利用新穎標(biāo)志物CT-proADM進(jìn)行診斷和危險(xiǎn)分層的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于對(duì)疾病進(jìn)行診斷和/或危險(xiǎn)分層的新穎的診斷標(biāo)志物CT-proADM（preproADM的C末端片段，SEQ?ID?No.1）。本發(fā)明還公開(kāi)了對(duì)疾病，尤其是對(duì)心血管疾病、心功能不全、肺和呼吸道感染和/或炎癥進(jìn)行診斷和/或危險(xiǎn)分層的方法。在所述方法中，對(duì)待測(cè)患者進(jìn)行標(biāo)志物CT-proADM、或其片段或肽段、或包含在標(biāo)志物組合（標(biāo)志物組、標(biāo)志物簇）中的該標(biāo)志物進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明還涉及用于實(shí)施所述方法的診斷設(shè)備和試劑盒。
【專(zhuān)利說(shuō)明】利用新穎標(biāo)志物CT-proADM進(jìn)行診斷和危險(xiǎn)分層
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年12月20日、申請(qǐng)?zhí)枮?00780047509.X、發(fā)明名稱為“利用新穎標(biāo)志物CT-proADM進(jìn)行診斷和危險(xiǎn)分層”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002]本發(fā)明涉及對(duì)疾病進(jìn)行診斷和/或危險(xiǎn)分層的新穎診斷標(biāo)志物CT-proADM(pr印roADM的C末端片段，SEQ ID N0.1)0本發(fā)明還涉及對(duì)疾病，特別是對(duì)心血管疾病、心功能不全、肺及呼吸道感染和/或炎癥進(jìn)行診斷和/或危險(xiǎn)分層的方法。在所述方法中，在待測(cè)患者中測(cè)定CT-proADM (SEQ ID N0.1)標(biāo)志物、或其肽段或片段、或者包含在標(biāo)志物組合(標(biāo)志物組、標(biāo)志物簇)中的該標(biāo)志物。本發(fā)明還涉及用于實(shí)施所述方法的診斷設(shè)備和試劑盒。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)描述了如何在診斷中測(cè)定腎上腺髓質(zhì)素原(proADM)和腎上腺髓質(zhì)素(EP0622458B1, Lewis LK, Smith MW, Yandle TG, Richards AM, NichollsMG.Adrenomedullin(1-52)measured in human plasma by radioimmunoassay:plasmaconcentration, adsorption, and storage.Clin Cheml998;44:571-7;Ueda S，NishioK，Minamino N，Kubo A，Akai Yj Kangawa K 等 人,Increased plasma levels ofadrenomedullin in patients with systemic inflammatory response syndrome.AmJ Respir Crit Care Medl999;160:132-6;Kobayashi Kj Kitamura K，Etoh T，NagatomoY，Takenaga Mj Ishikawa T等人，Increased plasma adrenomedullin levels in chroniccongestive heart failure.Am Heart J1996;131:994-8;Kobayashi K，KitamuraKj Hirayama N，Date Hj Kashiwagi T，Ikushima I 等人，Increased plasma adrenomedullinin acute myocardial infarction.Am Heart J1996; 131:676-80.)，特別是用于敗血病診斷目的(EP1121600B1)。在EP0622458B1中同樣描述了用于診斷的(前)腎上腺髓質(zhì)素原的 N 端片段，例如 PAMP (HashidaS, Kitamura K，Nagatomo Y，Shibata Y，ImamuraT，Yamada K 等人，Development of an ultrasensitive enzyme immunoassay for humanproadrenomedulI in N_terminal20peptide and direct measurement of two molecularforms of PAMP in plasma from healthy subjects and patients with cardiovasculardisease.Clin Biochem2004;37:14—21)。
[0004]此外，在EP1488209B1中公開(kāi)了用于診斷目的的腎上腺髓質(zhì)素原的其他片段，即所謂的腎上腺髓質(zhì)素原中段(MR-proADM) (Struck J，Tao C，Morgenthaler NGj BergmannA.1dentification of an Adrenomedullin precursor fragment in plasma ofsepsis patients.Peptides2004;25:1369-72;Morgenthaler NGj Struck J，AlonsoCjBergmann A.Measurement of midregional proadrenomedulI in in plasma with animmunoluminometric assay.Clin Chem 2005;51:1823-9;Christ-Crain M，MorgenthalerNGj Stolz D，Muller C，Bingisser R，Harbarth S 等人，Pro-adrenomedullin to predictseverity and outcome in communityacquired pneumonia [ISRCTN04176397].CritCare2006;10:R96;Christ-Crain M，Morgenthaler NGj Struck J，Harbarth S，BergmannA，Muller B Mid-regional pro-adrenomedulI in as a prognostic marker in sepsis: anobservational study.Crit Care2005;9:R816-24)。[0005]但是，非常需要對(duì)疾病，特別是心血管疾病、心功能不全、肺和呼吸道感染和/或炎癥做出可靠的診斷或進(jìn)行(危險(xiǎn))分層，尤其是針對(duì)進(jìn)一步臨床決策，并且尤其是針對(duì)疾病嚴(yán)重度一特別是心血管疾病、心功能不全、肺和呼吸道感染和/或炎癥。
[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新穎的標(biāo)志物。
[0007]本發(fā)明的另外一個(gè)目的是為疾病，特別是心血管疾病、心功能不全、肺和呼吸道感染和/或炎癥提供改進(jìn)的診斷和/或危險(xiǎn)分層方法。
[0008]上述目的一方面通過(guò)提供診斷標(biāo)志物CT-proADM(腎上腺髓質(zhì)素原的C末段片段，SEQ ID N0.1)、或其肽段或片段得以解決，另一方面，通過(guò)對(duì)疾病的體外診斷和/或危險(xiǎn)分層方法得以解決。在所述方法中，在待測(cè)患者中測(cè)定CT-proADM (SEQ ID N0.1)標(biāo)志物、或其肽段或片段、或者包含在標(biāo)志物組合(標(biāo)志物組、標(biāo)志物簇)中的該標(biāo)志物(下文稱為根據(jù)本發(fā)明的方法)。
[0009]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“危險(xiǎn)分層”包括發(fā)現(xiàn)預(yù)后較差的患病患者，以便對(duì)疾病進(jìn)行更強(qiáng)化的診斷和(后續(xù))治療/處理，目的是獲得盡可能有利的病程。
[0010]因此，尤其有利地，借助于根據(jù)本發(fā)明的方法可以進(jìn)行可靠的診斷和/或危險(xiǎn)分層。根據(jù)本發(fā)明的方法使得能夠作出導(dǎo)致較快速診斷的臨床決策。這種臨床決策還包括通過(guò)應(yīng)用藥物進(jìn)一步治療，所述藥物用于疾病的治療或療法。
[0011]因此，本發(fā)明也涉及對(duì)患者進(jìn)行危險(xiǎn)分層的方法，尤其是對(duì)患者進(jìn)行危險(xiǎn)分層以進(jìn)行臨床決策，尤其是在時(shí)間緊迫的重癥醫(yī)學(xué)或急救醫(yī)學(xué)中，以及用于患者的入院。
[0012]在根據(jù)本發(fā)明所述方法的進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方式中，進(jìn)行診斷和/或危險(xiǎn)分層用于預(yù)后(預(yù)測(cè))、用于鑒別診斷性早期診斷和檢測(cè)、用于嚴(yán)重程度的評(píng)價(jià)、以及用于伴隨治療的疾病進(jìn)程評(píng)估。
[0013]在根據(jù)本發(fā)明所述方法的另一種實(shí)施方式中，從待測(cè)患者提取體液或者身體組織，優(yōu)選血液，可選地是全血、血清或可得的血漿，并且在體外/離體，即在人或動(dòng)物體外部進(jìn)行診斷。由于在至少一個(gè)患者樣品中測(cè)定標(biāo)志物CT-proADM(SEQ ID N0.1)、或者其肽段或片段、及其存在量，可以進(jìn)行診斷和/或危險(xiǎn)分層。
[0014]在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“疾病”被理解為人或者動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物的疾病。這些疾病，尤其是人類(lèi)疾病在Pschyrembel, De Gruyter, Berlin2004中描述。
[0015]然而，尤其有利的是，在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)心血管疾病、心功能不全、肺和呼吸道感染和/或炎癥做出診斷和/或分層。
[0016]術(shù)語(yǔ)“心血管疾病”根據(jù)本發(fā)明包括所有的心臟和血液循環(huán)疾病，尤其是例如高血壓、冠心病，特別是急性冠狀動(dòng)脈綜合征、(急性)心肌梗塞、心絞痛的這類(lèi)適應(yīng)癥。
[0017]術(shù)語(yǔ)“急性冠狀動(dòng)脈綜合征”包括對(duì)生命有直接威脅的冠心病的不同階段。尤其涉及急救醫(yī)學(xué)，即，急性心肌梗塞和/或心絞痛以及心源性猝死。除了急性心肌
梗塞-根據(jù) WHO 標(biāo)準(zhǔn)(WHO(1979):Nomenclature and criteria for diagnosis
of ischemic heart disease.Report of the Joint International Societyand Federation of Cardiology/World Health Organization task force onstandardization of clinical nomenclature，Circulation59(3):607-609)，其被定義為急性胸痛事件持續(xù)20分鐘以上，伴有ST段抬高和/或心肌酶升高——之外，該術(shù)語(yǔ)包括不穩(wěn)定型心絞痛(AP)——其根據(jù)本發(fā)明可包含在“急性冠狀動(dòng)脈綜合征”中(Hamm Cff:Leitlinien:Akutes Koronarsyndrom(ACS)-Teill:ACS ohne persistierendeST-Hebung.Z Kardiol(2004)93:72-90)。
[0018]在本發(fā)明范圍內(nèi)，“心功能不全”被理解為指心臟急性或慢性地?zé)o力供給組織足夠的血液并從而提供足夠的氧氣，以便確保在靜息或負(fù)荷(應(yīng)激)時(shí)的組織代謝。在臨床上，心功能不全在典型癥狀(呼吸困難、疲勞、液體潴留)存在時(shí)出現(xiàn)，其原因是基于收縮或舒張功能失常意義上的心功能失常。慢性心功能不全(CHF)同樣包括在本發(fā)明中(Kardiologiecompact,由 Chrisian Mewis, Reimer Riessen und 1akim Spyridopoulos 出版,2.未修訂版，Thieme2006)。心功能不全的原因可以是:心臟瓣膜缺陷(例如，風(fēng)濕熱的長(zhǎng)期后果)、心肌炎(心肌炎癥)、心律失常、除過(guò)高的血壓(高血壓)之外和/或附加冠狀血管動(dòng)脈硬化(鈣化)(冠心病)的心臟病發(fā)作。本發(fā)明還包括下列:伴有(充血性)心功能不全的高血壓性心臟病、伴有(充血性)心功能不全的高血壓性心臟病和腎病、原發(fā)性右心室功能不全、繼發(fā)性右心室功能不全、無(wú)不適左心室功能不全(NYHA(紐約心臟協(xié)會(huì))I級(jí))、增加負(fù)荷下有不適的左心室功能不全(NYHA II級(jí))、較輕負(fù)荷下有不適的左心室功能不全(NYHA III級(jí))、在靜息狀態(tài)下有不適的左心室功能不全(NYHA IV級(jí))和心源性休克。
[0019]在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“肺和呼吸道感染”特別是指由細(xì)菌、病毒、真菌或者寄生蟲(chóng)而導(dǎo)致的這種感染，例如，適應(yīng)癥如深部呼吸道感染(LRT1:下呼吸道感染)、支氣管炎、肺炎、結(jié)節(jié)病、支氣管擴(kuò)張、非心源性肺水腫。
[0020]而且，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選深部呼吸道感染(LRT1:下呼吸道感染)、支氣管炎、腐敗性支氣管炎、肺炎。特別優(yōu)選肺炎，尤其是社區(qū)獲得性肺炎(CAP:社區(qū)相關(guān)肺炎)、深部呼吸道感染(LRT1:下呼吸道感染)。
[0021]在本發(fā)明的范圍內(nèi)，肺炎被理解為急性或者慢性肺組織炎癥。其感染由細(xì)菌、病毒或者真菌引起，少數(shù)情況下通過(guò)吸入有毒物質(zhì)而毒性地引起或免疫引起。對(duì)于臨床醫(yī)生而言，肺炎構(gòu)成多種癥狀群(發(fā)熱或低體溫、戰(zhàn)栗、咳嗽、胸膜炎胸痛、痰量增加、呼吸頻率增加、濁音(KlopfSChalldSmpfung)、支氣管呼吸音、高頻率干羅音(ohrnahe
Rasselgeriiusche )、胸膜摩擦音)，聯(lián)合至少一種胸部X光可視浸潤(rùn)(HarrisonsInnere Medizinj herausgegeben von Manfred Dietelj Norbert Suttorp und MartinZeitzjABW Wissenschaftsverlag2005)。
[0022]在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“肺和呼吸道感染性疾病”或“肺和呼吸道炎性疾病”指以下適應(yīng)征:例如，間質(zhì)性肺疾病和肺纖維化，慢性阻塞性肺疾病(C0PD)、特別是COPD感染
加重，支氣管哮喘、特別是支氣管哮喘感染加重，支氣管癌。
[0023]根據(jù)本發(fā)明，CCffD指一組慢性疾病，其特征是咳嗽、痰多和負(fù)荷下呼吸困難。首先，要提及慢性阻塞性支氣管炎和肺氣腫。這兩種疾病的臨床表現(xiàn)尤其通過(guò)呼氣阻塞來(lái)表征。而且，CCffD的主要癥狀被通俗地稱為“吸煙者的咳嗽”。本發(fā)明在急性加重情況下尤其有利。
[0024]在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“CT-proADM”被理解為由33個(gè)氨基酸組成的游離人類(lèi)蛋白質(zhì)或者多肽，所述氨基酸具有氨基酸序列SEQ ID N0.1:SLPEAGPGRTLVSSKPQAHGAPAPPSGSAPHFL ;或片段，所述片段具有前腎上腺髓質(zhì)素原SEQ ID N0.2(圖1)的氨基酸序列153-185(153位表不 Ser,185 位表不 Leu)(Kitamura K, Sakata J, Kangawa K, Kojima M, MatsuoH，Eto T.Cloning and characterization of cDNA encoding aprecursor for humanadrenomedullin Biochem Biophys Res Communl993; 194:720-725);或其妝段和 / 或其片段。此類(lèi)片段可以是，例如，SEQ ID N0.1的氨基酸序列1-15和/或前腎上腺髓質(zhì)素原(圖1)的153-167或SEQ ID N0.1的19-33和/或前腎上腺髓質(zhì)素原(圖1)的171-185 (見(jiàn)實(shí)施例)。CT-proADM由于其血管收縮效應(yīng)也被稱為腎上腺升壓素(adrenotensin) (GumuselB，Chang JKj Hyman A，Lippton H.Adrenotensin:an ADM gene product with the oppositeeffects of ADM.Life Scil995;57:PL87_90)。
[0025]此外，根據(jù)本發(fā)明的“CT-proADM”可以具有修飾，例如乙二醇化或糖基化、脂化或
者衍生化。
[0026]在另一種實(shí)施方式中，“CT-proADM”(SEQ ID N0.1)也可額外連同其它標(biāo)志物測(cè)定，其中“CT-proADM”包含在標(biāo)志物組合(標(biāo)志物組，標(biāo)志物簇)中，即，優(yōu)選已經(jīng)指示出疾病的這種標(biāo)志物組合。然而，優(yōu)選此類(lèi)標(biāo)志物，其進(jìn)而指示出本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選的適應(yīng)癥/疾病，以及可以帶來(lái)協(xié)同效應(yīng)。
[0027]由此，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明方法的這樣的實(shí)施方式，其中額外連同至少一個(gè)選自下列的其它標(biāo)志物對(duì)待測(cè)患者進(jìn)行測(cè)定:炎癥標(biāo)志物、心血管標(biāo)志物、神經(jīng)激素標(biāo)志物或缺血標(biāo)志物。
[0028]根據(jù)本發(fā)明，炎癥標(biāo)志物可以選自下列至少一種標(biāo)志物:C_反應(yīng)蛋白(CRP)，細(xì)胞因子諸如例如TNF-α，白細(xì)胞介素諸如例如IL-6，降鈣素原(1_116，3-116)，和粘附分子如VCAM (血管細(xì)胞粘附分子)或者ICAM (細(xì)胞間粘附分子)；且心血管標(biāo)志物選自下列至少一種標(biāo)志物:肌酸激酶，髓過(guò)氧化物酶，和肽素，肌紅蛋白，利鈉蛋白——特別是ANP (或ANF), proANP, NT-proANP, BNP、proBNP, NT-proBNP或者在每一情況下其部分序列，心肌鈣蛋白，CRP。此外，還包括調(diào)節(jié)循環(huán)的激素(原)，特別是如胃泌素釋放肽原(proGRP)、內(nèi)皮素原(PiOEnd)、瘦蛋白原、神經(jīng)肽Y原、生長(zhǎng)抑素原、神經(jīng)肽YY原、阿黑皮素原、和肽素或在每一情況下其部分序列。
[0029]缺血標(biāo)志物可以選自下列至少一種標(biāo)志物:肌鈣蛋白I和T、CK_MB。此外，神經(jīng)激素標(biāo)志物可以是至少一種利鈉蛋白，特別是ANP (或ANF)、proANP、NT-proANP、BNP、proBNP、NT-proBNP或者在每一情況下其部分序列。
[0030]特別優(yōu)選的是CT-proADM與激素原，特別是proBNP、NT-proBNP的標(biāo)志物組合。
[0031]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法可以借助平行或同時(shí)測(cè)定標(biāo)志物(例如，96孔或更多孔的多孔滴定板)而實(shí)施，其中該測(cè)定對(duì)至少一個(gè)患者樣品進(jìn)行。
[0032]此外，根據(jù)本發(fā)明的方法及其測(cè)定也可以借助自動(dòng)分析設(shè)備進(jìn)行，特別是Kryptor (http://www.kryptor.net/)。
[0033]在另一實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法及其測(cè)定可以借助快速檢驗(yàn)(例如側(cè)流檢驗(yàn)(lateral-flow Test))進(jìn)行,無(wú)論是單參數(shù)還是多參數(shù)測(cè)定。
[0034]本發(fā)明另外涉及CT-proADM (SEQ ID N0.1)或其肽段或片段的應(yīng)用，用于疾病，特別是對(duì)心血管循環(huán)疾病、心功能不全、肺和呼吸道感染和/或炎癥的體外診斷和/或危險(xiǎn)分層。
[0035]在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及CT-proADM (SEQ ID N0.1)或其肽段或片段在心臟診斷中的應(yīng)用。
[0036]本發(fā)明另外涉及CT-proADM (SEQ ID N0.1)或其肽段或片段、或包含在標(biāo)志物組合(標(biāo)志物組、標(biāo)志物簇)中的應(yīng)用，用于對(duì)疾病，特別是對(duì)心血管循環(huán)疾病、心功能不全、肺和呼吸道感染和/或炎癥進(jìn)行體外診斷和/或危險(xiǎn)分層，以及尤其是考慮到上述實(shí)施方式。所述標(biāo)志物組合可以任選包含額外的合適標(biāo)志物。
[0037]另一個(gè)目的是提供合適的診斷設(shè)備或應(yīng)用所述設(shè)備實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法。
[0038]在本發(fā)明范圍內(nèi)，這種診斷設(shè)備被理解為特別是陣列或分析儀器(例如免疫分析、ELISA等)，在寬泛的意義上，其為用于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明方法的設(shè)備。
[0039]本發(fā)明還涉及試劑盒或者這種試劑盒的應(yīng)用，用于對(duì)疾病，特別是心血管疾病、心功能不全、肺和呼吸道感染和/或炎癥進(jìn)行體外診斷和/或者危險(xiǎn)分層，在所述方法中，特別考慮上述實(shí)施方式，對(duì)待測(cè)患者測(cè)定CT-proADM(SEQ ID N0.1)標(biāo)志物、或其肽段或片段、或包含在標(biāo)志物組合(標(biāo)志物組、標(biāo)志物簇)中的該標(biāo)志物。這種檢測(cè)試劑包括例如抗體等。
[0040]本發(fā)明因此涉及抗體，特別是單克隆抗體，用于CT-proADM的檢測(cè)，所述單克隆抗體優(yōu)選在SEQ ID N0.1的結(jié)合點(diǎn)位1-15或19-33彼此獨(dú)立地分別與CT-proADM單獨(dú)結(jié)合；或在這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)之一處或在這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)處結(jié)合所述CT-proADM。
[0041]下列實(shí)施例和附圖是為了對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的解釋?zhuān)景l(fā)明不限于這些實(shí)施例和附圖。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1顯示前腎上腺髓質(zhì)素原(pr印roADM)的氨基酸序列。
[0043]圖2顯示CT-proADM濃度與心功能不全的嚴(yán)重度有關(guān)。
[0044]圖3顯示CT-proADM濃度隨PSI而增大。
實(shí)施例:
[0045]免疫分析
[0046]肽合成
[0047]從preproADM的已知氨基酸序列選擇兩個(gè)區(qū)域(位置153-167、171-185)。各自補(bǔ)充有N末端半胱氨酸殘基的所述區(qū)域被化學(xué)合成、純化、借助于質(zhì)譜和反相HPLC檢測(cè)質(zhì)量、和根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法以等分試樣凍干為可溶肽(Firma JPT, Berlin, Deutschland)。該肽的氨基酸序列為:
[0048]PSK16CSLPEAGPGRTLVSSK 位置 153-167
[0049]PHL16CHGAPAPPSGSAPHFL 位置 171-185
[0050]此外，合成包含pr印roADM 的區(qū)域位置 153_185(PSL33SLPEAGPGRTLVSSKPQAHGAPAPPSGSAPHFL)的肽。
[0051]偶聯(lián)和免疫
[0052]借助于MBS (間馬來(lái)酰亞胺苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯)，使得多肽PSK16和PHL16與載體蛋白KLH (匙孔血藍(lán)蛋白)偶聯(lián)(見(jiàn)操作說(shuō)明書(shū)“NHS Esters-MaleimideCrosslinkers (NHS酯-馬來(lái)酰亞胺交聯(lián)劑”P(pán)ffiRCE公司，Rockford, IL, USA)。應(yīng)用這些偶聯(lián)物，按照如下步驟對(duì)綿羊免疫:每只綿羊最初接受100 μ g偶聯(lián)物(質(zhì)量數(shù)據(jù)基于偶聯(lián)物的肽部分)，并且接下來(lái)每四個(gè)星期接受50 μ g偶聯(lián)物(質(zhì)量數(shù)據(jù)基于偶聯(lián)物的肽部分)。從開(kāi)始免疫后四個(gè)月開(kāi)始，每4個(gè)星期從每只羊采集700ml血液，并通過(guò)離心獲得抗血清。偶聯(lián)、免疫和抗血清的提取由MicroPharm公司，Carmarthenshire UK進(jìn)行。[0053]抗體的純化
[0054]在一步法中，從已經(jīng)從免疫后四個(gè)月開(kāi)始提取的抗血清中制備肽特異性抗體。
[0055]對(duì)此，首先將肽PSK16和PHL16偶聯(lián)于SulfoLink凝膠(見(jiàn)操作說(shuō)明書(shū)“SulfoLinkKit”，PIERCE公司，Rockford, IL, USA)。在該方法中，對(duì)每5mg肽提供5ml凝膠進(jìn)行偶聯(lián)。
[0056]來(lái)自羊抗血清的肽特異性抗體針對(duì)肽的親和純化如下進(jìn)行:
[0057]首先對(duì)肽柱進(jìn)行三次交替清洗，其中各使用IOml洗脫緩沖液(50mM檸檬酸，pH值為2.2)和結(jié)合緩沖液(IOOmM磷酸鈉，0.1 %吐溫，pH值為6.8)。將IOOml抗血清經(jīng)0.2 μ m過(guò)濾并與現(xiàn)有的柱材料混合。為此，使用IOml結(jié)合緩沖液從柱定量地沖洗凝膠。在室溫下過(guò)夜震蕩進(jìn)行溫育。將沉積物定量地轉(zhuǎn)移到空柱(NAP25，Pharmacia，空的)。棄去通過(guò)物。然后用250ml結(jié)合緩沖液洗滌以便移去蛋白質(zhì)(洗脫液蛋白質(zhì)含量〈0.02A280nm)。在沖洗過(guò)的柱上加入洗脫緩沖液，收集各為一毫升的級(jí)分。用BCA-方法(見(jiàn)操作說(shuō)明書(shū)，PIERCE公司，Rockford, IL, USA)測(cè)定每一級(jí)分的蛋白質(zhì)含量。合并蛋白質(zhì)濃度>0.8mg/ml的級(jí)分。采用BCA方法對(duì)合并物進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)定后，得到產(chǎn)量為34mg的抗-PSK16抗體和48mg的抗-PHL16抗體。
[0058]標(biāo)記
[0059]按照操作說(shuō)明，經(jīng)NAP-5凝膠過(guò)濾柱(Pharmacia),將500 μ I經(jīng)過(guò)純化的抗-PSK16抗體(參見(jiàn)上文)在ImllOOmM的磷酸鉀緩沖液(pH值為8.0)中進(jìn)行充分緩沖。用IOOmM的磷酸鉀緩沖液(pH值為8.0)將抗體溶液的蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)為1.5mg/ml。
[0060]為了進(jìn)行化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，將抗體進(jìn)一步處理如下:用10 μ I的ΜΑ70-吖啶徵-NHS-酯(lmg/ml; H0ECHST公司Behring)處理67 μ I抗體溶液，并在室溫下溫育15分鐘。然后加入423 μ IlM的甘氨酸并再溫育10分鐘。接下來(lái)，按照操作說(shuō)明將標(biāo)記的沉積物在Iml洗脫液A (50mM磷酸鉀，IOOmM氯化鈉,pH值為7.4)中通過(guò)NAP-5凝膠過(guò)濾柱(Pharmacia)進(jìn)行充分緩沖，在該過(guò)程中，脫除低分子量組分。為了分離未連接于抗體的最終標(biāo)記殘余物，進(jìn)行凝膠過(guò)濾HPLC (柱:Waters Protein Pak SW300)。進(jìn)行試驗(yàn)，并且用洗脫液A在Iml/分鐘的流速下進(jìn)行層析。利用流率光度計(jì)對(duì)368nm和280nm波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)度。作為抗體標(biāo)記程度的度量的368nm/280nm吸光度比在峰值為0.10+/-0.01。采集包含單體抗體的級(jí)分(保留時(shí)間為8-10分鐘)并收集在3ml IOOmM磷酸鈉、150mM氯化鈉、5 %牛血清白蛋白、0.1%疊氮化鈉的液體中、pH值7.4中。
[0061]偶聯(lián)
[0062]用純化過(guò)的抗-PHL16抗體如下涂覆照射過(guò)的5ml小聚苯乙烯管(Greiner公司):該抗體在50mM的Tris、IOOmM氯化鈉、pH7.8中稀釋為濃度6.6 μ g/mL.在每個(gè)小管中吸入300 μ I該溶液。在22攝氏度下對(duì)小管進(jìn)行20小時(shí)溫育。抽吸溶液。然后對(duì)每個(gè)小管填充
4.2mlIOmM磷酸鈉、2% Karion FP、0.3%牛血清白蛋白、pH值6.5。20小時(shí)之后抽吸溶液。最后將小管在真空干燥器中干燥。
[0063]免疫試驗(yàn)的實(shí)施和分析
[0064]將在正常馬血清(SIGMA公司)中連續(xù)稀釋的肽PSL33用作標(biāo)準(zhǔn)材料。根據(jù)起始肽重量的濃度被指定給以此方式制得的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0065]夾心免疫分析如下述進(jìn)行:將50 μ I標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試物以及含有100萬(wàn)RLU(相對(duì)光單位)的MA70標(biāo)記抗體的200 μ I檢測(cè)緩沖劑(IOOmM磷酸鈉、150mM氯化鈉、5 %牛血清白蛋白、0.1%非特異性綿羊IgG、0.1%疊氮化鈉，PH7.4)吸入各自涂覆有抗體的小測(cè)試管中。在22°C在振蕩下進(jìn)行2小時(shí)的溫育。然后每次用Iml的清洗溶液(0.1% TWeen20)將各個(gè)小管清洗4次，滴盡并在光度計(jì)(BERTHOLD公司，LB952T; Basisreagenzien BRAHMS AG)中對(duì)粘附于小管的化學(xué)發(fā)光進(jìn)行測(cè)定。借助MultiCalc軟件(Spline Fit)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出測(cè)試物的CT-proADM濃度。
[0066]可用所述檢測(cè)測(cè)定的分析物被稱為C末端腎上腺髓質(zhì)素原(CT-proADM)。
[0067]臨床價(jià)值
[0068]正常范圍
[0069]在健康對(duì)照人的測(cè)試物(n=200 )中對(duì)CT-proADM的濃度進(jìn)行測(cè)定。中位數(shù)是77.6pmol/L，最低測(cè)量值是46.6，最高值是136.2pmol/L，95%百分位數(shù)值分別是58.6或113.8pmol/L。
[0070]心功能不全/嚴(yán)重度
[0071]測(cè)定患有慢性或急性失代償性心功能不全的患者的CT-proADM濃度。CT-proADM濃度與心功能不全的嚴(yán)重度有關(guān):在4個(gè)嚴(yán)重度NYHA分類(lèi)1-1V中，CT-proADM濃度的平均值為:85,107,140.4 或 242.7pmol/L(見(jiàn)圖 2)。
[0072]慢性心功能不全/診斷
[0073]CT-proADM值是對(duì)患有慢性心功能不全的316例患者組和200例健康對(duì)照組測(cè)定的。受者作用特征分析(Receiver-Operat or-Characteristics Analyse)不出 AUC 是
0.79。閾值(cut-off Wert)是122pmol/ml時(shí)，得出靈敏度39.7%和特異性98%.在閾值是113pmol/L下，得到靈敏度46.3%和特異性95%。
[0074]慢性心功能不全/預(yù)測(cè)(預(yù)后)
[0075]CT-proADM值是對(duì)患有慢性心功能不全的316例患者組測(cè)定的?；颊咴?60天的平均時(shí)期內(nèi)被觀察。在此期間死亡42例患者，存活274例。通過(guò)受者作用特征分析確定預(yù)測(cè)死亡率的最佳閾值(定義為靈敏度和特異性的最大乘積):119.7pmol/Lo在這個(gè)閾值下，預(yù)測(cè)的靈敏度是73.2%，特異性是62.2%。閾值119.7pg/ml下的死亡似然比是:1.9。
[0076]
【權(quán)利要求】
1.診斷標(biāo)志物，其由CT-proADM(SEQ ID N0.1)或其肽段或片段組成。
2.對(duì)疾病進(jìn)行診斷和/或危險(xiǎn)分層的方法，其特征在于，測(cè)定待測(cè)病人的CT-pix)ADM(SEQ ID N0.1)或其片段或肽段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法是體外診斷。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法，其特征在于，疾病，特別是心血管疾病、心功能不全、肺和呼吸道感染和/或炎癥的診斷和/或危險(xiǎn)分層在體外進(jìn)行。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于，所述心血管疾病包括高血壓、冠心病，尤其是急性冠狀動(dòng)脈綜合征、(急性)心肌梗塞、心絞痛。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于，所述心功能不全包括慢性心功能不全、伴有(充血性)心功能不全的高血壓性心臟病、伴有(充血性)心功能不全的高血壓性心臟病和腎病、原發(fā)性右心室功能不全、繼發(fā)性右心室功能不全、無(wú)不適左心室功能不全(NYHA(紐約心臟協(xié)會(huì))I級(jí))、增加應(yīng)力下有不適的左心室功能不全(NYHA II級(jí))、較輕應(yīng)力下有不適的左心室功能不全(NYHA III級(jí))、在休息狀態(tài)下有不適的左心室功能不全(NYHAIV級(jí))、心源性休克、心肌炎、心律不齊和/或高血壓。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于，所述肺和呼吸道感染和/或炎癥包括: a)由細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲(chóng)導(dǎo)致的感染、深部呼吸道感染(LRT1:下呼吸道感染)、支氣管炎、肺炎、結(jié)節(jié)病、支氣管擴(kuò)張、非心性肺水腫和/或 b.)間質(zhì)性肺疾病和肺纖維 化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)特別是COPD感染加重、支氣管哮喘特別是支氣管哮喘感染加重、支氣管癌。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于，至少一個(gè)選自下列的其他標(biāo)志物在待測(cè)患者中被額外測(cè)定:炎癥標(biāo)志物、心血管標(biāo)志物、神經(jīng)激素標(biāo)志物或缺血標(biāo)志物。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于，所述炎癥標(biāo)志物選自下列至少一種標(biāo)志物:C-反應(yīng)蛋白(CRP)，細(xì)胞因子諸如TNF-α，白細(xì)胞介素諸如例如IL-6，降鈣素原(1-116，3-116)，和粘附分子如 VCAM 或 ICAM。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于，所述心血管標(biāo)志物選自下列至少一種標(biāo)志物:肌酸激酶，髓過(guò)氧化物酶，和肽素，肌紅蛋白，利鈉蛋白，特別是ANP (或ANF)、proANP、NT-proANP、BNP、proBNP、NT-proBNP或在每一情況下其部分序列，心肌鈣蛋白，CRP,以及調(diào)節(jié)循環(huán)的激素(原)，如胃泌素釋放肽原(proGRP)、內(nèi)皮素I原、瘦蛋白原、神經(jīng)肽Y原、生長(zhǎng)抑素原、神經(jīng)肽YY原、阿黑皮素原、和肽素或在每一情況下其部分序列。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于，所述缺血標(biāo)志物選自下列至少一種標(biāo)志物:肌鈣蛋白I和T、CK-MB。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)激素標(biāo)志物是至少一種利鈉蛋白，特別是ANP (或者說(shuō)ANF)、proANP、 NT-proANP、BNP、proBNP、NT-proBNP或者在每一情況下其部分序列。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于，進(jìn)行標(biāo)志物的平行或者同時(shí)測(cè)定。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于，所述測(cè)定針對(duì)至少一個(gè)病人樣本進(jìn)行。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于，所述測(cè)定針對(duì)自動(dòng)分析設(shè)備，特別是借助于Kryptor進(jìn)行。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于，所述測(cè)定借助于快速檢驗(yàn)，特別是在單參數(shù)或多參數(shù)測(cè)定中進(jìn)行。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于，對(duì)患者進(jìn)行分層的診斷，用于臨床決策，尤其是借助疾病的處理或治療的藥物的進(jìn)一步治療，尤其是在重癥醫(yī)學(xué)或急救醫(yī)學(xué)中，并且用于患者的入院。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于，進(jìn)行所述診斷和/或危險(xiǎn)分層，用于預(yù)后、用于鑒別診斷性早期診斷和檢測(cè)、用于嚴(yán)重程度的評(píng)價(jià)、以及用于伴隨治療評(píng)估疾病過(guò)程，特別是對(duì)心血管疾病、心功能不全、肺和呼吸道感染和/或炎癥。
19.CT-proADM (SEQ ID N0.1)或其片段或肽段的應(yīng)用，用于疾病，特別是對(duì)心血管疾病、心功能不全、肺和呼吸道感染和/或炎癥的體外診斷和/或危險(xiǎn)分層。
20.CT-proADM (SEQ ID N0.1)或其片段或肽段在心臟診斷中的應(yīng)用。
21.CT-proADM (SEQ ID N0.1)或其肽段或片段或者包含在標(biāo)志物組合中的CT-proADM的應(yīng)用，用于疾病，特別是心血管疾病、心功能不全、肺和呼吸道感染和/或炎癥的體外診斷和/或危險(xiǎn)分層，所述標(biāo)志物組合包括根據(jù)權(quán)利要求8至12之一所述的其他標(biāo)志物、或者必要時(shí)包括另外的適合的標(biāo)志物。
22.實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求2至18之一所述方法的診斷裝置。
23.試劑盒，用于疾病，特別是心血管疾病、心功能不全、肺和呼吸道感染和/或炎癥的體外診斷和/或危險(xiǎn)分層，所述試劑盒包含:用于測(cè)定標(biāo)志物CT-proADM (SEQ ID N0.1)或其肽段或片段或者包含在標(biāo)志物組合中的CT-proADM的檢測(cè)試劑,所述標(biāo)志物組合包括根據(jù)權(quán)利要求8至12之一所述的其他標(biāo)志物；和助劑。
24.抗體，用于檢測(cè)CT-proADM (SEQ ID N0.1)。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103884841SQ201410026248
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2007年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2006年12月20日
【發(fā)明者】A·博格曼, J·斯塔克 申請(qǐng)人:布拉姆斯股份公司