全局調(diào)控因子IrrE、Csp及CarD蛋白的金標(biāo)快速聯(lián)檢試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型涉及全局調(diào)控因子IrrE、Csp及CarD蛋白的金標(biāo)快速聯(lián)檢試劑盒。本試劑盒由底板、上蓋組成，其特征為，所述試劑盒的形狀為三角形盒體，盒體的底板上設(shè)置有3條測試帶；上蓋有3個觀測窗和3個加樣孔。所述3條測試帶分別位于所述三角形盒體底板表面的三邊；所述3個加樣孔分別位于所述三角形盒體上蓋表面的三邊。本試劑盒可一步同時檢測IrrE、Csp及CarD三種不同的轉(zhuǎn)基因成份，且操作簡便、檢測結(jié)果形象、準(zhǔn)確、快速。
【專利說明】全局調(diào)控因子丨rrE、Csp及CarD蛋白的金標(biāo)快速聯(lián)檢試劑 合 Sl

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本實(shí)用新型涉及全局調(diào)控因子IrrE、Csp及CarD蛋白的金標(biāo)快速聯(lián)檢試劑盒。

【背景技術(shù)】：
[0002] IrrE、Csp及CarD蛋白是在目前在轉(zhuǎn)基因生物的研究工作中，或在對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品 進(jìn)行篩選或安全性評價時，經(jīng)常需要同時進(jìn)行檢測的三種外源性基因。如果分別進(jìn)行檢測， 不但操作很繁瑣，而且檢測成本高。
[0003] IrrE蛋白是耐輻射球菌中的全局調(diào)控因子，將irrE基因?qū)氪竽c桿菌中能夠顯 著增強(qiáng)其輻射抗性、氧化抗性和耐鹽能力。而且將該基因?qū)胫参锖?，明顯提高了植物的耐 鹽和抗旱能力。
[0004] CSP蛋白是一種冷脅迫應(yīng)激蛋白，作為一種分子伴侶與單鏈核酸非特異性結(jié)合，具 有穩(wěn)定單鏈核苷酸二級結(jié)構(gòu)的作用，使細(xì)胞在極端環(huán)境下存活下來。將冷激蛋白基因（csp) 轉(zhuǎn)入植物后，賦予了植物較強(qiáng)的耐鹽及抗旱性能。目前，冷激蛋白CSP編碼基因已應(yīng)用于多 種轉(zhuǎn)基因植物的研究。
[0005] CarD蛋白是一類全局調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，在DNA復(fù)制、重組、修復(fù)以及基因轉(zhuǎn)錄等生物 過程中發(fā)揮著重要的作用。UV輻射脅迫條件下全基因組轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CarD蛋白在UV 輻射后被誘導(dǎo)，可能參與了 DNA損傷修復(fù)過程的調(diào)控。在可自然轉(zhuǎn)化和易于遺傳操作的模 式菌株D. radiodurans中，敲除了相應(yīng)的CarD編碼基因，發(fā)現(xiàn)與野生型菌株相比在UV福 照、過氧化氫、乙醇以及饑餓脅迫下，其表型的存在明顯差異。
[0006] 因此，實(shí)踐中很需要有一種可同時檢測轉(zhuǎn)基因植物中IrrE、Csp及CarD蛋白，且操 作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、快速的裝置。 實(shí)用新型內(nèi)容：
[0007] 本實(shí)用新型的目的是建立一種操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、快速，并能同時檢測3種 不同轉(zhuǎn)基因成分的檢測試劑盒。
[0008] 本實(shí)用新型的技術(shù)方案是這樣的：全局調(diào)控因子IrrE、Csp及CarD蛋白的金標(biāo)快 速聯(lián)檢試劑盒，由底板、上蓋組成；其特征為，所述試劑盒的形狀為三角形盒體，盒體的底板 上設(shè)置有3條測試帶；上蓋有3個觀測窗和3個加樣孔。
[0009] 所述3條測試帶分別位于所述三角形盒體底板表面的三邊；
[0010] 所述3個加樣孔分別位于所述三角形盒體上蓋表面的三邊。
[0011] 所述底板或上蓋可具有卡槽，以保證底板與上蓋扣緊。
[0012] 所述觀測窗優(yōu)選是長方形。
[0013] 試劑盒的優(yōu)選的形狀為扁平的三角形盒。
[0014] 本實(shí)用新型的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：當(dāng)?shù)装迳w入上蓋后，每個觀測窗對應(yīng)一條測試 帶，通過盒蓋上的單一的加樣孔及3個觀測窗可進(jìn)行加樣和觀察檢測結(jié)果，每個觀測窗可 分別檢查一種基因。
[0015] 在本實(shí)用新型的一個優(yōu)選的實(shí)例中，以轉(zhuǎn)植物的CarD蛋白的檢測為例：
[0016] 試劑盒為三角形扁盒，盒底板沿三角形的三條邊各設(shè)置有一條凹槽，可放置3條 測試帶；上蓋與測試帶相應(yīng)位置有3個觀測窗，3個加樣孔設(shè)置在上蓋三個頂角處(見圖1、 圖2)。
[0017] 3條測試帶以此種方式分布，一是加樣方便，可同時加樣以檢查3種基因，二是檢 測結(jié)果互不受影響。
[0018] 上述3條測試帶，一條用于檢測CarD蛋白，一條用于檢測IrrE蛋白，另一條用于 檢測Csp蛋白。所述測試帶是一種具有檢測系統(tǒng)主體膜反應(yīng)體系功能的檢測材料，由高分 子纖維膜、塑料等多層材料制成。3種蛋白的測試帶均可分為質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)，質(zhì)控區(qū)可包 被羊抗鼠 IgG或兔抗鼠 IgG多克隆抗體；CarD蛋白測試帶的樣品檢測區(qū)包被特異功能性 CarD, IrrE蛋白測試帶的樣品檢測區(qū)包被IrrE, Csp蛋白測試帶的樣品檢測區(qū)包被特異功 能性Csp的單克隆抗體或多克隆抗體。
[0019] 每個觀測窗分為測試區(qū)（T)和質(zhì)控區(qū)（C)兩部分，可在上蓋上用字母C、T標(biāo)示出；
[0020] 檢測時，將送檢物品的提取液分別滴加在試劑盒的加樣孔中，5 - 10分鐘后，通過 肉眼就可以通過上蓋的觀測窗直接觀察到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。
[0021] 對于每個觀測窗來說，用以下方式判斷檢測結(jié)果：
[0022] 1、陰性（_):
[0023] 反應(yīng)狀況：觀測窗質(zhì)控區(qū)（C)出現(xiàn)一條紫紅色條帶。
[0024] 檢測結(jié)果：待檢樣品中不含待檢基因或其含量在其閾值以下。
[0025] 2、陽性（ + ):
[0026] 反應(yīng)狀況：觀測窗質(zhì)控區(qū)（C)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測試區(qū)（T)內(nèi)同時出現(xiàn)紫紅 色條帶。檢測結(jié)果：待檢基因含量在閾值以上。
[0027] 3、無效：
[0028] 反應(yīng)狀況：質(zhì)控區(qū)（C)未出現(xiàn)紫紅色條帶，
[0029] 檢測結(jié)果：表明不正確的操作過程或試劑盒已變質(zhì)損壞。
[0030] 當(dāng)外源基因轉(zhuǎn)入植物，并在植物中表達(dá)，將產(chǎn)生目的蛋白（CarD、IrrE及Csp蛋 白），因此通過檢測樣品中是否含有上述3種蛋白來確定該基因是否存在。如果外源基因轉(zhuǎn) 入植物，發(fā)生基因沉默，無目的蛋白產(chǎn)生，將不能達(dá)到預(yù)期目的。
[0031] 本實(shí)用新型所述試劑盒的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0032] 加樣簡單，一次完成；
[0033] 經(jīng)濟(jì)高效：一個檢測盒可同時檢測3種不同的轉(zhuǎn)基因成份，大大降低了使用成本；
[0034] 簡便快速：3種不同的轉(zhuǎn)基因成份一步法操作，同時檢測，不需其他任何附加儀器 設(shè)備。直接將待測樣品液滴加在加樣孔中，5-10分鐘可出結(jié)果；
[0035] 檢測結(jié)果直觀：不借助任何儀器，用肉眼可觀察到結(jié)果；
[0036] 應(yīng)用廣泛：可檢測棉花、小麥、水稻、玉米、油菜、煙草、大豆等多種農(nóng)作物的葉片、 種子及加工產(chǎn)品。
[0037] 由于本實(shí)用新型提供的聯(lián)檢試劑盒可同時對生物樣品進(jìn)行多種轉(zhuǎn)基因分析，特別 適用于實(shí)驗(yàn)室、田間、邊防、海關(guān)植物檢驗(yàn)、檢驗(yàn)檢疫局、食品安全檢測及種子經(jīng)營銷售等部 門對可疑樣本現(xiàn)場、快速篩查。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0038] 圖1和圖2是本實(shí)用新型涉及全局調(diào)控因子IrrE、Csp及CarD蛋白的金標(biāo)快速聯(lián) 檢試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中圖1是底板的俯視圖，圖2是試劑盒上蓋的俯視圖；
[0039] 圖1中3是測試帶，圖2中1是加樣孔，2是觀測窗。

【具體實(shí)施方式】：
[0040] 本實(shí)用新型試劑盒中的測試帶的制備用制備檢測CarD的測試帶來舉例說明：
[0041] 實(shí)施例1制備測試帶
[0042] l.CarD單抗腹水的制備
[0043] 小鼠腹腔注射液體石蠟0. 5mL。1周后，將CarD單抗雜交瘤細(xì)胞注射于以上預(yù)先 處理過的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射雜交瘤細(xì)胞1?3 X 106。10天后收獲腹水，以上 過程皆在無菌條件下完成。
[0044] 2. CarD單克隆抗體的純化
[0045] 1)以DEAE離子交換層析及S印hacryl S300分子篩對單抗進(jìn)行純化；SDS - PAGE 平板電泳檢測純化單抗的純度；ELISA法測定單抗活性；
[0046] 2)純化過程：取小鼠單抗腹水一3, OOOXg離心15min -上清液加50% (NH4)2S04 沉淀，過夜一3, 000 X g離心20min -沉淀溶于0. 01M磷酸鹽緩沖液（pH7. 2) - S-300凝膠 柱一DEAE Blue層析柱一0 - 800mM NaCl梯度洗脫一超濾離心，濃縮單抗；
[0047] 3)單抗純度測定：常規(guī)SDS - PAGE電泳，上述方法所純化的單抗的純度皆在95% 以上；
[0048] 4)蛋白濃度測定：紫外分光光度計(jì)測定279nm處的0D值，按以下公式計(jì)算蛋白含 量：〇D 2re/i.4=mg/mL (純化單抗）。將單抗?jié)舛日{(diào)節(jié)為約lmg/mL ;
[0049] 5)單抗活性測定：選用CarD抗原包被ELISA板（1 μ g/孔)，及羊抗鼠 IgG - HRP 復(fù)合物，測定各單抗效價(大于1:5000)。
[0050] 3.羊抗D0AT高效價免疫抗血清的制備和純化
[0051] 1)純化好的上述單抗+完全佐劑一免疫山羊一加強(qiáng)免疫2次，每次間隔1個月一 第二次加強(qiáng)后10天左右取血一離心取血清一（NH 4)2S04沉淀一DEAE離子交換層析純化；
[0052] 2)效價測定：ELISA夾心法，抗體效價稀釋度應(yīng)大于1:256 ;
[0053] 3)蛋白濃度測定：紫外分光法測定0D279，計(jì)算蛋白濃度。
[0054] 4.膠體金及金標(biāo)抗體制備
[0055] 1)膠體金的制備：以檸檬酸鹽還原法制備40-60nm的膠體金。將0. 01%HauCl4加 熱至沸，加入一定量的1%檸檬酸三鈉（Na3C6H 507 · 2H20)，繼續(xù)加熱煮沸5min，待膠體金溶 液顏色由蘭一紫一紅，穩(wěn)定后，冷卻即可。膠體金溶液應(yīng)清亮透明，如需長期保存，可加入 0. 02%NaN3〇
[0056] 2)將膠體金液500mL用0· 1M NaOH調(diào)ρΗ8· 4,磁力攪拌下緩慢加入單抗2mL，攪拌 20min。5,500Xg離心30min，除去上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。離心后吸取膠體金標(biāo)記抗體 沉淀，沉淀溶于10mL保存液中，用0. 45 μ m微孔濾膜過濾。取樣進(jìn)行檢定，其余置4°C保存。
[0057] 5.膜反應(yīng)體系Ml的制備
[0058] 1)將CarD抗體及純化的羊抗鼠 IgG以0. 1M磷酸鹽緩沖液稀釋，終濃度為約 0· 2_2mg/mL〇
[0059] 2)純化的羊抗鼠 IgG溶于0· 1M磷酸鹽緩沖液中，濃度為2. Omg/mL ;
[0060] 3)硝酸纖維素膜大小：10cmX 27cm，每張膜可噴長25cm的檢測及控制帶各4條；
[0061] 4)將以上兩種溶液分別加入Biodot XYZ3000噴涂機(jī)的2個噴頭儲存瓶中；
[0062] 5)設(shè)置噴速為2 μ L/cm，NC膜的移行速度為50mm/s。以單抗CarDAD2 (2mg/mL) 在NC膜上包被反應(yīng)檢測線，以1. Omg/mL兔抗鼠 IgG包被反應(yīng)對照線，對照線與檢測線的距 離為 4_4. 5mm ；
[0063] 6)完成包被后，置37°C干燥箱24h，用BB封閉液封閉處理0. 5h，用WB洗液抽洗1 次；
[0064] 7) 37 °C干燥箱干燥備用；
[0065] 8)切制備好的硝酸纖維素膜：1. 8cmX 27cm/條，放入鋁薄袋中密封干燥保存。置 室溫保存?zhèn)溆谩?br> [0066] 6.膜反應(yīng)體系M2a、M2b及M3的制備
[0067] 將吸水纖維膜分別浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，裝入塑料袋中， 室溫保存。
[0068] l)M2a制備：將制好的玻璃纖維切27cmX 1. 2cm/條；
[0069] 2)M2b制備：將制好的玻璃纖維切27cmX 1. 8cm/條；
[0070] 3)M3制備：將制好的玻璃纖維切27cmX 1. 2cm/條。
[0071] 7.膜反應(yīng)體系M4的制備
[0072] 1)取膠體金-單抗復(fù)合物加稀釋液，混勻配成工作濃度；
[0073] 2)將溶液加入噴涂機(jī)Biodot的Air jet噴頭儲存瓶中；
[0074] 3)設(shè)定壓力為15PSI，玻璃纖維膜的移動速度為50mm/s ;
[0075] 4)噴制規(guī)格為0· 5-1. 5cmX 25cm/條，每條噴2遍；
[0076] 5)于37°C烘干12h，放入鋁薄袋中，加入干燥劑，熱合封口，室溫保存。
[0077] 8.反應(yīng)體組裝
[0078] 1)在M6塑料基板上貼4條雙面膠帶M7 ;
[0079] 2)在M7中間貼反應(yīng)膜Ml (18mm)，離M6上緣約22mm ;
[0080] 3)在M7上貼M5 (22_)，與M6上緣對齊并與Ml上緣交1mm ;
[0081] 4)在M7上貼M2a (12mm)，與Ml下緣相接；
[0082] 5)在 M2 上貼 M4 (10mm)，壓住 Ml 下緣 0· 5mm ;
[0083] 6)在 M7 上貼 M3 (12mm)，上緣壓住 M4 約 2/3 ;
[0084] 7)在M7上貼M2b (18mm)，上緣壓住M4約2/3,下緣與M7的下緣對齊；
[0085] 8)在M4和M7上貼透明保護(hù)膠帶M8,上緣完全壓住M4,并壓住Ml約1. 5mm ;
[0086] 9)在M5上貼彩色標(biāo)記膠帶M9,與Ml上緣交1mm，另一端翻過M6上緣，貼于M6被 面；
[0087] 10)將組裝成型的反應(yīng)體用全自動切條機(jī)切成3. 5_規(guī)格。
[0088] 實(shí)施例2試劑盒裝配
[0089] 試劑盒呈三角形扁盒，盒底板的三邊各設(shè)置有一條凹槽，放置3條測試帶；上蓋與 測試帶相應(yīng)位置有3個觀測窗，3個加樣孔設(shè)置在上蓋三個頂角處(見圖1、圖2)。
[0090] 將制備好的檢測CarD、IrrE及Csp蛋白的三種測試帶分別嵌入底板的3個凹槽 中，然后將上蓋與底板扣緊，即成試劑盒。
[0091] 將試劑盒、滴管和使用說明書裝塑料袋封裝后，即可。
[0092] 實(shí)施例3試劑盒使用過程
[0093] 1.檢測樣本處理及準(zhǔn)備
[0094] 植物種子、葉子、籽苗等樣本在檢測前需經(jīng)研磨，并以蒸餾水抽提和稀釋。為獲得 最佳檢測效果，各不同樣品應(yīng)根據(jù)下表中的比例稀釋，在完成研磨和稀釋后，將樣本混勻， 靜置，取上清液作為檢測樣品。
[0095]

【權(quán)利要求】
1.全局調(diào)控因子IrrE、Csp及CarD蛋白的金標(biāo)快速聯(lián)檢試劑盒，由底板、上蓋組成；其 特征為，所述試劑盒的形狀為三角形盒體，盒體的底板上設(shè)置有3條測試帶；上蓋有3個觀 測窗和3個加樣孔；所述3條測試帶分別位于所述三角形盒體底板表面的三邊；所述底板 的上表面設(shè)置有3條可嵌入測試帶凹槽。
【文檔編號】G01N33/68GK203849263SQ201320731951
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】張維, 谷偉, 周正富, 滕超, 王金輝, 陸偉, 陳明, 林敏
申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所