禾谷類作物籽粒中β-葡聚糖含量的測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種禾谷類作物籽粒中β-葡聚糖含量的測(cè)定方法，其中采用的酶測(cè)定方法具有與標(biāo)準(zhǔn)方法一致的準(zhǔn)確度和專一性，種子用量少，且使用廉價(jià)易得的酶，適用于珍稀種質(zhì)資源小批量多批次長(zhǎng)期、連續(xù)測(cè)定的工業(yè)生產(chǎn)的需要。
【專利說明】禾谷類作物好粒中β-葡聚糖含量的測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化學(xué)分析領(lǐng)域，具體地說，涉及禾谷類作物籽粒中β -葡聚糖含量的測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]β -葡聚糖是禾草與禾谷類作物籽粒中特有的一種多糖，在大麥和燕麥中含量較高。其中80%的β_葡聚糖是可溶的。大量研究表明，β_葡聚糖具有降低血糖、降低膽固醇、減少心血管疾病、預(yù)防糖尿病等生理功能。燕麥β-葡聚糖還可通過促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、抑制腸道內(nèi)酶的水解能力等功能減少機(jī)體的糖吸收總量，從而緩解高血糖癥狀，且該作用與燕麥β-葡聚糖的濃度和分子量呈正相關(guān)。因此，燕麥β-葡聚糖的開發(fā)和利用日益受到重視。開發(fā)一種準(zhǔn)確可靠經(jīng)濟(jì)的β-葡聚糖含量測(cè)定方法對(duì)于β_葡聚糖的利用至關(guān)重要。
[0003]現(xiàn)有的β -葡聚糖測(cè)定方法包括苯酚-硫酸法、剛果紅法、酶測(cè)定法、熒光法和高效液相色譜法等。其中，酶測(cè)定法因其反應(yīng)專一，準(zhǔn)確性和可靠性高，是目前國(guó)際上較通用的測(cè)定方法。但其檢測(cè)試劑盒價(jià)格昂貴，大量使用成本高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種禾谷類作物籽粒中β -葡聚糖含量的測(cè)定方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種禾谷類作物籽粒中β -葡聚糖含量的測(cè)定方法，包括以下步驟:
[0006]I)從纖維酶中純化葡聚糖酶；
[0007]2)樣品溶液的配制:籽粒曬干粉碎，將粉末樣品用酒精潤(rùn)濕，加入NaOH溶液混勻后放置14-16h，然后調(diào)pH值呈中性，離心后取上清，即得樣品溶液；
[0008]3)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制；
[0009]4)葡萄糖轉(zhuǎn)化:向上述樣品溶液中加入琥珀酸鈉緩沖液和步驟I)中純化的葡聚糖酶，于35-40°C水浴中保溫2-3h ；
[0010]5)顯色測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:向步驟3)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液中依次加入醋酸鈉緩沖液、琥珀酸鈉緩沖液和GOPOD顯色液，于35-40°C水浴中保溫35_45min，然后置于暗處10-15min，在510nm測(cè)吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0011]6)樣品顯色測(cè)定及β-葡聚糖含量的計(jì)算:采用與步驟5)相同的方法，對(duì)步驟4)中所得溶液進(jìn)行顯色測(cè)定，根據(jù)測(cè)定的吸光度值對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線上葡萄糖的含量，代入以下計(jì)算公式，即得β -葡聚糖的含量:
[0012]β_ 葡聚糖含量(%) =CX50X2.5X100X0.9/(WX 1000) =CX 11.25/W
[0013]其中，C為樣品對(duì)應(yīng)的葡萄糖的含量，W為樣品重量(以mg計(jì))，0.9為葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖苷的轉(zhuǎn)換因子。
[0014]步驟I)具體為:向0.6g纖維酶中加入IOmL醋酸鈉緩沖液，混勻，4000r/min離心5min，然后于70°C水浴中加熱50min，隨后冰浴Imin ;將溶液轉(zhuǎn)移至滲透膜中，4°C置于3L醋酸鈉緩沖液中滲透14h，最后4000r/min離心5min，收集的上清液中含有純化的葡聚糖酶。
[0015]步驟2)具體為:籽粒曬干粉碎過60目篩，稱取100粉末樣品用0.2mL50%酒精潤(rùn)濕，加入5.0mLImoI/L NaOH溶液，混勻，于20°C放置14h ;然后調(diào)pH值呈中性，將溶液轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，定容，5000r/min離心取上清，即得樣品溶液。
[0016]步驟3)具體為:配制2.5mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液原液，稀釋原液至濃度分別為100 μ g/mL、200 μ g/mL、300 μ g/mL 和 400 μ g/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。
[0017]步驟4)具體為:向2個(gè)IOmL具塞試管中分別加入0.2mL樣品溶液，向一個(gè)作為樣品分析的試管中加入0.1mL步驟2)中得到的含葡聚糖酶的上清液，向另一個(gè)用于空白測(cè)定的試管中加入0.1mL醋酸鈉緩沖液；向用于酶空白測(cè)定的試管中加入0.2mL水和0.1mL步驟2)的上清液；向所有試管中加入0.2mL琥珀酸鈉緩沖液，加蓋搖勻后于40°C水浴保溫2h。
[0018]其中，琥珀酸鈉緩沖液的配制方法為:向0.68g琥珀酸鈉中加入40mL水溶解，用鹽酸調(diào)pH值5.5，加入IOmg疊氮鈉，溶解后轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中定容，即得。
[0019]步驟5)具體為:取5個(gè)試管，向一個(gè)試管中加入0.2mL水以作為空白對(duì)照，向其它四個(gè)試管中分別加入0.2mL各濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，然后向5個(gè)試管中依次加入0.1mL醋酸鈉緩沖液、0.2mL琥珀酸鈉緩沖液和3mL GOPOD顯色液，于40°C水浴中保溫45min，取出試管置于暗處15min，在510nm測(cè)吸光度值。
[0020]本發(fā)明中所述禾谷類作物包括但不限于大麥和燕麥。
[0021]本發(fā)明值涉及的反應(yīng)方程式為:
[0022]
【權(quán)利要求】
1.禾谷類作物籽粒中β-葡聚糖含量的測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)從纖維酶中純化葡聚糖酶； 2)樣品溶液的配制:籽粒曬干粉碎，將粉末樣品用酒精潤(rùn)濕，加入NaOH溶液混勻后放置14-16h，然后調(diào)pH值呈中性，離心后取上清，即得樣品溶液； 3)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制； 4)葡萄糖轉(zhuǎn)化:向上述樣品溶液中加入琥珀酸鈉緩沖液和步驟I)中純化的葡聚糖酶，于35-40°C水浴中保溫2-3h ； 5)顯色測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:向步驟3)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液中依次加入醋酸鈉緩沖液、琥珀酸鈉緩沖液和GOPOD顯色液，于35-40 V水浴中保溫35_45min，然后置于暗處10-15min，在510nm測(cè)吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； 6)樣品顯色測(cè)定及β-葡聚糖含量的計(jì)算:采用與步驟5)相同的方法，對(duì)步驟4)中所得溶液進(jìn)行顯色測(cè)定，根據(jù)測(cè)定的吸光度值對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線上葡萄糖的含量，代入以下計(jì)算公式，即得β -葡聚糖的含量: β -葡聚糖含量(%) =CX50X2.5X100X0.9/(WX 1000) =CX 11.25/W 其中，C為樣品對(duì)應(yīng)的葡萄糖的含量，W為粉末樣品重量，0.9為葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖苷的轉(zhuǎn)換因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)具體為:向0.6g纖維酶中加入IOmL醋酸鈉緩沖液，混勻，4000r/min離心5min，然后于70°C水浴中加熱50min，隨后冰浴Imin ;將溶液轉(zhuǎn)移至滲透膜中，4°C置于3L醋酸鈉緩沖液中滲透14h，最后4000r/min離心5min,收集的上清液中含有純化的葡聚糖酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)具體為:籽粒曬干粉碎過60目篩，稱取100粉末樣品用0.2mL50%酒精潤(rùn)濕，加入5.0mLImoI/L NaOH溶液，混勻，于20°C放置14h ;然后調(diào)pH值呈中性，將溶液轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，定容，5000r/min離心取上清，即得樣品溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)具體為:配制2.5mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液原液，稀釋原液至濃度分別為100 μ g/mL>200 μ g/mL>300 μ g/mL和400 μ g/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟4)具體為:向2個(gè)IOmL具塞試管中分別加入0.2mL樣品溶液，向一個(gè)作為樣品分析的試管中加入0.1mL步驟2)中得到的含葡聚糖酶的上清液，向另一個(gè)用于空白測(cè)定的試管中加入0.1mL醋酸鈉緩沖液；向用于酶空白測(cè)定的試管中加入0.2mL水和0.1mL步驟2)的上清液；向所有試管中加入0.2mL琥珀酸鈉緩沖液，加蓋搖勻后于40°C水浴保溫2h ； 其中，琥珀酸鈉緩沖液的配制方法為:向0.68g琥珀酸鈉中加入40mL水溶解，用鹽酸調(diào)pH值5.5，加入IOmg疊氮鈉，溶解后轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中定容，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟5)具體為:取5個(gè)試管，向一個(gè)試管中加入0.2mL水以作為空白對(duì)照，向其它四個(gè)試管中分別加入0.2mL各濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，然后向5個(gè)試管中依次加入0.1mL醋酸鈉緩沖液、0.2mL琥珀酸鈉緩沖液和3mL GOPOD顯色液，于40°C水浴中保溫45min，取出試管置于暗處15min，在510nm測(cè)吸光度值。
7.棚權(quán)利要求任一項(xiàng)《的方法，期寺征在于，所述禾谷類作物包括但不限于大麥減麥。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK103743734SQ201310727703
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】彭遠(yuǎn)英, 唐雪琴, 顏紅海, 周萍萍, 趙軍, 王智英, 魏育明 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)