一種谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抗原生物傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抗原生物傳感器的制備方法及應(yīng)用，屬于新型納米功能材料與生物傳感【技術(shù)領(lǐng)域】。具體是基于磺酸化石墨烯（HSO3-GS）和雙金屬納米多孔合金材料鉑鐵（PtFe），制備的檢測(cè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的夾心型電化學(xué)免疫傳感器，用于檢測(cè)血清中的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶。其特征在于：（1）磺酸化石墨烯的制備；（2）雙金屬多孔材料鉑鐵—辣根過氧化物酶—谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶二抗復(fù)合物的制備；（3）電化學(xué)免疫傳感器的制備。PtFe對(duì)H2O2具有很強(qiáng)的催化能力，同時(shí)利于固定更多的二抗、保持物質(zhì)生物活性；將電子媒介體天青A加入底液中，避免了修飾到電極上后的泄漏問題，制備的傳感器靈敏度高、特異性好、易于操作、檢測(cè)限低。
【專利說明】一種谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抗原生物傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抗原生物傳感器的制備方法及應(yīng)用。具體是基于磺酸化石墨烯(HSO3-GS)和雙金屬納米多孔合金材料鉬鐵(PtFe)，制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的夾心型電化學(xué)免疫傳感器，用于檢測(cè)血清中的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶。屬于新型納米功能材料與生物傳感【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)主要是在肝臟中參與生物轉(zhuǎn)化第二相反應(yīng)的一種生物酶，它既能在組織中又可在血清中檢測(cè)到，而其它許多腫瘤標(biāo)志物只能在組織中檢測(cè)到，而且檢測(cè)血清中的GST對(duì)機(jī)體無侵襲性，可以大大方便臨床的應(yīng)用，因此谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶免疫傳感器的研制具有重要的意義。
[0003]本發(fā)明基于合成納米材料磺酸化石墨烯(HSO3-GS)以及雙金屬納米多孔材料鉬鐵(PtFe)制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶夾心型免疫傳感器的研究，突出了電極修飾材料對(duì)生物傳感器增大響應(yīng)、提高檢測(cè)靈敏度、增大線性范圍等作用。HSO3-GS具有比表面積大、能加強(qiáng)電子傳導(dǎo)等優(yōu)勢(shì)，利用化學(xué)鍵合作用可直接與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶一抗聯(lián)接，無需采用傳統(tǒng)交聯(lián)劑戊二醛固定化。采用PtFe有利于固定更多的二抗、保持物質(zhì)生物活性，并且對(duì)H2O2具有很強(qiáng)的催化能力。兩者利用簡單滴涂法修飾于玻碳電極上可增強(qiáng)電極在反應(yīng)過程中的電化學(xué)響應(yīng)。將電子媒介體天青A加入底液中，避免了修飾到電極上后的泄漏問題。
[0004]本發(fā)明制得的生物傳感器的響應(yīng)電流與GST濃度在0.01?12 ng/mL范圍內(nèi)保持良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為2.1 pg/mL。
[0005]本發(fā)明利用免疫反應(yīng)的高特異性，結(jié)合HSO3-GS和PtFe，制備了 一種谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶夾心型免疫傳感器。
[0006]本發(fā)明具有靈敏度高、特異性好、檢測(cè)成本低、能快速檢測(cè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等優(yōu)勢(shì)，且本發(fā)明制備過程簡單，操作過程簡便，有效克服了目前谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)方法的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的之一在于避免傳統(tǒng)檢測(cè)方法的儀器設(shè)備復(fù)雜、操作過程繁瑣、檢測(cè)人員要求高等缺點(diǎn)，提供了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、操作簡便的快速檢測(cè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法。
[0008]本發(fā)明的目的之二是將該電化學(xué)免疫傳感器應(yīng)用于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的。
[0010]一種谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抗原生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
(I)PtFe的制備
將PtFeAl合金片放到裝有0.5?1.0 mol.T1NaOH溶液的小燒杯中，置于恒溫水浴中，40?50°C條件下，放置24?48 h，將得到的產(chǎn)物用二次水反復(fù)洗，室溫下晾干，即制備出所需的PtFe。
[0011](2) PtFe/辣根過氧化物酶/谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶二抗復(fù)合物(PtFe/HRP/Ab2)制備 將裝有PtFe懸浮液超聲，移取PtFe懸浮液、HRP溶液和Ab2溶液于一離心管中，體積比
為PtFe: HRP: Ab2 = 1: 0.5 ^ 2: 0.5 ^ 2進(jìn)行混合，4°C條件下，進(jìn)行振蕩孵化，孵化12~24 h后，置于4 °C冰箱中保存待用。
[0012](3)電化學(xué)免疫傳感器的制備
1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0,0.3和0.05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol.L-1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2~0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于90 mV ；
2)將殼聚糖分散的HSO3-GS修飾于玻碳電極表面,室溫干燥；
3)將谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶一抗(Ab1)滴涂到步驟2)HS03-GS修飾的電極表面，置于4°C濕潤條件下晾干； 4)將濃度為100Pg.ml/1牛血清白蛋白滴涂到步驟3)41^修飾的電極表面,4°C下濕潤條件下晾干；
5)將GST滴涂在步驟4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干；
6)將PtFe/HRP/Ab2滴涂在步驟5)GST修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干，電化學(xué)免疫傳感器制備完成。
[0013]所述HSO3-GS的濃度為0.5~2.5 mg.mL—1，所述PtFe懸浮液的濃度為10mg.ml/1,所述HRP的濃度為1.0 mg.ml/1,所述Ab2的濃度為1.0 mg.mL'
[0014](4)電化學(xué)免疫傳感器的應(yīng)用 用于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)，步驟如下:
1)采用0.10 mo I.ml/1, pH = 7.4的磷酸鹽緩沖溶液,配制在0.01~12 ng.ml/1范圍內(nèi)不同濃度的GST溶液，將6 μ L不同濃度的GST溶液分別滴涂至上述步驟4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，晾干后，按照上述步驟6)修飾電極，連接至電化學(xué)工作站中，分別將電極置于含有 2.0 ~3.0 mmol.L-1 天青 A 和 1.0 ~5.0 mmol.L-1 H2O2 的 ρΗ=7.4 的 PBS緩沖溶液中測(cè)定其電流變化；
2)根據(jù)所得電流差值與GST濃度呈線性關(guān)系，繪制工作曲線；
3)依據(jù)工作曲線的繪制方法進(jìn)行樣品中GST的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果從工作曲線中查得。
[0015]本發(fā)明的有益成果
(I)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抗原生物傳感器，HSO3-GS引入到谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抗原電化學(xué)免疫傳感器的制備當(dāng)中，利用HSO3-GS良好的電子傳遞能力，顯著改善了電極的性能。
[0016](2)將PtFe與腫瘤標(biāo)志物二抗直接孵化，利用鉬鐵優(yōu)異的生物相容性和高的催化性能，顯著提高了電化學(xué)免疫傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。
[0017](3) PtFe與辣根過氧化物酶復(fù)合標(biāo)記二抗，具有對(duì)信號(hào)的協(xié)同增敏作用。
[0018](4)本發(fā)明所制備的電化學(xué)免疫傳感器，操作簡單，檢測(cè)速度快，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)批量樣品的測(cè)定。
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1 PtFe的制備將PtFeAl合金片放到裝有0.5 mo I.T1NaOH溶液的小燒杯中，置于恒溫水浴中，40 °C條件下，放置24 h，將得到的產(chǎn)物用二次水反復(fù)洗滌，室溫下晾干，即制備出所需的PtFe。
[0020]實(shí)施例2 PtFe的制備
將PtFeAl合金片放到裝有1.0 mo 1-L^1NaOH溶液的小燒杯中，置于恒溫水浴中，50°C條件下，放置48 h，將得到的產(chǎn)物用二次水反復(fù)洗滌，室溫下晾干，即制備出所需的PtFe。
[0021]實(shí)施例3 PtFe的制備
將PtFeAl合金片放到裝有0.7 mo 1-L^1NaOH溶液的小燒杯中，置于恒溫水浴中，45 V條件下，放置35 h，將得到的產(chǎn)物用二次水反復(fù)洗滌，室溫下晾干，即制備出所需的PtFe。
[0022]實(shí)施例4 PtFe/HRP/Ab2 制備
將裝有PtFe懸浮液超聲，移取PtFe懸浮液、HRP溶液和Ab2溶液于一離心管中，體積比為PtFe: HRP: Ab2 = 1: 0.5: 0.5進(jìn)行混合，4°C條件下，進(jìn)行振蕩孵化，孵化12 h后，置于4 °C冰箱中保存待用。
[0023]實(shí)施例5 PtFe/HRP/Ab2 制備
將裝有PtFe懸浮液超聲，移取PtFe懸浮液、HRP溶液和Ab2溶液于一離心管中，體積比為PtFe: HRP: Ab2 = 1:1:1進(jìn)行混合，4°C條件下，進(jìn)行振蕩孵化，孵化24h后，置于4 °C冰箱中保存待用。
[0024]實(shí)施例6 PtFe/HRP/Ab2 制備
將裝有PtFe懸浮液超聲，移取PtFe懸浮液、HRP溶液和Ab2溶液于一離心管中，體積比為PtFe: HRP: Ab2 = 1: 2: 2進(jìn)行混合，4°C條件下，進(jìn)行振蕩孵化，孵化18h后，置于4 °C冰箱中保存待用。
[0025]實(shí)施例7電化學(xué)免疫傳感器的制備
(1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0、0.3和0.05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol.I/1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2~0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于90 mV ；
(2)將殼聚糖分散的HSO3-GS修飾于玻碳電極表面,室溫干燥；
(3)將谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶一抗(Ab1)滴涂到步驟(2)HS03-GS修飾的電極表面，置于4°C濕潤條件下晾干；
(4)將濃度為100Kg 牛血清白蛋白滴涂到步驟(S)Ab1修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干；
(5)將GST滴涂在步驟(4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干；
(6)將PtFe/HRP/Ab2滴涂在步驟(5)GST修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干，電化學(xué)免疫傳感器制備完成。
[0026]實(shí)施例8電化學(xué)免疫傳感器的應(yīng)用 用于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移 酶的檢測(cè)，步驟如下:
(1)采用0.10 mo I.ml/1, pH = 7.4的磷酸鹽緩沖溶液,配制在0.01 ng.ml/1范圍內(nèi)不同濃度的GST溶液，將6 μ L不同濃度的GST溶液分別滴涂至實(shí)施例7中步驟(4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，晾干后，按照實(shí)施例7中步驟(6)修飾電極，連接至電化學(xué)工作站中，分別將電極置于含有2.0 mmol.L-1天青A和1.0 mmol.L-1 H2O2的pH=7.4的PBS緩沖溶液中測(cè)定其電流變化；(2)根據(jù)所得電流差值與GST濃度呈線性關(guān)系，繪制工作曲線；
(3)依據(jù)工作曲線的繪制方法進(jìn)行樣品中GST的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果從工作曲線中查得。
[0027]實(shí)施例9電化學(xué)免疫傳感器的應(yīng)用 用于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)，步驟如下:
(1)采用0.10 mo I.ml/1, pH = 7.4的磷酸鹽緩沖溶液,配制在12 ng.ml/1范圍內(nèi)不同濃度的GST溶液，將6 μ L不同濃度的GST溶液分別滴涂至實(shí)施例7中步驟(4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，晾干后，按照實(shí)施例7中步驟(6)修飾電極，連接至電化學(xué)工作站中，分別將電極置于含有3.0 mmol.L-1天青A和5.0 mmol.L-1 H2O2的pH=7.4的PBS緩沖溶液中測(cè)定其電流變化；
(2)根據(jù)所得電流差值與GST濃度呈線性關(guān)系，繪制工作曲線；
(3)依據(jù)工作曲線的繪制方法進(jìn)行樣品中GST的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果從工作曲線中查得。
[0028]實(shí)施例10電化學(xué)免疫傳感器的應(yīng)用 用于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)，步驟如下:
(1)采用0.10 mo I.ml/1, pH = 7.4的磷酸鹽緩沖溶液,配制在5.0 ng.ml/1范圍內(nèi)不同濃度的GST溶液，將6 μ L不同濃度的GST溶液分別滴涂至實(shí)施例7中步驟(4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，晾干后，按照實(shí)施例7中步驟(6)修飾電極，連接至電化學(xué)工作站中，分別將電極置于含有2.5 mmol.L-1天青A和3.0 mmol.L-1 H2O2的pH=7.4的PBS緩沖溶液中測(cè)定其電流變化；
(2)根據(jù)所得電流差值與GST濃度呈線性關(guān)系，繪制工作曲線；
(3)依據(jù)工作曲線的繪制方法進(jìn)行樣品中GST的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果從工作曲線中查得。
【權(quán)利要求】
1.一種谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抗原生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)雙金屬納米多孔材料鉬鐵(PtFe)的制備 將PtFeAl合金片放到裝有0.5~1.0 mol.T1NaOH溶液的小燒杯中，置于恒溫水浴中，40~50°C條件下，放置24~48 h，將得到的產(chǎn)物用二次水反復(fù)洗滌，室溫下晾干，即制備出所需的PtFe ； (2)PtFe/辣根過氧化物酶/谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶二抗復(fù)合物(PtFe/HRP/Ab2)制備 將PtFe懸浮液超聲，移取懸浮液、HRP溶液和Ab2溶液于一離心管中，體積比為PtFe:HRP: Ab2 = 1: 0.5~2: 0.5~2進(jìn)行混合，4°C條件下，進(jìn)行振蕩孵化，孵化12~24h后，置于4 1:冰箱中保存待用； (3)電化學(xué)免疫傳感器的制備。
2.如權(quán)利要求1所述的一種谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抗原生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述的電化學(xué)免疫傳感器的制備，步驟如下: (1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0、0.3和0.05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol.1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2~0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于80 mV ； (2)將殼聚糖分散的HSO3-GS修飾于玻碳電極表面,室溫干燥； (3)將谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶一抗(Ab1)滴涂到步驟(2)HS03-GS修飾的電極表面，置于4°C濕潤條件下晾干； (4)將濃度為100Kg 牛血清白蛋白滴涂到步驟(S)Ab1修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干； (5)將谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抗原(GST)滴涂在步驟(4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干； (6)將PtFe/HRP/Ab2滴涂在步驟(5)GST修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干，電化學(xué)免疫傳感器制備完成。
3.如權(quán)利要求1所述的一種谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抗原生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述HSO3-GS的濃度為0.5~2.5 mg.πι?Λ所述PtFe懸浮液的濃度為10 mg.mL—1，所述HRP的濃度為1.0 mg.ml/1,所述Ab2的濃度為1.0 mg.mL'
4.如權(quán)利要求1~3之一所述的制備方法制備的傳感器的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)采用0.10 mol.ml/1, pH = 7.4的磷酸鹽緩沖溶液,配制在0.01~12 ng.mL-1范圍內(nèi)不同濃度的GST溶液，將6 μ L不同濃度的GST溶液分別滴涂至權(quán)利要求2中步驟(4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，晾干后，按照權(quán)利要求2中步驟(6)修飾電極，連接至電化學(xué)工作站中，分別將電極置于含有2.0~3.0 mmol1天青A和1.0~5.0 mmol1 H2O2的pH=7.4的PBS緩沖溶液中測(cè)定其電流變化； (2)根據(jù)所得電流差值與GST濃度呈線性關(guān)系，繪制工作曲線； (3)依據(jù)工作曲線的繪制方法進(jìn)行樣品中GST的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果從工作曲線中查得。
【文檔編號(hào)】G01N27/48GK103868971SQ201410036028
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月26日
【發(fā)明者】魏琴, 李月云, 閆濤, 胡麗華, 張勇, 吳丹, 李賀, 魏東 申請(qǐng)人:濟(jì)南大學(xué)