方法，其特征在于，所述采用不含血清的細胞培養(yǎng)液重懸細胞至細胞終濃度為I X IO5~I X 107/ul。
4.如權利要求1所述的對細胞進行原位標記的方法，其特征在于，所述報告分子與細胞進行孵育的條件為:加入報告分子至所述報告分子的終濃度為100μΜ~ΙΟΟΟμΜ，孵育的時間為10~40分鐘。
5.如權利要求1所述的對細胞進行原位標記的方法，其特征在于，所述報告分子與細胞進行孵育后，采用PBS緩沖液洗滌細胞2~4次。
6.如權利要求1所述的對細胞進行原位標記的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，對所述染料分子為熒光素、羅丹明、菁染料分子、二苯乙烯、萘酰亞胺、香豆素類、吖啶類或芘類。
7.如權利要求6所述的對細胞進行原位標記的方法，其特征在于，所述熒光素為異硫氰酸熒光素、羥基熒光素或四氯熒光素。
8.如權利要求6所述的對細胞進行原位標記的方法，其特征在于，所述羅丹明為羅丹明101、四乙基羅丹明或羧基四甲基羅丹明。
9.如權利要求6所述的對細胞進行原位標記的方法，其特征在于，所述菁染料分子為噻唑橙、噁唑橙、或多甲川系列菁染料。
10.如權利要求1所述的膽堿類似物在制備細胞原位檢測試劑盒中的應用，其中，所述細胞為人類胚腎細胞、人乳腺癌細胞、人肺腺癌細胞或人卵巢癌細胞，所述膽堿類似的結構式如Pl所示:
【文檔編號】G01N33/52GK103983764SQ201410154914
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月17日 優(yōu)先權日:2014年4月17日
【發(fā)明者】蔡林濤, 劉宏, 潘正銀, 張鵬飛, 李文軍, 潘宏, 馬軼凡 申請人:深圳先進技術研究院