目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法
【專利摘要】目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法為使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的不發(fā)光粒子的方法，其具有：(a)調(diào)制包含目標(biāo)粒子和平均外徑小于前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的直徑的15％的標(biāo)記用粒子的試樣溶液，在前述試樣溶液中使每1分子前述目標(biāo)粒子結(jié)合2分子以上的前述標(biāo)記用粒子，形成外徑為前述光檢測(cè)區(qū)域的直徑的15％以上的不發(fā)光復(fù)合體的工序；和(b)通過(guò)反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法算出前述工序(a)中調(diào)制的試樣溶液中的前述復(fù)合體的分子數(shù)的工序。
【專利說(shuō)明】目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測(cè)到來(lái)自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)而檢測(cè)目標(biāo)粒子的方法。
[0002]本申請(qǐng)基于2012年4月18日在日本提交的日本特愿2012-095101號(hào)主張優(yōu)先權(quán)，本文援引其內(nèi)容。

【背景技術(shù)】
[0003]隨著近年來(lái)光學(xué)測(cè)量技術(shù)的發(fā)展，使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和能夠進(jìn)行光子計(jì)數(shù)(單光子檢測(cè))的超高靈敏度的光檢測(cè)技術(shù)，能夠檢測(cè)以及測(cè)定單光子或單分子熒光水平的微弱光。因此，提出了使用這樣的微弱光的檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)行生物分子等的分子間相互作用或者結(jié)合-解離反應(yīng)的檢測(cè)的各種裝置或方法。特別是，熒光相關(guān)光譜分析(FluorescenceCorrelat1nSpectroscopy:FCS)、突光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence —IntensityDistribut1nAnalysis:FIDA)等使用了應(yīng)用了共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)的微小區(qū)域的熒光測(cè)定技術(shù)的方法，測(cè)定所需要的試樣與以往相比較濃度極低且微量即可，每次測(cè)定所使用的量最多數(shù)十μ L左右。另外，測(cè)定時(shí)間也大幅地縮短，每次測(cè)定中可重復(fù)進(jìn)行數(shù)次的秒數(shù)量級(jí)時(shí)間的測(cè)定。需要說(shuō)明的是，前述微小區(qū)域是指顯微鏡的激光聚光而成的焦點(diǎn)區(qū)域，被稱為共焦體積。進(jìn)而，作為FCS的方式之一有如下方法:分散于溶解有大量發(fā)光物質(zhì)的溶液中的不發(fā)光粒子進(jìn)入共焦體積內(nèi)時(shí)檢測(cè)到的光強(qiáng)度降低的體系中，計(jì)算出熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)的值并計(jì)算出不發(fā)光粒子在共焦體積內(nèi)的平移擴(kuò)散時(shí)間和滯留粒子數(shù)的平均值的方法(inverse — FCS(iFCS))(例如，參照專利文獻(xiàn)I。)
[0004]最近，提出了使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測(cè)到來(lái)自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)，一邊在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)作為光的檢測(cè)區(qū)域的微小區(qū)域的位置，一邊逐個(gè)地檢測(cè)在前述微小區(qū)域內(nèi)出入的發(fā)光粒子(通過(guò)熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)出光的粒子)的新穎方式的光分析技術(shù)(掃描分子計(jì)數(shù)法)(例如，參照專利文獻(xiàn)2?4)。掃描分子計(jì)數(shù)法為如下技術(shù):具體而言，使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，一邊在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置，一邊檢測(cè)由前述光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子發(fā)出的光，由此一個(gè)一個(gè)地逐個(gè)檢測(cè)試樣溶液中的發(fā)光粒子，能夠取得關(guān)于發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)、試樣溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的信息。
[0005]掃描分子計(jì)數(shù)法的光檢測(cè)機(jī)理自身與FIDA等光分析技術(shù)的情況相同，采取對(duì)來(lái)自共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)的構(gòu)成，所以與FIDA同樣地，試樣溶液的量同樣地可以是微量的(例如數(shù)十UL左右)，另外，測(cè)定時(shí)間也短。另一方面，掃描分子計(jì)數(shù)法與需要計(jì)算出熒光強(qiáng)度的波動(dòng)這樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的FIDA等不同，不需要實(shí)行這樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。因此，掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)能夠適用于粒子的數(shù)密度或濃度大幅地低于FIDA等光分析技術(shù)所需要的水平的試樣溶液。即，利用掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)被發(fā)光探針標(biāo)記的試樣溶液中的目標(biāo)粒子(觀測(cè)對(duì)象粒子)，即便在試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度或數(shù)密度非常低的情況下，也能夠檢測(cè)并解析目標(biāo)粒子的狀態(tài)或特性(參照例如專利文獻(xiàn)5。)。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)1:國(guó)際公開(kāi)第2010/119098號(hào)
[0009]專利文獻(xiàn)2:國(guó)際公開(kāi)第2011/108369號(hào)
[0010]專利文獻(xiàn)3:國(guó)際公開(kāi)第2011/108370號(hào)
[0011]專利文獻(xiàn)4:國(guó)際公開(kāi)第2011/108371號(hào)
[0012]專利文獻(xiàn)5:國(guó)際公開(kāi)第2012/014778號(hào)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]發(fā)明要解決的問(wèn)題
[0014]逐個(gè)地檢測(cè)發(fā)光的單一粒子的光的掃描分子計(jì)數(shù)法中，來(lái)自單一粒子的光是微弱的，所以容易受到漫射光、水的拉曼散射的影響。即，將表示由發(fā)光粒子發(fā)出的光的光強(qiáng)度值的增大識(shí)別為發(fā)光粒子的信號(hào)的分析手法的情況下，有時(shí)誤將漫射光、水的拉曼散射產(chǎn)生的光識(shí)別為發(fā)光粒子的信號(hào)。另外，檢測(cè)單一粒子的光的掃描分子計(jì)數(shù)法的情況下，作為觀測(cè)對(duì)象的粒子(觀測(cè)對(duì)象粒子)僅僅限于發(fā)光粒子。因此，想觀測(cè)不發(fā)光粒子的情況下，需要對(duì)于作為觀測(cè)對(duì)象的粒子附加發(fā)光標(biāo)記(熒光標(biāo)記、磷光標(biāo)記等)，但不一定總是能夠?qū)τ^測(cè)對(duì)象粒子賦予適當(dāng)?shù)陌l(fā)光標(biāo)記。觀測(cè)對(duì)象粒子有時(shí)由于賦予發(fā)光標(biāo)記而變性。
[0015]本發(fā)明的方式目的在于提供抑制由漫射光、水的拉曼散射帶來(lái)的影響并且不進(jìn)行發(fā)光標(biāo)記地利用掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)試樣溶液中的不發(fā)光目標(biāo)粒子(檢測(cè)對(duì)象的粒子)的方法。
[0016]用于解決問(wèn)題的方案
[0017]為了解決上述問(wèn)題而深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用了共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的掃描分子計(jì)數(shù)法中，如果從所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)包含實(shí)質(zhì)上一定的背景光的光，則當(dāng)充分小于光檢測(cè)區(qū)域的粒子通過(guò)時(shí)，檢測(cè)到的光強(qiáng)度幾乎沒(méi)有變化；而比較大的粒子通過(guò)時(shí)，光被前述粒子遮蔽，檢測(cè)到的光強(qiáng)度降低。進(jìn)而，使用每一分子的大小充分地小于光檢測(cè)區(qū)域的不發(fā)光粒子作為標(biāo)記用粒子、使用多個(gè)標(biāo)記用粒子來(lái)標(biāo)記每一分子目標(biāo)粒子，檢測(cè)背景光的降低(由光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)到的光強(qiáng)度的降低)作為表示目標(biāo)粒子存在的信號(hào)，由此能夠區(qū)別地檢測(cè)與目標(biāo)粒子結(jié)合的標(biāo)記用粒子與游離的標(biāo)記用粒子。
[0018]即，本發(fā)明的一方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法為以下的(I)?(12)。
[0019](I)本發(fā)明的一方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法為使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的不發(fā)光粒子的方法，
[0020](a)調(diào)制包含目標(biāo)粒子和平均外徑小于前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的直徑的15%的標(biāo)記用粒子的試樣溶液，在前述試樣溶液中使每I分子前述目標(biāo)粒子結(jié)合2分子以上的前述標(biāo)記用粒子，形成外徑為前述光檢測(cè)區(qū)域的直徑的15%以上的不發(fā)光復(fù)合體的工序；和
[0021](b)通過(guò)如下工序算出所述工序(a)中調(diào)制的試樣溶液中的前述復(fù)合體的分子數(shù)的工序:
[0022]在前述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序；
[0023]一邊在前述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置，一邊由前述光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)包含實(shí)質(zhì)上一定的背景光的光而生成按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的工序；
[0024]在前述按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，將前述復(fù)合體進(jìn)入前述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的光強(qiáng)度的降低作為表示各前述復(fù)合體存在的信號(hào)并逐個(gè)檢測(cè)的工序；和
[0025]對(duì)前述逐個(gè)檢測(cè)到的表示復(fù)合體存在的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而計(jì)數(shù)前述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)到的前述復(fù)合體的個(gè)數(shù)的工序。
[0026](2)前述(I)的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，前述復(fù)合體的外徑為前述光檢測(cè)區(qū)域的直徑的35%以上。
[0027](3)前述⑴或⑵的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，前述目標(biāo)粒子與前述標(biāo)記用粒子特異地結(jié)合。
[0028](4)前述⑴?(3)的任一項(xiàng)的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，前述目標(biāo)粒子為核酸。
[0029](5)前述⑴?(4)的任一項(xiàng)的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，前述背景光為由分散于前述試樣溶液內(nèi)的物質(zhì)產(chǎn)生的熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或散射光。
[0030](6)前述⑴?(4)的任一項(xiàng)的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，前述背景光為照明光。
[0031](7)前述(I)?(6)的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中的前述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，前述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比前述復(fù)合體的擴(kuò)散移動(dòng)速度更快的速度移動(dòng)。
[0032](8)前述⑴?(7)的任一項(xiàng)的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中的前述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，通過(guò)改變前述光學(xué)系統(tǒng)的光路而移動(dòng)前述光檢測(cè)區(qū)域在前述試樣溶液內(nèi)的位置。
[0033](9)前述(I)?(8)的任一項(xiàng)的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中的逐個(gè)地檢測(cè)表示前述復(fù)合體存在的信號(hào)的工序中，由前述背景光的強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，檢測(cè)到具有低于規(guī)定閾值的光強(qiáng)度的信號(hào)時(shí)可以判定I個(gè)復(fù)合體進(jìn)入到前述光檢測(cè)區(qū)域。
[0034](10)前述(I)?(9)的任一項(xiàng)的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中的逐個(gè)地檢測(cè)表示前述復(fù)合體存在的信號(hào)的工序中，前述按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)被平滑化，在前述被平滑化的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，由前述背景光的強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，檢測(cè)具有低于規(guī)定閾值的強(qiáng)度的、向下凸的鐘形的脈沖狀信號(hào)作為表示前述復(fù)合體存在的信號(hào)。
[0035](11)前述(I)?(10)的任一項(xiàng)的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法進(jìn)而具有:根據(jù)前述工序
(b)中檢測(cè)到的被計(jì)數(shù)的前述復(fù)合體的個(gè)數(shù)確定前述試樣溶液中的前述目標(biāo)粒子的數(shù)密度或濃度的工序。
[0036](12)前述(I)?(10)的任一項(xiàng)的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法的前述工序(b)中，重復(fù)進(jìn)行前述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)、來(lái)自前述光檢測(cè)區(qū)域的光的檢測(cè)、表示前述復(fù)合體存在的信號(hào)的檢測(cè)，直至表示前述復(fù)合體存在的信號(hào)的個(gè)數(shù)達(dá)到預(yù)定的個(gè)數(shù)為止，
[0037]根據(jù)表示前述復(fù)合體的信號(hào)存在的個(gè)數(shù)達(dá)到預(yù)定的個(gè)數(shù)所需要的時(shí)間，確定前述試樣溶液中的前述目標(biāo)粒子的濃度。
[0038]發(fā)明的效果
[0039]本發(fā)明的方式中的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法利用掃描分子計(jì)數(shù)法的原理，所以即便在試樣溶液中的目標(biāo)粒子的數(shù)密度或濃度非常低的情況下，也能夠檢測(cè)目標(biāo)粒子。另外，本發(fā)明的方式中的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法不需要對(duì)目標(biāo)粒子進(jìn)行發(fā)光標(biāo)記，因此，即便是賦予光標(biāo)記時(shí)變性的粒子，也能夠作為目標(biāo)粒子檢測(cè)出。進(jìn)而，通過(guò)在某種程度的背景光存在下檢測(cè)背景光的降低作為表示目標(biāo)粒子存在的信號(hào)的方式，能夠防止將漫射光、拉曼散射光誤檢測(cè)為目標(biāo)粒子的信號(hào)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040]圖1A是用于反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的示意圖。
[0041]圖1B是共焦體積(共聚焦顯微鏡的光檢測(cè)區(qū)域)的示意圖。
[0042]圖1C是改變鏡子7的方向，在試樣溶液內(nèi)部移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)的示意圖。
[0043]圖1D是移動(dòng)微孔板的水平方向位置而移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域在試樣溶液內(nèi)的位置的機(jī)構(gòu)的示意圖。
[0044]圖2A是說(shuō)明反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的檢測(cè)不發(fā)光的單一粒子的存在的原理的示意圖以及檢測(cè)到的光強(qiáng)度的時(shí)間變化的示意圖。
[0045]圖2B是說(shuō)明反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的檢測(cè)不發(fā)光的單一粒子的存在的原理的示意圖以及檢測(cè)到的光強(qiáng)度的時(shí)間變化的示意圖。
[0046]圖2C是說(shuō)明不發(fā)光的單一粒子進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的檢測(cè)光量降低的原理的圖。
[0047]圖2D是表示光檢測(cè)區(qū)域與單一粒子的直徑的比、與檢測(cè)光量的降低的比例的關(guān)系的圖。
[0048]圖3為以流程圖的形式表示反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的處理次序的一方式的圖。
[0049]圖4A是表示單一粒子邊進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)邊橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的粒子的運(yùn)動(dòng)方式、以及以快于單一粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度的速度移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域在試樣溶液內(nèi)的位置、從而粒子橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的粒子的運(yùn)動(dòng)方式的模型圖。
[0050]圖4B是表示單一粒子邊進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)邊橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的粒子的運(yùn)動(dòng)方式、以及以快于單一粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度的速度移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域在試樣溶液內(nèi)的位置、從而粒子橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的粒子的運(yùn)動(dòng)方式的模型圖。
[0051]圖4C是說(shuō)明從根據(jù)通過(guò)反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)的時(shí)間變化)檢測(cè)單一粒子存在的處理次序中的、檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)處理過(guò)程的例子的圖。
[0052]圖5為以流程圖的形式表示反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的處理次序的另一方式的圖。
[0053]圖6A為以流程圖的形式表示反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的處理次序的另一方式的圖。
[0054]圖6B為以流程圖的形式表示反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的處理次序的另一方式的圖。
[0055]圖7為表示參考例I中計(jì)算各試樣溶液的峰檢測(cè)率)的結(jié)果的圖。
[0056]圖8為表示實(shí)施例1中由各試樣溶液得到的峰數(shù)與葡聚糖生物素的濃度的圖。

【具體實(shí)施方式】
[0057]本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法(以下，有時(shí)簡(jiǎn)單地稱為“本實(shí)施方式的檢測(cè)方法”。)為使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的不發(fā)光粒子的方法，利用反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法。反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法是指由前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)包含實(shí)質(zhì)上一定的背景光的光，將由前述光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)到的光強(qiáng)度的降低作為指標(biāo)，檢測(cè)通過(guò)前述光檢測(cè)區(qū)域的粒子的存在的掃描分子計(jì)數(shù)法。
[0058]專利文獻(xiàn)2?5中記載的通常的掃描分子計(jì)數(shù)法中，作為觀測(cè)對(duì)象的粒子為發(fā)光粒子，不能檢測(cè)出不發(fā)光粒子。因此，本來(lái)將不發(fā)光粒子作為觀測(cè)對(duì)象時(shí)，需要對(duì)所述粒子賦予熒光標(biāo)記等發(fā)光標(biāo)記。然而，某些粒子難以賦予發(fā)光標(biāo)記，可能由于賦予發(fā)光標(biāo)記而引起粒子的變性。另外，將粒子發(fā)出的光識(shí)別為表示該粒子存在的信號(hào)時(shí)，由漫射光、散射光或者光檢測(cè)器的電噪音導(dǎo)致產(chǎn)生光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的值增大時(shí)，存在誤將該值的增大識(shí)別為發(fā)光粒子的信號(hào)的情況。
[0059]另一方面，通常通過(guò)顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行光檢測(cè)的情況下，背景光高時(shí)，不易受到漫射光、水的拉曼散射的影響。另外，為共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的情況下，沿光軸方向的分辨率比通常的光學(xué)顯微鏡高，所以當(dāng)不發(fā)光粒子通過(guò)共焦體積的內(nèi)部時(shí)，觀測(cè)到來(lái)自共焦體積的光強(qiáng)度的降低。即，在充分的背景光存在下通過(guò)反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)，從而能夠在漫射光、水的拉曼散射的影響降低的環(huán)境下檢測(cè)目標(biāo)粒子。另夕卜，不需要將目標(biāo)粒子用發(fā)光探針等標(biāo)記。
[0060]本實(shí)施方式中，共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測(cè)區(qū)域”是指在這些顯微鏡中檢測(cè)到光的微小區(qū)域，當(dāng)由物鏡照射照明光時(shí)，相當(dāng)于該照明光聚光的區(qū)域。需要說(shuō)明的是，在共聚焦顯微鏡中，所述區(qū)域尤其根據(jù)物鏡與小孔之間的位置關(guān)系確定。
[0061]本實(shí)施方式中，“在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子”是指在試樣溶液中分散或溶解的原子、分子或者它們的聚集體等粒子(可以為發(fā)光的粒子或不發(fā)光粒子的任一者。)，是指非固定于基板等而在溶液中自由地進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)的粒子。
[0062]反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法與掃描分子計(jì)數(shù)法同樣地，邊在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置、即通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)邊逐次地進(jìn)行光的檢測(cè)。所述構(gòu)成中，來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光包含實(shí)質(zhì)上一定的背景光的情況下，“相對(duì)于光檢測(cè)區(qū)域具有某種程度的大小的不發(fā)光粒子”進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，或者在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)的光檢測(cè)區(qū)域包含前述不發(fā)光粒子時(shí)，由于前述粒子的存在，來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的、到達(dá)光檢測(cè)部的背景光的光強(qiáng)度或光量降低。這樣，反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法中，逐個(gè)地檢測(cè)到的光中，在逐次地檢測(cè)所述背景光的光強(qiáng)度或光量的降低作為前述不發(fā)光粒子的信號(hào)。由此，能夠一個(gè)一個(gè)逐個(gè)逐次地檢測(cè)粒子的存在，并且能夠取得關(guān)于粒子在溶液內(nèi)的狀態(tài)的各種信息。需要說(shuō)明的是，本實(shí)施方式中，言及“粒子的信號(hào)”時(shí)，只要沒(méi)有特別的限定，是指表示前述粒子存在的信號(hào)。
[0063]以下，首先對(duì)反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行說(shuō)明。
[0064]<用于反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置的構(gòu)成>
[0065]可以通過(guò)在基本的構(gòu)成中如圖1A中示意性的示例那樣組合能夠?qū)嵤〧CS、FIDA等的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光檢測(cè)器而構(gòu)成的光分析裝置實(shí)施反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法。參照?qǐng)D1A，光分析裝置I是由光學(xué)系統(tǒng)2?17、和用于控制光學(xué)系統(tǒng)的各部分的行為并獲得、分析數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)18構(gòu)成的。光分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以是與通常的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)同樣的。光分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)中，自光源2放射的在單模光纖3內(nèi)傳播的激光(Ex)在光纖的射出端以固有的NA (Numerical Aperture)規(guī)定的角度放射為發(fā)散的光，通過(guò)準(zhǔn)直儀4成為平行光，在分色鏡5、反射鏡6、7處發(fā)生反射，入射至物鏡8。在物鏡8的上方，典型地配置有分注了 I μ L?數(shù)十μ L的試樣溶液的試樣容器或排列有孔10的微孔板9。自物鏡8射出的激光在試樣容器或孔10內(nèi)的試樣溶液中聚集為焦點(diǎn)，形成光強(qiáng)度強(qiáng)的區(qū)域(激發(fā)區(qū)域)。試樣溶液中，除了作為觀測(cè)對(duì)象的不發(fā)光粒子(本實(shí)施方式的方法中為目標(biāo)粒子)等不發(fā)光粒子之外，可以分散或溶解產(chǎn)生背景光的任意的發(fā)光物質(zhì)。該情況下，當(dāng)不發(fā)光粒子未進(jìn)入激發(fā)區(qū)域時(shí)，發(fā)光物質(zhì)被激發(fā)而發(fā)出實(shí)質(zhì)上一定的光而成為背景光；當(dāng)不發(fā)光粒子進(jìn)入激發(fā)區(qū)域時(shí)，背景光降低。
[0066]這樣，由激發(fā)區(qū)域發(fā)出的光(Em)通過(guò)物鏡8、分色鏡5，在鏡11處反射，在聚光鏡12處聚光，通過(guò)小孔13，透過(guò)二次濾片14(此處，只選擇特定的波長(zhǎng)范圍的光成分。)被導(dǎo)入至多模光纖15而到達(dá)光檢測(cè)器16，轉(zhuǎn)換成按照時(shí)間順序的電信號(hào)之后，輸入至計(jì)算機(jī)18，按照后面說(shuō)明的方式實(shí)施用于檢測(cè)單一粒子(顯示作為一粒子的行為的粒子。本實(shí)施方式的檢測(cè)方法中，除了游離狀態(tài)的目標(biāo)粒子、游離狀態(tài)的標(biāo)記用粒子之外，還包含目標(biāo)粒子與標(biāo)記用粒子的復(fù)合體。)的處理。需要說(shuō)明的是，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，在上述的構(gòu)成中，小孔13配置于與物鏡8的焦點(diǎn)位置共軛的位置上。由此，僅自如圖1B中示意地所示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域即激發(fā)區(qū)域內(nèi)發(fā)出的光通過(guò)小孔13，而來(lái)自激發(fā)區(qū)域以外的光被擋住。圖1B所例示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域通常是具有IfL?1fL左右的實(shí)際體積的、位于本光分析裝置中的光檢測(cè)區(qū)域(典型地，光強(qiáng)度呈現(xiàn)以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)的高斯樣分布。實(shí)際體積是以光強(qiáng)度為Ι/e2的面為界面的幾乎橢球體的體積。)，被稱為共焦體積。另外，本實(shí)施方式中，由于檢測(cè)的是由來(lái)自數(shù)分子左右的熒光色素分子的微弱光形成的背景光中的、由單一粒子的存在導(dǎo)致的光量的降低，所以作為光檢測(cè)器16優(yōu)選使用能夠用于光子計(jì)數(shù)的超高靈敏度的光檢測(cè)器。光的檢測(cè)通過(guò)光子計(jì)數(shù)進(jìn)行時(shí)，光強(qiáng)度的測(cè)定按照如下方式實(shí)施:經(jīng)過(guò)規(guī)定時(shí)間逐次地檢測(cè)規(guī)定的每單位時(shí)間(BIN TIME)內(nèi)到達(dá)光檢測(cè)器的光子的個(gè)數(shù)。因此，該情況下，按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)也可以為按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。此外，為了改變欲進(jìn)行觀察的孔10，在顯微鏡的平臺(tái)(沒(méi)有圖示)上可以設(shè)有用于移動(dòng)微孔板9的水平方向位置的平臺(tái)位置變化裝置17a。可以通過(guò)計(jì)算機(jī)18控制平臺(tái)位置變化裝置17a的動(dòng)作。通過(guò)所述的構(gòu)成，即使被檢體為多個(gè)，也能夠?qū)崿F(xiàn)快速的測(cè)量。
[0067]進(jìn)一步，上述的光分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，設(shè)置有通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)部、即用于在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)焦點(diǎn)區(qū)域即光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)。所述用于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)，例如如圖1C示意性示例的，也可以采用改變反射鏡7的方向的鏡轉(zhuǎn)向器17(移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的絕對(duì)位置的方式)。所述的鏡轉(zhuǎn)向器17也可以為與裝備在普通的激光掃描型顯微鏡中的檢流計(jì)鏡裝置相同?；蛘?，作為其他的方式，如圖1D所例示，也可以操作平臺(tái)位置變化裝置17a從而移動(dòng)注入有試樣溶液的容器10 (微孔板9)的水平方向的位置，從而移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域在試樣溶液內(nèi)的相對(duì)位置(移動(dòng)試樣溶液的絕對(duì)位置的方式)。利用任意方式的情況下，鏡轉(zhuǎn)向器17或平臺(tái)位置變化裝置17a在計(jì)算機(jī)18的控制下與光檢測(cè)器16的光檢測(cè)協(xié)調(diào)而被驅(qū)動(dòng)，以實(shí)現(xiàn)預(yù)期的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)模式。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可任意地選自圓形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合(可以從計(jì)算機(jī)18的程序中的各種移動(dòng)模式中選擇。)。另外，也可以將移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的絕對(duì)位置的方式與移動(dòng)試樣溶液的絕對(duì)位置的方式組合，移動(dòng)試樣溶液的位置并且實(shí)施光檢測(cè)區(qū)域的絕對(duì)位置的移動(dòng)。該情況下，能夠避免由于光檢測(cè)區(qū)域短時(shí)間內(nèi)通過(guò)同一區(qū)域而重復(fù)檢測(cè)同一單一粒子。或者，也可以通過(guò)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域絕對(duì)位置的方式，有意地使光檢測(cè)區(qū)域重復(fù)地通過(guò)同一區(qū)域而周期性檢測(cè)同一單一粒子多次，從而謀求信號(hào)精度的提高。該情況下，也可以在規(guī)定時(shí)間內(nèi)實(shí)行光檢測(cè)區(qū)域的絕對(duì)位置的移動(dòng)之后，間歇地移動(dòng)試樣溶液的位置，在試樣溶液內(nèi)的其他位置，實(shí)行同一單一粒子的重復(fù)檢測(cè)而謀求所檢測(cè)的單一粒子的個(gè)數(shù)的增大。需要說(shuō)明的是，雖然沒(méi)有圖示，但也可以通過(guò)上下地移動(dòng)物鏡8或平臺(tái)，而使光檢測(cè)區(qū)域的位置沿上下方向移動(dòng)，使光檢測(cè)區(qū)域位置的軌跡在試樣溶液內(nèi)被三維地展開(kāi)。
[0068]當(dāng)產(chǎn)生背景光的發(fā)光物質(zhì)通過(guò)吸收多光子而發(fā)光時(shí)，上述光學(xué)系統(tǒng)作為多光子顯微鏡使用。在此情況下，僅在激發(fā)光的焦點(diǎn)區(qū)域(光檢測(cè)區(qū)域)中發(fā)出光，所以可以去除小孔13。此外，當(dāng)產(chǎn)生背景光的發(fā)光物質(zhì)通過(guò)化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光現(xiàn)象而不依賴激發(fā)光發(fā)光時(shí)，可以省略用于產(chǎn)生激發(fā)光的光學(xué)系統(tǒng)2?5。當(dāng)產(chǎn)生背景光的發(fā)光物質(zhì)通過(guò)磷光或散射發(fā)光時(shí)，直接使用上述共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。另外，在裝置I中，如圖1A所示，可以為如下構(gòu)成:可以設(shè)置有多個(gè)激發(fā)光源2，根據(jù)發(fā)光物質(zhì)的激發(fā)波長(zhǎng)，選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光的波長(zhǎng)。同樣地，也可以設(shè)置多個(gè)光檢測(cè)器16，也可以根據(jù)背景光的波長(zhǎng)而分別檢測(cè)。進(jìn)而，背景光也可以通過(guò)照明光而給與。該情況下，通過(guò)由物鏡的上方進(jìn)行透射照明(也可以為Koehler照明。)而使試樣溶液被照明。
[0069]<反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的原理>
[0070]反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法直接了當(dāng)?shù)卣f(shuō)，按照檢測(cè)單一粒子的影子的形式的掃描分子計(jì)數(shù)法，逐個(gè)地檢測(cè)單一粒子的存在，能夠取得關(guān)于其計(jì)數(shù)或試樣溶液中的濃度的信息，所述反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法在背景光存在下在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置，檢測(cè)不發(fā)光的單一粒子包含于光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的背景光的降低作為單一粒子的信號(hào)。
[0071]具體而言，與通常的掃描分子計(jì)數(shù)法同樣地，驅(qū)動(dòng)用于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)(鏡偏向器17)而改變光路,或者移動(dòng)注有試樣溶液的容器10 (微孔板9)的水平方向的位置，如圖2A中示意地描述，一邊在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域CV的位置即利用光檢測(cè)區(qū)域CV掃描試樣溶液內(nèi)，一邊實(shí)施光檢測(cè)。如已經(jīng)提到的，試樣溶液中分散有發(fā)光物質(zhì)，光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)存在有多個(gè)發(fā)光物質(zhì)，所以在光檢測(cè)區(qū)域CV的移動(dòng)中(圖2A中，時(shí)間to?t2)，基本上檢測(cè)出大致一樣的來(lái)自這些發(fā)光物質(zhì)的光。然而，在光檢測(cè)區(qū)域CV移動(dòng)期間通過(guò)存在有I個(gè)不發(fā)光粒子的區(qū)域時(shí)(tl)，發(fā)光物質(zhì)存在區(qū)域的體積降低，所以發(fā)光物質(zhì)發(fā)出的光的總量降低，如圖2B所描述那樣，按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上，出現(xiàn)鐘形的脈沖狀的顯著的光強(qiáng)度(Em)的降低。這樣，實(shí)行上述的光檢測(cè)區(qū)域CV位置的移動(dòng)和光檢測(cè)，一個(gè)一個(gè)地檢測(cè)其間出現(xiàn)的如圖2B所例示的脈沖狀的顯著的光強(qiáng)度的降低即表示單一粒子存在的信號(hào)。由此，通過(guò)逐個(gè)地檢測(cè)單一粒子并將其個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠得到與存在于所測(cè)量的區(qū)域內(nèi)的單一粒子的個(gè)數(shù)、或者濃度或數(shù)密度相關(guān)的信息。
[0072]上述的光強(qiáng)度降低的程度，可以由不發(fā)光的單一粒子的直徑與光檢測(cè)區(qū)域直徑的關(guān)系而大概算出。參照?qǐng)D2C，典型地，光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的光強(qiáng)度分布如圖2C中實(shí)線所示，在中心具有最大強(qiáng)度Imax，并且具有向著半徑!■方向降低的鐘形的輪廓f(r)。因此，光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)不存在不發(fā)光粒子時(shí)，由光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)發(fā)出的光的總量α可使用f (r)大致為O的光檢測(cè)區(qū)域的半徑a由式(I)給出。
[0073]α = 4 / r2 f (r) dr [積分區(qū)間為 O ?a]…(I)
[0074]另一方面，半徑為b的不發(fā)光的單一粒子進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)并如圖2C的下部分那樣位于光檢測(cè)區(qū)域的中心時(shí)，該區(qū)域的發(fā)光物質(zhì)被排除。由此，降低了相當(dāng)于圖2C的上部分的斜線區(qū)域的光量。相當(dāng)于該被排除的發(fā)光物質(zhì)的光量即降低量β由式(2)給出。
[0075]β = 4 / r2 f (r) dr [積分區(qū)間為 O ?b]…(2)
[0076]這樣，光強(qiáng)度降低的比例能夠通過(guò)β/α而估算出。
[0077]此處，f (r)為高斯函數(shù)，α = 1、a = I時(shí)，f (r)用式⑶表示。
[0078]f (r) = 0.684exp ( — 2r2)…(3)
[0079]圖2D為使用式(3)，將相對(duì)于半徑比b/a的光強(qiáng)度降低的比例β/α作圖而成的圖。參照?qǐng)D2D，典型地，當(dāng)背景光的變動(dòng)率為1%左右、由單一粒子導(dǎo)致的光強(qiáng)度降低的比例為1%以下時(shí)不能檢測(cè)信號(hào)，所以單一粒子半徑相對(duì)于光檢測(cè)區(qū)域的半徑的比b/a應(yīng)該為0.15以上。另外，將由單一粒子導(dǎo)致的光強(qiáng)度降低的比例設(shè)為10%以上時(shí)，能夠檢測(cè)的單一粒子半徑相對(duì)于光檢測(cè)區(qū)域的半徑的比b/a為0.35。
[0080]需要說(shuō)明的是，欲觀測(cè)的單一粒子為猝滅劑、熒光共振能量轉(zhuǎn)移的受體的情況下，單一粒子吸收周圍(例如，1nm)的光，所以能夠檢測(cè)的單一粒子半徑可以比上述所例示的半徑更小。
[0081]<反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的處理工序>
[0082]反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法中，測(cè)定包含成為觀測(cè)對(duì)象的粒子的試樣溶液的光強(qiáng)度之后進(jìn)行分析。圖3中以流程圖的形式表示反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法中的處理次序的一方式。
[0083](試樣溶液的光強(qiáng)度的測(cè)定:圖3的步驟S100)
[0084]就利用反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析中的光強(qiáng)度的測(cè)定而言，除了在檢測(cè)中驅(qū)動(dòng)鏡轉(zhuǎn)向器17或平臺(tái)位置變化裝置17a，在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置(試樣溶液內(nèi)部的掃描)以外，可以以與FCS或FIDA中的光強(qiáng)度檢測(cè)工序相同的方式實(shí)施。在操作處理中，典型地，在微孔板9的孔10中注入試樣溶液而載置于顯微鏡的平臺(tái)上后，使用者對(duì)計(jì)算機(jī)18輸入測(cè)定開(kāi)始的指示，計(jì)算機(jī)18根據(jù)存儲(chǔ)裝置(沒(méi)有圖示)存儲(chǔ)的程序(在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的次序、和在光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光并生成按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的次序)，開(kāi)始試樣溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域中的激發(fā)光的照射以及光強(qiáng)度的測(cè)量。所述測(cè)量中，在根據(jù)計(jì)算機(jī)18程序的處理操作的控制下，鏡轉(zhuǎn)向器17或平臺(tái)位置變化裝置17a驅(qū)動(dòng)鏡7 (檢流計(jì)鏡)或顯微鏡的平臺(tái)上的微孔板9，在孔10內(nèi)實(shí)施光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)。同時(shí)光檢測(cè)器16將逐次檢測(cè)到的光轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，傳送給計(jì)算機(jī)18，計(jì)算機(jī)18以任意方式由送達(dá)的信號(hào)生成按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并保存。需要說(shuō)明的是，典型地光檢測(cè)器16為能夠檢測(cè)到單光子到達(dá)的超高靈敏度光檢測(cè)器，所以光的檢測(cè)利用光子計(jì)數(shù)的情況下，按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)也可以為按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。
[0085]光強(qiáng)度測(cè)量中的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)速度可以是任意的，可以設(shè)定為適合例如實(shí)驗(yàn)或分析目的的規(guī)定速度。當(dāng)根據(jù)所檢測(cè)到的單一粒子的個(gè)數(shù)獲得與其數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息時(shí)，光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的大小或體積是必需的，所以以移動(dòng)距離受掌握的方式進(jìn)行光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)。需要說(shuō)明的是，測(cè)量中的經(jīng)過(guò)時(shí)間與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)距離成比例關(guān)系的方式，能夠容易地解釋測(cè)定結(jié)果，所以移動(dòng)速度優(yōu)選基本上為恒定速度，但并非僅限于此。
[0086]此外，對(duì)于光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度，為了由測(cè)量的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)逐個(gè)地檢測(cè)單一粒子或者以良好的精度定量地實(shí)行單一粒子的個(gè)數(shù)的計(jì)數(shù)，優(yōu)選將所述的移動(dòng)速度設(shè)定為比單一粒子的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)即布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的移動(dòng)速度更快的值。反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的觀測(cè)對(duì)象粒子是分散或溶解在溶液中的自由地隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子，由于布朗運(yùn)動(dòng)，位置伴隨著時(shí)間而移動(dòng)。因此，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度比粒子的布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的移動(dòng)慢時(shí)，如圖4A示意地描述，粒子在區(qū)域內(nèi)隨機(jī)地移動(dòng)。由此，光強(qiáng)度隨機(jī)地變化(如已知，光檢測(cè)區(qū)域的激發(fā)光強(qiáng)度以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)向外側(cè)降低。)，難以確定對(duì)應(yīng)于各個(gè)單一粒子的顯著的光強(qiáng)度的變化。于是，如圖4B所描述那樣，優(yōu)選粒子幾乎直線地橫穿光檢測(cè)區(qū)域，由此，按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，如圖4C的最上部分例示，對(duì)應(yīng)于各個(gè)單一粒子的光強(qiáng)度變化的輪廓大概一致(單一粒子幾乎直線地通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的情況下，光強(qiáng)度變化的輪廓與反轉(zhuǎn)激發(fā)光強(qiáng)度輪廓幾乎相同。)，將光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為快于粒子的布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的平均的移動(dòng)速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)，以容易確定每個(gè)粒子與光強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
[0087]另外，反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法中，檢測(cè)光檢測(cè)區(qū)域通過(guò)單一粒子的存在位置時(shí)由該單一粒子的存在導(dǎo)致的背景光的降低，從而逐個(gè)地檢測(cè)單一粒子。然而，單一粒子在溶液中由于布朗運(yùn)動(dòng)而隨機(jī)移動(dòng)，在光檢測(cè)區(qū)域中出入多次時(shí)，多次檢測(cè)到來(lái)自一個(gè)單一粒子的、表示其存在的信號(hào)，難以將檢測(cè)到的信號(hào)與一個(gè)單一粒子的存在對(duì)應(yīng)起來(lái)。因此，如上所述，通過(guò)將光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)為高于單一粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度，能夠使I個(gè)單一粒子與一個(gè)(表不單一粒子存在的)信號(hào)相對(duì)應(yīng)。
[0088]具體而言，由于布朗運(yùn)動(dòng)，具有擴(kuò)散系數(shù)D的粒子通過(guò)半徑Wo的光檢測(cè)區(qū)域(共焦體積)所需要的時(shí)間是由均方位移的關(guān)系式(4)推斷出，用式(5)表示。
[0089](2ffo)2 = 6D.At...(4)
[0090]At = (2ffo)2/6D— (5)
[0091]因此，粒子通過(guò)布朗運(yùn)動(dòng)移動(dòng)的速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)Vdif大約是由式(6)表示。
[0092]Vdif = 2ffo/ At = 3D/Wo…(6)
[0093]此處，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度可以參考所述Vdif而設(shè)定為比之充分快的值。例如，假定觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散系數(shù)為D = 2.0 X 10_lclm2/s左右的情況下，Wo為0.62 μ m左右，則Vdif為1.0X10_3m/s。因此，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為其略10倍以上的15mm/s等即可。此外，當(dāng)觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散系數(shù)未知時(shí)，為了找到使在光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)速度的各種設(shè)定下的光強(qiáng)度變化的輪廓成為預(yù)期輪廓(典型的是與激發(fā)光強(qiáng)度分布幾乎相同)的條件，可以重復(fù)進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，確定適當(dāng)?shù)墓鈾z測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。
[0094](光強(qiáng)度的分析)
[0095]通過(guò)上述的處理得到按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)，計(jì)算機(jī)18中，按照存儲(chǔ)裝置中存儲(chǔ)的程序進(jìn)行處理，從而實(shí)施單一粒子的信號(hào)的檢測(cè)、單一粒子的計(jì)數(shù)、濃度算出等各種分析。
[0096]I個(gè)粒子是否進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域的判定，可以通過(guò)上述的處理，根據(jù)按照時(shí)間順序檢測(cè)到的光信號(hào)的形狀而進(jìn)行。典型地，首先測(cè)量背景光的強(qiáng)度，檢測(cè)到具有低于規(guī)定閾值的光強(qiáng)度的信號(hào)時(shí)，可以判定I個(gè)單一粒子進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域。更具體而言為如下構(gòu)成，通常表示單一粒子存在的信號(hào)在光檢測(cè)部的按照時(shí)間順序的檢測(cè)值即光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中以低于某種程度的強(qiáng)度的向下凸的鐘形的脈沖狀信號(hào)的形式表現(xiàn)；噪音并非鐘形的脈沖狀，以強(qiáng)度高的信號(hào)的形式表現(xiàn)。因此，按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上，首先，測(cè)量背景光的強(qiáng)度，檢測(cè)低于規(guī)定閾值的、向下凸的鐘形的脈沖狀的信號(hào)作為表示單一粒子的存在的信號(hào)?！耙?guī)定閾值”能夠通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)定為適當(dāng)?shù)闹怠?br> [0097]進(jìn)而，由反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法中應(yīng)用的光分析裝置而得到的光強(qiáng)度是比較微弱的，產(chǎn)生細(xì)微的增減，所述光強(qiáng)度的細(xì)微的增減使表示單一粒子存在的信號(hào)的檢測(cè)精度變差。因此，也可以將按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)平滑化并將數(shù)據(jù)加工成能夠無(wú)視光強(qiáng)度細(xì)微的增減之后，在平滑化的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，由背景光的強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，檢測(cè)具有低于規(guī)定閾值的強(qiáng)度的、向下凸的鐘形的脈沖狀信號(hào)作為表示單一粒子存在的信號(hào)。
[0098]反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法中，也可以計(jì)數(shù)信號(hào)的個(gè)數(shù)并計(jì)數(shù)光檢測(cè)區(qū)域所包含的單一粒子的個(gè)數(shù)(粒子的計(jì)數(shù))。該情況下，通過(guò)組合檢測(cè)到的單一粒子的個(gè)數(shù)與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)量，能夠獲得與試樣溶液中被識(shí)別的單一粒子的數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息。具體而言，例如，計(jì)算出多個(gè)試樣溶液的數(shù)密度或濃度的比或者相對(duì)于成為濃度或數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的相對(duì)的數(shù)密度或濃度的比，或者，使用相對(duì)于成為濃度或數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的相對(duì)的數(shù)密度或濃度的比，從而確定絕對(duì)的數(shù)密度值或濃度值。或者，通過(guò)任意手法例如以規(guī)定速度移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置等來(lái)確定光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)軌跡的總體積，就能夠具體計(jì)算單一粒子的數(shù)密度或濃度。
[0099]以下，更詳細(xì)地進(jìn)行說(shuō)明。
[0100](i)單一粒子信號(hào)的逐個(gè)檢測(cè)
[0101]在按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，當(dāng)一個(gè)粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的軌跡是如圖4B所示的幾乎直線狀時(shí)，與該粒子相對(duì)應(yīng)的信號(hào)的光強(qiáng)度變化具有反映(由光學(xué)系統(tǒng)確定的)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的光強(qiáng)度分布的、向下凸的大致鐘形的輪廓(參照?qǐng)D4C最上部分)。因此，掃描分子計(jì)數(shù)法中，基本上，當(dāng)由背景光測(cè)量的、低于適宜設(shè)定的閾值的光強(qiáng)度降低的持續(xù)時(shí)間寬度在規(guī)定的范圍時(shí)，判定為具有該光強(qiáng)度降低輪廓的信號(hào)與一個(gè)粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域相對(duì)應(yīng)，從而檢測(cè)到一個(gè)粒子。并且，低于閾值的光強(qiáng)度的降低所持續(xù)的時(shí)間寬度不在規(guī)定的范圍內(nèi)的信號(hào)，可以判定為噪音或異物的信號(hào)。另外，光檢測(cè)區(qū)域的光強(qiáng)度分布可以假設(shè)為由背景光Ibg向下凸的高斯分布的式(7)。
[0102]I = Ibg — A.exp ( — 2t2/a2)…(7)
[0103]當(dāng)對(duì)光強(qiáng)度顯著降低的輪廓(可以明確判斷為非背景光的波動(dòng)的輪廓)擬合式
(7)算出的強(qiáng)度A和寬度a落入規(guī)定范圍內(nèi)時(shí)，該光強(qiáng)度輪廓可判斷為對(duì)應(yīng)一個(gè)粒子通過(guò)了光檢測(cè)區(qū)域，可以視為檢測(cè)到一個(gè)粒子。
[0104]強(qiáng)度A和寬度a落在規(guī)定范圍之外的信號(hào)，可以在之后的分析等中作為噪音或異物的信號(hào)而無(wú)視。
[0105]作為由按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)對(duì)于單一粒子進(jìn)行一次性地檢測(cè)的處理方法的一例，首先，對(duì)于按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(圖4C的最上部分“檢測(cè)結(jié)果(未處理)”所表示的數(shù)據(jù))進(jìn)行平滑(平滑化)處理(圖3—步驟S110、圖4C的中上部分用“SMOOTHING”表示。)。發(fā)光物質(zhì)發(fā)出的光是概率地發(fā)出的，另外，該光強(qiáng)度是比較微弱的，所以產(chǎn)生細(xì)微的增減的結(jié)果，所述光強(qiáng)度的細(xì)微的增減(波動(dòng))使表示單一粒子存在的信號(hào)的檢測(cè)精度變差。平滑處理可以無(wú)視所述數(shù)據(jù)上的細(xì)微的增減。平滑化處理可以例如通過(guò)移動(dòng)平均法等而進(jìn)行。需要說(shuō)明的是，可以根據(jù)獲得光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)速度(掃描速度)、ΒΙΝ --ΜΕ，適當(dāng)設(shè)定實(shí)施平滑化處理時(shí)的參數(shù)，例如，在移動(dòng)平均法中一次取平均的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)、移動(dòng)平均的次數(shù)等。
[0106]接著，為了檢測(cè)平滑處理后的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中存在顯著的脈沖狀的信號(hào)(以下，稱為“脈沖信號(hào)”。)的時(shí)間區(qū)域(脈沖存在區(qū)域)，對(duì)于平滑處理后的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)對(duì)時(shí)間進(jìn)行一階微分值運(yùn)算(步驟S120)。按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的時(shí)間微分值，如圖4C中下部分的“時(shí)間微分”所示信號(hào)值變化時(shí)間點(diǎn)處的值的變化變大，所以通過(guò)參考所述時(shí)間微分值可以有利地確定顯著的信號(hào)的起點(diǎn)和終點(diǎn)。
[0107]之后，在按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上，逐次檢測(cè)顯著的脈沖信號(hào)，判斷檢測(cè)到的信號(hào)是否是與單一粒子相對(duì)應(yīng)的信號(hào)。具體而言，首先，在按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的按照時(shí)間順序的時(shí)間微分值數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，逐次地參照時(shí)間微分值，搜索一個(gè)脈沖信號(hào)的始點(diǎn)和終點(diǎn)進(jìn)行確定，從而確定脈沖存在區(qū)域(步驟S130)。一旦確定了一個(gè)脈沖存在區(qū)域,就對(duì)該脈沖存在區(qū)域中的平滑化的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，進(jìn)行向下凸的鐘形函數(shù)擬合(圖4C下部分的“鐘形函數(shù)擬合”)，算出鐘形函數(shù)的脈沖的峰強(qiáng)度(由背景光的最大降低量)Ipeak、脈沖寬度(半高全寬(full width half maximum)) Wpeak、擬合中的(最小二乘法的)相關(guān)系數(shù)等參數(shù)(步驟S140)。需要說(shuō)明的是，擬合的鐘形函數(shù)典型的是高斯函數(shù)，也可以是洛倫茲型函數(shù)。并且，判斷算出的鐘形函數(shù)的參數(shù)是否落在一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)檢測(cè)到的脈沖信號(hào)所描述的鐘形輪廓的參數(shù)所規(guī)定的范圍內(nèi)，即，脈沖的峰強(qiáng)度、脈沖寬度、相關(guān)系數(shù)是否分別落在規(guī)定范圍內(nèi)等(步驟S150)。例如，判定是否滿足下述的條件等。
[0108]20μ秒<脈沖寬度< 400μ秒
[0109]峰強(qiáng)度>4.0 [pc/ΙΟ μ s]…(A)
[0110]相關(guān)系數(shù)>0.95，這樣，計(jì)算的鐘形函數(shù)的參數(shù)被判斷為落在與一個(gè)粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)規(guī)定的范圍內(nèi)時(shí)，則該信號(hào)判定為與一個(gè)粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)。另一方面，將算出的鐘形函數(shù)的參數(shù)沒(méi)有落在規(guī)定范圍內(nèi)的脈沖信號(hào)作為噪音而無(wú)視。
[0111]上述的步驟S130?S150的處理中的脈沖信號(hào)的搜索和判定可以在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的整個(gè)領(lǐng)域內(nèi)重復(fù)地進(jìn)行(步驟S160)。需要說(shuō)明的是，從按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個(gè)地檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)的處理，不限定于上述的次序，可以通過(guò)任意的手法實(shí)行。
[0112](ii)粒子濃度的確定
[0113]進(jìn)而，也可以計(jì)數(shù)檢測(cè)到的單一粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)，確定粒子的個(gè)數(shù)(粒子的計(jì)數(shù))。另外，通過(guò)任意的手法計(jì)算光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的總體積，由該體積值和粒子的個(gè)數(shù)確定試樣溶液中的粒子的數(shù)密度或濃度(步驟S170)。
[0114]光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的總體積理論上可以根據(jù)激發(fā)光或檢測(cè)光的波長(zhǎng)、鏡頭開(kāi)口數(shù)、光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)而計(jì)算。另外，實(shí)驗(yàn)上例如可以在與所要檢查的試樣溶液的測(cè)定相同的條件下，對(duì)已知粒子濃度的溶液(對(duì)照溶液)進(jìn)行上文說(shuō)明的光強(qiáng)度測(cè)定、粒子的檢測(cè)和計(jì)數(shù)，根據(jù)檢測(cè)到的粒子的個(gè)數(shù)和對(duì)照溶液的粒子的濃度而確定。具體而言，例如，對(duì)于粒子濃度為C的對(duì)照溶液，對(duì)照溶液的單一粒子的檢測(cè)數(shù)為N時(shí)，光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域總體積Vt則由式⑶給出。
[0115]Vt = N/C— (8)
[0116]另外，準(zhǔn)備單一粒子的多個(gè)濃度不同的溶液作為對(duì)照溶液，分別對(duì)其實(shí)施測(cè)定，將算出的Vt的平均值作為光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)區(qū)域的總體積Vt而采用即可。并且，一旦獲得Vt值，單一粒子的計(jì)數(shù)結(jié)果為η的試樣溶液的粒子濃度C可由式(9)給出。
[0117]C = n/Vt …(9)
[0118]需要說(shuō)明的是，可以不通過(guò)上述方法而利用任意方法例如FCS、FIDA等得到光檢測(cè)區(qū)域的體積、光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)區(qū)域的總體積。此外，本實(shí)施方式的裝置也可以如下構(gòu)成，對(duì)于規(guī)定的光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)模式，將各種標(biāo)準(zhǔn)粒子的濃度C和粒子的個(gè)數(shù)N之間的關(guān)系(式(6))的信息預(yù)先存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)18的存儲(chǔ)裝置中，裝置的使用者在實(shí)施單一粒子的檢測(cè)時(shí)可以適當(dāng)利用存儲(chǔ)的關(guān)系信息。
[0119]這樣，用光檢測(cè)區(qū)域在試樣溶液中掃描并逐個(gè)地檢測(cè)粒子的反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法中，通過(guò)上述的處理次序能夠進(jìn)行試樣溶液中的粒子的計(jì)數(shù)、濃度的確定等。
[0120]檢測(cè)一定信號(hào)數(shù)的單一粒子檢測(cè)處理
[0121]在上述的單一粒子檢測(cè)處理中，經(jīng)過(guò)某設(shè)定的時(shí)間實(shí)施光測(cè)定之后，根據(jù)得到的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)檢測(cè)單一粒子的信號(hào)。即，計(jì)數(shù)任意設(shè)定的測(cè)定時(shí)間中得到的單一粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)。該情況下，試樣溶液中的粒子濃度未知時(shí)，經(jīng)過(guò)某固定的測(cè)定時(shí)間進(jìn)行光強(qiáng)度的測(cè)定時(shí)，預(yù)期粒子的濃度低時(shí)，測(cè)定時(shí)間可以設(shè)定為充分地長(zhǎng)。另一方面，試樣溶液中的粒子濃度高的情況下，可以使光強(qiáng)度的測(cè)定持續(xù)所需要的時(shí)間以上，使得以可以接受的精度或者滿足的精度確定濃度等特性。另外，試樣溶液中的粒子濃度低于實(shí)驗(yàn)者預(yù)期的濃度、且設(shè)定的測(cè)定時(shí)間不足的情況下，結(jié)果的誤差變大。這樣，根據(jù)設(shè)定的測(cè)定時(shí)間的長(zhǎng)度變更檢測(cè)到的單一粒子的信號(hào)數(shù)，特別是，單一粒子濃度低時(shí)，由檢測(cè)信號(hào)數(shù)計(jì)算的單一粒子濃度值的偏差變大，精度降低。
[0122]因此，作為粒子的計(jì)數(shù)的另一方式，也可以實(shí)施測(cè)定直至單一粒子的信號(hào)數(shù)到達(dá)任意設(shè)定的個(gè)數(shù)為止，根據(jù)測(cè)定時(shí)間計(jì)算單一粒子濃度值。即，作為單一粒子檢測(cè)處理的另外的方式，重復(fù)進(jìn)行邊移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的光強(qiáng)度的測(cè)定和單一粒子的信號(hào)的檢測(cè)直至信號(hào)的個(gè)數(shù)到達(dá)預(yù)定的個(gè)數(shù)，測(cè)量信號(hào)的個(gè)數(shù)到達(dá)預(yù)定的個(gè)數(shù)所需要的時(shí)間，根據(jù)所述單一粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)到達(dá)預(yù)定的個(gè)數(shù)所需要的時(shí)間確定粒子濃度。根據(jù)所述構(gòu)成，當(dāng)試樣溶液中的粒子濃度高時(shí)，光強(qiáng)度的測(cè)定所需要的時(shí)間被縮短；當(dāng)試樣溶液中的粒子濃度低時(shí)，可以持續(xù)進(jìn)行光強(qiáng)度的測(cè)定直至得到達(dá)到結(jié)果(即，粒子濃度)所要求的精度的粒子數(shù)為止。即，根據(jù)單一粒子的濃度而使測(cè)定時(shí)間最優(yōu)化。
[0123]并且，通過(guò)將單一粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)所應(yīng)該達(dá)到的預(yù)定的個(gè)數(shù)，設(shè)定為達(dá)到結(jié)果所要求的精度的粒子數(shù)，單一粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)達(dá)到預(yù)定的個(gè)數(shù)所需要的時(shí)間反映達(dá)到結(jié)果所需要的精度的粒子數(shù)，所以可以期待根據(jù)該時(shí)間確定的粒子的濃度值具有能夠接受的精度或者滿足的精度。即，將預(yù)定的個(gè)數(shù)設(shè)定為達(dá)到結(jié)果所要求的精度的個(gè)數(shù)，該預(yù)定的個(gè)數(shù)的單一粒子的檢測(cè)所需要的時(shí)間或者由其導(dǎo)出的任意的結(jié)果中的偏差被抑制得很小，能夠滿足結(jié)果的精度。
[0124]⑴基本原理
[0125]粒子的濃度值與信號(hào)數(shù)達(dá)到預(yù)定的個(gè)數(shù)所需要的時(shí)間為如以下的關(guān)系。即，某粒子濃度C的試樣溶液中，經(jīng)過(guò)時(shí)間τ以掃描速度u移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，如果將光檢測(cè)區(qū)域的截面積設(shè)為S，則檢測(cè)到的粒子信號(hào)的個(gè)數(shù)X用式(10)表示。
[0126]X = CSu τ Na...(10)
[0127]此處，Na為阿伏伽德羅數(shù)。因此，當(dāng)信號(hào)數(shù)到達(dá)預(yù)定的數(shù)XE需要的時(shí)間為T時(shí)，粒子濃度C根據(jù)式(11)以時(shí)間T的函數(shù)形式給出。
[0128]C = XE/(STuNa)…(11)
[0129]需要說(shuō)明的是，式(11)中，每單位時(shí)間的粒子的檢測(cè)速度V根據(jù)信號(hào)數(shù)達(dá)到預(yù)定的數(shù)XE所需要的時(shí)間T和粒子檢測(cè)數(shù)XE，由式(12)給出。
[0130]V = ΧΕ/Τ…(12)
[0131]由此，粒子濃度C用式(13)表示。
[0132]C = V/(SuNa)…(13)
[0133]該式(13)中，粒子濃度C與檢測(cè)速度V成一次比例，粒子濃度C與檢測(cè)速度V的對(duì)應(yīng)關(guān)系容易理解，所以在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)中，粒子濃度C也可以使用檢測(cè)速度V確定。
[0134](ii)處理操作次序
[0135]檢測(cè)一定的信號(hào)數(shù)的單一粒子檢測(cè)處理也可以例如按照?qǐng)D5的流程圖所示的處理次序?qū)嵭?。圖5的例中，簡(jiǎn)單地說(shuō)，每隔解析時(shí)間間隔t(規(guī)定的時(shí)間間隔)反復(fù)實(shí)施光檢測(cè)區(qū)域位置的移動(dòng)、來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光的檢測(cè)、單一粒子的信號(hào)的檢測(cè)以及檢測(cè)到的粒子信號(hào)的計(jì)數(shù)的一連串處理，直至檢測(cè)到的粒子數(shù)X到達(dá)結(jié)束粒子數(shù)XE (發(fā)光粒子數(shù)所應(yīng)到達(dá)的預(yù)定的數(shù))為止。需要說(shuō)明的是，應(yīng)該理解為，以下所述的一連串處理和構(gòu)成，通過(guò)計(jì)算機(jī)18的處理操作而實(shí)現(xiàn)。
[0136](a)初始設(shè)置
[0137]參照?qǐng)D5，對(duì)于操作處理具體地進(jìn)行說(shuō)明。首先，向微孔板9的孔10中注入試樣溶液，載置于顯微鏡的平臺(tái)上。之后，使用者對(duì)計(jì)算機(jī)18輸入光強(qiáng)度的測(cè)定、粒子的檢測(cè)以及計(jì)數(shù)處理的開(kāi)始指示，計(jì)算機(jī)18進(jìn)行結(jié)束粒子數(shù)XE的設(shè)定(步驟10)以及解析時(shí)間間隔t的設(shè)定(步驟20)作為初始設(shè)置。結(jié)束粒子數(shù)XE和解析時(shí)間間隔t也可以由使用者任意地設(shè)定。為了達(dá)到粒子濃度的結(jié)果值所要求的精度，可以使用粒子濃度已知的溶液進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，參考預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果而適宜確定結(jié)束粒子數(shù)XE。作為解析時(shí)間間隔t，充分短于由處理開(kāi)始后至粒子數(shù)(X)到達(dá)結(jié)束粒子數(shù)(XE)為止的時(shí)間的任意的時(shí)間間隔，也可以考慮裝置I中的處理速度等而適宜設(shè)定。另外，關(guān)于結(jié)束粒子數(shù)XE和解析時(shí)間間隔t，分別參考使用了粒子濃度已知的溶液的預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果而預(yù)先確定的值被存儲(chǔ)于裝置I中，所述存儲(chǔ)的值可以通過(guò)自動(dòng)選擇或者通過(guò)使用者的選擇而使用。
[0138](b)粒子數(shù)的檢測(cè)
[0139]如上所述進(jìn)行結(jié)束粒子數(shù)XE和解析時(shí)間間隔t的設(shè)定時(shí)，可以如下所述反復(fù)實(shí)施以下的步驟:每隔解析時(shí)間間隔t，利用經(jīng)過(guò)解析時(shí)間間隔t的掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行光強(qiáng)度的測(cè)定處理和由測(cè)定的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行粒子信號(hào)的檢測(cè)以及粒子數(shù)X的檢測(cè)(步驟S30)；累積步驟S30中檢測(cè)到的粒子數(shù)X計(jì)算粒子的總數(shù)X(tn)的處理(步驟S40)，直至粒子的總數(shù)X(tn)達(dá)到結(jié)束粒子數(shù)XE為止(步驟S50)。需要說(shuō)明的是，也可以先于反復(fù)實(shí)施步驟S30?S50的處理存儲(chǔ)一系列處理的開(kāi)始時(shí)間Ts (步驟S25)。
[0140]步驟S30中的光檢測(cè)以及粒子數(shù)檢測(cè)的處理也可以與圖3所示的處理同樣。簡(jiǎn)單地說(shuō)，邊進(jìn)行光檢測(cè)區(qū)域位置在試樣溶液內(nèi)的移動(dòng)(試樣溶液內(nèi)的掃描)邊經(jīng)過(guò)解析時(shí)間間隔t進(jìn)行光強(qiáng)度的測(cè)定。之后，在得到的解析時(shí)間間隔t中的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，在計(jì)算機(jī)18中，根據(jù)存儲(chǔ)于存儲(chǔ)裝置的程序進(jìn)行處理，實(shí)施表示單一粒子存在的信號(hào)的檢測(cè)以及檢測(cè)數(shù)的計(jì)數(shù)。
[0141]這樣，如果檢測(cè)到經(jīng)過(guò)解析時(shí)間間隔t的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的粒子數(shù)X，則發(fā)光粒子的檢測(cè)總數(shù)X (tn)通過(guò)式(14)算出(圖5—步驟S40)。
[0142]X(tn) = X(tn—J+x…(14)
[0143]需要說(shuō)明的是，X(tn—J為至前次的解析時(shí)間間隔t為止檢測(cè)到的粒子的檢測(cè)總數(shù)，其初始值為O。接著，每隔解析時(shí)間間隔t重復(fù)步驟S30?S40直至發(fā)光粒子的檢測(cè)總數(shù)X(tn)達(dá)到結(jié)束粒子數(shù)XE為止即式(15)成立為止(步驟50)。
[0144]X (tn)彡 XE…(15)
[0145]并且，反復(fù)進(jìn)行步驟S30?S50期間，當(dāng)式(15)成立時(shí)，試樣溶液的光強(qiáng)度的測(cè)定與粒子的檢測(cè)/計(jì)數(shù)的處理結(jié)束。也可以當(dāng)步驟S30?S50的反復(fù)處理結(jié)束時(shí)，存儲(chǔ)結(jié)束時(shí)間TE (步驟S60)。
[0146](C)粒子數(shù)與測(cè)定結(jié)束時(shí)間的顯示
[0147]然而，每隔解析時(shí)間間隔t反復(fù)實(shí)施步驟S30?S50期間(直至式(15)成立為止)，計(jì)算機(jī)18的監(jiān)視器上等顯示器顯示粒子的檢測(cè)總數(shù)X (tn)和/或測(cè)定結(jié)束時(shí)間TE或者測(cè)定剩余時(shí)間Tr。根據(jù)所述構(gòu)成，有如下優(yōu)點(diǎn):使用者能夠通過(guò)看見(jiàn)這些顯示預(yù)測(cè)實(shí)施中的測(cè)定何時(shí)結(jié)束。
[0148]如上所述實(shí)施顯示的情況下，圖5的步驟S50的判定中，當(dāng)式(15)不成立時(shí)，實(shí)施圖中虛線所示的各處理。具體而言，首先，在顯示器上顯示步驟S40中計(jì)算的最新的粒子的檢測(cè)總數(shù)X(tn)(步驟S52)。需要說(shuō)明的是，已經(jīng)反復(fù)實(shí)施了步驟S30?S50的情況下，到目前為止的粒子的檢測(cè)總數(shù)X(tn)的值被更新。接著，為了計(jì)算出測(cè)定結(jié)束時(shí)間TE或者測(cè)定剩余時(shí)間Tr，計(jì)算出步驟S30?S50的處理開(kāi)始后的粒子的檢測(cè)速度v (步驟S54)。到目前為止的粒子的檢測(cè)速度V可以由式(16)給出。
[0149]V = X(tn)/(Tp — Ts)…(16)
[0150]此處，Tp為現(xiàn)在的時(shí)刻。這樣，可以使用粒子的檢測(cè)速度V通過(guò)式(17)推定測(cè)定剩余時(shí)間I；(直至步驟S30?S50的處理結(jié)束為止的時(shí)間)。
[0151]Tr= (XE — X(tn))/v…(17)
[0152]另外，測(cè)定結(jié)束時(shí)間TE (步驟S30?S50的處理結(jié)束的時(shí)間)通過(guò)式(18)推測(cè)(步驟S56)。
[0153]TE = Tp+Tr...(18)
[0154]接著，在顯示器上顯示推定的測(cè)定結(jié)束時(shí)間TE或者測(cè)定剩余時(shí)間Tr (步驟S58)。需要說(shuō)明的是，當(dāng)已經(jīng)反復(fù)實(shí)施步驟S30?S50的情況下，已經(jīng)顯示的值被更新。另外，當(dāng)X(tn) =0時(shí)，式(17)或(18)沒(méi)有被運(yùn)算而Tr和TE也可以顯示為不明。
[0155]如上所述，每隔解析時(shí)間間隔t重復(fù)上述圖5的步驟S30?S50的處理。關(guān)于這一點(diǎn)，圖3的步驟SlOO的光強(qiáng)度的測(cè)定也可以從測(cè)定的開(kāi)始至結(jié)束為止在步驟SlOO以外的信號(hào)處理步驟的實(shí)施中也連續(xù)地實(shí)施。即，在光檢測(cè)以及粒子數(shù)檢測(cè)的處理中，當(dāng)一次循環(huán)的經(jīng)過(guò)解析時(shí)間間隔t的光強(qiáng)度的測(cè)定結(jié)束時(shí)，直接連續(xù)地實(shí)施下一循環(huán)的經(jīng)過(guò)解析時(shí)間間隔t的光強(qiáng)度的測(cè)定，與此同時(shí)，在計(jì)算機(jī)18中，由結(jié)束的循環(huán)的經(jīng)過(guò)解析時(shí)間間隔t而取得的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)實(shí)施粒子的信號(hào)檢測(cè)以及計(jì)數(shù)的處理。由此，實(shí)時(shí)地實(shí)現(xiàn)粒子的檢測(cè)以及計(jì)數(shù)。
[0156](d)濃度計(jì)算等分析
[0157]這樣，當(dāng)粒子數(shù)到達(dá)結(jié)束粒子數(shù)時(shí)，也可以使用粒子數(shù)到達(dá)結(jié)束粒子數(shù)為止的時(shí)間T( = TE 一 Ts)或者由檢測(cè)到的粒子信號(hào)得到的其他的信息，實(shí)施濃度計(jì)算等的分析(步驟S70)。如上所述，使用式(12)，由到達(dá)結(jié)束粒子數(shù)為止的時(shí)間T和結(jié)束粒子數(shù)XE，計(jì)算粒子的檢測(cè)速度V;由粒子的檢測(cè)速度V使用式(13)的關(guān)系確定粒子濃度。
[0158]需要說(shuō)明的是，式(10)?(13)中的光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)區(qū)域的截面積S理論上可以根據(jù)激發(fā)光或檢測(cè)光的波長(zhǎng)、鏡頭開(kāi)口數(shù)、光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)而算出；也可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)例如:對(duì)于粒子濃度已知的溶液(對(duì)照溶液)，按照與欲檢查的試樣溶液的測(cè)定同樣的條件，進(jìn)行如上述說(shuō)明的光強(qiáng)度的測(cè)定、粒子的檢測(cè)以及計(jì)數(shù)，根據(jù)由此檢測(cè)到的粒子的個(gè)數(shù)、對(duì)照溶液的發(fā)光粒子的濃度而確定。具體而言，例如，對(duì)于粒子濃度為C的對(duì)照溶液，假設(shè)以移動(dòng)速度UO經(jīng)過(guò)某時(shí)間τ O實(shí)施的光強(qiáng)度的測(cè)定中的粒子的檢測(cè)數(shù)為N，則光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)區(qū)域的截面積S由式(19)給出。
[0159]S = N/ (C.NA.U0.το)…(19)
[0160]另外，準(zhǔn)備粒子的多個(gè)濃度不同的溶液作為對(duì)照溶液，分別對(duì)其實(shí)施測(cè)定，將計(jì)算的S的平均值作為光檢測(cè)區(qū)域的截面積S而采用即可。
[0161](e)試樣溶液的光強(qiáng)度的測(cè)定和粒子的檢測(cè)以及計(jì)數(shù)處理的修正例
[0162]上述的試樣溶液的光強(qiáng)度的測(cè)定、發(fā)光粒子的檢測(cè)以及計(jì)數(shù)的處理中，作為另外的方式，解析時(shí)間間隔t并非為固定值，也可以根據(jù)發(fā)光粒子的檢測(cè)狀況進(jìn)行修正。圖6A以流程圖的形式表示包含將解析時(shí)間間隔t根據(jù)粒子的檢測(cè)狀況進(jìn)行修正的處理(步驟S20’)而構(gòu)成的、試樣溶液的光強(qiáng)度的測(cè)定和粒子的檢測(cè)以及計(jì)數(shù)的處理。圖6B以流程圖的形式表示步驟S20’中的解析時(shí)間間隔t的運(yùn)算處理。需要說(shuō)明的是，圖6A中，與圖5相同的處理中，帶有同一步驟序號(hào)。
[0163]圖6A的處理中，每次經(jīng)過(guò)解析時(shí)間間隔t的光強(qiáng)度的測(cè)定結(jié)束后，解析時(shí)間間隔t都會(huì)被修正(步驟S20’)。另外，圖示的例子的處理特別構(gòu)成為:從開(kāi)始起至粒子數(shù)到達(dá)結(jié)束粒子數(shù)XE為止的一次測(cè)定中，只實(shí)施預(yù)定的次數(shù)N(以下，稱為“更新預(yù)定次數(shù)”。)的、光強(qiáng)度的測(cè)定和粒子的檢測(cè)、計(jì)數(shù)的處理循環(huán)。具體而言，首先，作為初始設(shè)置進(jìn)行結(jié)束粒子數(shù)XE的設(shè)定(步驟S10)以及開(kāi)始時(shí)間Ts的存儲(chǔ)(步驟S25)之后，最初實(shí)施光強(qiáng)度的測(cè)定和粒子的檢測(cè)、計(jì)數(shù)的處理時(shí)即光強(qiáng)度的測(cè)定和粒子的檢測(cè)以及計(jì)數(shù)的處理循環(huán)的實(shí)施次數(shù)k為O時(shí)，對(duì)于解析時(shí)間間隔t，賦值為可以任意設(shè)定的初始值to (參照?qǐng)D6B的步驟S200、S210)。接著，處理循環(huán)的實(shí)施次數(shù)k增大I (步驟S270)，與圖5所述的處理同樣地實(shí)施經(jīng)過(guò)解析時(shí)間間隔t的光強(qiáng)度的測(cè)定和粒子的檢測(cè)以及計(jì)數(shù)的處理(步驟S30?S50)。這樣，當(dāng)?shù)玫阶畛跹h(huán)的粒子數(shù)X ( = X(ti))時(shí)，依次計(jì)算出粒子檢測(cè)速度V (步驟S54)、測(cè)定剩余時(shí)間Tr (步驟S56)。需要說(shuō)明的是，也可以與圖5的情況同樣地，計(jì)算機(jī)18的監(jiān)視器上等顯示器顯示粒子的檢測(cè)總數(shù)X (tn)和/或測(cè)定結(jié)束時(shí)間TE或者測(cè)定剩余時(shí)間Tr (步驟S52、S58)。另外，在最初的處理循環(huán)中粒子數(shù)即到達(dá)結(jié)束粒子數(shù)XE時(shí)，直接結(jié)束光強(qiáng)度的測(cè)定、粒子的檢測(cè)以及計(jì)數(shù)的處理(步驟S50)。
[0164]最初的處理循環(huán)之后，反復(fù)進(jìn)行解析時(shí)間間隔t的修正、與圖5的情況同樣的光強(qiáng)度的測(cè)定和粒子的檢測(cè)以及計(jì)數(shù)的處理循環(huán)(步驟S20’、S30?S58)直至粒子數(shù)到達(dá)結(jié)束粒子數(shù)XE為止。此時(shí)，在進(jìn)行解析時(shí)間間隔t的修正的步驟S20’中，首先，判斷到此時(shí)為止檢測(cè)到的粒子數(shù)X(tn)是否為0(步驟S220)。X(tn) = O時(shí)，即將開(kāi)始的循環(huán)的解析時(shí)間間隔t也可以設(shè)為m倍(m為I以上的正數(shù))。當(dāng)X(tn) > O時(shí)，使用測(cè)定剩余時(shí)間Tr、更新預(yù)定次數(shù)N和處理循環(huán)的實(shí)施次數(shù)k，通過(guò)式(20)算出解析時(shí)間間隔t (步驟S240)。
[0165]t = Tr/ (N 一 k)…(20)
[0166]需要說(shuō)明的是，計(jì)算的解析時(shí)間間隔t也可以設(shè)定下限，解析時(shí)間間隔t低于下限值tmin時(shí)，解析時(shí)間間隔t也可以設(shè)定為下限值tmin(步驟S250、S260)。如上所述，根據(jù)解析時(shí)間間隔t被修正的方式，測(cè)定剩余時(shí)間Tr反映作為觀測(cè)對(duì)象的試樣溶液中的粒子的檢測(cè)狀況，所以解析時(shí)間間隔t可以根據(jù)所述粒子的檢測(cè)狀況而最優(yōu)化。
[0167]<目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法>
[0168]本實(shí)施方式的檢測(cè)方法利用反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的不發(fā)光粒子。如前所述，反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法在分子離散的狀況下對(duì)于PM級(jí)以下的比較低的濃度的粒子也能進(jìn)行測(cè)定。因此，通過(guò)本實(shí)施方式的檢測(cè)方法，即使當(dāng)試樣溶液中的解析對(duì)象的目標(biāo)粒子的濃度非常低時(shí)，也能夠高靈敏度地計(jì)數(shù)結(jié)合有標(biāo)記用粒子的目標(biāo)粒子。
[0169]進(jìn)而，本實(shí)施方式的檢測(cè)方法中，通過(guò)使每一分子的大小相對(duì)于光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的體積充分小(即，前述粒子通過(guò)前述光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，由前述光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)到的光強(qiáng)度幾乎不降低)的標(biāo)記用粒子結(jié)合2個(gè)以上目標(biāo)粒子，形成相對(duì)于前述光檢測(cè)區(qū)域的體積為某程度的大小的復(fù)合體。接著，前述復(fù)合體通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，根據(jù)由前述光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)到的光強(qiáng)度降低而檢測(cè)前述復(fù)合體。即，本實(shí)施方式的檢測(cè)方法中使用的反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法中，由于能夠?qū)⑴c目標(biāo)粒子結(jié)合而形成復(fù)合體的標(biāo)記用粒子從沒(méi)有結(jié)合目標(biāo)粒子的游離的標(biāo)記用粒子中區(qū)別地檢測(cè)，所以不需要在利用反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的測(cè)量之前從試樣溶液中去除游離的標(biāo)記用粒子。
[0170]具體而言，本實(shí)施方式的方法具有下述工序(a)和(b)。
[0171](a)調(diào)制包含目標(biāo)粒子和外徑小于前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的直徑的15%的標(biāo)記用粒子的試樣溶液，在前述試樣溶液中使每I分子前述目標(biāo)粒子結(jié)合2分子以上的前述標(biāo)記用粒子，形成外徑為前述光檢測(cè)區(qū)域的直徑的15%以上的不發(fā)光復(fù)合體的工序；和
[0172](b)通過(guò)如下工序算出前述工序(a)中調(diào)制的試樣溶液中的前述復(fù)合體的分子數(shù)的工序:
[0173]在前述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序；
[0174]—邊在前述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置,一邊由前述光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)包含實(shí)質(zhì)上一定的背景光的光而生成按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的工序；
[0175]在前述按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，將前述復(fù)合體進(jìn)入前述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的光強(qiáng)度的降低作為表示各前述復(fù)合體存在的信號(hào)并逐個(gè)檢測(cè)的工序；和
[0176]對(duì)前述逐個(gè)檢測(cè)到的表示復(fù)合體存在的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而計(jì)數(shù)前述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)到的前述復(fù)合體的個(gè)數(shù)的工序。
[0177]本實(shí)施方式的檢測(cè)方法的作為檢測(cè)對(duì)象的目標(biāo)粒子只要是試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)粒子，就可以是任意的，沒(méi)有特別的限定。可列舉出例如:蛋白質(zhì)、肽、核酸、核酸類似物質(zhì)、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚集體等生物分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的生物學(xué)的對(duì)象物或非生物學(xué)的粒子(例如:原子、分子、膠束、金屬膠體等)等。核酸可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴(kuò)增的核酸。核酸類似物質(zhì)可列舉DNA或RNA這類天然類型核苷酸(天然存在的核苷酸)的側(cè)鏈等被氨基等官能團(tuán)修飾的物質(zhì)、用蛋白質(zhì)或低分子化合物等標(biāo)記的物質(zhì)等。更具體而言，可列舉出例如:橋式核酸(BNA, Bridged nucleicacid)、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子取代的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2’位羥基被甲氧基取代的核苷酸、己糖醇核酸(HNA, Hexitol Nucleic Acid)、肽核酸(PNA)等。
[0178]作為本實(shí)施方式的檢測(cè)方法中的目標(biāo)粒子，優(yōu)選為核酸分子或核酸類似物質(zhì)。核酸分子或核酸類似物質(zhì)既可以是雙鏈核酸分子，也可以是單鏈核酸分子。具體而言，可列舉出例如:具有存在于動(dòng)物或植物的染色體、細(xì)菌或病毒基因中的堿基序列的核酸分子、具有人工設(shè)計(jì)的堿基序列的核酸分子。其中，作為目標(biāo)粒子，優(yōu)選例如:micr0RNA、SiRNA、mRNA、hnRNA、基因組DNA、利用PCR擴(kuò)增等得到的合成DNA、使用逆轉(zhuǎn)錄酶由RNA合成的cDNA等。
[0179]本實(shí)施方式的檢測(cè)方法中所應(yīng)用的標(biāo)記用粒子，每一分子的大小充分小至前述粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)由前述光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)到的光強(qiáng)度幾乎不降低的程度，并且每I分子目標(biāo)粒子結(jié)合2分子以上標(biāo)記用粒子而通過(guò)前述光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，相比于一分子的狀態(tài)，形成的不發(fā)光復(fù)合體的大小為由前述光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)到的背景光的光強(qiáng)度降低程度顯著地變大的程度。因此，通過(guò)反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法，能夠?qū)](méi)有結(jié)合目標(biāo)粒子的游離的標(biāo)記用粒子與結(jié)合了目標(biāo)粒子而形成復(fù)合體的標(biāo)記用粒子區(qū)別地計(jì)數(shù)。
[0180]標(biāo)記用粒子的大小只要是該粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)由前述光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)到的光強(qiáng)度幾乎不降低的程度即可，可以考慮反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的測(cè)定中使用的光分析裝置的光檢測(cè)區(qū)域、檢測(cè)到的背景光的波長(zhǎng)、光強(qiáng)度等而適宜確定。本實(shí)施方式中，出于一分子的狀態(tài)下幾乎觀察不到背景光的光強(qiáng)度的降低的考慮，標(biāo)記用粒子的平均外徑優(yōu)選小于前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的直徑的15%，更優(yōu)選小于10%。
[0181]目標(biāo)粒子與2分子以上的標(biāo)記用粒子結(jié)合而成的復(fù)合體的大小，只要前述粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)由前述光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)到的光強(qiáng)度的降低度相比于標(biāo)記用粒子一分子的情況顯著地大即可，可以考慮反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的測(cè)定所使用的光分析裝置的光檢測(cè)區(qū)域、檢測(cè)到的背景光的波長(zhǎng)、光強(qiáng)度等而適宜確定。本實(shí)施方式中，復(fù)合體的外徑優(yōu)選為前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的直徑的15%以上，更優(yōu)選為35%以上。
[0182]每一分子的目標(biāo)粒子所結(jié)合的標(biāo)記用粒子的個(gè)數(shù)只要是2分子以上即可，可以考慮目標(biāo)粒子、標(biāo)記用粒子的每一分子的大小、復(fù)合體的大小等而適宜確定。本實(shí)施方式中，標(biāo)記用粒子一分子的大小與結(jié)合了目標(biāo)粒子的復(fù)合體的大小的差可以充分地大，所以優(yōu)選與每一分子的目標(biāo)粒子結(jié)合的標(biāo)記用粒子的個(gè)數(shù)多。
[0183]本實(shí)施方式的檢測(cè)方法中，復(fù)合體為不發(fā)光粒子即可。例如，可以是目標(biāo)粒子與標(biāo)記用粒子兩者均為不發(fā)光粒子，也可以是目標(biāo)粒子為熒光粒子，標(biāo)記用粒子為吸收由前述熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光的猝滅物質(zhì)。
[0184]標(biāo)記用粒子為具有與目標(biāo)粒子特異或非特異地結(jié)合或吸附的部位的物質(zhì)。例如，目標(biāo)粒子為核酸分子或核酸類似物質(zhì)的情況下，作為標(biāo)記用粒子，可列舉出:與目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸、核酸結(jié)合性蛋白質(zhì)(例如，核酸結(jié)合性抗體等)、與核酸結(jié)合的不發(fā)光的色素分子等。作為該寡核苷酸，可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴(kuò)增物質(zhì)，可以是部分或全部包含核酸類似物質(zhì)的物質(zhì)；所述核酸類似物質(zhì)能夠與天然的核酸堿基同樣地形成核苷酸鏈或堿基對(duì)。
[0185]另外，目標(biāo)粒子為蛋白質(zhì)的情況下，作為標(biāo)記用粒子，可以使用目標(biāo)粒子的抗原或抗體、目標(biāo)粒子的配體或受體。
[0186]本實(shí)施方式中使用的標(biāo)記用粒子也可以為與目標(biāo)粒子非特異地結(jié)合等的物質(zhì)，從目標(biāo)粒子的檢測(cè)以及定量的精度的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選特異地結(jié)合等的物質(zhì)。需要說(shuō)明的是，作為與目標(biāo)粒子特異地結(jié)合的標(biāo)記用粒子，只要是與物理或化學(xué)的性質(zhì)與目標(biāo)粒子類似的其他物質(zhì)相比更優(yōu)先與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)即可，不需要為與除了目標(biāo)粒子以外的物質(zhì)完全地不結(jié)合的物質(zhì)。因此，例如，目標(biāo)粒子為核酸分子的情況下，作為標(biāo)記用粒子使用的寡核苷酸既可以具有與前述目標(biāo)粒子的部分堿基序列完全地互補(bǔ)的堿基序列，也可以具有與前述目標(biāo)粒子的部分堿基序列錯(cuò)配I?數(shù)堿基的堿基序列。
[0187]作為標(biāo)記用粒子，可以使用例如:表面具備與目標(biāo)粒子特異或非特異地結(jié)合或吸附的物質(zhì)(以下，有時(shí)稱為“與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)”。)的粒子。作為前述粒子，可列舉出例如:磁性粒子、二氧化硅粒子、瓊脂糖凝膠粒子、聚丙烯酰胺樹(shù)脂粒子、膠乳粒子、聚苯乙烯粒子等塑料粒子，陶瓷粒子、氧化鋯粒子等。
[0188]作為標(biāo)記用粒子，使用表面上具備與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)的粒子的情況下，通常在粒子表面結(jié)合多個(gè)用于與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)。因此，通過(guò)使用這樣的粒子，目標(biāo)粒子與標(biāo)記用粒子聚集，能夠形成更大的復(fù)合體。需要說(shuō)明的是，I個(gè)粒子的表面可以結(jié)合有一種用于與目標(biāo)粒子結(jié)合等的物質(zhì)，也可以結(jié)合兩種以上用于與目標(biāo)粒子結(jié)合等的物質(zhì)。
[0189]對(duì)于特異地或者非特異地結(jié)合或吸附目標(biāo)粒子的物質(zhì)與這些粒子表面結(jié)合的方法，沒(méi)有特別地限定，可以物理地吸附，也可以與粒子表面的官能團(tuán)化學(xué)地結(jié)合。化學(xué)地結(jié)合的情況下，可以根據(jù)適合于各官能團(tuán)的方法使其結(jié)合?？闪信e出例如=EDAC反應(yīng)、預(yù)先將EDC和NHS混合而使羧酸與氨基結(jié)合的反應(yīng)，使用具有雙極性的連接體使氨基之間交聯(lián)的反應(yīng)，使活性化的醛基、甲苯磺?；?、與特異地或者非特異地結(jié)合或吸附目標(biāo)粒子的物質(zhì)中的官能團(tuán)結(jié)合的反應(yīng)等。在粒子表面上不具有官能團(tuán)的磁性粒子的情況下，也可以用官能團(tuán)覆蓋粒子表面。
[0190]本實(shí)施方式中，I分子目標(biāo)粒子同時(shí)與多個(gè)標(biāo)記用粒子結(jié)合即可，可以使用一種標(biāo)記用粒子，也可以使用兩種以上的標(biāo)記用粒子。例如，目標(biāo)粒子中存在多處相同結(jié)構(gòu)的部位時(shí)，也可以使用與前述部位特異或非特異地結(jié)合或吸附的一種物質(zhì)作為標(biāo)記用粒子。另外，對(duì)于目標(biāo)粒子，也可以一起使用能夠分別獨(dú)立地與不同的部位結(jié)合的多個(gè)物質(zhì)作為標(biāo)記用粒子。例如，目標(biāo)粒子為核酸分子或核酸類似物質(zhì)的情況下，能夠使用與前述目標(biāo)粒子的各個(gè)不同部分區(qū)域雜交的多個(gè)寡核苷酸作為標(biāo)記用粒子。
[0191]具體而言，工序(a)首先向適當(dāng)?shù)娜軇┲刑砑幽繕?biāo)粒子和標(biāo)記用粒子而調(diào)制包含兩者的溶液。前述溶劑只要是不有損目標(biāo)粒子和標(biāo)記用粒子的溶劑，就沒(méi)有特別的限定。典型地為水溶液，也可以為甲酰胺等有機(jī)溶劑及其他的任意的液體。具體而言，前述溶劑可以從該【技術(shù)領(lǐng)域】中通常使用的緩沖液中適宜選擇而使用。作為前述緩沖液，有例如:PBS(磷酸緩沖生理鹽水、pH7.4)等磷酸緩沖液、Tris緩沖液等。
[0192]對(duì)于溶液中添加的標(biāo)記用粒子的濃度，沒(méi)有特別的限定，為了提高目標(biāo)粒子的檢測(cè)靈敏度，優(yōu)選按照標(biāo)記用粒子的濃度高于所期待的目標(biāo)粒子的濃度與每一分子目標(biāo)粒子可結(jié)合的標(biāo)記用粒子的個(gè)數(shù)相乘而得的濃度的方式調(diào)制包含兩者的溶液。
[0193]接著，在該試樣溶液中使每I分子前述目標(biāo)粒子結(jié)合2分子以上的前述標(biāo)記用粒子而形成復(fù)合體。只是使目標(biāo)粒子與標(biāo)記用粒子共存于同一溶液中就能夠使兩者結(jié)合的情況下，調(diào)制包含兩者的溶液之后，只需根據(jù)需要以規(guī)定時(shí)間孵育前述溶液，就能在前述溶液中形成包含目標(biāo)粒子與標(biāo)記用粒子的復(fù)合體。
[0194]另一方面，目標(biāo)粒子、標(biāo)記用粒子為雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸分子或者核酸類似物質(zhì)的情況下，優(yōu)選使溶液中的核酸分子等變性之后使兩者締合。需要說(shuō)明的是，“使核酸分子或核酸類似物質(zhì)變性”是指使堿基對(duì)解離。例如，意味著使雙鏈核酸分子成為單鏈核酸分子。需要說(shuō)明的是，當(dāng)標(biāo)記用粒子是包含PNA等核酸類似物質(zhì)的寡核苷酸時(shí)，即使目標(biāo)粒子是雙鏈核酸分子，有時(shí)不進(jìn)行特別的變性處理也可以形成包含前述標(biāo)記用粒子和目標(biāo)粒子的復(fù)合體。
[0195]作為變性處理，可列舉出:利用高溫處理的變性(熱變性)或利用低鹽濃度處理的變性等。其中，由于操作簡(jiǎn)便而優(yōu)選進(jìn)行熱變性。具體而言，熱變性可以通過(guò)將前述溶液進(jìn)行高溫處理而使前述溶液中的核酸分子等變性。通常地，DNA在90°C下、RNA在70°C下保溫?cái)?shù)秒至2分鐘左右，能夠使之變性；但根據(jù)目標(biāo)粒子的堿基的長(zhǎng)度等進(jìn)行變性的溫度千差萬(wàn)別，只要能夠變性，就對(duì)其溫度沒(méi)有限定。另一方面，通過(guò)低鹽濃度處理進(jìn)行變性可以是例如利用純水等稀釋，將前述溶液的鹽濃度調(diào)整至足夠低，從而進(jìn)行。
[0196]根據(jù)需要使之變性之后，使前述溶液中的目標(biāo)粒子與標(biāo)記用粒子締合，從而形成包含兩者的復(fù)合體。當(dāng)進(jìn)行熱變性時(shí)，在高溫處理后，使前述溶液的溫度降至目標(biāo)粒子能夠與標(biāo)記用粒子特異地雜交的溫度(特異的締合條件)，由此能夠使前述溶液中的兩者適當(dāng)締合。優(yōu)選使包含兩者的溶液的溫度降低至標(biāo)記用粒子中具有與目標(biāo)粒子互補(bǔ)的堿基序列的區(qū)域的Tm值±3°C的溫度左右。另外，當(dāng)通過(guò)低鹽濃度處理進(jìn)行變性時(shí)，通過(guò)添加鹽溶液等，使前述溶液的鹽濃度升高至目標(biāo)粒子能夠與標(biāo)記用粒子特異地雜交的濃度，能夠使前述溶液中的兩者適當(dāng)締合。
[0197]需要說(shuō)明的是，可以根據(jù)兩者的締合體的熔解曲線，求出兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的溫度。例如可以使僅含有兩者的溶液的溫度從高溫向低溫變化，測(cè)定前述溶液的吸光度或熒光強(qiáng)度來(lái)求出熔解曲線。根據(jù)所獲得的熔解曲線，從變性了的兩條單鏈核酸分子開(kāi)始形成締合體的溫度，至幾乎全部成為締合體的溫度這一范圍內(nèi)的溫度，都可以作為兩者能夠特異地雜交的溫度。也可以用使溶液中的鹽濃度自低濃度向高濃度變化來(lái)代替溫度，同樣地確定熔解曲線，能夠求出兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的濃度。
[0198]這樣，特異的締合條件根據(jù)目標(biāo)粒子、標(biāo)記用粒子的種類而不同，由實(shí)驗(yàn)而確定；通常，可以用Tm值(熔解溫度)代替。例如，利用普遍使用的引物/探針設(shè)計(jì)軟件等，根據(jù)標(biāo)記用粒子的堿基序列信息，能夠算出與目標(biāo)粒子雜交的區(qū)域的Tm值(雙鏈DNA的50%解離為單鏈DNA的溫度)?？梢詫囟葹門m值附近的值的條件例如Tm值±3°C左右的條件作為特異的締合條件。在算出的Tm值附近通過(guò)實(shí)驗(yàn)求出熔解曲線，由此也能夠更詳細(xì)地確定特異的締合條件。
[0199]此外，為了抑制非特異雜交，在形成締合體時(shí)，優(yōu)選使前述溶液的溫度較緩慢地下降。例如，使前述溶液溫度為70°C以上而使核酸分子變性后，可以按0.05°C /秒以上的降溫速度，降低該溶液的液溫。
[0200]此外，為了抑制非特異地雜交，還優(yōu)選預(yù)先在前述溶液中添加表面活性劑、甲酰胺、二甲亞砜或尿素等。這些化合物可以只添加一種，也可以組合添加2種以上。通過(guò)添加這些化合物，在較低溫度環(huán)境下也能夠使非特異的雜交難以發(fā)生。
[0201]之后，作為工序(b)，通過(guò)反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法計(jì)算工序(a)中調(diào)制的試樣溶液中的前述復(fù)合體的分子數(shù)。具體而言，首先，將試樣溶液設(shè)置于用于前述反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置中。邊通過(guò)前述的手法在前述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置邊由前述光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)包含實(shí)質(zhì)上一定的背景光的光，從而生成按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。在得到的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，逐個(gè)地檢測(cè)前述復(fù)合體進(jìn)入前述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的光強(qiáng)度的降低作為表示各前述復(fù)合體存在的信號(hào)。對(duì)于逐個(gè)檢測(cè)到的表示復(fù)合體存在的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而計(jì)數(shù)前述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)到的前述復(fù)合體的個(gè)數(shù)。
[0202]利用反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的測(cè)量中，作為來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光所應(yīng)包含的實(shí)質(zhì)上一定的背景光，可以是利用透射照明等的照明光，也可以是由試樣溶液內(nèi)分散的物質(zhì)產(chǎn)生的熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或散射光。該情況下，用作試樣溶液的溶液中沒(méi)有分散發(fā)出或散射光的物質(zhì)的情況下，所述溶液中也可以溶解或分散有積極地發(fā)出或散射光的物質(zhì)。另外，用作試樣溶液的溶液發(fā)出自身熒光的情況下，其自身熒光也可以作為上述背景光而利用。
[0203]為了作為背景光而在試樣溶液內(nèi)溶解或分散發(fā)出或散射光的物質(zhì)的情況下，前述物質(zhì)可以在利用反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法的測(cè)量之前添加至試樣溶液內(nèi)，也可以在工序(a)中形成復(fù)合體之前與標(biāo)記用粒子等一起添加，還可以在工序(a)之后添加。作為前述物質(zhì)，典型地為熒光性物質(zhì)，但也可以為通過(guò)磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)出光的物質(zhì)。作為熒光物質(zhì)，只要是由特定波長(zhǎng)的光照射就發(fā)出熒光的物質(zhì)即可，沒(méi)有特別的限定，可以從用于FCS或FIDA等的熒光色素中適當(dāng)?shù)倪x擇使用。
[0204]進(jìn)而，可以根據(jù)工序(b)中檢測(cè)到的被計(jì)數(shù)的前述復(fù)合體的個(gè)數(shù)，確定前述試樣溶液中的前述目標(biāo)粒子的數(shù)密度或濃度。通過(guò)組合檢測(cè)到的復(fù)合體的個(gè)數(shù)與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)量，能夠獲得與試樣溶液中的被識(shí)別的復(fù)合體的數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息。具體而言，例如，計(jì)算出多個(gè)試樣溶液的數(shù)密度或濃度的比或者相對(duì)于成為濃度或數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的相對(duì)的數(shù)密度或濃度的比，或者，使用相對(duì)于成為濃度或數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的相對(duì)的數(shù)密度或濃度的比，從而確定絕對(duì)的數(shù)密度值或濃度值?；蛘撸ㄟ^(guò)任意手法例如以規(guī)定速度移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置等來(lái)確定光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)軌跡的總體積，就能夠具體計(jì)算復(fù)合體的數(shù)密度或濃度。
[0205]實(shí)施例
[0206]接著，以下示出實(shí)施例等，進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的方式，但本發(fā)明的方式不限于下列實(shí)施例。
[0207][參考例I]
[0208]使用光檢測(cè)區(qū)域的直徑為約2.8 μ m的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，通過(guò)反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量直徑不同的不發(fā)光粒子。
[0209]首先,將平均粒徑(平均外徑)為0.32 μ m、0.41 μ m或0.92 μ m的聚苯乙烯粒子(SpheroTech公司制)使用20體積％的PEG溶液調(diào)制成各20fM，從而調(diào)制聚苯乙烯粒子溶液。另外，將熒光物質(zhì)ATTO (注冊(cè)商標(biāo))488 (ATT0公司制)使用1mMTris緩沖液(pH8)調(diào)制成6nM，從而調(diào)制熒光物質(zhì)溶液。之后，將前述聚苯乙烯粒子溶液和前述熒光物質(zhì)溶液等量混合，調(diào)制測(cè)定用的試樣溶液。通過(guò)反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)定這些試樣溶液。
[0210]具體而言，檢測(cè)中，使用具備共聚焦熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)的單分子突光測(cè)定裝置MF-20 (Olympus Corporat1n)作為光分析裝置,對(duì)于上述的各試樣溶液，獲得按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。激發(fā)光使用50 μ W的488nm的激光，使用帶通濾波器，測(cè)定510nm?560nm的波長(zhǎng)頻帶的光,生成按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。使試樣溶液中的光檢測(cè)區(qū)域按照6000rpm的移動(dòng)速度旋轉(zhuǎn)，將BIN TIME設(shè)為10 μ秒，將測(cè)定時(shí)間設(shè)為30秒鐘。對(duì)于各試樣溶液，各進(jìn)行3次測(cè)定。用Savinzky-Golay算法將由測(cè)定獲得的按照時(shí)間順序的數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑化以后，通過(guò)微分進(jìn)行峰檢測(cè)。從被視為峰的區(qū)域中，提取可以擬合為高斯函數(shù)的區(qū)域作為信號(hào)。
[0211]將由測(cè)定的結(jié)果得到的實(shí)際的峰數(shù)除以由掃描體積計(jì)算的峰數(shù)，從而算出峰檢測(cè)率(％)。將計(jì)算結(jié)果示于圖7中。平均粒徑為0.32 μ m和0.41 μ m的聚苯乙烯粒子沒(méi)有檢測(cè)到峰，峰檢測(cè)率分別為5.6%和4.7%，均小于10% ;與此相對(duì)，平均粒徑為0.92 μ m的聚苯乙烯粒子的峰檢測(cè)率高達(dá)85.7%。由這些結(jié)果可以確認(rèn)，外徑小于光檢測(cè)區(qū)域的直徑的粒子在反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法中沒(méi)有被檢測(cè)到。
[0212][實(shí)施例1]
[0213]使用光檢測(cè)區(qū)域的直徑為約2.8 μ m的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，使用每I分子具有多個(gè)生物素化部位的葡聚糖(葡聚糖生物素)作為目標(biāo)粒子，使用鏈親合素粒子作為標(biāo)記用粒子，通過(guò)反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)試樣溶液中的目標(biāo)粒子。
[0214]首先，將粒子表面涂敷有鏈親合素的鏈親合素粒子(平均粒徑:0.32μπκSpherotech公司制)使用20體積％的PEG溶液調(diào)制成各4ρΜ(鏈親合素粒子溶液)。另夕卜，將葡聚糖生物素(Invitrogen公司制)使用1mM Tris緩沖液(ρΗ8)調(diào)制成0ρΜ、20ρΜ、200ρΜ、2ηΜ(葡聚糖生物素溶液)。進(jìn)而，另外將熒光物質(zhì)ATTO(注冊(cè)商標(biāo))488 (ΑΤΤ0公司制)使用1mM Tris緩沖液(ρΗ8)調(diào)制成6ηΜ(熒光物質(zhì)溶液)。
[0215]將鏈親合素粒子溶液和葡聚糖生物素溶液等量地混合，將得到的混合液在室溫下靜置30分鐘。之后，向前述混合液中加入等量的熒光物質(zhì)溶液，調(diào)制測(cè)定用的試樣溶液。
[0216]對(duì)于這些試樣溶液，將測(cè)定時(shí)間設(shè)為60秒鐘，除此以外，與參考例I同樣地，通過(guò)反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)定。圖8為表示得到的峰數(shù)與葡聚糖生物素的濃度的圖。結(jié)果，檢測(cè)到的峰數(shù)依賴葡聚糖生物素濃度而增大。即，通過(guò)葡聚糖生物素與鏈親合素粒子的聚集體檢測(cè)到峰。
[0217][實(shí)施例2]
[0218]使用光檢測(cè)區(qū)域的直徑為約2.8 μ m的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，使用每I分子具有0、1或2處生物素化部位的核酸作為目標(biāo)粒子,使用鏈親合素粒子作為標(biāo)記用粒子,通過(guò)反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)試樣溶液中的目標(biāo)粒子。
[0219]首先，調(diào)制分別含有以下所示的核酸的水溶液(核酸試樣I?4)。需要說(shuō)明的是，將各個(gè)堿基序列示于表I中。
[0220]核酸試樣I 為 1ng/μ L 的由 HSRRB (Health Science Research Resources Bank)提供的基因組試樣:N0.194(以下，為“基因組N0.194”)。
[0221]核酸試樣2為1ng/ μ L的基因組N0.194、與一條核酸鏈為由序列號(hào)I所表不的堿基序列組成的PCR產(chǎn)物(以下，為“PCR產(chǎn)物”)。
[0222]核酸試樣3為1ng/ μ L的基因組N0.194、與由序列號(hào)2所表示的堿基序列組成的5’末端被生物素標(biāo)記的單鏈核酸(以下，為“生物素-ssDNA” )。
[0223]核酸試樣4:1Ong/μ L的基因組N0.194、以及由序列號(hào)3所表示的堿基序列組成的5’末端被生物素標(biāo)記的單鏈核酸與由序列號(hào)4所表示的堿基序列形成的5’末端被生物素標(biāo)記的單鏈核酸締合而成的雙鏈核酸(以下，為“生物素一 dsDNA”)。
[0224][表1]
[0225]

【權(quán)利要求】
1.一種目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其為使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的不發(fā)光粒子的方法，其具有: (a)調(diào)制包含目標(biāo)粒子和平均外徑小于所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的直徑的15%的標(biāo)記用粒子的試樣溶液，在所述試樣溶液中使每I分子所述目標(biāo)粒子結(jié)合2分子以上的所述標(biāo)記用粒子，形成外徑為所述光檢測(cè)區(qū)域的直徑的15%以上的不發(fā)光復(fù)合體的工序；和 (b)通過(guò)如下工序算出所述工序(a)中調(diào)制的試樣溶液中的所述復(fù)合體的分子數(shù)的工序: 在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序； 一邊在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置，一邊由所述光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)包含實(shí)質(zhì)上一定的背景光的光而生成按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的工序； 在所述按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，將所述復(fù)合體進(jìn)入所述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的光強(qiáng)度的降低作為表示各所述復(fù)合體存在的信號(hào)并逐個(gè)檢測(cè)的工序；和 對(duì)所述逐個(gè)檢測(cè)到的表示復(fù)合體存在的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而計(jì)數(shù)所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)到的所述復(fù)合體的個(gè)數(shù)的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，所述復(fù)合體的外徑為所述光檢測(cè)區(qū)域的直徑的35%以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，所述目標(biāo)粒子與所述標(biāo)記用粒子特異地結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1?3的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，所述目標(biāo)粒子為核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1?4的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，所述背景光為所述試樣溶液內(nèi)分散的物質(zhì)產(chǎn)生的熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或散射光。
6.根據(jù)權(quán)利要求1?4的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，所述背景光為照明光。
7.根據(jù)權(quán)利要求1?6的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，在所述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比所述復(fù)合體的擴(kuò)散移動(dòng)速度更快的速度移動(dòng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1?7的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，在所述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，通過(guò)變更所述光學(xué)系統(tǒng)的光路而移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域在所述試樣溶液內(nèi)的位置。
9.根據(jù)權(quán)利要求1?8的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，在逐個(gè)檢測(cè)表示所述復(fù)合體存在的信號(hào)的工序中，由所述背景光的強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，檢測(cè)到具有低于規(guī)定閾值的光強(qiáng)度的信號(hào)時(shí)判定I個(gè)復(fù)合體進(jìn)入到所述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1?9的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，在逐個(gè)地檢測(cè)表示所述復(fù)合體存在的信號(hào)的工序中，所述按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)被平滑化，在所述被平滑化的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，由所述背景光的強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，檢測(cè)具有低于規(guī)定閾值的強(qiáng)度的、向下凸的鐘形的脈沖狀信號(hào)作為表示所述復(fù)合體存在的信號(hào)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1?10的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其進(jìn)而具有:根據(jù)所述工序(b)中檢測(cè)到的被計(jì)數(shù)的所述復(fù)合體的個(gè)數(shù)確定所述試樣溶液中的所述目標(biāo)粒子的數(shù)密度或濃度的工序。
12.根據(jù)權(quán)利要求1?10的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中， 所述工序(b)中，重復(fù)進(jìn)行所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)、來(lái)自所述光檢測(cè)區(qū)域的光的檢測(cè)、表示所述復(fù)合體存在的信號(hào)的檢測(cè)，直至表示所述復(fù)合體存在的信號(hào)的個(gè)數(shù)達(dá)到預(yù)定的個(gè)數(shù)為止， 根據(jù)表示所述復(fù)合體的信號(hào)存在的個(gè)數(shù)達(dá)到預(yù)定的個(gè)數(shù)所需要的時(shí)間，確定所述試樣溶液中的所述目標(biāo)粒子的濃度。
【文檔編號(hào)】G01N15/14GK104136915SQ201380010136
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月18日
【發(fā)明者】西川和孝, 葉梨拓哉 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社