一種中華鱉胚胎期性腺的連續(xù)石蠟切片制作方法及其在性別判定中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種中華鱉胚胎期性腺的連續(xù)石蠟切片制作方法及其在性別判定中的應(yīng)用，包括①樣品固定、②性腺染色、③脫水與透明程序、④透蠟和包埋、⑤切片和展片、⑥染色與封片，其特征在于：在所述步驟②中，對性腺先進(jìn)行染色；在所述步驟⑤中，采用水浴和高溫石蠟進(jìn)行兩次展片，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：性腺在進(jìn)行包埋處理前先進(jìn)行染色，多個個體的性腺同時包埋在一個蠟塊中，并通過連續(xù)組織切片的形式進(jìn)行判定，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明的操作簡單，即可以快速準(zhǔn)確地對中華鱉胚胎期性別比例進(jìn)行統(tǒng)計，便于推廣應(yīng)用。
【專利說明】一種中華鱉胚胎期性腺的連續(xù)石蠟切片制作方法及其在性
別判定中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種連續(xù)石蠟切片的制作方法及其應(yīng)用，尤其涉及一種中華鱉胚胎期性腺的石蠟切片制作方法以及在胚胎性別判定中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]中華鳘(Pelodiscus sinensis),又稱甲魚、王八、水魚、元魚、團(tuán)魚、腳魚和老鳘，隸屬脊椎動物亞門(Vertebtata)、爬行綱(Reptilia)、龜鳘目(Chelonia)、鳘科(Trionychidae),廣泛分布于我國除寧夏、新疆、青海及西藏外的其它各省，以長江流域和華南地區(qū)為多見，是我國養(yǎng)殖最廣泛的水生爬行動物，具有重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價值；國外分布于日本、朝鮮和越南。而關(guān)于爬行動物的胚胎發(fā)育，不同孵化條件和激素處理會影響中華鱉的性腺分化和發(fā)育。由于中華鱉屬變溫動物，實驗證實，適于鱉胚胎發(fā)育的溫度范圍是(23?35) V，最適宜的溫度范圍是(31?33) V，低于22°C胚胎發(fā)育停止，高于34°C孵化率降低，37°C為致死溫度，在適于鱉胚發(fā)育的溫度范圍內(nèi)，隨孵化溫度的升高發(fā)育速度加快，孵化周期縮短。有關(guān)研究表明，在(32±0.5) °C溫度下孵化鱉卵，自孵化開始，至最初的原始生殖細(xì)胞開始遷移、生殖嵴形成、性腺開始分化、精巢或卵巢形成，分別需要孵化至第3、5、16和22天。在胚胎期、出殼7天的稚鱉和I齡幼鱉的精巢與卵巢，外形上難以區(qū)別，均呈短細(xì)管狀，只有從生殖導(dǎo)管與生殖腺的位置關(guān)系，才能區(qū)分精巢和卵巢。
[0003]從以上分析可知，在不經(jīng)過長時間飼養(yǎng)的前提下，通過解剖學(xué)方法進(jìn)行中華鱉性別判定存在著較大困難。因此，本發(fā)明開發(fā)了一種適合于中華鱉胚胎期性別判定的連續(xù)切片技術(shù)。通過抽取一定的樣本數(shù)，該技術(shù)快速準(zhǔn)確的判定胚胎期的性別，而不需要在孵化后進(jìn)行長期的飼養(yǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種簡單易行的中華鱉胚胎期性腺的連續(xù)石蠟切片制作方法。
[0005]本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種使用該連續(xù)石蠟切片方法在胚胎性別判定中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種中華鱉胚胎期性腺的連續(xù)石蠟切片制作方法，包括①樣品固定、②性腺染色、③脫水與透明程序、④透蠟和包埋、⑤切片和展片、⑥染色與封片，其特征在于:在所述步驟②中，對性腺先進(jìn)行染色；在所述步驟⑤中，分別采用水浴和高溫石蠟進(jìn)行兩次展片，先加入0.3mL?1.0mL40°C?50°C的去離子水，切片開始在水膜張力的作用下伸展，在第一次展片結(jié)束后吸干水分放入65°C?85°C的烘箱中，在高溫環(huán)境下石蠟溶解，切片在液態(tài)石蠟的環(huán)境中進(jìn)行第二次展片。該高溫環(huán)境指65 V?85 °C的環(huán)境。
[0007]所述步驟①?⑥的具體處理如下:[0008]①樣品固定:收集中華鱉胚胎發(fā)育中后期胚胎的性腺-中腎-腎上腺的復(fù)合體，將取出的復(fù)合體立即投入到固定液中固定，固定0.5h~24h之后轉(zhuǎn)移到50~80%酒精溶液中保存；
[0009]②性腺染色:將步驟①中收集到的中華鱉性腺先進(jìn)行伊紅染色處理，伊紅染色時間為2min~4min，伊紅染色結(jié)束后用50%~95%酒精沖洗干凈；
[0010]③脫水與透明程序:將步驟②的中華鱉性腺用梯度乙醇脫水；先后采用80%乙醇浸泡Imin~60min、90%乙醇浸泡30s~SOmirulOO1^乙醇浸泡Imin~60min ;然后用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理20s~40min,再用二甲苯浸泡處理20s~40min,使之透明；
[0011]④透臘和包埋:用體積比為1:1的二甲苯:石臘過渡處理30s~IOmin,56°C~62°C熔點的石蠟，65~85°C透蠟20min~40min，透蠟2次；將脫水透蠟后的性腺組織進(jìn)行包埋；
[0012]⑤切片和展片:用切片機(jī)做連續(xù)切片，切片厚度控制在4μπι~15 μ m，連續(xù)切片按照順序貼于載玻片上，裱片后經(jīng)過水浴和石蠟兩次展片把組織展平。該連續(xù)切片的步驟具體為:連續(xù)切片按照順序先擺放整齊，之后在載玻片上按照次序進(jìn)行裱片；在載玻片上加入40°C~50°C的去離子水進(jìn)行水浴展片，之后吸干水分，放入65°C~85°C的烘箱中，進(jìn)行第二次石蠟展片；經(jīng)過兩次展片，石蠟化為液體時對組織的空間阻礙消失，因此二次展片的效果更好。
[0013]⑥染色與封片:染色采用伊紅-蘇木精復(fù)染方法，其中用蘇木精染色I(xiàn)Os~5min，伊紅染色5s~5min ;然后用中性樹膠封片。
[0014]在進(jìn)行所述步驟⑥染色之前還進(jìn)行脫蠟復(fù)水，其中脫蠟步驟具體為:先用二甲苯浸泡Imin~15min,再用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理Imin~3min ;復(fù)水步驟具體為:先后采用100%乙醇浸泡30s~30min、90%乙醇浸泡30s~30min、70%乙醇浸泡30s~30min、50%乙醇浸泡30s~30min、最后用流水沖洗。
[0015]其中，所述的蘇木精染液配方為:lg蘇木精溶于IOOmL無水乙醇中，20g明礬溶于200mL蒸餾水中，兩液混合，加熱沸騰3min，稍冷卻加入0.51g氧化汞，溶解后即得到蘇木精染液。
[0016]所述的伊紅染液為1%的伊紅溶液，用70%乙醇溶解。即該伊紅染液配方可以為:Ig伊紅溶于99mL70%乙醇中。
[0017]所述步驟①固定液可以選取4%的多聚甲醛、福爾馬林或波恩氏液的一種。
[0018]本發(fā)明還提供一種使用該連續(xù)石蠟切片方法在胚胎性別判定中的應(yīng)用。
[0019]通過觀察按照上述制備方法制得的連續(xù)石蠟切片，該胚胎性別判定的判斷標(biāo)準(zhǔn)為:雌性中華鱉性腺皮質(zhì)層發(fā)育明顯，外形略顯不規(guī)則，可見大量的空泡狀結(jié)構(gòu)；雄性中華鱉性腺髓質(zhì)層發(fā)育明顯，外形飽滿而規(guī)則，內(nèi)部曲細(xì)精管發(fā)育可見大量連續(xù)成帶狀的結(jié)構(gòu)。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0021]1、由于胚胎性腺顏色略透明，在組織透明處理后往往不易觀察。在進(jìn)行包埋處理前先進(jìn)行染色，便于后期的操作和觀察，不易丟失樣品；
[0022] 2、多個個體的性腺同時包埋在一個蠟塊中，并通過連續(xù)組織切片的形式進(jìn)行判定，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確和高效；[0023]3、由于連續(xù)組織切片中各個切片的位置受到石蠟位置的影響而不能全部展開，在用水進(jìn)行展片后再用石蠟高溫進(jìn)行展片，能使組織周圍的石蠟熔化，解除了石蠟對組織的空間阻力，組織受到的空間束縛也同時被解除，確保了切片制作的質(zhì)量；
[0024]4、在胚胎發(fā)育的中后期(孵化積溫達(dá)到17000度時以后)，即可對孵化的群體進(jìn)行性別比例判定，而不需孵化后長期飼養(yǎng)，降低了實驗的成本且縮短了實驗的周期；
[0025]5、本發(fā)明操作簡單，毋需增加專門的儀器，即可以快速準(zhǔn)確地對中華鱉胚胎期性別比例進(jìn)行統(tǒng)計，便于推廣應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明實施例1中入孵24天時雄性性腺切片；
[0027]圖2為本發(fā)明實施例1中入孵24天時雌性性腺切片；
[0028]圖3為本發(fā)明實施例2中入孵31天時雄性性腺切片；[0029]圖4為本發(fā)明實施例2中入孵31天時雌性性腺切片；
[0030]圖5為本發(fā)明實施例3中出殼I天時雄性性腺切片；
[0031]圖6為本發(fā)明實施例3中出殼I天時雌性性腺切片。
【具體實施方式】
[0032]以下通過結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0033]首先配制蘇木精染液、伊紅染液和福爾馬林、波恩氏固定液。
[0034]蘇木精染液:先稱取鉀明礬20g溶于200mL蒸餾水中，邊加熱邊攪拌，再稱取蘇木精1.0g溶于IOmL無水乙醇，邊加熱邊攪拌，待鉀明礬和蘇木素溶解后，混和二溶液，加熱至沸騰(89°C~91°C )，然后稱取0.51g HgO緩緩加入沸騰的混合液中，邊加入邊攪拌使溶解，以防產(chǎn)生大量氣泡，最后待溶解后使其稍降溫置于冷水中，有少許HgO結(jié)晶，使用前濾紙過濾，避光保存。
[0035]伊紅酒精染液:將Ig伊紅溶于99mL70%的乙醇中即得到伊紅染液。
[0036]福爾馬林溶液:量取甲醛lOOmL，加入磷酸二氫鈉6.5g，溶解后加蒸餾水補(bǔ)足1000mL0
[0037]波恩氏液:苦味酸飽和水溶液液75mL，甲醛(37%~40% ) 25mL,冰醋酸5mL，混合。
[0038]4%多聚甲醛:按IOOmL配比為:多聚甲醛4g，0.1M PBS (pH=7.4) 80mL，加熱至60°C水浴溶解，邊攪拌邊滴加IM Na0H2mL溶液至澄清，之后添加IM HC12mL左右，調(diào)節(jié)pH值后(?!1=7.2~7.4)，定容為lOOmL。(現(xiàn)用現(xiàn)配以防多聚甲醛聚合)
[0039]另外，本發(fā)明適合的性別比判定時間在孵化積溫達(dá)到17000度時以后，也就是在正常孵化溫度(31~33) °〇下，入孵23天之后。
[0040]實施例1
[0041]①樣品固定:在入孵24天后收集孵化溫度為33°C中華鱉胚胎100枚，剪開腹腔后取出性腺-中腎-腎上腺的復(fù)合體，需要注意的是中華鱉兩側(cè)性腺只需要取出一側(cè)即可，將取出的復(fù)合體立即投入到4%的多聚甲醛固定液中固定，固定3h之后轉(zhuǎn)移到70%酒精溶液中保存；
[0042]②性腺染色:將步驟①中收集到的中華鱉性腺先進(jìn)行伊紅染色處理，伊紅染色時間為2min，伊紅染色結(jié)束后用80%酒精沖洗干凈；
[0043]③脫水與透明程序:將步驟②的中華鱉性腺用梯度乙醇脫水；先后采用80%乙醇浸泡20min、90%乙醇浸泡20min、100%乙醇浸泡IOmin ;然后用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理IOmin,再用二甲苯浸泡處理IOmin,使之透明；
[0044]④透蠟和包埋:用體積比為1:1的二甲苯:石蠟過渡處理10min，60°C熔點的石蠟，65°C透蠟30min，透蠟2次；將脫水透蠟后的性腺組織進(jìn)行包埋，每個蠟塊包埋5個性腺；
[0045]⑤切片和展片:用切片機(jī)做連續(xù)切片，切片厚度控制在10 μ m，連續(xù)切片按照順序貼于載玻片上，裱片后經(jīng)過水浴和石蠟兩次展片把組織展平。該連續(xù)切片的步驟具體為:連續(xù)切片按照順序先擺放整齊，之后在載玻片上按照次序進(jìn)行裱片；在載玻片上加入1.0mL50°C的去離子水進(jìn)行水浴展片，之后吸干水分，放入85°C的烘箱中，進(jìn)行第二次石蠟展片；
[0046]⑥脫蠟、復(fù)水、染色與封片:脫蠟步驟具體為:先用二甲苯浸泡3min，再用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理3min ;復(fù)水步驟具體為:先后采用100%乙醇浸泡IOmin,90%乙醇浸泡10min、70%乙醇浸泡20min、50%乙醇浸泡20min、最后用流水沖洗；染色采用伊紅-蘇木精復(fù)染方法，其中用蘇木精染色1.5min，伊紅染色I(xiàn)Os ;然后用中性樹膠封片，在載玻片上均勻滴加3滴樹膠，輕壓蓋玻片趕出樹膠內(nèi)氣泡。應(yīng)注意壓片時用力要均勻，不宜用力過大，以免壓壞蓋玻片或使樣品移位。
[0047]⑦觀察、拍照與統(tǒng)計:待樣片風(fēng)干后用刀片刮去多余的樹膠進(jìn)行觀察和根據(jù)中華鱉雌雄性腺的特點，分別進(jìn)行個體統(tǒng)計。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)為100倍。在統(tǒng)計的過程中，左右手分別拿一個血細(xì)胞計數(shù)器，左手記錄雄性樣本數(shù)，右手記錄雌性樣本數(shù)。在載玻片上自上而下觀察每排性腺組織的變化，而統(tǒng)計的判斷標(biāo)準(zhǔn)為:雌性中華鱉性腺皮質(zhì)層發(fā)育明顯，外形略顯不規(guī)則，可見大量的空泡狀結(jié)構(gòu)；雄性中華鱉性腺髓質(zhì)層發(fā)育明顯，外形飽滿而規(guī)則，內(nèi)部曲細(xì)精管發(fā)育可見大量連續(xù)成帶狀的結(jié)構(gòu)。
[0048]該性腺皮質(zhì)層石蠟切片清晰、對比度大、觀察方便，當(dāng)找到所包埋樣品數(shù)量時即可停止，然后進(jìn)入下一個蠟塊連續(xù)切片的統(tǒng)計。采用該方法可以快速準(zhǔn)確地對中華鱉胚胎期性別判定，同時對其比例進(jìn)行統(tǒng)計。
[0049]⑧觀察結(jié)果:表明在孵化溫度為33°C時，雄性的比例為56%，雌性的比例為44%。
[0050]實施例2
[0051]①樣品固定:在入孵31天后收集孵化溫度為32°C中華鱉胚胎100枚，剪開腹腔后取出性腺-中腎-腎上腺的復(fù)合體，需要注意的是中華鱉兩側(cè)性腺只需要取出一側(cè)即可，將取出的復(fù)合體立即投入到福爾馬林固定液中固定，固定24h之后轉(zhuǎn)移到80%酒精溶液中保存；
[0052]②性腺染色:將步驟①中收集到的中華鱉性腺先進(jìn)行伊紅染色處理，伊紅染色時間為2min，伊紅染色結(jié)束后用70%酒精沖洗干凈；
[0053]③脫水與透明程序:將步驟②的中華鱉性腺用梯度乙醇脫水；先后采用80%乙醇浸泡40min、90%乙醇浸泡30min、100%乙醇浸泡20min ;然后用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理20min,再用二甲苯浸泡處理20min,使之透明；
[0054]④透蠟和包埋:用體積比為1:1的二甲苯:石蠟過渡處理10min，58°C熔點的石蠟，70°C透蠟20min，透蠟2次；將脫水透蠟后的性腺組織進(jìn)行包埋，每個蠟塊包埋5個性腺；[0055]⑤切片和展片:用切片機(jī)做連續(xù)切片，切片厚度控制在12 μ m，連續(xù)切片按照順序貼于載玻片上，裱片后經(jīng)過水浴和石蠟兩次展片把組織展平；該連續(xù)切片的步驟具體為:連續(xù)切片按照順序先擺放整齊，之后在載玻片上按照次序進(jìn)行裱片；在載玻片上加入
1.0mL40°C的去離子水進(jìn)行水浴展片，之后吸干水分，放入80°C的烘箱中，進(jìn)行第二次石蠟展片；
[0056]⑥脫蠟、復(fù)水、染色與封片:脫蠟步驟具體為:先用二甲苯浸泡5min，再用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理2min ;復(fù)水步驟具體為:先后采用100%乙醇浸泡20min、90%乙醇浸泡20min、70%乙醇浸泡30min、50%乙醇浸泡30min、最后用流水沖洗；染色采用伊紅-蘇木精復(fù)染方法，其中用蘇木精染色2min，伊紅染色I(xiàn)min ;然后用中性樹膠封片，在載玻片上均勻滴加3滴樹膠，輕壓蓋玻片趕出樹膠內(nèi)氣泡。應(yīng)注意壓片時用力要均勻，不宜用力過大，以免壓壞蓋玻片或使樣品移位。
[0057]⑦觀察、拍照與統(tǒng)計:待樣片風(fēng)干后用刀片刮去多余的樹膠進(jìn)行觀察和根據(jù)中華鱉雌雄性腺的特點，分別進(jìn)行個體統(tǒng)計。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)為100倍。在統(tǒng)計的過程中，左右手分別拿一個血細(xì)胞計數(shù)器，左手記錄雄性樣本數(shù)，右手記錄雌性樣本數(shù)。在載玻片上自上而下觀察每排性腺組織的變化，采用該方法可以快速準(zhǔn)確地對中華鱉胚胎期性別進(jìn)行判定，同時對其比例進(jìn)行統(tǒng)計，而統(tǒng)計的判斷標(biāo)準(zhǔn)為如同實施I采用的標(biāo)準(zhǔn)。
[0058]⑧觀察結(jié)果:表明在孵化溫度為32°C時，雄性的比例為55%，雌性的比例為45%。
[0059]實施例3
[0060]①樣品固定:在出殼后I天收集孵化溫度為31°C中華鱉胚胎100枚，剪開腹腔后取出性腺-中腎-腎上腺的復(fù)合體，需要注意的是中華鱉兩側(cè)性腺只需要取出一側(cè)即可，將取出的復(fù)合體立即投入到波恩氏固定液中固定，固定12h之后轉(zhuǎn)移到75%酒精溶液中保存；
[0061]②性腺染色:將步驟①中收集到的中華鱉性腺先進(jìn)行伊紅染色處理，伊紅染色時間為3min，伊紅染色結(jié)束后用90%酒精沖洗干凈；
[0062]③脫水與透明程序:將步驟②的中華鱉性腺用梯度乙醇脫水；先后采用80%乙醇浸泡50min、90%乙醇浸泡15min、100%乙醇浸泡30min ;然后用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理30min,再用二甲苯浸泡處理30min,使之透明；
[0063]④透蠟和包埋:用體積比為1:1的二甲苯:石蠟過渡處理5min，62°C熔點的石蠟，85°C透蠟40min，透蠟2次；將脫水透蠟后的性腺組織進(jìn)行包埋；
[0064]⑤切片和展片:用切片機(jī)做連續(xù)切片，切片厚度控制在8 μ m，連續(xù)切片按照順序貼于載玻片上，裱片后經(jīng)過水浴和石蠟兩次展片把組織展平；該連續(xù)切片的步驟具體為:連續(xù)切片按照順序先擺放整齊，之后在載玻片上按照次序進(jìn)行裱片；在載玻片上加入
0.8mL45°C的去離子水進(jìn)行水浴展片，之后吸干水分，放入75°C的烘箱中，進(jìn)行第二次石蠟展片；
[0065]⑥脫蠟、復(fù)水、染色與封片:脫蠟步驟具體為:先用二甲苯浸泡6min，再用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理2.5min ;復(fù)水步驟具體為:先后采用100%乙醇浸泡15min、90%乙醇浸泡15min、70%乙醇浸泡10min、50%乙醇浸泡lOmin、最后用流水沖洗；染色采用伊紅-蘇木精復(fù)染方法，其中用蘇木精染色4min，伊紅染色2min ;然后用中性樹膠封片，在載玻片上均勻滴加3滴樹膠，輕壓蓋玻片趕出樹膠內(nèi)氣泡。應(yīng)注意壓片時用力要均勻，不宜用力過大，以免壓壞蓋玻片或使樣品移位。
[0066]⑦觀察、拍照與統(tǒng)計:待樣片風(fēng)干后用刀片刮去多余的樹膠進(jìn)行觀察和根據(jù)中華鱉雌雄性腺的特點，分別進(jìn)行個體統(tǒng)計。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)為100倍。在統(tǒng)計的過程中，左右手分別拿一個血細(xì)胞計數(shù)器，左手記錄雄性樣本數(shù)，右手記錄雌性樣本數(shù)。在載玻片上自上而下觀察每排性腺組織的變化，采用該方法可以快速準(zhǔn)確地對中華鱉胚胎期性別進(jìn)行判定，同時對其比例進(jìn)行統(tǒng)計，而統(tǒng)計的判斷標(biāo)準(zhǔn)為如同實施I采用的標(biāo)準(zhǔn)。
[0067]⑧觀察結(jié)果:表明在孵化溫度為31 °C時，雄性的比例為53%，雌性的比例為47%。
【權(quán)利要求】
1.一種中華鱉胚胎期性腺的連續(xù)石蠟切片制作方法，包括①樣品固定、②性腺染色、③脫水與透明程序、④透蠟和包埋、⑤切片和展片、⑥染色與封片，其特征在于:在所述步驟②中，對性腺先進(jìn)行染色；在所述步驟⑤中，分別采用水浴和高溫石蠟進(jìn)行兩次展片，先加入0.3mL?1.0mL40°C?50°C的去離子水，切片開始在水膜張力的作用下伸展，在第一次展片結(jié)束后吸干水分后放入65°C?85°C的烘箱中，在高溫環(huán)境下石蠟溶解，切片在液態(tài)石蠟的環(huán)境中進(jìn)行第二次展片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中華鱉胚胎期性腺的連續(xù)石蠟切片制作方法，其特征在于:所述步驟①?⑥的具體處理如下: ①樣品固定:收集中華鱉胚胎發(fā)育中后期胚胎的性腺-中腎-腎上腺的復(fù)合體，將取出的復(fù)合體立即投入到固定液中固定，固定0.5h?24h之后轉(zhuǎn)移到50?80%酒精溶液中保存； ②性腺染色:將步驟①中收集到的中華鱉性腺先進(jìn)行伊紅染色處理，伊紅染色時間為2min?4min，伊紅染色結(jié)束后用50%?95%酒精沖洗干凈； ③脫水與透明程序:將步驟②的中華鱉性腺用梯度乙醇脫水；先后采用80%乙醇浸泡Imin?60min、90%乙醇浸泡30s?30min、100%乙醇浸泡Imin?60min ;然后用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理20s?40min,再用二甲苯浸泡處理20s?40min,使之透明； ④透蠟和包埋:用體積比為1:1的二甲苯:石蠟過渡處理30s?10min，56°C?62°C熔點的石蠟，65?85°C透蠟20min?40min，透蠟2次；將脫水透蠟后的性腺組織進(jìn)行包埋； ⑤切片和展片:用切片機(jī)做連續(xù)切片，切片厚度控制在4μπι?15μ m，連續(xù)切片按照順序貼于載玻片上，裱片后經(jīng)過水浴和石蠟兩次展片把組織展平； ⑥染色與封片:染色采用伊紅-蘇木精復(fù)染方法，其中用蘇木精染色I(xiàn)Os?5min，伊紅染色5s?5min ;然后用中性樹膠封片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中華鱉胚胎期性腺的連續(xù)石蠟切片制作方法，其特征在于:在進(jìn)行所述步驟⑥染色之前還進(jìn)行脫蠟復(fù)水，其中脫蠟步驟具體為:先用二甲苯浸泡Imin?15min,再用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理Imin?3min ;復(fù)水步驟具體為:先后采用100%乙醇浸泡30s?30min、90%乙醇浸泡30s?30min、70%乙醇浸泡30s?30min、50%乙醇浸泡30s?30min、最后用流水沖洗。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中華鱉胚胎期性腺的連續(xù)石蠟切片制作方法，其特征在于:所述的蘇木精染液配方為:lg蘇木精溶于IOOmL無水乙醇中，20g明礬溶于200mL蒸餾水中，兩液混合，加熱沸騰3min，稍冷卻加入0.51g氧化汞，溶解后即得到蘇木精染液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中華鱉胚胎期性腺的連續(xù)石蠟切片制作方法，其特征在于:所述的伊紅染液為I %的伊紅溶液，用70%乙醇溶解。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中華鱉胚胎期性腺的連續(xù)石蠟切片制作方法，其特征在于:所述步驟①固定液為4%的多聚甲醛、福爾馬林或波恩氏液。
7.一種使用如權(quán)利要求1所述的制作方法在性別判定中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N1/28GK103940647SQ201410132534
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】王偉, 錢國英, 李彩燕, 宋偉, 汪財生, 尹尚軍, 樸龍斗 申請人:浙江萬里學(xué)院