用于生產(chǎn)葡萄糖聚合物和葡萄糖聚合物的水解產(chǎn)物的凈化回路的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種通過使用采用細(xì)胞系的炎癥應(yīng)答體外試驗(yàn)，用于確定生產(chǎn)步驟或純化步驟對葡萄糖聚合物或葡萄糖聚合物的水解產(chǎn)物中促炎污染分子的存在或性質(zhì)的影響的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種生產(chǎn)或純化葡萄糖聚合物或葡萄糖聚合物的水解產(chǎn)物的優(yōu)化方法，包括分析葡萄糖聚合物或葡萄糖聚合物的水解產(chǎn)物中的促炎污染分子以及選擇相對于促炎污染分子的存在或性質(zhì)被優(yōu)化的生產(chǎn)或純化步驟。
【專利說明】用于生產(chǎn)葡萄糖聚合物和葡萄糖聚合物的水解產(chǎn)物的凈化 回路的方法
[0001] 本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)或純化葡萄糖聚合物，更具體地是目的在于食品行業(yè)（富含 纖維的健康成分）和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域（腹膜透析）的那些，或葡萄糖聚合物的水解產(chǎn)物，更具體地 是目的在于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域（可注射的非熱原性葡萄糖）的那些的凈化回路的方法。
[0002] 發(fā)明的摶術(shù)背景
[0003] 本申請公司已經(jīng)選擇在如下領(lǐng)域研發(fā)其發(fā)明，該領(lǐng)域因微生物來源的污染物能夠 在用于生產(chǎn)葡萄糖聚合物的回路中、或在用于生產(chǎn)其水解產(chǎn)物的那些回路中發(fā)展的風(fēng)險而 眾所周知，所述污染物可能導(dǎo)致以下各項(xiàng)：
[0004] -食物中毒，
[0005] -對人類健康危害很大的炎癥反應(yīng)。
[0006] 因此在食品安全方法的背景下，如在健康安全方法的背景下，重要地是通過所有 適當(dāng)?shù)募夹g(shù)手段，特別是通過以下各項(xiàng)來確保不存在處于活細(xì)胞形式和處于細(xì)胞碎片形式 兩者的微生物來源的污染物 ：
[0007] -通過設(shè)置適當(dāng)?shù)募兓b置和技術(shù)限定安全生產(chǎn)回路，
[0008] -用于有效鑒別和測定污染物的方法的限定。
[0009] 例如，在腹膜透析的情況下，必需在嚴(yán)格的凈度條件下制備一定量的成分。
[0010] 腹膜透析事實(shí)上是一種類型的透析，它的目的是除去腎不能成功地或者不再能成 功地從血漿純化的廢物，例如脲、肌酸酐、過量的鉀或過剩水。這種醫(yī)學(xué)處理適用于終末期 慢性腎衰竭的情況。
[0011] 最常使用的透析液由在酸性pH(5. 2-5. 5)或生理pH(7. 4)下的緩沖溶液（乳 酸鹽緩沖溶液或碳酸氫鹽緩沖溶液）構(gòu)成，向其中添加電解質(zhì)（鈉、鈣、鎂、氯）并且尤 其是滲透劑（葡萄糖或葡萄糖聚合物，例如存在于由巴克斯特公司（Baxter)銷售的 EXTRANEAL?流動腹膜透析液中的"艾考糊精（icodextrin) "）。
[0012] 作為滲透劑，葡萄糖聚合物，如上文提到的艾考糊精，相對于葡萄糖是優(yōu)選的，原 因在于快速跨過腹膜的葡萄糖因其小尺寸而導(dǎo)致在2至4小時的輸注中滲透梯度的喪失。
[0013] 在將葡萄糖聚合物用于連續(xù)流動式腹膜透析的更具體領(lǐng)域中，非?？斓刈兊妹黠@ 的是，這些淀粉水解物（葡萄糖的混合物和葡萄糖低聚物和聚合物的混合物）不能夠按照 原樣使用。
[0014] 歐洲專利申請EP 207 676傳授在水中形成10%濃度的清澈和無色溶液的葡萄糖 聚合物是優(yōu)選的，所述葡萄糖聚合物具有5000至100 000道爾頓的重均分子量（Mw)和小 于8000道爾頓的數(shù)均分子量（Mn)。
[0015] 這類葡萄糖聚合物還優(yōu)選地包含其分子量在5000和50 000道爾頓之間的至少 80%葡萄糖聚合物，很少或沒有葡萄糖或葡萄糖聚合物，其中DP小于或等于3 (分子量504) 以及很少或沒有葡萄糖聚合物，其中分子量大于100 〇〇〇 (DP約600)。
[0016] 換言之，優(yōu)選的葡萄糖聚合物是具有低多分散性指數(shù)（通過計算Mw/Mn比率所獲 得的值）的葡萄糖聚合物。
[0017] 在所述專利申請EP 207 676中建議的用于從淀粉水解物獲得這些具有低多分散 性指數(shù)的葡萄糖聚合物的方法在于：
[0018] -用水混溶性溶劑進(jìn)行麥芽糊精的分級沉淀，
[0019] -或者通過擁有適當(dāng)?shù)慕亓艋蚺懦撝档牟煌ο嗤溠亢M(jìn)行分子過濾。
[0020] 在這兩種情況中，這些方法目的在于移除非常高分子量的聚合物以及低分子量單 體或寡聚物兩者。
[0021] 然而，就它們的實(shí)現(xiàn)方式而言并且就它們使可能獲得的產(chǎn)品的產(chǎn)率和質(zhì)量而言， 這些方法并不令人滿意。
[0022] 在有興趣發(fā)展一種用于產(chǎn)生具有優(yōu)選小于2. 5的低多分散性指數(shù)、優(yōu)選具有小于 8000道爾頓的Μη、并且具有在12 000和20 000道爾頓之間的Mw的完全水溶性葡萄糖聚 合物的方法中，所述方法沒有現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本申請公司在它的專利EP 667 356中努力 解決此問題，通過從水解淀粉而非麥芽糊精開始。
[0023] 通過色譜分級所獲得的葡萄糖聚合物則優(yōu)選含有少于3 %的葡萄糖和少于3%的 具有小于或等于3的DP的葡萄糖聚合物，以及少于0. 5%的具有大于600的DP的葡萄糖聚 合物。
[0024] 這種葡萄糖聚合最終由腹膜透析領(lǐng)域的專家接受，在于因其滲透能力使用的這些 葡萄糖聚合物是完全令人滿意的。
[0025] 然而，微生物污染意在用于腹膜透析的這些制品的風(fēng)險是令人痛惜的。
[0026] 事實(shí)上已知用于葡萄糖聚合物的生產(chǎn)回路可能受微生物或所述微生物中所含的 促炎物質(zhì)污染。
[0027] 例如淀粉工業(yè)中描述了玉米或小麥淀粉受酵母、霉菌以及細(xì)菌型微生物，并且更 具體地受酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidocaldarius)型的嗜酸熱細(xì)菌（在 回路的熱區(qū)域以及酸性區(qū)域生長的嗜極性細(xì)菌）污染。
[0028] 接受這些污染產(chǎn)品的患者的主要風(fēng)險則是腹膜炎。
[0029] 腹膜炎的這些發(fā)作是通過腹膜內(nèi)細(xì)菌感染引起的，并且通過陽性透析液培養(yǎng)通常 易于建立診斷。
[0030] "無菌性腹膜炎"，其被描述為無菌、化學(xué)或培養(yǎng)物陰性腹膜炎，就其本身來說一般 由化學(xué)刺激物或異物引起。
[0031] 自從引入艾考糊精用于制備腹膜透析液以來，已經(jīng)報告了無菌性腹膜炎的孤立病 例，這些病例可能與不同原因相關(guān)，并且特別由可能存在的促炎物質(zhì)誘導(dǎo)。
[0032] 無菌炎性發(fā)作因此是注射透析液后所觀察到的主要并發(fā)癥。
[0033] 雖然這些炎性發(fā)作的某些與化學(xué)性質(zhì)關(guān)聯(lián)（意外注射化學(xué)污染物或某些化合物 的不正確劑量），但是大部分病例與用來制備透析液的溶液中出現(xiàn)的微生物源污染物存在 直接相連。
[0034] 脂多糖（LPS)和肽聚糖（PGN)是甚至以痕量存在時導(dǎo)致引發(fā)炎癥的高風(fēng)險的主要 微生物源污染物。
[0035] 此外，本申請公司的榮譽(yù)在于也已經(jīng)考慮到存在這樣的分子，這些分子能夠加重 這些污染物，例如PGN解聚產(chǎn)物（其仍有生物活性的最少結(jié)構(gòu)是胞壁酰二肽（MDP))引起的 炎癥應(yīng)答。
[0036] 單獨(dú)考慮時，這些衍生物在體外不是非常有炎性的并且針對大于1 μ g/ml的值給 出顯著應(yīng)答。
[0037] 除PGN解聚產(chǎn)物之外，甲酰化微生物肽，其原型是f-MLP (甲?；?Met-Leu-Phe三 肽），也具有實(shí)質(zhì)性的協(xié)同活性。最初，這些肽因它們對白細(xì)胞的趨化劑活性而鑒定，盡管它 們不能誘導(dǎo)細(xì)胞因子反應(yīng)本身。
[0038] 因此重要的不是忽略這些"小分子"，因?yàn)樗鼈兛梢酝ㄟ^加重痕量PGN和/或LPS 的作用間接地引起無菌炎性發(fā)作。
[0039] 藥典提出了如下一連串的用于檢測熱原性物質(zhì)的測試：
[0040] -用于檢測是革蘭氏陰性細(xì)菌的主要組分的細(xì)菌內(nèi)毒素（LAL測試），
[0041] -兔熱原測試。
[0042] 雖然總體上是可靠的，但是這兩種測試具有它們的局限。兔熱原測試是基于熱原 性物質(zhì)的間接檢測，通過測量注射含有這些物質(zhì)的產(chǎn)品的兔的體溫升高（發(fā)熱反應(yīng)）。 [0043] 如果不希望的物質(zhì)具有太弱的生物活性或者濃度太低而不能誘導(dǎo)全身生熱反應(yīng)， 此測試會產(chǎn)生假陰性。
[0044] 此外，此物質(zhì)可能具有足以產(chǎn)生局部炎性反應(yīng)的生物活性或濃度。
[0045] LAL測試，就其本身而言，只檢測細(xì)菌內(nèi)毒素（LPS)以及還有β -葡聚糖，它們是真 菌菌群的壁組分。未檢測其他生物雜質(zhì)（DNA、肽聚糖等）。
[0046] 因此對于某些情況，用含有艾考糊精的腹膜透析液觀察到的無菌性腹膜炎的表現(xiàn) 證明了一些物質(zhì)可以逃過在藥典中描述的測試并且可能造成不希望的臨床效果的方式。
[0047] 為糾正此情況，BAXTER公司已經(jīng)建議進(jìn)行檢測革蘭氏陽性微生物污染物的努力。
[0048] 特別是，在它的專利EP 1 720 999中，BAXTER公司提出特別是在用于制備腹膜透 析液的葡萄糖聚合物中發(fā)展基于檢測肽聚糖的方法，肽聚糖是革蘭氏陽性菌細(xì)胞膜的主要 組分。
[0049] 換言之，為防止出現(xiàn)這些無菌腹膜炎發(fā)作，BAXTER公司針對腹膜透析液的產(chǎn)生以 及使用建議了一個將檢測腹膜透析液中的肽聚糖的方案。
[0050] 此外，雖然在這一專利EP 1 720 999中提到葡萄糖聚合物的上游處理，這一處理 僅借助能夠這樣截留肽聚糖的親和性樹脂。
[0051] 因此沒有預(yù)想以這樣一種方式修飾用于生產(chǎn)葡萄糖聚合物的方法，該方式使最終 產(chǎn)物不含有酸熱環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌型嗜酸熱細(xì)菌的或這些具體細(xì)菌的細(xì)胞膜碎片的污 染。
[0052] 另一方面，在其國際專利申請WO 2010/125315中，借助制備和純化安全方法，本 申請公司提供用于具有更好的品質(zhì)的腹膜透析的物質(zhì)，在這種情況下是葡萄糖聚合物，用 來確保這些物質(zhì)有效地不含有污染物質(zhì)。
[0053] 本申請公司已經(jīng)實(shí)施一種值得注意的純化方法，結(jié)合一定數(shù)量的以適合預(yù)防任何 污染的方式組織的用活性炭/顆粒狀炭黑處理、過濾（微量過濾和超濾）、以及熱處理的步 驟。
[0054] 然而，可以對這一方法進(jìn)行改進(jìn)，并且本申請公司已經(jīng)致力于研發(fā)比現(xiàn)有技術(shù)中 可得的那些更加有效的檢測和測定方法，以更好地限定為了確保生產(chǎn)線（特別是葡萄糖聚 合物）的最佳安全性而有待實(shí)施的關(guān)鍵方法步驟。
[0055] 在上述所有中，借助制備和純化安全方法，仍然存在對于提供用于具有更好的品 質(zhì)的治療應(yīng)用的物質(zhì)的未滿足的需求，在這種情況下是葡萄糖聚合物及其水解產(chǎn)物，用來 確保這些物質(zhì)有效地不含有污染物質(zhì)。
[0056] 因此本申請公司已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過實(shí)施適當(dāng)?shù)募兓襟E可以滿足這一需求，借助于用 于檢測和測定污染物的完全特異的方法，可以測量這些純化步驟的效力。
[0057] 經(jīng)過過去數(shù)年，已經(jīng)開發(fā)了使用原代細(xì)胞的許多試驗(yàn)，以便替代炎癥應(yīng)答試驗(yàn)中 的動物模型。
[0058] 然而，這些體外模型遭受巨大的個體間變異性，這可能是實(shí)驗(yàn)偏倚的原因。
[0059] 相反，單核細(xì)胞細(xì)胞系給出恒定反應(yīng)，由此解釋了目前正在開發(fā)的試驗(yàn)為何日益 使用培養(yǎng)的這種類型細(xì)胞。然而，這些試驗(yàn)具有對溶液中作為混合物存在的全部污染物給 出總體炎癥應(yīng)答的缺點(diǎn)，并且因此導(dǎo)致不可能表征污染物的性質(zhì)。
[0060] 還重要地指出，對于炎癥急性期細(xì)胞因子（例如TNF-α (腫瘤壞死因子α))、 IL-I β (白介素1 β )和趨化因子（例如CCL5 (趨化因子（C-C單元）配體5)) /RANTES (激 活時受調(diào)節(jié)，正常T-細(xì)胞表達(dá)和分泌），加重的炎癥應(yīng)答是可見到的，但是對于IL-6 (白介 素6)，不是或幾乎不是可見的。
[0061] 因此，基于后者產(chǎn)生的方法（US 2009/0239819和US2007/0184496)不適合檢測溶 液中作為混合物的污染物。
[0062] 本申請公司已經(jīng)得出以下結(jié)論：
[0063] (i)難以檢測生物溶液中以痕量存在的細(xì)菌性污染物，
[0064] (ii)重要地是不限于檢測PGN和LPS，原因在于協(xié)同作用，
[0065] (iii)需要開發(fā)靈敏和可重復(fù)的新檢測方法，并且
[0066] (iv)有利地是使用能夠表征污染物性質(zhì)的靈敏和可重復(fù)的檢測方法。
[0067] 因此本申請公司的榮譽(yù)在于已經(jīng)開發(fā)了用于檢測具有促炎作用的微生物污染物 的靈敏且有效方法，低于目前使用和/或文獻(xiàn)中描述的程序的靈敏度閾值，并且隨后在于 鑒定了源自生產(chǎn)回路的批次中以痕量存在的促炎分子的家族或甚至其性質(zhì)。
[0068] 發(fā)明概沭
[0069] 本發(fā)明涉及一種用于試驗(yàn)一個生產(chǎn)步驟或多個生產(chǎn)步驟對葡萄糖聚合物或其水 解產(chǎn)物中促炎分子的存在或其性質(zhì)的影響或一個純化步驟或多個純化步驟對葡萄糖聚合 物或其水解產(chǎn)物中促炎分子的存在或其性質(zhì)的效力的方法，該方法包括：
[0070] a)提供葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物；
[0071] b)任選地，檢測或測定步驟a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分 子；
[0072] c)對步驟a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物進(jìn)行該一個或多個生產(chǎn)或純化 步驟；
[0073] d)檢測或測定步驟c)后獲得的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分子；
[0074] e)確定步驟c)對促炎分子的存在或性質(zhì)的效力或效果；
[0075] 其中用于檢測或測定這些葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分子的步驟包括 使用細(xì)胞系進(jìn)行的體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)，該細(xì)胞系是巨噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞-分化的細(xì)胞系， 或是表達(dá)一種或多種TLR(T 〇ll樣受體）或NOD (含有核苷酸結(jié)合性寡聚結(jié)構(gòu)域的蛋白）受 體，例如，TLR2、TLR4或N0D2的細(xì)胞，并且使得檢測該一個或多個受體、或其組合的應(yīng)答成 為可能。
[0076] 本發(fā)明還涉及一種用于生產(chǎn)或純化葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物的優(yōu)化方法，該優(yōu) 化方法包括：
[0077] a)提供葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物；
[0078] b)檢測或測定步驟a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分子；
[0079] c)選擇用于生產(chǎn)或純化這些葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物的一個或多個步驟，這個 或這些步驟適用于葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中存在的促炎分子；
[0080] d)任選地，對步驟a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物進(jìn)行該一個或多個選 擇的生產(chǎn)或純化步驟；并且
[0081] e)任選地，檢測或測定步驟d)后獲得的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分 子；
[0082] 其中用于檢測或測定這些葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分子的步驟包括 使用細(xì)胞系進(jìn)行的體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)，該細(xì)胞系是巨噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞-分化的細(xì)胞系， 或是表達(dá)一種或多種TLR(T〇ll樣受體）或NOD (含有核苷酸結(jié)合性寡聚結(jié)構(gòu)域的蛋白）受 體，例如，TLR2、TLR4或N0D2的細(xì)胞，并且使得檢測該一個或多個受體、或其組合的應(yīng)答成 為可能。
[0083] 在一個第一方面，該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)可以包括使得這些葡萄糖聚合物或其水解 產(chǎn)物與MDP-或LPS-敏化的、巨噬細(xì)胞-分化的THP-I細(xì)胞系相接觸，通過測量由該細(xì)胞系 產(chǎn)生的RANTES或TNF- α的量來檢測或測定這些促炎分子。
[0084] 在一個第二方面，該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)可以包括使得這些葡萄糖聚合物或其水解 產(chǎn)物與用報告基因轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞系相接觸，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在炎癥信號通路的直接 控制下，例如Raw-Blue?系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這些促炎分 子。
[0085] 在一個第三方面，該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)可以包括使得這些葡萄糖聚合物或其水解 產(chǎn)物與表達(dá)TLR2受體和報告基因的細(xì)胞系相接觸，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在TLR2信號通路 的直接控制下，例如HEK-BlueTMhTLR2系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定 這些促炎分子。
[0086] 在一個第四方面，該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)可以包括使得這些葡萄糖聚合物或其水解 產(chǎn)物與表達(dá)N0D2受體和報告基因的細(xì)胞系相接觸，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在N0D2信號通路 的直接控制下，例如HEK-Blue? hN0D2系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定 這些促炎分子。
[0087] 在一個第五方面，該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)可以包括使得這些葡萄糖聚合物或其水解 產(chǎn)物與表達(dá)TLR4受體和報告基因的細(xì)胞系相接觸，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在TLR4信號通路 的直接控制下，例如HEK-BlueTMhTLR4系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定 這些促炎分子。
[0088] 在一個第六方面，該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)可以包括使得這些葡萄糖聚合物或其水解 產(chǎn)物與以下各項(xiàng)相接觸：
[0089] a. MDP-或LPS-敏化的、巨噬細(xì)胞-分化的THP-I細(xì)胞系，通過測量由該細(xì)胞系產(chǎn) 生的RANTES或TNF- α的量來檢測或測定這些促炎分子；和/或
[0090] b.用報告基因轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞系，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在炎癥信號通路的直接控 制下，例如Raw-Blue?系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這些促炎分子； 和/或
[0091] c.表達(dá)TLR2受體和報告基因的細(xì)胞系，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在TLR2信號通路的 直接控制下，例如HEK-Blue? hTLR2系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這 些促炎分子；和/或
[0092] d.表達(dá)N0D2受體和報告基因的細(xì)胞系，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在N0D2信號通路的 直接控制下，例如HEK-Blue? hN0D2系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這 些促炎分子；和/或
[0093] e.表達(dá)TLR4受體和報告基因的細(xì)胞系，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在TLR4信號通路的 直接控制下，例如HEK-Blue? hTLR4系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這 些促炎分子；和/或
[0094] f.未經(jīng)免疫受體轉(zhuǎn)染的對照系。
[0095] 在一個第七方面，該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)可以包括使得這些葡萄糖聚合物或其水解 產(chǎn)物與以下各項(xiàng)相接觸：
[0096] a.用報告基因轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞系，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在炎癥信號通路的直接控 制下，例如Raw-Blue?系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這些促炎分子；
[0097] b.表達(dá)TLR2受體和報告基因的細(xì)胞系，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在TLR2信號通路的 直接控制下，例如HEK-Blue TMhTLR2系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這 些促炎分子；和/或
[0098] c.表達(dá)TLR4受體和報告基因的細(xì)胞系，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在TLR4信號通路的 直接控制下，例如HEK-Blue? hTLR4系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這 些促炎分子；和/或
[0099] d.表達(dá)N0D2受體和報告基因的細(xì)胞系，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在N0D2信號通路的 直接控制下，例如HEK-Blue? hN0D2系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這 些促炎分子；和
[0100] e.未經(jīng)免疫受體轉(zhuǎn)染的對照系，例如HEK-Blue? Null2系。
[0101] 優(yōu)選地，這些促炎分子是細(xì)菌來源的分子，優(yōu)選地選自PGN、LPS、脂肽、PGN解聚產(chǎn) 物，特別是MDP、甲?；⑸镫睦鏵-MLP、以及β -葡聚糖。
[0102] 優(yōu)選地，該一個或多個生產(chǎn)或純化步驟選自以下步驟：熱處理、酸化、穿過活性炭、 穿過吸附樹脂、超濾、過濾、或化學(xué)或酶水解。
[0103] 優(yōu)選地，這些葡萄糖聚合物選自艾考糊精和麥芽糊精，特別是分枝的或未分枝的 麥芽糊精，并且這些葡萄糖聚合物水解產(chǎn)物是完全水解的產(chǎn)物，例如，一水右旋糖。
[0104] 預(yù)過濾葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物的樣品，特別是用30kDa的截取閾值，并且使 得該濾液與本試驗(yàn)中使用的細(xì)胞系相接觸。
[0105] 發(fā)明詳細(xì)說明
[0106] 本發(fā)明因此涉及一種用于試驗(yàn)一個生產(chǎn)步驟或多個生產(chǎn)步驟對葡萄糖聚合物或 其水解產(chǎn)物中促炎分子的存在或其性質(zhì)的效果或影響或一個純化步驟或多個純化步驟對 葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中促炎分子的存在或其性質(zhì)的效力的方法，該方法包括：
[0107] a)提供葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物；
[0108] b)任選地，檢測或測定步驟a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分 子；
[0109] c)對步驟a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物進(jìn)行該一個或多個生產(chǎn)或純化 步驟；
[0110] d)檢測或測定步驟C)后獲得的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分子；
[0111] e)確定步驟c)對促炎分子的存在或性質(zhì)的效力或效果；
[0112] 其中用于檢測或測定這些葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分子的步驟包括 使用細(xì)胞系進(jìn)行的體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)，該細(xì)胞系是巨噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞-分化的細(xì)胞系， 或是表達(dá)一種或多種TLR(T 〇ll樣受體）或NOD (含有核苷酸結(jié)合性寡聚結(jié)構(gòu)域的蛋白）受 體，例如，TLR2、TLR4或N0D2的一種細(xì)胞，并且使得檢測該一個或多個受體、或其組合的應(yīng) 答成為可能。
[0113] 該方法可以包括，特別是在步驟e)背景下，步驟b)和d)中檢測或測定的、這些葡 萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分子的比較。因此，促炎分子或這些分子中的一些的量 的減少指示生產(chǎn)或純化步驟對這些葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物凈化的效力。促炎分子的量 和性質(zhì)將由下文詳細(xì)描述的方法確定。
[0114] 具體地，本發(fā)明的目標(biāo)是研發(fā)一種優(yōu)化方法，用于凈化葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn) 物，特別是用于制備腹膜透析液的葡萄糖聚合物，該方法優(yōu)選地包括通過體外炎癥應(yīng)答試 驗(yàn)來檢測或測定促炎分子。
[0115] 具體地，一旦已經(jīng)表征這些純化或生產(chǎn)步驟對促炎分子的效果或效力，特別是根 據(jù)其存在及其性質(zhì)，考慮到存在于這些葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分子，本領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員能夠選擇最適合的步驟。因此，該優(yōu)化方法包括：
[0116] a)提供葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物；
[0117] b)檢測或測定步驟a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分子；
[0118] c)選擇用于生產(chǎn)或純化這些葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物的一個或多個步驟，這個 或這些步驟適用于葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中存在的促炎分子；
[0119] d)任選地，對步驟a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物進(jìn)行該一個或多個選 擇的生產(chǎn)或純化步驟；并且
[0120] e)任選地，檢測或測定步驟d)后獲得的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分 子；
[0121] 其中用于檢測或測定這些葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分子的步驟包括 使用細(xì)胞系進(jìn)行的體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)，該細(xì)胞系是巨噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞-分化的細(xì)胞系， 或是表達(dá)一種或多種TLR(T 〇ll樣受體）或NOD (含有核苷酸結(jié)合性寡聚結(jié)構(gòu)域的蛋白）受 體，例如，TLR2、TLR4或N0D2的細(xì)胞，并且使得檢測該一個或多個受體、或其組合的應(yīng)答成 為可能。
[0122] 這些葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物可以用于腹膜透析、腸內(nèi)及腸胃外給食和新生嬰 兒給食。
[0123] 在一個優(yōu)選實(shí)施例中，將在本發(fā)明背景下制備的葡萄糖聚合物是艾考糊精或麥芽 糊精（分枝或不分枝的，如將在下文描述的）。
[0124] 在此提及的葡萄糖聚合物水解產(chǎn)物具體地被認(rèn)為是完全水解的產(chǎn)物，例如，在本 申請公司的商標(biāo)LYCADEX s= PF下銷售的非熱原性的一水右旋糖。
[0125] 它們可以在其制備的一個或多個階段，并且特別是在原料水平、在其制備方法中 的任何步驟和/或在該方法的成品水平被凈化。
[0126] 因此，在根據(jù)本發(fā)明的方法中提供的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物對應(yīng)于原料、對 應(yīng)于在制備方法中的任何水平的產(chǎn)物或?qū)?yīng)于成品。
[0127] 這些促炎污染物尤其是細(xì)菌來源的分子。它們具體可以是PGN、LPS、脂肽、PGN解 聚產(chǎn)物，特別是MDP、甲酰化微生物肽例如f-MLP、β -葡聚糖，等。
[0128] 為了監(jiān)控用于制備于人類中用作治療性用途的葡萄糖聚合物（例如，腹膜透析 液）的方法的凈化步驟的效力，在本發(fā)明背景下使用的、用于體外測量炎癥應(yīng)答的方法基 于細(xì)胞試驗(yàn)（"生物測定")，使用單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞型細(xì)胞系（ΤΗΡ-1、和/或Raw-Blue?) 以及表達(dá)天然免疫的特異性受體的、經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系（HEK-Blue?)。
[0129] THP-I系（88081201，ECACC)是人幼單核細(xì)胞系。對于促炎應(yīng)答試驗(yàn)，這些細(xì)胞在 佛波醇酯（PM)存在下持續(xù)3日分化成單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。
[0130] 對于根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的這些試驗(yàn)，巨噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分化的細(xì)胞，特別是巨噬 細(xì)胞分化的THP-I細(xì)胞在MDP，特別是金黃色葡萄球菌（S. aureus) MDP存在下被敏化。這是 因?yàn)镸DP是一種弱炎癥性誘導(dǎo)物，但是已知其與其他炎癥性分子協(xié)同作用。這種特性基于 以下事實(shí)：這些分子經(jīng)由干預(yù)除MDP，尤其是TLR之外的受體發(fā)揮作用。因此，MDP的存在將 加劇由葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物溶液中存在的污染物誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答，由此使得可能檢 測低劑量的污染物。優(yōu)選地，將MDP以多于1 μ g/ml的濃度、優(yōu)選地以1和100 μ g/ml之間 的濃度添加至樣品。在一個相當(dāng)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，將MDP以10μ g/ml的濃度添加至樣 品。
[0131] 可替代地，巨噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分化的細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞分化的THP-I細(xì)胞， 可以在除MDP之外的分子的存在下被敏化。事實(shí)上，還可以使用LPS，特別是來自大腸桿菌 的LPS。可以將其以至少10pg/ml的濃度，例如以25pg/ml的濃度添加至樣品。
[0132] 在一個優(yōu)選實(shí)施例中，將巨噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分化的細(xì)胞、特別是巨噬細(xì)胞分化 的THP-I細(xì)胞以0. 5和I X IO6個細(xì)胞/ml培養(yǎng)基之間、優(yōu)選地0. 7和0. 8 X IO6個細(xì)胞/ml 之間和甚至更優(yōu)選地約0. 75 X IO6個細(xì)胞/ml的密度使用。
[0133] 該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)基于由THP-1細(xì)胞敏化的RANTES生產(chǎn)的測量。這是因?yàn)橄惹?研究表明這種趨化因子的測定適合用于檢測葡萄糖聚合物溶液中的低劑量的污染物，特別 是內(nèi)毒素。可替代地，該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)還可以基于由敏化的THP-I細(xì)胞生產(chǎn)的TNF-α 的測量。這些細(xì)胞因子的測定可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的任何手段并且特別是通 過ELISA實(shí)施。在一個優(yōu)選實(shí)施例中，該試驗(yàn)包括在刺激8小時后測量TNF-α的產(chǎn)生。在 另一個優(yōu)選實(shí)施例中，該試驗(yàn)包括在刺激20h后，特別是借助ELISA測定法測量RANTES的 產(chǎn)生。
[0134] 這個第一試驗(yàn)使得可能去檢測葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物被PGN和/或LPS、優(yōu)選 地被PGN(中等大?。ㄌ貏e是約120kDa))和/或LPS、甚至更具體地被LPS污染。
[0135] 該Raw-Blue?系是用報告基因轉(zhuǎn)染的小鼠巨噬細(xì)胞系，該報告基因產(chǎn)生一種分泌 形式的堿性磷酸酶（SEAP :分泌型胚性堿性磷酸酶），其轉(zhuǎn)錄處于炎癥性信號通路的直接控 制下。這個系的優(yōu)點(diǎn)是它天然地表達(dá)幾乎全部天然免疫受體，包括TLR2、TLR4和N0D2受 體。因此，這些細(xì)胞將響應(yīng)于大多數(shù)炎癥性污染物，并且該響應(yīng)將通過測量產(chǎn)生的SEAP的 酶活性來監(jiān)控。優(yōu)選地，這個系以約0.5 X IO6個細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度在本試驗(yàn)中使用。這 使得葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物的制劑與這些細(xì)胞接觸持續(xù)約16至24h。
[0136] 這些細(xì)胞系，特別是HEK-BlueTM(InVi V〇Gen公司），是通過用編碼天然免疫受體 (特別是人（h)受體）的載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染來修飾的。它們還與報告基因，特別是產(chǎn)生SEAP的 報告基因共轉(zhuǎn)染，其合成處于與過表達(dá)的受體相關(guān)的信號通路的直接控制下。優(yōu)選地，這種 報道基因編碼有色蛋白或熒光蛋白或編碼可以在底物存在或不存在下測量其活性的蛋白。 這種報告基因的信號的活性的檢測表明該樣品含有能夠激活一種或多種天然免疫受體和 能夠觸發(fā)炎癥性反應(yīng)的污染物。這類系的使用使得可能根據(jù)表達(dá)的受體靶向微生物源分子 的某些家族。優(yōu)選地，使用表達(dá)hTLR2或hTLR4或hN0D2的細(xì)胞系。此外，還使用不表達(dá)天 然免疫受體的對照系。該對照系的使用對于驗(yàn)證葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物溶液不經(jīng)由寄 生機(jī)制，例如，毒性機(jī)制誘導(dǎo)報告基因產(chǎn)生是有用的。
[0137] 對于根據(jù)本發(fā)明的試驗(yàn)，優(yōu)選使用四個系：
[0138] -HEK-Blue? hTLR2系：這個系表達(dá)特異性響應(yīng)于TLR2激動劑的hTLR2受體（尤 其是PGN和脂肽）。它的使用因此使得可能知道這些污染物在觸發(fā)炎癥應(yīng)答中的水平，
[0139] -HEK-Blue? hTLR4系：這個系表達(dá)特異性響應(yīng)于LPS的hTLR4受體。它的使用因 此使得可能知道這些污染物在觸發(fā)炎癥應(yīng)答中的水平，
[0140] -HEK-Blue? hN0D2系：這個系表達(dá)特異性響應(yīng)于N0D2激動劑的hN0D2受體。它 的使用因此使得可能知道MDP和相關(guān)分子在觸發(fā)炎癥應(yīng)答中的水平，
[0141] -HEK-Blue? Null2系：它是未經(jīng)免疫受體轉(zhuǎn)染的對照系。它的使用是必須的，以 驗(yàn)證葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物溶液不經(jīng)由毒性機(jī)制誘導(dǎo)SEAP產(chǎn)生。
[0142] 然而，應(yīng)當(dāng)指出本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以使用其他可商業(yè)獲得系（Imgenex公司）或 他們可以制備這些系。
[0143] 在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，這些細(xì)胞系以0. 5和IX IO6個細(xì)胞/ml培養(yǎng)基的密度使 用，并且使得葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物的制劑與這些細(xì)胞接觸持續(xù)約16至24h。
[0144] 可以通過劑量-應(yīng)答曲線實(shí)施對這些污染物的定量。這種劑量-應(yīng)答曲線可以特 別是用相同的細(xì)胞在相同條件下伴以遞增劑量的污染物時產(chǎn)生。這些劑量-應(yīng)答曲線具體 地用LPS、PGN、脂肽、β -葡聚糖和MDP標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生。優(yōu)選地，這種劑量-應(yīng)答曲線可以針對 以下各項(xiàng)而生成：表達(dá)TLR4的細(xì)胞（例如，THP-1、HEK-Blue? hTLR4和Raw-Blue?)，具有 遞增劑量的LPS產(chǎn)生；針對表達(dá)TLR2 (例如，THP-I、HEK-Blue?hTLR2和Raw-Blue?)，具有 遞增劑量的PGN產(chǎn)生；并且針對經(jīng)由N0D2反應(yīng)的細(xì)胞（例如，HEK-Blue? hN0D2)，具有遞 增劑量的MDP產(chǎn)生。
[0145] 在具體實(shí)施例中，該THP-I、Raw-Blue?和HEK-Blue?系用遞增濃度的標(biāo)準(zhǔn)品孵育， 并且通過針對THP-I系通過ELISA定量RANTES產(chǎn)生以及針對Raw-Blue?和HEK-Blue?系， 通過報告基因，特別是SEAP酶活性的測量，來測量細(xì)胞應(yīng)答。
[0146] 根據(jù)本發(fā)明的試驗(yàn)使得可能辨別能夠觸發(fā)炎癥反應(yīng)的一種或多種污染物。因此， 表達(dá)N0D2,特別是HEK-Blue? hN0D2的系使得可能相當(dāng)具體地檢測PGN解聚產(chǎn)物和MDP污 染、優(yōu)選地MDP污染。表達(dá)TLR2,特別是HEK-Blue? hTLR2和/或Raw-Blue?的系使得可 能相當(dāng)具體地檢測PGN污染。另外，巨噬細(xì)胞、特別是THP-I巨噬細(xì)胞，以及表達(dá)TLR4,特別 是HEK-Blue? hTLR4的系使得可能相當(dāng)具體地檢測LPS污染。
[0147] 在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)包括使用以下細(xì)胞系的試驗(yàn)：
[0148] -巨噬細(xì)胞，特別是THP-I巨噬細(xì)胞；使得可能檢測TLR2受體活性的細(xì)胞系，特別 是HEK-Blue? hTLR2系；使得可能檢測TLR4受體活性的細(xì)胞系，特別是HEK-Blue?hTLR4 系；使得可能檢測N0D2受體活性的細(xì)胞系，特別是HEK-Blue? hN0D2系；以及可任選地，但 是優(yōu)選地，對照系，特別是HEK-Blue? Null2系；或
[0149] -用報告基因轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞系，特別是Raw-Blue?系；使得可能檢測TLR2 受體活性的細(xì)胞系，特別是HEK-Blue? hTLR2系；使得可能檢測TLR4受體活性的細(xì)胞系，特 別是HEK-Blue? hTLR4系；使得可能檢測N0D2受體活性的細(xì)胞系，特別是HEK-Blue?hN0D2 系；以及可任選地，但是優(yōu)選地，對照系，特別是HEK -Blue?Null2系。
[0150] 在該優(yōu)選實(shí)施例中，使用上述五種細(xì)胞類型對不同樣品中污染物的存在進(jìn)行試 驗(yàn)，以使得知道常規(guī)炎癥應(yīng)答，還有針對某些污染物的特異性應(yīng)答：
[0151] -MDP-敏化的THP-I系：對于LPS具有強(qiáng)反應(yīng)性的任何污染物，
[0152] -Raw-Blue?系：對于PGN具有強(qiáng)反應(yīng)性的任何污染物，
[0153] -HEK-Blue? hTLR2 系：PGN 和其他 TLR2 配體（脂肽等），
[0154] -HEK-Blue? hTLR4 系：LPS，
[0155] -HEK-Blue? hN0D2 系：MDP 和 PGN 解聚產(chǎn)物，
[0156] -HEK-Blue? Null2 系：陰性對照。
[0157] 在根據(jù)本發(fā)明的方法中，該一個或多個生產(chǎn)或純化步驟可以選自以下步驟：熱處 理、酸化、穿過活性炭、穿過吸附樹脂、超濾、過濾、或化學(xué)或酶水解、或其組合。針對每一步 驟，可以試驗(yàn)不同參數(shù)，使得可能選擇最有效的那些。例如，在穿過活性炭的情況下，可以試 驗(yàn)不同品質(zhì)的活性炭及其組合。在超濾的情況下，將可能試驗(yàn)不同截取閾值和/或組合它 們。在熱處理的情況下，將可能改變處理溫度及時間。在酶處理的情況下，將可能改變所使 用的一種或多種酶，它們的濃度及其處理?xiàng)l件。
[0158] 在一個非常具體的實(shí)施例中，對以在非熱原性水（例如，注射劑）中32% (重量/ 體積）而制備的樣品進(jìn)行這些處理，并且然后將這些溶液通過0.22 μ m過濾。對于這些細(xì) 胞試驗(yàn)，將這些樣品稀釋為在細(xì)胞培養(yǎng)基中的1/10(最終濃度：3.2% (w/v))。
[0159] 在進(jìn)行試驗(yàn)以檢測或測定促炎分子之前，葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物的樣品可以 另外經(jīng)受酶或化學(xué)處理或經(jīng)受過濾步驟。任選地，可以對這些處理或過濾步驟之前以及之 后獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。
[0160] 由此，葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物的樣品在該試驗(yàn)之前可以用變?nèi)芫剡M(jìn)行處 理。這種酶，借助其胞壁酸酶活性，能夠使PGN解聚。例如，可以在樣品存在下，放置濃度約 2500U/ml的該酶，任選地進(jìn)行稀釋，從而具有7. 5%至37. 5% (重量/體積）的葡萄糖聚合 物濃度，持續(xù)6至16h，優(yōu)選地約16h。如此處理的樣品然后將經(jīng)歷根據(jù)本發(fā)明的用一種或 多種細(xì)胞系進(jìn)行的試驗(yàn)。
[0161] 可替代地，葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物制劑的樣品可以在該試驗(yàn)之前進(jìn)行過濾。 這種過濾的目的基本上旨在移除高分子量分子，如高分子量PGN，并且旨在對濾液實(shí)施試驗(yàn) 以便相當(dāng)具體地分析小尺寸污染物。過濾的截留閾值可以，例如，在30kD和150kD之間，優(yōu) 選地在30kD和IOOkD之間或在30kD和50kD之間，并且特別是約30kD。在一個優(yōu)選實(shí)施例 中，這些細(xì)胞試驗(yàn)在通過過濾獲得的部分上進(jìn)行，特別是具有30和IOOkDa的截取閾值。優(yōu) 選地，通過超濾實(shí)施過濾。它也可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何手段實(shí)施。因此，如此 過濾樣品，濾液將經(jīng)歷根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞試驗(yàn)。不過濾或過濾之前獲得的這些結(jié)果的比較 將使得可能推導(dǎo)小尺寸分子的具體炎性貢獻(xiàn)。此外，這使得可能證實(shí)生產(chǎn)或純化步驟是否 改變污染物的大?。ㄋ馀c聚集相比較）、和/或未去除限定大小的某些污染物。
[0162] 此外，用溶菌酶和/或β-葡聚糖酶處理樣品使得可能消除PGN和/或β-葡聚 糖，并且因此可以已知可能在污染批次中存在的其他TLR2激動劑（糖脂和脂肽）的意義。
[0163] 在根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實(shí)施例中，在未過濾的樣品上進(jìn)行一個第一系列的 細(xì)胞試驗(yàn)，從而測量應(yīng)答（不考慮這些分子的大?。┎㈩A(yù)防這些分子之間可能的協(xié)同效應(yīng)。 然后，在一個第二系列中，對通過超濾（截取閾值：30和IOOkDa)獲得的部分進(jìn)行這些細(xì) 胞試驗(yàn)，從而證實(shí)這些處理是否改變污染物的大?。ㄋ馀c聚集相比較）、和/或未去除限 定大小的某些污染物。
[0164] 為了示例本發(fā)明的方法，針對多種不同的葡萄糖聚合物基質(zhì)和一個批次的葡萄糖 聚合物水解產(chǎn)物進(jìn)行不同凈化步驟：
[0165] -葡萄糖聚合物，艾考糊精原料（在根據(jù)發(fā)明EP 667356的傳授進(jìn)行層析分離之 前），
[0166] -一個批次的艾考糊精，
[0167]-一個批次的分枝麥芽糊精，由本申請公司在商標(biāo)名Nutriosex fb〇6下銷售，
[0168] -一個批次的制備的一水右旋糖，從而在注射溶液中進(jìn)行調(diào)制，由本申請公司在商 標(biāo)名LYCADEX:i;，PF下銷售，
[0169] -一個批次的高度分枝的可溶性葡萄糖聚合物，根據(jù)本申請公司是所有人的國際 專利申請WO 2007/099212的傳授進(jìn)行制備，
[0170] - 一種商業(yè)麥芽糊精。
[0171] 保留的處理是：
[0172] -熱處理，例如：
[0173] 〇70°C和 / 或
[0174] 〇 120。。，
[0175] -酸化，
[0176] -穿過不同品質(zhì)的活性炭，例如：
[0177] 〇 SX+，來自諾芮特公司（NORIT)
[0178] 〇 SX2,來自諾芮特公司（NORIT)，
[0179] 〇 C EXTRA USP，來自諾芮特公司，
[0180] 〇 A SUPRA EUR，來自諾芮特公司，
[0181] 〇 EN0-PC，來自 CECA 公司，
[0182] 〇 L4S，來自 CECA 公司，
[0183] 〇 L3S，來自 CECA 公司，
[0184] o CSA，來自 CECA 公司，
[0185] -穿過吸附樹脂，
[0186] 〇 Amberlite XAD-4,來自羅門哈斯公司（Rohm&Haas),
[0187] 〇 Amberlite XAD-761，來自羅門哈斯公司（Rohm&Haas)，
[0188] 〇 Amberlite XAD-1600,來自羅門哈斯公司（Rohm&Haas)，
[0189] 〇 Amberlite XAD_16HP( = FPX66)，來自陶氏公司（Dow)，
[0190] 〇 Dowex SD2,來自陶氏公司（Dow)，
[0191] 〇 Macronet MN-100,來自漂萊特公司（Purolite)，
[0192] 〇 Macronet MN-150,來自漂萊特公司（Purolite)，
[0193] -具有不同截取閾值的超濾，例如
[0194] -5kDa ；
[0195] -30kDa ；
[0196] -使用特異性酶進(jìn)行的酶水解,例如：
[0197] 〇β-1，3_ 葡聚糖酶，
[0198] 〇蛋白酶，
[0199] 〇具有甘露聚糖酶活性的酶制劑（例如，Mannaway'由諾維信公司 (N0V0ZYMES)銷售，用于其洗滌和澄清特性），
[0200] 〇具有內(nèi)切-β -葡聚糖酶活性的酶制劑（例如，SEBflox Τ1，由專業(yè)酶和生物技 術(shù)公司（Specialty Enzymes and Biotechnologies Co.)生產(chǎn)并且由先進(jìn)酶技術(shù)有限公司 (Advanced Enzyme Technologies Ltd.)銷售），
[0201] 〇具有酸蛋白酶活性的酶制劑（例如，SEBPro? FL100,由專業(yè)酶和生物技術(shù)公司 生產(chǎn)并且由先進(jìn)酶技術(shù)有限公司銷售）。
[0202] 本發(fā)明將借助以下實(shí)例更清晰地理解，這些實(shí)例意在是示意性的而非限制性的。
[0203] 附圖簡要說明
[0204] 圖I :RaW-Blue?細(xì)胞對標(biāo)準(zhǔn)品激動劑的應(yīng)答。
[0205] 圖2 :HEK-Blue? TLR2細(xì)胞對標(biāo)準(zhǔn)品激動劑的應(yīng)答。
[0206] 圖3 :HEK-Blue? TLR4細(xì)胞對標(biāo)準(zhǔn)品激動劑的應(yīng)答。
[0207] 圖4 :HEK-Blue? N0D2細(xì)胞對標(biāo)準(zhǔn)品激動劑的應(yīng)答。
[0208] 圖5 :HEK-BlueTM裸細(xì)胞對標(biāo)準(zhǔn)品激動劑的應(yīng)答。
[0209] 圖6 :由非過濾的基質(zhì)并且在穿過IOOkDa和30kDa過濾器之后誘導(dǎo)的Raw-Blue? 細(xì)胞應(yīng)答。
[0210] 圖7 :由非過濾的基質(zhì)并且在穿過IOOkDa和30kDa過濾器之后誘導(dǎo)的HEK-Blue? TLR2細(xì)胞應(yīng)答。
[0211] 圖8 :由非過濾的基質(zhì)并且在穿過IOOkDa和30kDa過濾器之后誘導(dǎo)的HEK-Blue? TLR4細(xì)胞應(yīng)答。
[0212] 圖9 :由非過濾的基質(zhì)并且在穿過IOOkDa和30kDa過濾器之后誘導(dǎo)的HEK-Blue? N0D2細(xì)胞應(yīng)答。
[0213] 圖10 :由這些基質(zhì)誘導(dǎo)的HEK-Blue?裸細(xì)胞應(yīng)答。
[0214] 圖11 :不同基質(zhì)的炎癥性活性的評估
[0215] 圖12 :由穿過炭SX+之后的基質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答。
[0216] 圖13 :由穿過不同炭之后的E3063基質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答。
[0217] 圖14 :由穿過不同炭之后的E1565基質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答。
[0218] 圖15 :由穿過不同炭之后的E1242基質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答。
[0219] 圖16 :由穿過不同炭之后的Lab3943基質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答。
[0220] 圖17 :通過5kDa超濾處理之后，由E1565基質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答。
[0221] 圖18 :通過5kDa超濾處理之后，由Lab3943基質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答。
[0222] 圖19 : Mannaway?處理之后，由E3063和E5250基質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答。
[0223] 圖20 : SEBfl〇:i< TL處理之后，由E5250基質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答。
[0224] 圖21 : SEBPrOx FL100處理之后，由E3063基質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答。
[0225] 圖22 :工業(yè)樹脂處理之后，由E1565基質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答。
[0226] 實(shí)例
[0227] 實(shí)例1 :劑量-應(yīng)答曲線的建立
[0228] 使用以下標(biāo)準(zhǔn)品激動劑分子產(chǎn)生劑量-應(yīng)答曲線：^^、？6隊(duì)1^^酵母聚糖和1--。 使用遞增濃度的激動劑孵育Raw-Blue?和HEK-Blue? TLR2、TLR4、N0D2以及裸系并且通過 定量SEAP活性（圖1-5)測量細(xì)胞應(yīng)答。TNF-α用作所有細(xì)胞激活的陽性對照：
[0229] -Raw-Blue?系：這些細(xì)胞應(yīng)答于可能存在于葡萄糖聚合物基質(zhì)以及衍生物中的 大多數(shù)炎癥性分子（PGN、LPS、酵母聚糖、LTA);特別地，相對于PGN，它們具有強(qiáng)反應(yīng)性，但 是不響應(yīng)于其解聚產(chǎn)物（MDP)。
[0230] -HEK-Blue? hTLR2系：相對于PGN具有強(qiáng)反應(yīng)性；這些細(xì)胞對其他TLR2配體 (LTA、酵母聚糖）的響應(yīng)更加弱并且相對于LPS和MDP不顯示反應(yīng)性。
[0231] -HEK-Blue? hTLR4系：相對于LPS具有強(qiáng)反應(yīng)性；這些細(xì)胞對酵母聚糖的響應(yīng)非 常弱并且相對于PGN、LTA和MDP不顯示反應(yīng)性。
[0232] -HEK-Blue? hN0D2系：相對于MDP具有強(qiáng)反應(yīng)性。
[0233] -HEK-Blue? Null2系：缺乏細(xì)胞毒性的對照。
[0234] 實(shí)例2 :多種不同的葡萄糖聚合物基質(zhì)的制備和一個批次的葡萄糖聚合物水解產(chǎn) 物的制備
[0235] 如上指出的，這些基質(zhì)如下：
[0236] -5種葡萄糖聚合物，艾考糊精原料（在根據(jù)發(fā)明EP 667 356的傳授進(jìn)行層析分離 之前），在此稱作 E1565、E3063、E1242、E5248 和 E5250。
[0237] 根據(jù)專利申請WO 2012/059685的傳授進(jìn)行這五種聚合物的制備；
[0238] --個污染批次的艾考糊精（在此稱作E209J)以及一個"標(biāo)準(zhǔn)"批次的艾考糊精， 即用于這些細(xì)胞試驗(yàn)中的非污染物對照（在此稱作P11-11)。根據(jù)專利EP 667 356的傳授 制備這些批次，詳細(xì)描述于專利申請WO 2010/125315的實(shí)例1中；
[0239] --個批次的分枝麥芽糊精，由本申請公司在商標(biāo)名NUTRIOSEd<' FB06下銷 售；
[0240] --個批次的一水右旋糖，進(jìn)行制備從而在注射溶液中進(jìn)行調(diào)制，由本申請公司在 商標(biāo)名LYCADEX:i< PF下銷售；
[0241] -一個批次的高度分枝的可溶性葡萄糖聚合物，用于腹膜透析，在此稱作 LAB3943。
[0242] 根據(jù)專利申請WO 2007/099212中的實(shí)例2,通過使用分枝酶和淀粉葡糖苷酶的雙 酶處理，制備這個批次。
[0243] - 一種商業(yè)麥芽糊精（嘉吉麥芽糊精（Cargill maltodextrin)，ODry MD 01915， 批號02044770)，在此稱作嘉吉（Cargill)。
[0244] 實(shí)例3 :由未處理的或穿過IOOkDa或30kDa過濾器后的樣品誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的分 析
[0245] 這些試驗(yàn)的目標(biāo)是確定存在于這些葡萄糖聚合物基質(zhì)和該批次的葡萄糖聚合物 水解產(chǎn)物中的污染物的促炎反應(yīng)性以及性質(zhì)。
[0246] 在非熱原性水（例如，注射劑）中以32% (重量/體積）制備根據(jù)
【權(quán)利要求】
1. 一種用于試驗(yàn)一個生產(chǎn)步驟或多個生產(chǎn)步驟對葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中促炎 分子的存在或其性質(zhì)的影響或一個純化步驟或多個純化步驟對葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn) 物中促炎分子的存在或其性質(zhì)的效力的方法，該方法包括： a) 提供葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物； b) 任選地，檢測或測定步驟a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分子； c) 對步驟a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物進(jìn)行該一個或多個生產(chǎn)或純化步 驟； d) 檢測或測定步驟c)后獲得的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分子； e) 確定步驟c)對這些促炎分子的存在或性質(zhì)的效力或效果； 其中用于檢測或測定這些葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分子的步驟包括使用 細(xì)胞系進(jìn)行的體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)，該細(xì)胞系是巨噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞_分化的細(xì)胞系，或是 表達(dá)一種或多種TLR(Toll樣受體）或NOD(含有核苷酸結(jié)合性寡聚結(jié)構(gòu)域的蛋白）受體， 例如，TLR2、TLR4或N0D2的細(xì)胞，并且使得檢測該一個或多個受體、或其組合的應(yīng)答成為可 能。
2. 用于生產(chǎn)或純化葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物的優(yōu)化方法，該優(yōu)化方法包括： a) 提供葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物； b) 檢測或測定步驟a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分子； c) 選擇用于生產(chǎn)或純化這些葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物的一個或多個步驟，這個或這 些步驟適用于這些葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中存在的促炎分子； d) 任選地，對步驟a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物進(jìn)行該一個或多個選擇的 生產(chǎn)或純化步驟；并且 e) 任選地，檢測或測定步驟d)后獲得的葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分子； 其中用于檢測或測定這些葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物中的促炎分子的步驟包括使用 細(xì)胞系進(jìn)行的體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)，該細(xì)胞系是巨噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞_分化的細(xì)胞系，或是 表達(dá)一種或多種TLR(Toll樣受體）或NOD(含有核苷酸結(jié)合性寡聚結(jié)構(gòu)域的蛋白）受體， 例如，TLR2、TLR4或N0D2的細(xì)胞，并且使得檢測該一個或多個受體、或其組合的應(yīng)答成為可 能。
3. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)包括使得這些葡萄 糖聚合物或其水解產(chǎn)物與MDP-或LPS-敏化的、巨噬細(xì)胞-分化的THP-1細(xì)胞系相接觸，通 過測量由該細(xì)胞系產(chǎn)生的RANTES或TNF- a的量來檢測或測定這些促炎分子。
4. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)包括使得這些葡萄 糖聚合物或其水解產(chǎn)物與用報告基因轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞系相接觸，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在炎 癥信號通路的直接控制下，例如Raw-Blue?系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測 或測定這些促炎分子。
5. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)包括使得這些葡萄 糖聚合物或其水解產(chǎn)物與表達(dá)TLR2受體和報告基因的細(xì)胞系相接觸，該報告基因的轉(zhuǎn)錄 是在TLR2信號通路的直接控制下，例如HEK-Blue?hTLR2系，通過測量該報告基因的活性或 信號來檢測或測定這些促炎分子。
6. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)包括使得這些葡萄 糖聚合物或其水解產(chǎn)物與表達(dá)TLR4受體和報告基因的細(xì)胞系相接觸，該報告基因的轉(zhuǎn)錄 是在TLR4信號通路的直接控制下，例如HEK-Blue?hTLR4系，通過測量該報告基因的活性或 信號來檢測或測定這些促炎分子。
7. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)包括使得這些葡萄 糖聚合物或其水解產(chǎn)物與表達(dá)N0D2受體和報告基因的細(xì)胞系相接觸，該報告基因的轉(zhuǎn)錄 是在N0D2信號通路的直接控制下，例如HEK-Blue?hN0D2系，通過測量該報告基因的活性或 信號來檢測或測定這些促炎分子。
8. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)包括使得這些葡萄 糖聚合物或其水解產(chǎn)物與以下各項(xiàng)相接觸： a. MDP-或LPS-敏化的、巨噬細(xì)胞-分化的THP-1細(xì)胞系，通過測量由該細(xì)胞系產(chǎn)生的 RANTES或TNF- a的量來檢測或測定這些促炎分子；和/或， b. 用報告基因轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞系，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在炎癥信號通路的直接控制 下，例如Raw-Blue?系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這些促炎分子；和 /或， c. 表達(dá)TLR2受體和報告基因的細(xì)胞系，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在TLR2信號通路的直接 控制下，例如ffiK-BlueTMhTLR2系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這些促 炎分子；和/或 d. 表達(dá)N0D2受體和報告基因的細(xì)胞系，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在N0D2信號通路的直接 控制下，例如ffiK-BlueTMhN0D2系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這些促 炎分子；和/或， e. 表達(dá)TLR4受體和報告基因的細(xì)胞系，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在TLR2信號通路的直接 控制下，例如ffiK-BlueTMhTLR4系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這些促 炎分子；和/或， f. 未經(jīng)免疫受體轉(zhuǎn)染的對照系。
9. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該體外炎癥應(yīng)答試驗(yàn)包括使得這些葡萄 糖聚合物或其水解產(chǎn)物與以下各項(xiàng)相接觸： a. 用報告基因轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞系，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在炎癥信號通路的直接控制 下，例如Raw-Blue?系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這些促炎分子； b. 表達(dá)TLR2受體和報告基因的細(xì)胞系，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在TLR2信號通路的直接 控制下，例如ffiK-BlueTMhTLR2系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這些促 炎分子；和/或 c. 表達(dá)TLR4受體和報告基因的細(xì)胞系，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在TLR4信號通路的直接 控制下，例如ffiK-BlueTMhTLR4系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這些促 炎分子；和/或 d. 表達(dá)N0D2受體和報告基因的細(xì)胞系，該報告基因的轉(zhuǎn)錄是在N0D2信號通路的直接 控制下，例如ffiK-BlueTMhN0D2系，通過測量該報告基因的活性或信號來檢測或測定這些促 炎分子；和， e. 未經(jīng)免疫受體轉(zhuǎn)染的對照系，例如HEK-Blue?Null2系。
10. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中這些促炎分子是細(xì)菌來源的分子，優(yōu)選 地選自PGN、LPS、脂肽、PGN解聚產(chǎn)物，特別是MDP、甲酰化微生物肽例如f-MLP、以及0 -葡 聚糖。
11. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中該一個或多個生產(chǎn)或純化步驟選自以 下步驟：熱處理、酸化、穿過活性炭、穿過吸附樹脂、超濾、過濾、或化學(xué)或酶水解、或其組合。
12. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中這些葡萄糖聚合物選自艾考糊精和麥 芽糊精，特別是分枝的或未分枝的麥芽糊精，并且這些葡萄糖聚合物水解產(chǎn)物是完全水解 的產(chǎn)物，例如，一水右旋糖。
13. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中預(yù)過濾葡萄糖聚合物或其水解產(chǎn)物的 樣品，特別是用30kDa的截取閾值，并且使濾液與試驗(yàn)中使用的細(xì)胞系相接觸。
【文檔編號】G01N33/68GK104364648SQ201380029037
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2013年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月29日
【發(fā)明者】索菲亞·杜萬特, 赫拉·海新納-伽爾比, 皮埃爾·拉諾, 法布里斯·阿蘭, 馬蒂厄·卡龐捷, 安納斯·丹伊斯 申請人:羅蓋特兄弟公司