專利名稱：用于腹膜透析的支化的可溶性葡萄糖聚合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及支化的可溶性葡萄糖聚合物，這些聚合物具有的α-1，6糖苷鍵含量為介于7%與 10%之間、優(yōu)選介于8%與9%之間，窄重均分子量(Mw)分布為介于50，000與150,000道爾頓之間。這些支化的可溶性葡萄糖聚合物還對(duì)α淀粉酶具有某種抗性并且具有小于100m0sm/kg的低重量克分子滲透濃度?；诒景l(fā)明的目的，表述“對(duì)α淀粉酶的某種抗性”旨在表示這些支化的可溶性葡萄糖聚合物具有的能力，即該聚合物是相對(duì)非血糖的，并且能夠延長在特別地含有α淀粉酶的介質(zhì)中其滲透力的持續(xù)時(shí)間(模擬腹膜內(nèi)的產(chǎn)物水解)，從而允許這些聚合物特別地用在腹膜透析應(yīng)用中，以獲得長效的治療。本發(fā)明還涉及可溶的支化葡萄糖聚合物，這些聚合物具有一個(gè)完全特殊的支鏈長度分布特征?；诒景l(fā)明的目的，術(shù)語“支鏈長度分布特征”旨在表示通過α_1，6支化點(diǎn)連接到其他α-1，4線性糖苷鏈上的α_1，4線性糖苷鏈的尺寸分布，該尺寸分布被表達(dá)為聚合度(或DP)。本發(fā)明還涉及包含這類支化的可溶性葡萄糖聚合物的組合物，這些組合物可以用于許多工業(yè)應(yīng)用，特別是用于制藥工業(yè)，并且尤其是腹膜透析中。最后，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)所述支化的可溶性葡萄糖聚合物的方法，并且還涉及一種用于純化所述聚合物的方法，從而使這些聚合物更加特別適合用于生產(chǎn)腹膜透析液。
背景技術(shù)：
工業(yè)上常規(guī)生產(chǎn)的葡萄糖聚合物是通過天然或雜化淀粉及其衍生物的水解而制備的。因此，這些淀粉水解物是通過來自谷類或來自塊莖類植物的淀粉的酸水解或酶水解而產(chǎn)生。這些淀粉水解物實(shí)際上是葡萄糖與多種葡萄糖聚合物的一種混合物，具有非常不同的分子量。這些工業(yè)上生產(chǎn)的淀粉水解物(糊精類、麥芽糊精類等)具有某種平均聚合度或DP，包含一個(gè)寬分布的糖類，這些糖類含有線性結(jié)構(gòu)(α-I，4糖苷鍵)以及支化結(jié)構(gòu)(α-I，6糖苷鍵)兩者。這些淀粉水解物、尤其是麥芽糊精類，一般用作一種轉(zhuǎn)運(yùn)體或增量劑、用作一種調(diào)質(zhì)劑、用作一種噴霧干燥載體、用作一種脂肪替代品、用作一種成膜劑、用作一種凍結(jié)調(diào)節(jié)齊U、用作一種抗結(jié)晶劑，或用作一種營養(yǎng)源。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員都知道，麥芽糊精類的糖類成分決定了其物理特性和其生物特性。因此，這些淀粉水解物的吸濕性、可發(fā)酵性、粘度、甜性、穩(wěn)定性、膠凝性、以及重量克分子滲透濃度是根據(jù)使用它們的不同領(lǐng)域在常規(guī)上進(jìn)行評(píng)定和選擇的標(biāo)準(zhǔn)。因此，對(duì)這些糖類的理化特性的基本認(rèn)知引起將它們并入到例如腹膜透析液中。腹膜透析包括利用一個(gè)導(dǎo)液管將一種透析液引入腹膜腔內(nèi)。在一段時(shí)間后，在血液與該透析液之間發(fā)生溶質(zhì)交換。使用一種適當(dāng)?shù)臐B透劑使之有可能將血液中多余的水分排到該透析液中，并因此克服腎虛。用以從身體中去除多余的水分(超濾作用)以及溶質(zhì)的腹膜透析的常規(guī)方法包括通過添加葡萄糖作為一種滲透劑，向腹膜腔注射一種透析液，該透析液相對(duì)血液來說是聞滲的。、
穿過一個(gè)理想的半透膜的流動(dòng)主要由該溶液中存在的溶質(zhì)顆粒的總數(shù)(重量克分子滲透濃度)決定，而與這些溶質(zhì)顆粒的大小無關(guān)。另一方面，在一種生物膜如腹膜的情況下，該流動(dòng)只取決于未穿過或少量穿過該膜的溶質(zhì)，并且因此和該溶液的總的重量克分子滲透濃度沒有必然聯(lián)系。此外，這些溶質(zhì)穿過該膜的能力還取決于分子的形狀、它們的離子電荷以及它們的大小。選擇一種理想的滲透劑是困難的所述試劑必須能夠具有一個(gè)滲透梯度，以便將血液中的水分以及有毒物質(zhì)透過腹膜而移入該透析液中。該滲透劑還必須是無毒并且是生物惰性的，同時(shí)還可被身體代謝，其一部分可在血液中被吸收。該滲透劑不應(yīng)過快地穿過腹膜，以此方式來維持一個(gè)長期的超濾梯度，并且不會(huì)使不希望的非降解性物質(zhì)在血液中堆積。專利EP 207 676因此示教到為了用于連續(xù)的流動(dòng)式腹膜透析，應(yīng)優(yōu)選使用在水中形成10%的澄清且無色溶液的淀粉水解物，這些淀粉水解物具有從5，000至100，000道爾頓的Mw以及一個(gè)低多分散指數(shù)或PI。這導(dǎo)致形成多種組合物，這些組合物主要含有介于5，000和50，000道爾頓之間的高分子量葡萄糖聚合物，這些聚合物不含有或含有非常少的、DP小于或等于3的葡萄糖或低聚糖類；并且這些組合物不含有或含有非常少的、Mw大于100，000道爾頓的葡萄糖聚合物。事實(shí)上，針對(duì)這一應(yīng)用，快速穿過腹膜壁的低分子量單體類或聚合物類對(duì)于創(chuàng)建一個(gè)長期的滲透壓梯度毫無益處，此外，分子量非常高(大于100，000道爾頓)并且毫無滲透力的聚合物類應(yīng)當(dāng)被避免、甚至禁止，因?yàn)檫@些聚合物具有在身體中回生并沉淀的危險(xiǎn)。在專利EP667 356中，申請(qǐng)公司已經(jīng)提出了一種從蠟質(zhì)淀粉生產(chǎn)淀粉水解物的方法，該淀粉水解物在水中完全可溶，并且具有的低多分散指數(shù)小于2. 8，具有的Mw介于8，000至22，500道爾頓之間。該方法包括使僅由支鏈淀粉組成的一種淀粉乳進(jìn)行酸水解，然后利用使用細(xì)菌α淀粉酶的一個(gè)酶水解來使該酸水解物進(jìn)一步水解，并且在堿金屬或堿土金屬形式中的大孔強(qiáng)陽離子樹脂上對(duì)該水解物進(jìn)行色譜分析。這一特別的淀粉水解物，又稱為艾考糊精，具有的Mw為從21，000至22，000道爾頓，該Mw是通過光散射測(cè)定的，測(cè)定將在下文中描述。
艾考糊精的葡萄糖分子中大多數(shù)是α-1，4連接的線性鏈(多于90%)，而一小部分是α-1，6支化的α-1，4鏈(少于10% )。艾考糊精已經(jīng)使得對(duì)葡萄糖的日常吸收顯著下降，該葡萄糖先前在多種透析液中用作一種滲透劑。由此為治療糖尿病和/或肥胖患者提供了一個(gè)切實(shí)的優(yōu)勢(shì)，對(duì)這些患者來說卡路里含量是一個(gè)決定性的因素。含有艾考糊精作為滲透劑的腹膜透析液(尤其是百特醫(yī)療用品公司(BaxterHealthcare Corp.)銷售的商標(biāo)為Extraneal 的腹膜透析液)一般被用于長期的日常交換(夜間用于流動(dòng)式連續(xù)腹膜透析，日間用于自動(dòng)化腹膜透析)。然而，如果存在一種滲透劑產(chǎn)生較少的血糖，并且該滲透劑的滲透力持續(xù)時(shí)間較長，那么可以進(jìn)一步改良該艾考糊精，從而使透析治療過程顯著簡(jiǎn)化。事實(shí)上，由于透析液的產(chǎn)率可以得到提高，透析袋的更換頻率將會(huì)降低，這將會(huì)明 確地改善患者的生活質(zhì)量。因此，腹膜透析中的理想碳水化合物應(yīng)該是可溶于水的，具有一個(gè)低粘度，不逆行，誘導(dǎo)體循環(huán)中的低葡萄糖外觀動(dòng)力學(xué)，被緩慢水解，但應(yīng)在該水解結(jié)束時(shí)被體內(nèi)的酶完全降解，施加長期的滲透壓。事實(shí)上，關(guān)于后兩點(diǎn)，在遭受腎衰竭的患者的腹膜腔內(nèi)，在溶液中施用滲透劑的效果由以下各項(xiàng)決定，即這些滲透劑在腹膜液內(nèi)的穩(wěn)定性、這些滲透劑被吸收進(jìn)體循環(huán)的程度、以及這些滲透劑被淀粉酶水解的速率。與此同時(shí)，現(xiàn)有技術(shù)的滲透劑都有被快速水解的缺點(diǎn)。綜上所述，結(jié)果就是因此對(duì)于以下葡萄糖聚合物存在一個(gè)需要(該需要尚未得到滿足)，即這些葡萄糖聚合物展現(xiàn)出顯著的性質(zhì)，尤其在穩(wěn)定性和可溶性方面，并且它們同時(shí)賦予含有它們的產(chǎn)品一個(gè)較長的使用壽命以及受控的消化率，這樣使得有可能將這些葡萄糖聚合物相當(dāng)特別地用于腹膜透析領(lǐng)域中。發(fā)明概述申請(qǐng)公司確信已調(diào)和了所有這些目標(biāo)(直到現(xiàn)在還認(rèn)為這些目標(biāo)很難調(diào)和)，這種調(diào)和是通過以大量的研究為代價(jià)、想象和開發(fā)了新穎的支化的可溶性葡萄糖聚合物而實(shí)現(xiàn)的，這些聚合物是由以下淀粉制備，即具有的直鏈淀粉含量為按重量計(jì)至少30%、優(yōu)選按重量計(jì)在35%與80%之間。如下文將要示例的，本申請(qǐng)公司已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，只要使用富含直鏈淀粉的淀粉作為起始底物，就可以實(shí)現(xiàn)如下的葡萄糖聚合物的生產(chǎn)，即這些葡萄糖聚合物具有顯著的特性，尤其在穩(wěn)定性、較長的使用壽命以及受控制的消化率方面。本發(fā)明的支化葡萄糖聚合物在以下意義上構(gòu)成了可溶性葡萄糖聚合物的一個(gè)新的家族，即該新的家族與現(xiàn)有技術(shù)的那些聚合物非常不同，現(xiàn)有技術(shù)的那些聚合物包括本申請(qǐng)公司已在其自己的先前專利申請(qǐng)中提出并描述的其他高度支化的可溶性葡萄糖聚合物。
因此，本申請(qǐng)公司已經(jīng)克服了第一個(gè)技術(shù)偏見，根據(jù)該技術(shù)偏見，如在國際專利申請(qǐng)TO 2004/022602中所宣稱的，可用于腹膜透析的淀粉基產(chǎn)品必須具有的α-1，6支化度優(yōu)先介于11%與18%之間，以及分子量介于10，000與200，000之間。本申請(qǐng)公司還曾經(jīng)認(rèn)為，只有高度支化的可溶性聚合物(支化度大于10% )才可以用于腹膜透析在該公司的專利EP I 369 432中，聚合物是高度支化的可溶性葡萄糖聚合物，這些聚合物具有的α_1，6鍵含量大于10%、優(yōu)選介于12%與30%之間，并且Mw為從30，000至200，000道爾頓。在該公司的專利申請(qǐng)EP I 548 033中，聚合物是高度支化的可溶性葡萄糖聚合物，這些聚合物具有的α-1，6鍵含量為介于13%與17%之間，并且Mw為從90，000至150，000道爾頓。
在該公司的專利申請(qǐng)EP I 994 061中，聚合物是高度支化的可溶性葡萄糖聚合物，這些聚合物具有的α-1，6鍵含量為介于20%與30%之間，并且Mw為從20,000至30, 000道爾頓。與此同時(shí)，本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物是由以下淀粉制備，即具有的直鏈淀粉含量為按重量計(jì)至少30%、優(yōu)選按重量計(jì)在35%與80%之間，這些聚合物具有的α-1,6糖苷鍵含量為介于7%與10%之間、優(yōu)選介于8%與9%之間，并且Mw為介于50，000與150,000道爾頓之間。這些聚合物的特征在于，這些聚合物對(duì)α淀粉酶具有顯著的抗性，該抗性通過以下測(cè)試來測(cè)定，即包括制備根據(jù)本發(fā)明的支化聚合物的水溶液，使該溶液與源于胰臟的淀粉酶接觸，從而模擬腹膜內(nèi)的產(chǎn)物水解。本申請(qǐng)公司過去已經(jīng)在其專利EP I 177 216中描述了支化的可溶性葡萄糖聚合物，這些聚合物具有的α -I，6糖苷鍵含量為介于2. 5%與10%之間，以及Mw為介于10，000與IO8道爾頓之間。如下文所例證，大多數(shù)由標(biāo)準(zhǔn)淀粉、尤其由蠟質(zhì)玉米淀粉制備的這些化合物中，沒有一種對(duì)胰臟α淀粉酶展現(xiàn)出如此顯著的抗性特性。最后，這些聚合物具有的根據(jù)測(cè)試“Α”測(cè)定的重量克分子滲透濃度的值為小于100m0sm/kg。本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物具有的α-I，6糖苷鍵含量介于7%與10%之間、優(yōu)選介于8%與9%之間。所述含量是通過質(zhì)子核磁共振分析測(cè)定。于是支化度被表示為一個(gè)百分比，該百分比對(duì)應(yīng)于當(dāng)所述可溶性葡萄糖聚合物的葡萄糖殘基上的所有Cl攜帶的糖苷質(zhì)子的所有信號(hào)的值被給定為100時(shí)，一個(gè)脫水葡萄糖單位的Cl所攜帶的質(zhì)子信號(hào)的量，該脫水葡萄糖單位通過一個(gè)α -1，6鍵與另一個(gè)脫水葡萄糖單位連接。在這些條件下，本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物具有的α-1，6糖苷鍵含量介于7%與10%之間、優(yōu)選介于8%與9%之間。該α -1，6糖苷鍵含量在支化度方面賦予本發(fā)明的支化葡萄糖聚合物一種特殊的結(jié)構(gòu)，該特殊的結(jié)構(gòu)是相對(duì)于衍生這些聚合物的淀粉而言。
該α-I，6糖苷鍵含量使得根據(jù)本發(fā)明的支化葡萄糖聚合物難以消化，這促使這些聚合物可以用于所有的需要一個(gè)緩慢消化的應(yīng)用中。根據(jù)本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物的分子量通過測(cè)量重均分子量(Mw)來測(cè)定。該值通過在PSS SUPREMA 100以及PSS 5 SUPREMA 1000柱上使用尺寸排阻色譜
法來獲得，這些柱是串聯(lián)安裝并且結(jié)合至一個(gè)光散射檢測(cè)器。于是根據(jù)本發(fā)明的支化葡萄糖聚合物具有的Mw值為介于50，000與150，000道爾頓之間。根據(jù)本發(fā)明的聚合物的特征在于這些聚合物對(duì)α淀粉酶具有顯著的抗性，所述抗性根據(jù)本申請(qǐng)公司開發(fā)的一種測(cè)試來測(cè)定。該測(cè)試，稱為測(cè)試“B”，使之有可能評(píng)價(jià)這些聚合物對(duì)淀粉酶水解的抗性，該抗性尤其是選擇一種透析液的滲透劑的一個(gè)必要依據(jù)。根據(jù)測(cè)試“B”，用于淀粉酶消化的操作條件如下精確稱出O. 6克測(cè)試產(chǎn)物，添加150ml O. lmol/1的馬來酸鈉緩沖液，pH為7，攪拌直至該產(chǎn)物溶解，將燒瓶放置在37°C下的一個(gè)恒溫水浴中15分鐘，以使溶液溫度為37°C，在O分鐘時(shí)取I. 5ml的一個(gè)樣品(樣品SI)，添加O. 15克豬胰酶(來自動(dòng)物的α -淀粉酶)，該胰酶具有的活性相當(dāng)于8USP，在37°C下的該恒溫浴中孵育,伴隨攪拌(使用THP 15Variomag攪拌器，以該攪拌器四分之三的攪拌力進(jìn)行攪拌)，持續(xù)300分鐘，在以下時(shí)間點(diǎn)取I. 5ml 的樣品:15、30、45、60、90、120、180、240、300 分鐘，通過將樣品放置在100°C下的一個(gè)干浴中10分鐘來停止酶促反應(yīng)， 分析這些樣品中的還原糖以研究水解率，測(cè)定由此釋放的淀粉酶水解產(chǎn)物的平均摩爾質(zhì)量，用來分析這些還原糖的方法是Somogyi-Nelson方法,該方法包括將200微升樣品引入到一個(gè)有塞試管中，并向所述樣品中添加200微升工作液(酒石酸鈉和硫酸銅試劑)。使其沸騰，并且待冷卻后，添加砷鑰酸鹽試劑，然后添加水。將獲得的溶液積存在一個(gè)微板上，然后在520納米的一個(gè)波長下在一個(gè)微板讀取器上讀取吸光度。用于根據(jù)測(cè)試“B”測(cè)定這些還原糖的參考值是在300分鐘時(shí)測(cè)量的值。至于用來測(cè)定由此釋放的淀粉酶水解產(chǎn)物的平均摩爾質(zhì)量的方法，該方法是在Shodex OH pak-SB802-SB803_SB805 柱上進(jìn)行的一種 HPSEC 色譜法。洗脫溶劑是O. IM的硝酸鈉加上O. 02%的疊氮化鈉的溶液。流速為O. 5ml/min。這些柱的溫度維持在30°C。使用一種折射計(jì)作為檢測(cè)模塊，并且這些柱使用已知摩爾質(zhì)量的支鏈淀粉來定標(biāo)。用于根據(jù)測(cè)試“B”測(cè)定平均摩爾質(zhì)量的參考值也是在300分鐘時(shí)測(cè)量的值。
于是本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物對(duì)胰臟α淀粉酶展現(xiàn)出抗性，該抗性根據(jù)測(cè)試“B”表達(dá)為還原糖含量為介于25%與35%之間，以及多種所釋放產(chǎn)物的Mw為介于6，000與12，000道爾頓之間。根據(jù)本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物的第一個(gè)亞家族對(duì)胰臟α淀粉酶展現(xiàn)出抗性，該抗性根據(jù)測(cè)試“B”表達(dá)為
還原糖含量大于或等于25%并且小于30%，多種所釋放產(chǎn)物的Mw大于或等于9，500并且小于12，000道爾頓，根據(jù)本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物的第二個(gè)亞家族對(duì)胰臟α淀粉酶展現(xiàn)出抗性，該抗性根據(jù)測(cè)試“B”表達(dá)為還原糖含量大于或等于30%并且小于35%，多種所釋放產(chǎn)物的Mw大于或等于6，000道爾頓并且小于9，500道爾頓。根據(jù)本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物還具有特定的重量克分子滲透濃度值。一種溶液的重量克分子滲透濃度被定義為每千克水中溶解的一種物質(zhì)的摩爾數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物的重量克分子滲透濃度根據(jù)測(cè)試“Α”來測(cè)定，該測(cè)試“Α”與專利申請(qǐng)EP I 369 432中所描述的相同，包括測(cè)定一種溶液的重量克分子滲透濃度，該溶液含有放置在Ikg水中的IOOg干的支化葡萄糖聚合物。該溶液的重量克分子滲透濃度根據(jù)制造商的說明，使用Fiske TM Associates公司的Mark 3滲透壓計(jì)來測(cè)量，并且得到的重量克分子滲透濃度值小于lOOmOsm/kg。該值符合人們對(duì)用于腹膜透析的一種化合物的預(yù)期值(值過高意味著所述化合物與水的強(qiáng)結(jié)合，這會(huì)損及該化合物穿過腹膜的半透膜的通行)。建議使用顯著小于血液的重量克分子滲透濃度(300m0sm/kg)的重量克分子滲透濃度值。于是如上文所呈現(xiàn)的根據(jù)本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物的第一個(gè)亞家族具有一個(gè)特別低的重量克分子滲透濃度，該濃度介于10與20m0sm/kg之間。如上文所呈現(xiàn)的根據(jù)本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物的第二個(gè)亞家族對(duì)其部分而言具有的重量克分子滲透濃度介于50與lOOmOsm/kg之間。最后，根據(jù)本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物的特征在于這些聚合物的鏈長分布特征。對(duì)根據(jù)本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物長度的測(cè)定分兩個(gè)步驟進(jìn)行。第一步包括使用一種細(xì)菌異淀粉酶對(duì)所述產(chǎn)物進(jìn)行脫支(α-1，6鍵的特定水解)，然后第二步，確定所釋放的多種低聚糖的聚合度，此步驟通過使用尺寸排阻色譜法(HPSEC)與已知尺寸的支鏈淀粉比較來進(jìn)行。該技術(shù)包括稱出50mg待分析的產(chǎn)物，并向該產(chǎn)物添加3. 75ml水。在攪拌該混合物后，添加0. 5ml 二甲基亞砜(DMSO)，并使該混合物沸騰而伴隨攪拌持續(xù)30分鐘。將溫度降低到45°C，并添加0. 25ml的IM醋酸鈉緩沖液(事先用醋酸使pH值達(dá)到
3.5)。隨后，添加從異淀粉酶生產(chǎn)菌(Pseudomonas amyloderasoma)提取的一種異淀粉酶，并讓其在45°C下作用20分鐘，該生產(chǎn)菌由林原(Hayashibara)公司銷售，比例為59,OOOU/mg。重復(fù)該添加步驟20次，然后經(jīng)由煮沸3分鐘來停止反應(yīng)。然后使用分別由Fluka公司與Sigma公司出售的Amberlite 200與AmberliteIRA-67樹脂對(duì)該溶液進(jìn)行去礦化。然后，在將該溶液注射在HPSEC柱上之前，先將該溶液用孔徑為O. 45 μ m的一個(gè)尼龍過濾器過濾。用以下方式對(duì)HPSEC色譜法進(jìn)行參數(shù)化(該方法在TSK出售的PWXL寡柱以及Shodex 出售的 SB802+803+804+805 柱上進(jìn)行):注射體積2001
流速0.5ml/min柱溫度40°C洗脫劑0. 2M硝酸鈉+0. 02 %疊氮化鈉洗脫時(shí)間180分鐘。所釋放的多種低聚糖的尺寸借助這些低聚糖的洗脫時(shí)間來確定，該洗脫時(shí)間與已知尺寸的支鏈淀粉的洗脫時(shí)間進(jìn)行對(duì)比。于是根據(jù)本發(fā)明的支化葡萄糖聚合物具有一種支鏈長度分布特征，其特征在于25%至 80% 的 DP < 10，2%至 10%的 DP > 30，而平均DP介于4與12之間。如上文所呈現(xiàn)的根據(jù)本發(fā)明的支化葡萄糖聚合物的第一個(gè)家族具有一種支鏈長度分布特征，其特征在于25%至 40% 的 DP < 10，5%至 10%的 DP > 30，而平均DP介于10與12之間。如上文所呈現(xiàn)的根據(jù)本發(fā)明的支化葡萄糖聚合物的第二個(gè)家族具有一種支鏈長度分布特征，其特征在于65%至 80% 的 DP < 10，2%至 5%的 DP >30，而平均DP介于4與6之間。比較而言，艾考糊精具有一種支鏈長度分布特征，其特征在于22% 的 DP <10，16% 的 DP >30，而平均DP為13。因此，根據(jù)本發(fā)明的支化葡萄糖聚合物的特征在于，這些聚合物具有一個(gè)截然不同的鏈長度分布(顯著較高含量的DP < 10而較低含量的DP > 30)，尤其是與艾考糊精相比較。因此，該支鏈長度分布賦予根據(jù)本發(fā)明的支化葡萄糖聚合物一個(gè)完全特殊的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由多個(gè)支化的短鏈構(gòu)成。本發(fā)明還涉及一種腹膜透析液，其特征在于，該透析液包含作為滲透劑的至少一種支化的可溶性葡萄糖聚合物，該聚合物是通過對(duì)淀粉進(jìn)行酶處理而獲得，該聚合物所具有的α-1，6糖苷鍵含量介于7%與10%之間、優(yōu)選介于8%與9%之間，利用光散射測(cè)定的重均分子量(Mw)介于50，000與150，000道爾頓之間。根據(jù)本發(fā)明的腹膜透析液還可包含生理上可接受的電解質(zhì)，具體來說，如鈉、鉀、鈣、鎂或氯，從而避免從血清到腹膜的轉(zhuǎn)移所導(dǎo)致的電解質(zhì)損失。當(dāng)通過將根據(jù)本發(fā)明的支化聚合物溶于水中來獲得該溶液時(shí)，該溶液應(yīng)是澄清且無色的。該溶液不含內(nèi)毒素類、肽聚糖類以及β葡聚糖類，也不含源于原料或源于用來生產(chǎn)該溶液的酶制劑的污染物類。、為了達(dá)到這個(gè)效果，所述溶液中使用的高度支化的聚合物優(yōu)選將要經(jīng)過純化，以便去除任何著色或任何不想要的污染物，如蛋白質(zhì)類、細(xì)菌類、細(xì)菌毒素類、纖維類、微量金屬類等，這些將在下文說明。根據(jù)本發(fā)明的透析液也可包含多種緩沖劑(尤其是乳酸鹽、醋酸鹽、葡糖酸鹽)以及其他添加劑如氨基酸類、胰島素、多元醇類如山梨糖醇、赤蘚糖醇、甘露糖醇、麥芽糖醇或木糖醇，或氫化的淀粉水解物。向該組合物添加多元醇類、優(yōu)選為不含以上所述的雜質(zhì)(尤其是內(nèi)毒素類以及其他細(xì)菌源性殘基類)的無熱源多元醇類，相比于添加葡萄糖或麥芽糖，使之有可能更有利地增加該溶液的重量克分子滲透濃度，這歸因于這些多元醇較大的滲透力并且因?yàn)樗鼈儾皇沁€原性的。最后，還有可能用葡萄糖、麥芽糖和/或葡萄糖聚合物類來完成含有本發(fā)明的高度支化的可溶性葡萄糖聚合物的透析液。氨基酸基腹膜透析液類在阻止和葡萄糖及其衍生物相關(guān)的腹膜加速老化方面有一定的價(jià)值，即使這些氨基酸基腹膜透析液的成本以及對(duì)酸中毒的錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)節(jié)的風(fēng)險(xiǎn)限制了其專用而連續(xù)的處方。因此，有可能設(shè)想在相同的腹膜透析液中構(gòu)成一種不同分子的混合物，S卩葡萄糖、根據(jù)本發(fā)明的高度支化的可溶性葡萄糖聚合物以及氨基酸類。因此，最好對(duì)這些不同的組分單獨(dú)進(jìn)行殺菌(使用隔離帶)，從而特別是避免葡萄糖降解產(chǎn)物(GDP)或通過葡萄糖與所述氨基酸類結(jié)合所產(chǎn)生的產(chǎn)物(或AGE)的生成，這些產(chǎn)物的生成會(huì)對(duì)腹膜的穩(wěn)定性造成有害影響。此外，與現(xiàn)有技術(shù)的產(chǎn)物相比，根據(jù)本發(fā)明的透析液更有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樵撏肝鲆核械臐B透劑可以施加長期的滲透壓并且誘導(dǎo)緩慢的葡萄糖外觀動(dòng)力學(xué)，而同時(shí)不易回生，因此符合上文所定義的主要標(biāo)準(zhǔn)。為了制備根據(jù)本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物，可以進(jìn)行一種方法，該方法包括以下連續(xù)的步驟I)將一種淀粉乳爆裂和溶解，該淀粉乳具有的直鏈淀粉含量為按重量計(jì)至少30%，優(yōu)選按重量計(jì)在35%與80%之間，以及干物質(zhì)含量介于5%與25%之間，2)持續(xù)添加從嗜熱微生物提取的一種糖原分支酶，其活性介于25，000U/ml與60，000U/ml之間，添加的劑量為介于800與2500U/g干淀粉之間，溫度介于60°C與80°C之間，持續(xù)時(shí)間從12至18小時(shí)，3)可任選地，用活性介于100與150KNU/ml之間的α淀粉酶類型的一種淀粉液化酶進(jìn)行處理，溫度為95°C，pH介于5與8之間，持續(xù)時(shí)間為30至60分鐘、優(yōu)選持續(xù)45分鐘，4)通過以下步驟純化所生成的支化的可溶性葡萄糖聚合物至少一個(gè)用活性碳和/或用顆粒狀碳黑進(jìn)行處理的步驟，至少一個(gè)殺菌過濾步驟，以及可任選地，至少一個(gè)熱處理步驟，5)回收所生成的經(jīng)過純化的支化的可溶性葡萄糖聚合物。 使用分支酶修飾富含直鏈淀粉的淀粉的方法包括，首先，蒸煮該淀粉以使其處于部分或完全凝膠化的形式。根據(jù)本發(fā)明的方法的該第一個(gè)步驟對(duì)應(yīng)于一種富含直鏈淀粉的淀粉乳的爆裂和溶解，這種對(duì)淀粉的溶解旨在允許使用分支酶進(jìn)行處理?；诒景l(fā)明的目的，術(shù)語“富含直鏈淀粉的淀粉”旨在表示一種淀粉，該淀粉具有的直鏈淀粉含量為按重量計(jì)至少30%，優(yōu)選按重量計(jì)在35%與80%之間。在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，準(zhǔn)備一種干物質(zhì)含量介于5%與25%之間的豌豆淀粉乳，并使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的任何技術(shù)進(jìn)行加熱，溫度高于或等于該淀粉的凝膠化溫度、優(yōu)選介于100°C與200°C之間、甚至更優(yōu)選介于140°C與160°C之間，壓力為4巴至5巴，持續(xù)3至5分鐘。基于本發(fā)明的目的，術(shù)語“分支酶”旨在表示選自由多種糖原分支酶組成的組的分支酶。更具體地說，這些分支酶是從嗜熱生物和/或微生物提取的。在完全或部分溶解該淀粉這一步驟后，將分支酶持續(xù)引入反應(yīng)介質(zhì)中，引入的條件限制分子間絡(luò)合物的形成。更具體地說，將分支酶引入反應(yīng)介質(zhì)的條件要根據(jù)時(shí)間和溫度進(jìn)行調(diào)整，以便限制因該淀粉的回生造成的可溶性物質(zhì)的形成，以及結(jié)構(gòu)化的直鏈淀粉-脂質(zhì)結(jié)合體的形成。因此，將由此被部分或完全凝膠化的淀粉糊冷卻，以便達(dá)到選定的分支酶的最佳溫度。例如，如果選擇從芽孢桿菌屬(嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophiIus)、巨大芽孢桿菌(B. megaterium)等)的嗜熱微生物提取的熱穩(wěn)定性糖原分支酶,則有必要使該淀粉糊的溫度達(dá)到該酶的最佳操作溫度，即介于60°C和80°C之間。有利的選擇為，經(jīng)過不到15分鐘的時(shí)間段，將該部分或完全凝膠化的淀粉糊從介于140°C與160°C之間的起始溫度快速冷卻至從60°C至80°C的溫度，從而允許立即添加該分支酶以避免該淀粉的回生或結(jié)構(gòu)化的直鏈淀粉-脂質(zhì)結(jié)合體的形成。然后調(diào)整該溶液的pH以便使該pH值符合所述酶的操作模式。如下文所示例，在將反應(yīng)介質(zhì)的溫度快速降低至分支酶的最佳操作溫度后，選擇使用所述分支酶，其活性介于25，000U/ml與60，000U/ml之間，添加的劑量介于800與2500U/g干淀粉之間，溫度介于60°C與80°C之間，持續(xù)時(shí)間從12至18小時(shí)。
在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，該酶最終可以在從90°C至95°C的溫度下被熱滅活。由此，在一種水溶液中獲得支化的可溶性葡萄糖聚合物。根據(jù)本發(fā)明的方法的可任選的第三步包括使一種淀粉液化酶發(fā)揮作用，如一種α淀粉酶。反應(yīng)條件(溫度以及pH)如下從O. 10至O. 30ml的α淀粉酶，例如活性介于100與150KNU/ml之間的來自諾維信(Novozymes)公司的Termamyl 120L類型的α淀粉酶，溫度為95°C，pH介于5與8之間，持續(xù)時(shí)間為30至60分鐘、優(yōu)選持續(xù)45分鐘。然后，通過將pH降至3. 5，例如通過使用10% HC1，將該α淀粉酶滅活。在該處理結(jié)束時(shí)，在一個(gè)水溶液中作為與它的酶降解產(chǎn)物的混合物獲得了根據(jù)本
發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物。與上述的專利申請(qǐng)、尤其是EP I 369 432與EP I 548 033的傳授內(nèi)容相比，使用一種技術(shù)(例如選自膜分離和色譜法的組)來回收高分子量餾分并且排除低分子量餾分的一種分餾法，此處沒有必要進(jìn)行。因此，只使用分支酶進(jìn)行處理的直接產(chǎn)物，以及使用分支酶然后使用α淀粉酶進(jìn)行處理的直接產(chǎn)物，構(gòu)成了先前所描述的支化的可溶性葡萄糖聚合物的兩個(gè)家族。第一個(gè)家族對(duì)應(yīng)于只使用分支酶進(jìn)行處理而獲得的根據(jù)本發(fā)明的葡萄糖聚合物；第二個(gè)家族對(duì)應(yīng)于使用分支酶以及α淀粉酶進(jìn)行聯(lián)合處理而獲得的根據(jù)本發(fā)明的葡萄糖聚合物。因此，使用一種技術(shù)，該技術(shù)選自例如膜分離和色譜法的組，對(duì)上文所述的第二個(gè)家族的產(chǎn)物進(jìn)行分餾，將會(huì)產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物的第三個(gè)家族。根據(jù)本發(fā)明的方法的第四步包括通過以下步驟純化所生成的支化的可溶性葡萄糖聚合物至少一個(gè)用活性碳和/或用顆粒狀碳黑進(jìn)行處理的步驟，至少一個(gè)殺菌過濾步驟，以及可任選地，至少一個(gè)熱處理步驟。本申請(qǐng)公司，在一種特殊的安排中，將這些用活性碳和/或顆粒狀碳黑進(jìn)行處理的步驟、過濾步驟，或甚至熱處理步驟組合在一起，從而非常成功地保證了“幾乎不存在”污染物，尤其是內(nèi)毒素類、β葡聚糖類以及肽聚糖類。因此，這一方法的安全性使之有可能將所述方法結(jié)束時(shí)的細(xì)菌控制限制在檢測(cè)肽葡聚糖類的單個(gè)測(cè)試(例如本申請(qǐng)公司開發(fā)并驗(yàn)證的高敏感度測(cè)試，該測(cè)試將在下文描述)以及檢測(cè)內(nèi)毒素類的常規(guī)測(cè)試(LAL測(cè)試=檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素類的測(cè)試，這些細(xì)菌內(nèi)毒素類是革蘭氏陰性菌的主要成分)。基于本發(fā)明的目的，術(shù)語“幾乎不存在”旨在表示一個(gè)閾值定量，該定量遠(yuǎn)低于藥典測(cè)試中所描述的定量，即對(duì)于內(nèi)毒素類(以及β葡聚糖類)，通過LAL測(cè)試法(凝膠終點(diǎn)法)，使用CR恩度斯弗公司(Charles River-Endosafe)生產(chǎn)的多種試劑(敏感度為O. 015E. U/ml的LAL裂解物對(duì)照0R15015，以及每瓶500ng或IOng的CSE內(nèi)毒素類對(duì)照EllO或E120) 0. 6EU/g ;
對(duì)于肽葡聚糖類(以及β葡聚糖類)，通過本申請(qǐng)公司開發(fā)的一種高靈敏度測(cè)試<8ng/g的葡萄糖聚合物(因此，遠(yuǎn)低于專利EP I 720 999中針對(duì)肽葡聚糖類所描述的參考閾值)。表述“本申請(qǐng)公司開發(fā)并驗(yàn)證的高靈敏度測(cè)試”旨在表示由本申請(qǐng)公司開發(fā)并驗(yàn)證的一種測(cè)試，是通過調(diào)適由和光純藥工業(yè)公司(Wako Pure Chemical Industries Ltd.)生產(chǎn)并銷售的SLP-HS單套試劑盒對(duì)照293-58301來開發(fā)并驗(yàn)證。該測(cè)試包括添加“SLP-HS” (高靈敏度桑蠶幼蟲血漿)試劑，所述試劑是由桑蠶幼蟲血衆(zhòng)制備，能夠與葡萄糖聚合物溶液中含有的肽葡聚糖類以及β葡聚糖類反應(yīng)，該溶液是在水(例如，LAL測(cè)試的專用水)中以5%制備，誘導(dǎo)一個(gè)絲氨酸-蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并且
利用和光純藥工業(yè)公司制造并銷售的一個(gè)內(nèi)毒素檢測(cè)儀試管讀取器，檢測(cè)和/或定量所述肽葡聚糖類以及β葡聚糖類，在以下非常低的閾值下進(jìn)行，即檢測(cè)限度(LD)，閾值大約為O. 05ng/ml (即，lng/g的葡萄糖聚合物)以及定量限度(LQ),閾值大約為O. 15ng/ml (即，3ng/g的葡萄糖聚合物)(LD以及LQ在所測(cè)試的葡萄糖聚合物產(chǎn)物中測(cè)定)。更具體地說，該SLP-HP測(cè)試包括在合適質(zhì)量的水(例如，LAL測(cè)試的專用水)中以5%制備在溶液中的測(cè)試葡萄糖聚合物，在從O. 04至2. 5ng/ml (目標(biāo)值)的應(yīng)用范圍上，產(chǎn)生在水中的肽葡聚糖類的一個(gè)定標(biāo)范圍，利用SLP-HS單套試劑盒的肽葡聚糖類標(biāo)準(zhǔn)(從金黃色葡萄球菌提取的)，以用于建立一個(gè)直線的定標(biāo)線(對(duì)數(shù)刻度的線性回歸Ta = f(PG含量)，在添加100 μ I稀釋劑(在上述試劑盒中供應(yīng))進(jìn)行重構(gòu)后，向HS-SLP試管中引Λ 100 μ I所制備的測(cè)試溶液，將SLP-HS試管引入到內(nèi)毒素檢測(cè)儀試管讀取器(和光純藥公司)的孵育孔中，該讀取器恒溫在30°C，并根據(jù)制造商建議的條件進(jìn)行了參數(shù)化。該測(cè)試溶液的PG含量利用已建立的直線的定標(biāo)線進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表達(dá)為ng/ml的5%的測(cè)試溶液，然后表達(dá)為ng/g的葡萄糖聚合物。值得注意的是，結(jié)束時(shí)，利用根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的葡萄糖聚合物中的這些肽葡聚糖以及β葡聚糖的數(shù)量必定遠(yuǎn)低于8ng/g的葡萄糖聚合物。如上文已述，在純化旨在用于腹膜透析的支化的可溶性葡萄糖聚合物的方法中，該純化方法的第一步包括在一個(gè)特殊的配置中使用活性碳和/或顆粒狀碳黑。申請(qǐng)公司建議在以下三種變體的至少一個(gè)變體中來實(shí)施這一手段。在根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)變體中在使用顆粒狀碳黑的情況下，該配置是基于在逆流模式中的操作。在柱中的停留時(shí)間大約為3小時(shí)。在約80°C的溫度下，以約2m/h的速度進(jìn)行滲濾，以避免細(xì)菌污染。根據(jù)本發(fā)明的待純化的葡萄糖聚合物與顆粒狀碳黑之間的接觸在以下意義上發(fā)生在逆流模式中該葡萄糖聚合物溶液首先與飽和的顆粒狀碳黑在柱的底部進(jìn)行接觸。
因此，經(jīng)過純化的葡萄糖聚合物是在顆粒狀碳黑的柱的頂部得以回收，在該柱頂部，經(jīng)過純化的顆粒狀碳黑在逆流模式中添加。以此方式，在柱頂部的顆粒狀碳黑的最后一層充當(dāng)一個(gè)“安全屏障”。這一安排可以通過進(jìn)行顆粒狀碳黑“追加”操作來控制。使柱停止，經(jīng)底部取出飽和的顆粒狀碳黑，并且經(jīng)頂部用再生的顆粒狀碳黑予以替換。飽和的顆粒狀碳黑在再生之前，在一個(gè)平底爐中經(jīng)過熱處理而脫糖。在啟動(dòng)時(shí)，為了安全起見，將第一 Hi3具有低的干物質(zhì)含量的支化的可溶性葡萄糖聚合物降低等級(jí)。對(duì)污染物(內(nèi)毒素類、肽葡聚糖類以及β葡聚糖類)水平下降的監(jiān)控可以通過從柱底部到柱頂部取一定數(shù)目的樣品(例如五份)來加以分析；
在根據(jù)本發(fā)明的方法的第二個(gè)變體中在使用活性碳的情況下，該配置是基于使用活性碳進(jìn)行的一個(gè)“雙重”處理。將加入的支化的可溶性葡萄糖聚合物與活性碳(相對(duì)于待處理的干物質(zhì)，該活性碳介于O. 5%與5%之間、優(yōu)選介于O. 5%與I. 5%之間)混合,溫度介于70°C與75°C之間，持續(xù)時(shí)間為I小時(shí)。然后，過濾并分析這些葡萄糖聚合物。然后，使這些葡萄糖聚合物經(jīng)受相同性質(zhì)的一個(gè)處理。這第二次處理是“安全”處理。本申請(qǐng)公司建議在這兩個(gè)階段中使用孔隙度不同的活性碳，以便將污染物大小的變化性考慮在內(nèi)。在根據(jù)本發(fā)明的方法的第三個(gè)變體中選擇將一個(gè)顆粒狀碳黑階段以及一個(gè)活性碳階段相組合。于是本申請(qǐng)公司建議將顆粒狀碳黑柱放置在這一組合的始端。實(shí)施這兩個(gè)階段的條件與上文所述的條件相一致。為純化葡萄糖聚合物而實(shí)施的這三種手段中的第二個(gè)包括使用一個(gè)殺菌過濾步驟，這些葡萄糖聚合物旨在用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的腹膜透析液。此殺菌過濾步驟主要由以下各項(xiàng)組成一個(gè)膜過濾，其中孔徑為O. I μ m ;在此之前，適當(dāng)時(shí)先進(jìn)行一個(gè)膜超濾，其中孔徑為O. 22 μ m ;在該超濾之前，先進(jìn)行一個(gè)膜過濾，其中孔徑為O. 45 μ m。該步驟有可能保留多種微生物、并且尤其是酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)類型的嗜酸熱性細(xì)菌引起的任何污染,這些微生物的尺寸比這些過濾孔徑大。使用幾個(gè)筒式過濾器進(jìn)行該過濾，這些過濾器被插入一個(gè)垂直殼體中，糖漿被朝向該垂直殼體引導(dǎo)。這些筒式過濾器例如由Pall公司或Millipore公司供應(yīng)。這些筒的尺寸可以是10英寸、20英寸或30英寸，并且所安裝的筒的個(gè)數(shù)使得有可能獲得一個(gè)過濾表面積，該表面積足以使介于I和201/分鐘/m2之間的一個(gè)產(chǎn)物流速通過。這些筒式過濾器具有多種抵抗能力，這些能力用于在約75°C的高溫下持續(xù)工作，并用于在超過700h的時(shí)間段內(nèi)使上述的流速通過。
在高于75°C的溫度下工作可以限制任何微生物生長，尤其是嗜熱菌群的生長。這些筒的耐溫性還使得可以在它們投入使用前進(jìn)行一個(gè)殺菌步驟。該殺菌步驟包括使處于2巴下的蒸汽通過該殼體，持續(xù)20分鐘。在該殺菌步驟后，用純化水(藥典的含義之內(nèi)的純化水)沖洗5分鐘。這些過濾器還具有忍受某些用于設(shè)備清洗操作的化學(xué)產(chǎn)品、尤其是濃度為5%。的過氧乙酸的能力。可以對(duì)這些筒進(jìn)行一個(gè)完整性測(cè)試，使 用來自例如Millipore公司的一個(gè)完整性測(cè)試。當(dāng)安裝這些筒以驗(yàn)證其裝配時(shí)，進(jìn)行該完整性測(cè)試。然后，在每次清洗設(shè)備之前以及最后在拆卸之前進(jìn)行該測(cè)試，以驗(yàn)證所述筒在生產(chǎn)階段的正確運(yùn)行。這些過濾器的工作壓力差(ΛΡ)不得超過2巴，以保證它們的完整性。如果這種情況發(fā)生，這些過濾器必須更換成新的。為純化旨在用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的腹膜透析液的支化的可溶性葡萄糖聚合物而實(shí)施的第三個(gè)和最后一個(gè)手段可以包括使用一個(gè)特殊的熱處理步驟，該熱處理步驟最好在這些純化步驟結(jié)束時(shí)實(shí)施。本申請(qǐng)公司已經(jīng)注意到此處理在保證對(duì)通過根據(jù)本發(fā)明的方法提供的葡萄糖聚合物的高純化水平方面無關(guān)緊要，但考慮到安全性可以實(shí)施。更具體地說，該熱處理包括調(diào)節(jié)時(shí)間/溫度對(duì)，以消除嗜熱微生物的殘余生物負(fù)載，這些微生物仍能夠污染所述葡萄糖聚合物。該熱處理步驟然后包括加熱，加熱溫度介于100°C與130°C之間、優(yōu)選為120°C，持續(xù)時(shí)間I至5分鐘，優(yōu)選持續(xù)2分鐘。該熱處理利用一個(gè)管式換熱器來進(jìn)行，在該換熱器中葡萄糖聚合物溶液進(jìn)行循環(huán)，所述管式換熱器被一個(gè)壓延機(jī)包圍，該壓延機(jī)中被送入處于2巴下的蒸汽，以調(diào)節(jié)該壓延機(jī)中約120°C的溫度。這種管式換熱器，例如由Actini公司制造，由以下幾個(gè)部分組成用于回收能量的一個(gè)區(qū)段，該能量是在該區(qū)的進(jìn)口和出口之間產(chǎn)生，用處于2巴下的蒸汽加熱的區(qū)段，被整合的一個(gè)支撐區(qū)段，該支撐區(qū)段可以根據(jù)所需的停留時(shí)間進(jìn)行調(diào)制。計(jì)算該換熱器的長度，以便根據(jù)進(jìn)料流速來保證所需的停留時(shí)間。例如，針對(duì)約100至130升的一個(gè)支撐區(qū)段，進(jìn)料流速可以介于3000和4000升/小時(shí)之間。為了說明針對(duì)根據(jù)本發(fā)明的葡萄糖聚合物的這一純化處理，其中一個(gè)優(yōu)選的方法包括，在對(duì)步驟2)結(jié)束時(shí)所規(guī)定的分支酶進(jìn)行滅活步驟后，或在可任選的步驟3)結(jié)束時(shí)所建議的α淀粉酶進(jìn)行抑制步驟后，進(jìn)行以下連續(xù)步驟i)使含有支化的可溶性葡萄糖聚合物的水溶液的pH值達(dá)到4與5之間的值、優(yōu)選為4. 5的值，ii)對(duì)所生成的溶液進(jìn)行兩個(gè)用活性碳和/或用顆粒狀碳黑處理的連續(xù)步驟，iii)在孔徑為10 μ m的一個(gè)過濾器上、并且然后在孔徑為I μ m的一個(gè)過濾器上進(jìn)行過濾，iv)對(duì)支化的可溶性葡萄糖聚合物的溶液進(jìn)行蒸發(fā)、濃縮和去礦化，V)進(jìn)行用活性碳和/或用顆粒狀碳黑進(jìn)行處理的一個(gè)第三步驟，
vi)在孔徑為10 μ m的一個(gè)過濾器上、并且然后在孔徑為1.2μπι的一個(gè)過濾器上進(jìn)行過濾，vii)實(shí)施殺菌過濾，該殺菌過濾由兩個(gè)膜過濾組成，其中其孔徑為O. 45 μ m然后是 O. 22 μ rtio本申請(qǐng)公司建議，在步驟2)的水平上，在用活性碳和/或顆粒狀碳黑進(jìn)行處理的兩個(gè)連續(xù)步驟之間，去除第一個(gè)處理步驟產(chǎn)生的溶液的顆粒以及雜質(zhì)(例如，污染性碳或顆粒狀碳黑的顆粒)，以避免隨后使用的活性碳和/或顆粒狀碳黑柱的阻塞。對(duì)這種無機(jī)的、或甚至有機(jī)的填充物的去除可以在無菌條件下，通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的任何手段來進(jìn)行。例如，該去除可以使用以下各項(xiàng)來進(jìn)行，即使用一個(gè)無菌盤式離心分離器，如由阿法拉伐(Alfa Laval)公司銷售的一種無菌盤式離心分離器(BTUX型)；使用一個(gè)微濾模塊，如由頗爾(Pall)公司銷售并裝配有多個(gè)Membralox陶瓷膜的一種微濾模塊；或使用一 個(gè)伊頓(Eaton)袋式過濾器，該過濾器具有的連續(xù)孔徑為50μπι、25μπι以及10 μ m，這些將在下文中示例。因此，這些連續(xù)的步驟使之有可能逐步地增加葡萄糖聚合物生產(chǎn)的安全性，這些葡萄糖聚合物旨在用于制備腹膜透析液。完全有利的是，這些支化的可溶性葡萄糖聚合物，即使在副產(chǎn)物存在下，也完全適合用于旨在使用它們的腹膜透析應(yīng)用中。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的其他特征以及優(yōu)勢(shì)，在閱讀了下文所述的非限制性實(shí)例后，將會(huì)變得明顯。實(shí)例I.僅利用分支酶制備本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物(根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)家族的聚合物)一種含有11%的干物質(zhì)的淀粉溶液由以下豌豆淀粉制備，即富含的淀粉含量大于95%，并且具有的直鏈淀粉含量為36. 7%。為此，在環(huán)境溫度下并且伴隨攪拌，將IlOg干的豌豆淀粉重懸在890ml的水中。用4% NaOH 將 pH 調(diào)節(jié)到 7. O。在一個(gè)噴射式蒸煮鍋中進(jìn)行該淀粉的完全溶解，溫度為150°C，持續(xù)時(shí)間為4分鐘，氣壓為4-5巴，隨后通過在一個(gè)換熱器中再循環(huán)而常壓快速冷卻至70°C。持續(xù)添加從嗜熱脂肪芽孢桿菌純化的糖原分支酶，添加比例為每IOOg干底物，3ml處于45000U/ml的酶溶液。進(jìn)行酶促反應(yīng)，持續(xù)時(shí)間為15小時(shí)，溫度為70°C，并且pH為6. 8，然后經(jīng)由在90°C下加熱I小時(shí)來停止反應(yīng)。然后使反應(yīng)介質(zhì)回到溫度70°C，以及pH 4. 5。然后，將該反應(yīng)介質(zhì)在1% d/d Norit SX+活性碳上進(jìn)行處理，持續(xù)時(shí)間為I小時(shí)，并且在連續(xù)孔徑為50 μ m、25 μ m以及10 μ m的伊頓袋式過濾器上進(jìn)行過濾。所生成的溶液經(jīng)歷一個(gè)進(jìn)一步的處理，該處理使用按重量計(jì)I %干/干(d/d)的Norit SX+活性碳，持續(xù)時(shí)間為I小時(shí)，溫度為70°C，然后在一個(gè)孔徑為Ilym的Cricket過濾器上、并且然后在一個(gè)I μ m伊頓過濾器上進(jìn)行過濾。將所生成的產(chǎn)物在一個(gè)尼魯(Niro)降膜蒸發(fā)器上濃縮至干物質(zhì)含量為約30%。通過穿過一個(gè)混合床進(jìn)行去礦化，溫度為小于40°C，并且流速為3V/V/h。將經(jīng)過去礦化的溶液加熱至70°C，并經(jīng)歷使用I % d/d Norit SX+活性碳的一個(gè)第三處理步驟，持續(xù)時(shí)間為I小時(shí)，然后在一個(gè)孔徑為Ilym的Cricket過濾器上、并且然后在孔徑為I. 2 μ m的Millipore筒上進(jìn)行過濾,隨后在孔徑為O. 45 μ m然后O. 22 μ m的膜上進(jìn)彳丁殺囷過濾。然后將該溶液進(jìn)行噴霧干燥。由此純化的葡萄糖聚合物具有的內(nèi)毒素含量小于O. 3EU/g，并且肽葡聚糖含量小于20ng/g，并且每克中也不存在好氧微生物(酵母菌、霉菌和嗜熱嗜酸菌)。 以下表I呈現(xiàn)了由此獲得的根據(jù)本發(fā)明的支化的可溶性葡萄糖聚合物與艾考糊精對(duì)比的理化特征的結(jié)果。表I
權(quán)利要求
1.支化的可溶性葡萄糖聚合物，該聚合物是由以下淀粉制備，即具有的直鏈淀粉含量為按重量計(jì)至少30%、優(yōu)選介于按重量計(jì)35%與80%之間，該聚合物具有的α -1，6糖苷鍵含量介于7%與10%之間、優(yōu)選介于8%與9%之間，并且Mw介于50，000與150，000道爾頓之間，其特征在于，該聚合物對(duì)胰臟α淀粉酶展現(xiàn)出抗性，該抗性根據(jù)測(cè)試“B”表達(dá)為 還原糖含量為介于25%與35%之間，以及 多種所釋放產(chǎn)物的Mw為介于6，000與12，000道爾頓之間。
2.如權(quán)利要求I所述的聚合物，其特征在于，該聚合物具有的根據(jù)測(cè)試A測(cè)定的重量克分子滲透濃度的值為小于100m0sm/kg,該測(cè)試A包括使用來自Fiske Associates的Mark 3滲透壓計(jì)來測(cè)定含有被置于Ikg水中的IOOg干燥的所述支化葡萄糖聚合物的溶液的重量克分子滲透濃度。
3.如權(quán)利要求I和2中任一項(xiàng)所述的聚合物，其特征在于，該聚合物具有的支鏈長度分 布特征由以下特征組成 25%至 80%的 DP < 10， 2%至 10%的 DP > 30， 而平均DP介于4與12之間。
4.如權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的聚合物，其特征在于，該聚合物對(duì)胰臟α淀粉酶展現(xiàn)出抗性，該抗性根據(jù)測(cè)試“B”表達(dá)為 還原糖含量大于或等于25%并且小于30%， 多種所釋放產(chǎn)物的Mw大于或等于9，500且小于12，000道爾頓。
5.如權(quán)利要求4所述的聚合物，其特征在于，該聚合物根據(jù)測(cè)試“Α”測(cè)定的重量克分子滲透濃度的值為介于10與20m0sm/kg之間。
6.如權(quán)利要求4和5中任一項(xiàng)所述的聚合物，其特征在于，該聚合物具有的支鏈長度分布特征由以下特征組成 25%至 40%的 DP < 10， 5%至 10%的 DP > 30， 而平均DP介于10與12之間。
7.如權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的聚合物，其特征在于，該聚合物對(duì)胰臟α淀粉酶展現(xiàn)出抗性，該抗性根據(jù)測(cè)試“B”表達(dá)為 還原糖含量大于或等于30%并且小于35%， 多種所釋放產(chǎn)物的Mw大于或等于6，000道爾頓并且小于9，500道爾頓。
8.如權(quán)利要求7所述的聚合物，其特征在于，該聚合物根據(jù)測(cè)試“Α”測(cè)定的重量克分子滲透濃度的值為介于50與100m0sm/kg之間。
9.如權(quán)利要求7和8中任一項(xiàng)所述的聚合物，其特征在于，該聚合物具有的支鏈長度分布特征由以下各項(xiàng)組成 65%至 80%的 DP < 10， 2%至 5%的 DP > 30， 而平均DP介于4與6之間。
10.一種制備如權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的支化的可溶性葡萄糖聚合物的方法，其特征在于，該方法包括以下連續(xù)的步驟 1)將一種淀粉乳爆裂和溶解，該淀粉乳具有的直鏈淀粉含量為按重量計(jì)至少30%，優(yōu)選按重量計(jì)在35%與80%之間，以及干物質(zhì)含量介于5%與25%之間， 2)持續(xù)添加從嗜熱微生物提取的一種糖原分支酶，其活性介于25，000U/ml與·60，000U/ml之間，添加的劑量為介于800與2500U/g干淀粉之間，溫度介于60°C與80°C之間，持續(xù)時(shí)間從12至18小時(shí)， 3)可任選地，用活性介于100與150KNU/ml之間的α淀粉酶類型的一種淀粉液化酶進(jìn)行處理，溫度為95°C，pH介于5與8之間，持續(xù)時(shí)間為30至60分鐘、優(yōu)選持續(xù)45分鐘， 4)通過以下步驟純化所生成的支化的可溶性葡萄糖聚合物 至少一個(gè)用活性碳和/或用顆粒狀碳黑進(jìn)行處理的步驟， 至少一個(gè)殺菌過濾步驟，以及 可任選地，至少一個(gè)熱處理步驟， 5)回收所生成的經(jīng)過純化的支化的可溶性葡萄糖聚合物。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該純化步驟4)包括以下連續(xù)的步驟 i)使含有該支化的可溶性葡萄糖聚合物的水溶液的pH值達(dá)到4與5之間的值、優(yōu)選為·4.5的值， )對(duì)所生成的溶液進(jìn)行用活性碳和/或用顆粒狀碳黑進(jìn)行處理的兩個(gè)連續(xù)步驟， iii)在孔徑為10μ m的一個(gè)過濾器上、并且然后在孔徑為I μ m的一個(gè)過濾器上進(jìn)行過濾， iv)對(duì)該支化的可溶性葡萄糖聚合物的溶液進(jìn)行蒸發(fā)、濃縮和去礦化， V)進(jìn)行用活性碳和/或用顆粒狀碳黑處理的一個(gè)第三步驟， vi)在孔徑為10μ m的一個(gè)過濾器上、并且然后在孔徑為I. 2 μ m的一個(gè)過濾器上進(jìn)行過濾， vii)實(shí)施殺菌過濾，該殺菌過濾由兩個(gè)膜過濾組成，其中其孔徑為0.45μ m、然后為·0.22 μ m。
12.旨在用于人和動(dòng)物的食品和藥物應(yīng)用中的組合物，其特征在于，該組合物含有權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的或者可通過權(quán)利要求10和11所述的方法獲得的支化的葡萄糖聚合物。
13.一種腹膜透析液，其特征在于，它包含作為滲透劑的至少一種如權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的支化的可溶性聚合物。
14.如權(quán)利要求13所述的腹膜透析液，其特征在于，它還包含一種多元醇，該多元醇選自由以下各項(xiàng)構(gòu)成的組，即山梨糖醇、甘露糖醇、麥芽糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇以及氫化的淀粉水解物。
15.如權(quán)利要求13所述的腹膜透析液，其特征在于，它還包含緩沖劑如乳酸鹽類、乙酸鹽類和葡糖酸鹽類。
16.如權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述的腹膜透析液，其特征在于，它還包含葡萄糖、麥芽糖和/或葡萄糖聚合物。
17.如權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)所述的腹膜透析液，其特征在于，它還包含氨基酸類和葡萄糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及支化的可溶性葡萄糖聚合物，這些聚合物是由以下淀粉制備，即具有的直鏈淀粉含量為至少30wt％、優(yōu)選為35wt％至80wt％，這些聚合物具有的α-1，6糖苷鍵含量為7％至10％、優(yōu)選為8％至9％，并且Mw為50,000至150,000道爾頓，其特征在于所述聚合物對(duì)胰臟α淀粉酶具有抗性，該抗性根據(jù)測(cè)試“B”表達(dá)為還原糖含量25％至35％，并且多種所釋放產(chǎn)物的MW為6,000至12,000道爾頓。
文檔編號(hào)C08B30/12GK102741296SQ201180007357
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月2日
發(fā)明者C·珀蒂讓, D·威爾斯, L·格里安-德勒莫 申請(qǐng)人:羅蓋特公司