一種中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，包括①樣品固定、②脫水與透明程序、③透蠟和包埋、④切片和展片、⑤染色與封片，其特征在于：將步驟①中的樣品包埋于經(jīng)固定液預(yù)處理的豆制品中，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：將豆制品可以作為中華鱉胚胎期性腺組織的預(yù)包埋材料，其來源廣泛且成本很低，經(jīng)過預(yù)包埋后，胚胎期性腺可以被很好地包裹在豆制品中，不影響后續(xù)的組織包埋和切片，本發(fā)明避免了傳統(tǒng)方法的不足，特別是避免了中華鱉早期性腺組織小不容易操作和觀察的缺點(diǎn)；另外，由于預(yù)包埋性腺的位置固定并且可以一次處理多個性腺組織，這樣有利于大規(guī)模進(jìn)行切片制作和分析，也特別適合于針對不同個體進(jìn)行的研究。
【專利說明】一種中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種石蠟切片的制作方法，尤其涉及一種中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法。
【背景技術(shù)】
[0002]爬行動物的原始生殖細(xì)胞，經(jīng)過分化、遷移進(jìn)入生殖嵴或原始性腺分化成生殖細(xì)胞，而原始生殖細(xì)胞的起源要追溯到胚胎早期發(fā)育階段，不同動物原始生殖細(xì)胞進(jìn)入生殖嵴的遷移方式不同，在生殖嵴(生殖腺原基)發(fā)生時，原始生殖細(xì)胞在生殖嵴中進(jìn)行分化，原始生殖細(xì)胞在遷移過程中不斷分裂增殖，隨胎齡增長，性別發(fā)生分化，生殖嵴分化為雄性的睪丸或雌性的卵巢，原始生殖細(xì)胞形成精子或卵子。
[0003]中華鳘(Pelodiscus sinensis),又稱甲魚、王八、水魚、元魚、團(tuán)魚、腳魚和老鳘，隸屬脊椎動物亞門(Vertebtata)、爬行綱(Reptilia)、龜鳘目(Chelonia)、鳘科(Trionychidae),廣泛分布于我國除寧夏、新疆、青海及西藏外的其它各省，以長江流域和華南地區(qū)為多見，是我國養(yǎng)殖最廣泛的水生爬行動物，具有重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價值；國外分布于日本、朝鮮和越南。中華鱉營養(yǎng)豐富，肉味鮮美，又是珍貴的藥材，其成分含動物膠、角蛋白、維生素D及碘等，具有滋陰清熱，平肝益腎、破結(jié)軟堅(jiān)及消淤功能。鱉頭、甲、肉、膽、血等可入藥。研究中華鱉原始生殖細(xì)胞的起源、遷移以及性腺分化發(fā)育的機(jī)制，可為中華鱉的生產(chǎn)活動尤其是雄性化苗種選育提供可靠的理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。
[0004]但是，由于中華鱉自孵化開始，至最初的原始生殖細(xì)胞開始遷移、生殖嵴形成、性腺開始分化、精巢或卵巢形成，分別需要孵化至第3、5、16和22天。在胚胎期以及出殼后3月之內(nèi)，雌性和雄性性腺在外形上非常相似，難以用肉眼來判斷。因此，用組織學(xué)方法就成為了一種簡單而可靠的研究手段。另外，中華鱉胚胎早期性腺分化和性別決定的機(jī)理研究還少有報道。因此，通過常規(guī)石蠟組織切片的方法為詳盡研究中華鱉胚胎早期性腺分化和性別決定提供了可靠的條件。但由于中華鱉早期性腺體積微小，采用傳統(tǒng)的石蠟切片操作過程中，通常會出現(xiàn)如下問題:(1)性腺組織顏色淺，在組織透明后更加不易被觀察到，很容易丟失；(2)操作過程中容易使性腺損傷，從而破壞了性腺的完整性；(3)性腺組織體積小，不容易操作。為了解決這些問題，就需要對傳統(tǒng)的石蠟切片技術(shù)作進(jìn)一步的改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種方法簡單易行并能夠最大程度地保持性腺的完整性的中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法。
[0006]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，包括①樣品固定、②脫水與透明程序、③透蠟和包埋、④切片和展片、⑤染色與封片，其特征在于:將步驟①中的樣品包埋于經(jīng)固定液預(yù)處理的豆制品中。
[0007]具體地，所述豆制品的預(yù)處理包括如下步驟:先將豆制品進(jìn)行切塊處理，切成厚度為3mm?2cm的方型平板狀,然后再切成截面積為0.5cm2?6cm2的細(xì)條,用固定液固定6h~96h后在0.1%~10%的鹽酸溶液中浸泡0.5h~96h,最后在流水中沖洗后浸泡于50%~80%的酒精溶液中。
[0008]進(jìn)一步地,所述步驟①~⑤的具體處理如下:
[0009]①樣品固定:收集中華鱉胚胎發(fā)育中后期胚胎的性腺-中腎-腎上腺的復(fù)合體，將取出的復(fù)合體立即投入到固定液中固定，固定0.5h~24h之后轉(zhuǎn)移到50%~80%酒精溶液中保存；
[0010]②脫水與透明程序:將步驟①的中華鱉性腺預(yù)包埋于經(jīng)固定液預(yù)處理的豆制品中并用梯度乙醇脫水；先后米用70%乙醇浸泡Imin~60min、80%乙醇浸泡Imin~60min、90%乙醇浸泡30s~SOmiru lOO1^乙醇浸泡Imin~60min ;然后用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理20s~40min,再用二甲苯浸泡處理20s~40min,使之透明；
[0011]③透臘和包埋:用體積比為1:1的二甲苯:石臘過渡處理30s~IOmin, 56°C~70°C熔點(diǎn)的石蠟透蠟20min~40min，2次；將脫水透蠟后的組織樣品進(jìn)行包埋；
[0012]④切片和烤片:用切片機(jī)切片，切片厚度控制在4μπι~1511111，經(jīng)351:~451:水浴中進(jìn)行展片，載玻片撈片后放置于35°C~40°C烤片機(jī)上進(jìn)行烤片固定；
[0013]⑤染色與封片:染色采用伊紅-蘇木精復(fù)染方法，其中用蘇木精染色I(xiàn)Os~5min伊紅染色5s~5min ;然后用中性樹膠封片。
[0014]在進(jìn)行所述步驟⑤染色之前還進(jìn)行脫蠟復(fù)水，其中脫蠟步驟具體為:先用二甲苯浸泡Imin~15min,再用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理Imin~3min ;復(fù)水步驟具體為:先后采用100%乙醇浸泡30s~30min、90%乙醇浸泡30s~30min、70%乙醇浸泡30s~30min、50%乙醇浸泡30s~30min、最后用流水沖洗。
[0015]進(jìn)一步地，所述的蘇木精染液配方為:lg蘇木精溶于IOOmL無水乙醇中，20g明礬溶于200mL蒸餾水中，兩液混合，加熱沸騰3min，稍冷卻加入0.51g氧化汞，溶解后即得到蘇木精染液。
[0016]進(jìn)一步地，所述的伊紅染液為I %的伊紅溶液，用70%乙醇溶解。
[0017]進(jìn)一步地，所述步驟①固定液為4%的多聚甲醛、福爾馬林或波恩氏液。
[0018]作為優(yōu)選，所述豆制品為硬度較高的豆腐或素雞。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:將豆制品作為中華鱉胚胎早期性腺組織的預(yù)包埋材料，其來源廣泛且成本很低，經(jīng)過預(yù)包埋后，胚胎早期性腺可以被很好地包裹在豆制品中，不影響后續(xù)的組織包埋和切片。本發(fā)明避免了傳統(tǒng)方法的不足，特別是避免了中華鱉早期性腺組織小不容易操作和觀察的缺點(diǎn)；另外，由于預(yù)包埋性腺的位置固定并且可以一次處理多個性腺組織，這樣有利于大規(guī)模進(jìn)行切片制作和分析，也特別適合于針對不同個體進(jìn)行的研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中包埋于豆腐中的中華鱉性腺的圖片；
[0021]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中性腺組織被完整地包埋進(jìn)豆腐中的切片；
[0022]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中豆腐中的一個孔穴和在該孔穴性腺組織的切片；
[0023]圖4為圖3中央部分的局部放大圖；
[0024]圖5為圖4中央部分的放大圖；[0025]圖6為本發(fā)明實(shí)施例1中豆腐基質(zhì)的HE染色圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下通過結(jié)合附圖、序列表及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0027]首先配制蘇木精染液、伊紅染液和福爾馬林、波恩氏固定液。
[0028]蘇木精染液:先稱取鉀明礬20g溶于200mL蒸餾水中，邊加熱邊攪拌，再稱取蘇木精1.0g溶于IOmL無水乙醇，邊加熱邊攪拌，待鉀明礬和蘇木素溶解后，混和二溶液，加熱至沸騰(89-91°C)，然后稱取0.51g HgO緩緩加入沸騰的混合液中，邊加入邊攪拌使溶解，以防產(chǎn)生大量氣泡，最后待溶解后使其稍降溫置于冷水中，有少許HgO結(jié)晶，使用前濾紙過濾，避光保存。
[0029]伊紅酒精染液:將Ig伊紅溶于99mL70%的乙醇中即得到伊紅染液。
[0030]福爾馬林溶液:量取甲醛lOOmL，加入磷酸二氫鈉6.5g，溶解后加蒸餾水補(bǔ)足IOOOmL0
[0031 ] 波恩氏液:苦味酸飽和水溶液液75mL，甲醛(37%?40% ) 25mL,冰醋酸5mL，混合。
[0032]4%多聚甲醛:按IOOmL配比為:多聚甲醛4g，0.1M PBS (pH=7.4) 80mL，加熱至60°C水浴溶解，邊攪拌邊滴加IM Na0H2mL溶液至澄清，之后添加IM HC12mL左右，調(diào)節(jié)pH值后定容為lOOmL。(現(xiàn)用現(xiàn)配以防多聚甲醛聚合)
[0033]實(shí)施例1
[0034]1、豆制品的預(yù)處理和固定
[0035]豆制品采用硬度較高的豆腐，大塊豆腐先進(jìn)行切塊處理，切成厚度為Icm的方型平板狀，之后再切成截面積大約Icm2的細(xì)條，輕輕交叉堆疊放置于可密封塑料盒中。用4%的多聚甲醛固定液固定6h，之后在1%的鹽酸溶液中浸泡0.5h，在流水中沖洗后浸泡于70%的酒精溶液中。
[0036]2、成型和打孔
[0037]把預(yù)處理好的條狀豆制品切成合適的厚度，用硬質(zhì)毛細(xì)管進(jìn)行打孔處理，其中孔的大小可以用不同直徑和形狀的毛細(xì)管或管狀物進(jìn)行控制，管壁不要追求切割的圓滑，不規(guī)則的形狀有利于后期對性腺的固定。
[0038]3、中華鱉胚胎期性腺的分離和預(yù)包埋
[0039]取中華鱉胚胎，用眼科剪刀打開腹腔后，用鑷子取出“性腺-中腎-腎上腺”復(fù)合物，在組織固定5h后置于70%酒精溶液中短期存放，用裝上洗耳球的毛細(xì)管穿過打孔后的豆制品，在擠壓洗耳球后，吸取性腺組織，之后把毛細(xì)管向后回抽。性腺組織在通過孔穴時受到孔壁的擠壓，此時釋放性腺組織。這樣性腺組織就被包埋進(jìn)豆制品中。在組織的投放中，注意性腺擺放的方向和深淺，盡量保證性腺所處的位置一致(如圖1)，圖1為包埋于豆腐中的中華鱉性腺，從圖1我們可以看到性腺組織可以被完整地包埋進(jìn)豆制品中。
[0040]4、石蠟組織切片的制作和觀察
[0041]①脫水與透明程序:將包埋于豆腐中的中華鱉性腺用梯度乙醇脫水；先后采用70%乙醇浸泡20min、80%乙醇浸泡20min、90%乙醇浸泡lOmin、100%乙醇浸泡IOmin ;然后用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理20min,再用二甲苯浸泡處理20min,使之透明；[0042] ②透蠟和包埋:用體積比為1:1的二甲苯:石蠟過渡處理30s，60°C熔點(diǎn)的石蠟透蠟20min，2次；將脫水透蠟后的組織樣品進(jìn)行包埋；
[0043]③切片和烤片:用切片機(jī)切片，切片厚度控制在1(^!11，經(jīng)401:水浴中進(jìn)行展片，載玻片撈片后放置于35°C烤片機(jī)上進(jìn)行烤片固定；
[0044]④脫蠟復(fù)水:先用二甲苯浸泡3min，再用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理2min ;復(fù)水步驟具體為:先后采用100%乙醇浸泡10min、90%乙醇浸泡10min、70%乙醇浸泡10min、50%乙醇浸泡lOmin、最后用流水沖洗。
[0045]⑤染色、封片與觀察:染色采用伊紅-蘇木精復(fù)染方法，其中用蘇木精染色2min伊紅染色3min;然后用中性樹膠封片，封片時輕壓蓋玻片趕出樹膠內(nèi)氣泡，注意壓片時用力要均勻，不宜用力過大，以免壓壞蓋玻片或使樣品移位，影響觀察，待樣片風(fēng)干后用刀片刮去多余的樹膠。染色后的結(jié)果見圖2~6所示，從圖2~6我們可以看到性腺組織的切片組織保持完整，并且從圖6可以看出豆腐的染色背景均一。
[0046]實(shí)施例2
[0047]1、豆制品的預(yù)處理和固定
[0048]豆制品采用硬度較高的素雞，大塊素雞先進(jìn)行切塊處理，切成厚度為2cm的方型平板狀，之后再切成截面積大約2cm2的細(xì)條，輕輕交叉堆疊放置于可密封塑料盒中。用福爾馬林固定液固定24h，之后在7%的鹽酸溶液中浸泡5h。在流水中沖洗后浸泡于80%的酒精溶液中。
[0049]2、成型和打孔
[0050]把預(yù)處理好的條狀豆制品切成合適的厚度，用硬質(zhì)毛細(xì)管進(jìn)行打孔處理，其中孔的大小可以用不同直徑和形狀的毛細(xì)管或管狀物進(jìn)行控制，管壁不要追求切割的圓滑，不規(guī)則的形狀有利于后期對性腺的固定。
[0051]3、中華鱉胚胎期性腺的分離和預(yù)包埋
[0052]取中華鱉胚胎，用眼科剪刀打開腹腔后，用鑷子取出“性腺-中腎-腎上腺”復(fù)合物，在組織固定IOh后置于80%酒精溶液中短期存放，用裝上洗耳球的毛細(xì)管穿過打孔后的豆制品，在擠壓洗耳球后，吸取性腺組織，之后把毛細(xì)管向后回抽。性腺組織在通過孔穴時受到孔壁的擠壓，此時釋放性腺組織。這樣性腺組織就被包埋進(jìn)豆制品中。在組織的投放中，注意性腺擺放的方向和深淺，盡量保證性腺所處的位置一致。
[0053]4、石蠟組織切片的制作和觀察
[0054]①脫水與透明程序:將包埋于素雞中的中華鱉性腺用梯度乙醇脫水；先后采用70%乙醇浸泡30min、80%乙醇浸泡30min、90%乙醇浸泡20min、100%乙醇浸泡20min ;然后用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理30min,再用二甲苯浸泡處理30min,使之透明；
[0055]②透蠟和包埋:用體積比為1:1的二甲苯:石蠟過渡處理10min，70°C熔點(diǎn)的石蠟透蠟40min，2次；將脫水透蠟后的組織樣品進(jìn)行包埋；
[0056]③切片和烤片:用切片機(jī)切片，切片厚度控制在6 μ m，經(jīng)37°C水浴中進(jìn)行展片，展平后用載玻片撈片，然后放置于40°C烤片機(jī)上進(jìn)行烤片固定；
[0057]④脫蠟復(fù)水:先用二甲苯浸泡3min，再用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理3min ;復(fù)水步驟具體為:先后采用100%乙醇浸泡20min、90%乙醇浸泡20min、70%乙醇浸泡20min、50%乙醇浸泡20min、最后用流水沖洗。
[0058]⑤染色、封片與觀察:染色采用伊紅-蘇木精復(fù)染方法，其中用蘇木精染色3min伊紅染色2min;然后用中性樹膠封片，封片時輕壓蓋玻片趕出樹膠內(nèi)氣泡，注意壓片時用力要均勻，不宜用力過大，以免壓壞蓋玻片或使樣品移位，影響觀察，待樣片風(fēng)干后用刀片刮去多余的樹膠。
[0059]實(shí)施例3
[0060]在豆制品的預(yù)處理和固定的步驟中用波恩氏液固定，其余步驟與實(shí)施例1相同。
【權(quán)利要求】
1.一種中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，包括①樣品固定、②脫水與透明程序、③透蠟和包埋、④切片和展片、⑤染色與封片，其特征在于:將步驟①中的樣品包埋于經(jīng)固定液預(yù)處理的豆制品中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，其特征在于:所述豆制品的預(yù)處理包括如下步驟:先將豆制品進(jìn)行切塊處理，切成厚度為3mm?2cm的方型平板狀，然后再切成截面積為0.5cm2?6cm2的細(xì)條,用固定液固定6h?96h后在0.1%?10%的鹽酸溶液中浸泡0.5h?96h，最后在流水中沖洗后浸泡于50%?80%的酒精溶液中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，其特征在于:所述步驟①?⑤的具體處理如下: ①樣品固定:收集中華鱉胚胎發(fā)育中后期胚胎的性腺-中腎-腎上腺的復(fù)合體，將取出的復(fù)合體立即投入到固定液中固定，固定0.5h?24h之后轉(zhuǎn)移到50?80%酒精溶液中保存； ②脫水與透明程序:將步驟①的中華鱉性腺預(yù)包埋于經(jīng)固定液預(yù)處理的豆制品中并用梯度乙醇脫水；先后米用70%乙醇浸泡Imin?60min、80%乙醇浸泡Imin?60min、90%乙醇浸泡30s?30min、100%乙醇浸泡Imin?60min ;然后用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理20s?40min,再用二甲苯浸泡處理20s?40min,使之透明； ③透蠟和包埋:用體積比為1:1的二甲苯:石蠟過渡處理30s?10min，56°C?70°C熔點(diǎn)的石蠟透蠟20min?40min，2次；將脫水透蠟后的組織樣品進(jìn)行包埋； ④切片和烤片:用切片機(jī)切片，切片厚度控制在4μπι?15μπι，經(jīng)35°C?45°C水浴中進(jìn)行展片，載玻片撈片后放置于35°C?40°C烤片機(jī)上進(jìn)行烤片固定； ⑤染色與封片:染色采用伊紅-蘇木精復(fù)染方法，其中用蘇木精染色I(xiàn)Os?5min伊紅染色5s?5min ;然后用中性樹膠封片。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，其特征在于:在進(jìn)行所述步驟⑤染色之前還進(jìn)行脫蠟復(fù)水，其中脫蠟步驟具體為:先用二甲苯浸泡Imin?15min,再用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理Imin?3min ;復(fù)水步驟具體為:先后采用100%乙醇浸泡30s?30min、90%乙醇浸泡30s?30min、70%乙醇浸泡30s?30min、50%乙醇浸泡30s?30min、最后用流水沖洗。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，其特征在于:所述的蘇木精染液配方為:lg蘇木精溶于IOOmL無水乙醇中，20g明帆溶于200mL蒸懼水中，兩液混合，加熱沸騰3min，稍冷卻加入0.51g氧化汞，溶解后即得到蘇木精染液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，其特征在于:所述的伊紅染液為I %的伊紅溶液，用70%乙醇溶解。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，其特征在于:所述步驟①固定液為4%的多聚甲醛、福爾馬林或波恩氏液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，其特征在于:所述豆制品為硬度較高的豆腐或素雞。
【文檔編號】G01N1/28GK103954484SQ201410132532
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】李彩燕, 錢國英, 王偉, 趙彩勝, 葛楚天, 尹尚軍, 樸龍斗 申請人:浙江萬里學(xué)院