一種超敏的免疫電鏡標(biāo)記方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種超敏的免疫電鏡標(biāo)記方法，包括以下步驟：把生物樣品待測(cè)抗原用體積百分比為0.1-2.5%的戊二醛溶液和質(zhì)量百分比為1.5-5%多聚甲醛溶液固定后，經(jīng)過脫水程序后，經(jīng)過親水性樹脂包埋，切成超薄切片后，分別用特定的第一抗體標(biāo)記生物樣品待測(cè)抗原，再以吸附超微金顆粒的第二抗體標(biāo)記第一抗體，然后利用銀加強(qiáng)放大試劑在超微金顆粒周圍形成直徑較大的銀顆粒，然后在電鏡下即可敏感地檢測(cè)待測(cè)抗原在生物樣品中的表位。本發(fā)明具有靈敏高的優(yōu)勢(shì)，兼有陽性信號(hào)顆粒相對(duì)均勻，便于研判的優(yōu)勢(shì)，也同時(shí)具有可以檢測(cè)生物樣品內(nèi)部抗原的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明適合檢測(cè)位于生物醫(yī)學(xué)標(biāo)本內(nèi)部的微量抗原的檢測(cè)。
【專利說明】一種超敏的免疫電鏡標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種超敏的免疫電鏡標(biāo)記方法。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫電鏡是利用免疫組織化學(xué)技術(shù)和電鏡技術(shù)在超微結(jié)構(gòu)水平上觀察待測(cè)抗原在生物醫(yī)學(xué)樣品中的精確定位的方法。早年的免疫電鏡技術(shù)使用的是酶標(biāo)法，現(xiàn)在的免疫電鏡技術(shù)往往使用的是金標(biāo)二抗的方法。二抗也稱為第二抗體，是一種蛋白質(zhì)，可以與直徑不同的金顆粒通過靜電作用形成金標(biāo)二抗，如果這種金標(biāo)二抗與一抗結(jié)合，一抗再與其相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性偶聯(lián)作用，在電鏡下就會(huì)形成代表相應(yīng)抗原表位的致密顆粒。目前使用金標(biāo)二抗的免疫電鏡技術(shù)分為包埋前免疫電鏡和包埋后免疫電鏡兩大類。
[0003]包埋前免疫電鏡，顧名思義就是在經(jīng)過電鏡技術(shù)的包埋程序之前就對(duì)待測(cè)生物樣品進(jìn)行免疫標(biāo)記。一般而言，普通抗體的直徑是10nm，在與金顆粒發(fā)生靜電結(jié)合時(shí)，金顆粒的直徑越小，附著在抗體周圍的金顆粒也就越多，在標(biāo)記、洗脫過程中也越不容易使金顆粒丟失，在電鏡下顯示的代表待測(cè)抗原表位的顆粒也就越多。也就是說，和二抗發(fā)生靜電結(jié)合的金顆粒直徑越小，在檢測(cè)待測(cè)抗原時(shí)敏感性越高。但是如果直徑太小，如金顆粒直徑在0.8nm-l.4nm時(shí)，即使在電鏡的高倍模式下也不容易觀察到金顆粒，因此，包埋前免疫電鏡技術(shù)往往需要利用銀加強(qiáng)試劑，使以金顆粒為核心的位置再富集上直徑5-50nm的銀顆粒，從而間接顯示出生物樣品待測(cè)抗原的表位。
[0004]包埋前免疫電鏡的優(yōu)點(diǎn):檢測(cè)的敏感性高。因?yàn)榘袂懊庖唠婄R使用的是直徑是0.8nm-l.4nm的超微金顆粒,直徑10_15nm的二抗很容易吸附如此細(xì)小的超微金顆粒,并且可以抵抗嚴(yán)格的漂洗條件。經(jīng)過銀加強(qiáng)步驟后，可以很敏感地顯示待測(cè)抗原的精確表位，而且可以根據(jù)需要通過延長(zhǎng)銀加強(qiáng)試劑的孵育時(shí)間來控制超微金顆粒周圍的富集的銀顆粒直徑，使其達(dá)到放大5-50倍的效果而不影響標(biāo)記的敏感性。
[0005]包埋前免疫電鏡的缺點(diǎn)。首先，只能標(biāo)記樣品淺層的樣品(如實(shí)施例1)。吸附有直徑是0.8nm-l.4nm的金標(biāo)二抗，即使在加入穿透劑的情況下，其穿透能力非常有限，一般都會(huì)低于10 μ m，不能標(biāo)記生物樣品深層的抗原，對(duì)于大塊的生物樣品如腦片可以通過振動(dòng)切片完成，如果是很小的生物樣品如果蠅的胚胎、腦等器官，就很難達(dá)到標(biāo)記效果。其次，為了增加待測(cè)樣品的深度，包埋前免疫電鏡操作程序中往往會(huì)使用一定濃度的非離子型去污劑Tween-20或者表面活性劑Triton X-100,這兩類化學(xué)物質(zhì)往往會(huì)造成生物樣品超微結(jié)構(gòu)損壞或者丟失，從而可能影響待測(cè)抗原的檢測(cè)。再次，包埋前免疫電鏡在使用銀加強(qiáng)放大步驟時(shí)，由于生物樣品的細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和組分分布高度不均勻，銀顆粒在金顆粒周圍富集形成致密核心時(shí)，其穿透待測(cè)生物樣品所進(jìn)入的距離和路徑不一致，將導(dǎo)致最后形成的銀顆粒核心直徑大小不一(如實(shí)施例1)，如果這些直徑相差較大，將會(huì)干擾對(duì)檢測(cè)結(jié)構(gòu)的判斷，而且不能做定量分析。
[0006]包埋后免疫電鏡，顧名思義就是在經(jīng)過電鏡技術(shù)的包埋程序之后才對(duì)待測(cè)生物樣品進(jìn)行免疫標(biāo)記。[0007]包埋后免疫電鏡的優(yōu)點(diǎn)。首先，可以檢測(cè)生物樣品內(nèi)部的待測(cè)抗原。其次，包埋后免疫電鏡不使用穿透劑，可以使待測(cè)生物樣品的超微結(jié)構(gòu)和待測(cè)抗原得到較好的保存；再次，根據(jù)金顆粒的數(shù)量，可以對(duì)待測(cè)樣品作半定量分析。
[0008]包埋后免疫電鏡的缺點(diǎn)。由于包埋后免疫電鏡使用的金標(biāo)二抗的金顆粒直徑達(dá)到5-50nm,而與金顆粒結(jié)合的二抗直徑大約為10_15nm，與之結(jié)合的金顆粒數(shù)量比包埋前免疫電鏡使用的0.8-1.4nm的超微金顆粒數(shù)量低得多，而且在標(biāo)記、洗脫過程中金顆粒容易丟失，因此包埋后免疫電鏡標(biāo)記的敏感性低(如實(shí)施例2)，而且金顆粒越大，敏感性越低。另一方面，生物樣品的超薄切片一般厚度為IOOnm左右，如果利用直徑較大的金標(biāo)二抗，其穿透樣品的能力也會(huì)受到影響。因此，以包埋后免疫電鏡技術(shù)檢測(cè)生物樣品的待測(cè)抗原，敏感性將降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]發(fā)明目的:針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題和不足，本發(fā)明充分結(jié)合了包埋前免疫電鏡和包埋后免疫電鏡的優(yōu)點(diǎn)，提供了 一種超敏感的免疫電鏡標(biāo)記方法。
[0010]技術(shù)方案:為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:一種超敏的免疫電鏡標(biāo)記方法，包括以下步驟:把生物樣品待測(cè)抗原體積百分比為0.1-2.5%的戊二醛溶液和質(zhì)量百分比為1.5-5%多聚甲醛溶液固定后，經(jīng)過脫水程序后，經(jīng)過親水性樹脂包埋，切成超薄切片后，分別用特定的第一抗體標(biāo)記生物樣品待測(cè)抗原，再以吸附超微金顆粒的第二抗體標(biāo)記第一抗體，然后利用銀加強(qiáng)放大試劑在超微金顆粒周圍形成直徑較大的銀顆粒，然后在電鏡下即可敏感地檢測(cè)待測(cè)抗原在生物樣品中的表位。
[0011]其中，上述親水性樹脂為K4M或L.R.White。
[0012]其中，上述超薄切片厚度為60_100nm。
[0013]其中，超微金顆粒直徑為0.8nm-l.4nm。
[0014]本發(fā)明的具體步驟如下:利用包埋后免疫電鏡程序，將待測(cè)生物樣品經(jīng)過溶解在
0.1M的磷酸鹽緩沖液或二甲胂酸鈉緩沖液的1.5-5%多聚甲醛溶液和0.1-2.5%戊二醛雙固定(PH7.0-7.6)、經(jīng)過0.1M的磷酸鹽漂洗和脫水后，包埋在親水性樹脂K4M或L.R.White中，并使樣品在樹脂中聚合成堅(jiān)硬的塊狀；把包埋于親水性樹脂K4M或L.R.White中待測(cè)生物樣品在超薄切片機(jī)中切成60-100nm的超薄切片，并收集于金網(wǎng)或者鎳網(wǎng)中；將載有待測(cè)生物樣品的金網(wǎng)或者鎳網(wǎng)以去離子水孵育5分鐘后，再以含有BSA的封閉液中封閉30分鐘，然后以第一抗體孵育30分鐘，再以含有BSA的封閉液洗滌三次，以洗去沒有特異性結(jié)合的第一抗體；將0.8nm或者1.4nm的超微金標(biāo)記的第二抗體標(biāo)記第一抗體30分鐘,再以含有BSA的封閉液洗滌三次，以洗去沒有特異性結(jié)合的第二抗體；以銀加強(qiáng)試劑使鎳網(wǎng)中的第二抗體的超微金顆粒放大，放大的時(shí)間根據(jù)需要控制在10-30分鐘，時(shí)間越長(zhǎng)，在超微金顆粒表面形成的銀顆粒結(jié)晶越大，越容易觀察。將經(jīng)銀加強(qiáng)放大的載有待測(cè)生物樣品的鎳網(wǎng)經(jīng)過0.1MPBS (PH=7.4)洗滌三次，1%的戊二醛后固定，再經(jīng)常規(guī)的檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾染色后，在透射電鏡下觀察、拍照。
[0015]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明克服了包埋前免疫電鏡技術(shù)穿透生物樣品能力弱的弊端，保留了其靈敏高的優(yōu)勢(shì)，克服了包埋后免疫電鏡技術(shù)靈敏低，但是無需抗體穿透生物樣品內(nèi)部(包埋后免疫電鏡技術(shù)使用的超薄切片是60-100nm)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明適合檢測(cè)位于生物醫(yī)學(xué)標(biāo)本內(nèi)部的微量抗原的檢測(cè)，而且所出現(xiàn)的陽性信號(hào)相對(duì)均勻，便于判斷。利用本發(fā)明的方法，以突觸囊泡標(biāo)記分子突觸素(Synapsin)標(biāo)記突觸囊泡為例，利用直徑為1.4納米的金標(biāo)二抗標(biāo)記突觸素，再以銀加強(qiáng)試劑放大，對(duì)比直接以直徑為15納米的金標(biāo)二抗標(biāo)記突觸素，其靈敏度可以提高10倍以上(見具體實(shí)施方案2)，而且陽性信號(hào)相對(duì)均勻，便于判斷。如果采用直徑更小的，如0.8納米的金標(biāo)二抗標(biāo)記相應(yīng)抗原，其靈敏度還將大幅增加。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1A顯示利用包埋前免疫電鏡程序以果蠅的DLG抗體標(biāo)記的果蠅神經(jīng)肌肉接頭，因果蠅外周的神經(jīng)肌肉接頭在組織淺層，標(biāo)記結(jié)果可在光鏡下觀察(白色方框所示的球狀物即為標(biāo)記的果蠅幼蟲神經(jīng)肌肉接頭)；
[0017]圖1B顯示在圖1A中方框區(qū)域的以果蠅的DLG抗體標(biāo)記的果蠅神經(jīng)肌肉接頭在電鏡下的表達(dá)位點(diǎn)，DLG表達(dá)在突觸后的廣闊區(qū)域,而非表達(dá)在突觸后膜,與前人所述一致。DLG抗體在電鏡下的陽性檢測(cè)率很高，陽性的信號(hào)很密集，黑色小顆粒示陽性信號(hào)，黑色箭頭示和外界環(huán)境相通的肌肉細(xì)胞的細(xì)胞膜，示通過包埋前免疫程序，抗體只能穿過10微米左右的區(qū)域；
[0018]圖1C中的黑點(diǎn)均是陽性信號(hào)，但是大、中、小箭頭所示陽性信號(hào)出現(xiàn)的直徑相差巨大；
[0019]圖1D顯示果蠅的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，白線顯示的是腹神經(jīng)索的一個(gè)切面；
[0020]圖1E顯示圖1D沿著白線采取的斷面，在電鏡下，果蠅的突觸囊泡位于斷面的中央?yún)^(qū)域，利用傳統(tǒng)的包埋前免疫電鏡程序不能使該斷面的中央?yún)^(qū)域標(biāo)記上信號(hào)；要達(dá)到標(biāo)記的目的，目前只有借助于包埋后免疫電鏡程序(注意E圖的標(biāo)尺是5微米)；
[0021]圖2A示正常突觸小體和突觸囊泡在電鏡下的結(jié)構(gòu)和位置，突觸小體成球狀，突觸囊泡分布在突觸小體外周；
[0022]圖2B顯示本發(fā)明標(biāo)記的突觸素Synapsin的信號(hào)，代表了突觸囊泡在突觸小體內(nèi)的分布模式，結(jié)果顯示，陽性信號(hào)分布在突觸小體外周，這種分布模式和圖2A展示的突觸囊泡在突觸小體上的分布模式完全一致；
[0023]圖2C顯示傳統(tǒng)的包埋后免疫電鏡程序標(biāo)記的突觸素Synapsin的信號(hào)，這些信號(hào)非常稀疏，甚至在很多樣品上觀察不到。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。
[0025]本發(fā)明中的DLG、synapsin—抗和15nm金標(biāo)二抗購(gòu)自Sigma公司，1.4nm的鼠源金標(biāo)二抗和銀加強(qiáng)試劑購(gòu)自Nanogold分子探針公司，0.8nm的鼠源金標(biāo)二抗購(gòu)自AURION公司。
[0026]實(shí)施例1
[0027]DLG是表達(dá)在果蠅幼蟲神經(jīng)肌肉接頭突觸后的半突觸網(wǎng)狀組織，在神經(jīng)生物學(xué)研究中，DLG是顯示果蠅幼蟲神經(jīng)肌肉接頭突觸后區(qū)域的常用標(biāo)記分子之一(不是在突觸后膜)。因果蠅幼蟲神經(jīng)肌肉接頭位于肌肉的表層，利用包埋前免疫電鏡程序，以果蠅的抗DLG鼠源單抗為一抗(工作濃度1:20)，再以抗鼠的以1.4納米金顆粒標(biāo)記的二抗處理(工作濃度1:50)，然后進(jìn)行銀加強(qiáng)放大(放大條件為25°C下10分鐘)，可以在突觸后的區(qū)域檢測(cè)到大量的DLG的陽性信號(hào)，而在突觸后膜則檢測(cè)不到信號(hào)(圖1B-C)，這與人們的認(rèn)識(shí)一致，說明本案例在操作上沒問題。但是這些信號(hào)的直徑大小相差比較大(圖1C)，會(huì)給檢測(cè)帶來誤判的可能。而且包埋前免疫程序只能檢測(cè)位于樣品表面10微米左右的樣品，如果面對(duì)位于組織深層的抗原，如圖1D-E所示，利用包埋前免疫電鏡程序就無能為力。
[0028]實(shí)施例2
[0029]突觸素(Synapsin)是一種位于突觸囊泡上的蛋白，是突觸囊泡的標(biāo)識(shí)蛋白之一。在本發(fā)明的具體實(shí)施例2的過程中，所用的免疫標(biāo)記實(shí)驗(yàn)程序和本發(fā)明的內(nèi)容完全一樣。所用的固定劑為0.5%戊二醛+4%多聚甲醛的0.1M PBS溶液(PH=7.4)，所用動(dòng)物組織為果蠅的腹神經(jīng)索，其內(nèi)密集分布有突觸小體，突觸囊泡環(huán)繞在突觸小體周圍(圖2A)。所用的一抗均為特異識(shí)別果蠅突觸囊泡的鼠源單抗突觸素，工作濃度為1:20。所用二抗有兩種，一種是直徑為1.4納米的金標(biāo)鼠的二抗，標(biāo)記完成后，用銀加強(qiáng)試劑放大金顆粒直徑，銀加強(qiáng)放大的條件為25°C下10分鐘；另一種二抗是直徑為15納米的金標(biāo)抗鼠的二抗，直接標(biāo)記第一抗體；兩種第二抗體的工作濃度均為1:50。實(shí)驗(yàn)表明，在完全一樣的實(shí)驗(yàn)條件下，利用本發(fā)明的方案，以直徑為1.4納米的金標(biāo)二抗標(biāo)記，再在以銀加強(qiáng)試劑放大信號(hào)，突觸素Synapsin的出現(xiàn)的頻率(圖2B)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于直接用15nm直接標(biāo)記后突觸素Synapsin出現(xiàn)的頻率(圖2C)，在實(shí)驗(yàn)中選擇的兩個(gè)典型樣品中，以本發(fā)明的程序最多觀察到了 26個(gè)陽性信號(hào)(圖2B，箭頭所示)，而用傳統(tǒng)的包埋后免疫程序最多只能觀察到兩個(gè)陽性信號(hào)甚至是觀察不到陽性信號(hào)(圖2C，箭頭所示)。與傳統(tǒng)的包埋前免疫程序相比(圖1C，箭頭所示)，本發(fā)明出現(xiàn)陽性信號(hào)直徑相對(duì)均勻(圖2B，箭頭所示)，便于判斷。
[0030]實(shí)施例3
[0031]將待測(cè)生物樣品經(jīng)過溶解在0.1M的磷酸鹽緩沖液的2%多聚甲醛和0.1%戊二醛雙固定(PH7.0-7.6)、經(jīng)過0.1M的磷酸鹽漂洗和脫水后，包埋在親水性樹脂K4M ;把包埋于親水性樹脂K4M中待測(cè)生物樣品在超薄切片機(jī)中切成60nm的超薄切片，并收集于金網(wǎng)或者鎳網(wǎng)中；將載有待測(cè)生物樣品的金網(wǎng)或者鎳網(wǎng)以去離子水孵育5分鐘后，再以含有BSA的封閉液中封閉30分鐘，然后以第一抗體孵育30分鐘，再以含有BSA的封閉液洗滌三次，以洗去沒有特異性結(jié)合的第一抗體；將0.Snm膠體金標(biāo)記的第二抗體標(biāo)記第一抗體30分鐘，再以含有BSA的封閉液洗滌三次，以洗去沒有特異性結(jié)合的第二抗體；以銀加強(qiáng)試劑盒使鎳網(wǎng)中的第二抗體的超微金顆粒放大，放大的時(shí)間根據(jù)需要控制在30分鐘，將經(jīng)銀加強(qiáng)放大的載有待測(cè)生物樣品的鎳網(wǎng)經(jīng)過0.1MPBS (PH=7.4)洗滌三次，1%的戊二醛后固定，再經(jīng)常規(guī)的檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾染色后，在透射電鏡下觀察、拍照。所用動(dòng)物組織為果蠅的腹神經(jīng)索，其內(nèi)密集分布有突觸小體，突觸囊泡環(huán)繞在突觸小體周圍。所用的一抗均為特異識(shí)別果蠅突觸囊泡的鼠源單抗突觸素，工作濃度為1:20。所用二抗有兩種，一種是直徑為0.Snm納米的金標(biāo)鼠的二抗，標(biāo)記完成后，用銀加強(qiáng)試劑盒放大金顆粒直徑，銀加強(qiáng)放大的條件為25°C下10分鐘；另一種二抗是直徑為15納米的金標(biāo)抗鼠的二抗，直接標(biāo)記第一抗體；兩種第二抗體的工作濃度均為1:50。實(shí)驗(yàn)表明，在完全一樣的實(shí)驗(yàn)條件下，利用本發(fā)明的方案，以直徑為0.8nm納米的金標(biāo)二抗標(biāo)記,在以銀加強(qiáng)放大信號(hào),突觸素Synapsin的出現(xiàn)的頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于直接用15nm直接標(biāo)記后突觸素Synapsin出現(xiàn)的頻率，在實(shí)驗(yàn)中選擇的兩個(gè)典型樣品中，以本發(fā)明的程序最多觀察到了 26個(gè)陽性信號(hào)，而用傳統(tǒng)的包埋后免疫程序最多只能觀察到兩個(gè)陽性甚至是觀察不到陽性信號(hào)。
[0032]實(shí)施例4
[0033]將待測(cè)生物樣品經(jīng)過溶解在0.1M的二甲胂酸鈉緩沖液的5%多聚甲醛和0.25%戊二醛雙固定(PH7.0-7.6)、經(jīng)過0.1M的磷酸鹽漂洗和脫水后，包埋在親水性樹脂L.R.White ;把包埋于親水性樹脂L.R.White中待測(cè)生物樣品在超薄切片機(jī)中切成IOnm的超薄切片，并收集于金網(wǎng)或者鎳網(wǎng)中；將載有待測(cè)生物樣品的金網(wǎng)或者鎳網(wǎng)以去離子水孵育5分鐘后，再以含有BSA的封閉液中封閉30分鐘,然后以第一抗體孵育30分鐘,再以含有BSA的封閉液洗滌三次，以洗去沒有特異性結(jié)合的第一抗體；將0.Snm膠體金標(biāo)記的第二抗體標(biāo)記第一抗體30分鐘，再以含有BSA的封閉液洗滌三次，以洗去沒有特異性結(jié)合的第二抗體；以銀加強(qiáng)試劑盒使鎳網(wǎng)中的第二抗體的超微金顆粒放大，放大的時(shí)間根據(jù)需要控制在30分鐘，將經(jīng)銀加強(qiáng)放大的載有待測(cè)生物樣品的鎳網(wǎng)經(jīng)過0.1MPBS (PH=7.4)洗滌三次，1%的戊二醛后固定，再經(jīng)常規(guī)的檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾染色后，在透射電鏡下觀察、拍照。所用動(dòng)物組織為果蠅的腹神經(jīng)索，其內(nèi)密集分布有突觸小體，突觸囊泡環(huán)繞在突觸小體周圍。所用的一抗均為特異識(shí)別果蠅突觸囊泡的鼠源單抗突觸素，工作濃度為1:20。所用二抗有兩種，一種是直徑為1.4nm納米的金標(biāo)鼠的二抗，標(biāo)記完成后，用銀加強(qiáng)試劑盒放大金顆粒直徑，銀加強(qiáng)放大的條件為25°C下10分鐘；另一種二抗是直徑為15納米的金標(biāo)抗鼠的二抗，直接標(biāo)記第一抗體；兩種第二抗體的工作濃度均為1:50。實(shí)驗(yàn)表明，在完全一樣的實(shí)驗(yàn)條件下，利用本發(fā)明的方案，以直徑為0.Snm納米的金標(biāo)二抗標(biāo)記，在以銀加強(qiáng)放大信號(hào)，突觸素Synapsin的出現(xiàn)的頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于直接用15nm直接標(biāo)記后突觸素Synapsin出現(xiàn)的頻率，在實(shí)驗(yàn)中選擇的兩個(gè)典型樣品中，以本發(fā)明的程序最多觀察到了 35個(gè)陽性信號(hào)，而用傳統(tǒng)的包埋后免疫程序最多只能觀察到兩個(gè)陽性甚至是觀察不到陽性信號(hào)。
【權(quán)利要求】
1.一種超敏的免疫電鏡標(biāo)記方法，其特征在于，包括以下步驟:把生物樣品待測(cè)抗原用體積百分比為0.1-2.5%的戊二醛溶液和質(zhì)量百分比為1.5-5%多聚甲醛溶液固定后，經(jīng)過脫水程序后，經(jīng)過親水性樹脂包埋，切成超薄切片后，分別用特定的第一抗體標(biāo)記生物樣品待測(cè)抗原，再以吸附超微金顆粒的第二抗體標(biāo)記第一抗體，然后利用銀加強(qiáng)放大試劑在超微金顆粒周圍形成直徑較大的銀顆粒，然后在電鏡下即可敏感地檢測(cè)待測(cè)抗原在生物樣品中的表位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超敏的免疫電鏡標(biāo)記方法，其特征在于，所述親水性樹脂為 K4M 或 L.R.White。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超敏的免疫電鏡標(biāo)記方法，其特征在于，所述超薄切片厚度為60-100nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超敏的免疫電鏡標(biāo)記方法，其特征在于，超微金顆粒直徑為 0.8nm_l.4nm。
【文檔編號(hào)】G01N33/532GK103777001SQ201410036229
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月24日
【發(fā)明者】甘光明 申請(qǐng)人:東南大學(xué)