一種檢測(cè)食品中大腸桿菌胞內(nèi)β-葡萄糖苷酸酶的雙抗體夾心法
【專利摘要】一種檢測(cè)食品中大腸桿菌胞內(nèi)β-葡萄糖苷酸酶的雙抗體夾心法，屬于免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明應(yīng)用大腸桿菌β-葡萄糖苷酸酶（EC3.2.1.31）免疫7周齡BALB/c小鼠，經(jīng)融合、篩選得10株單抗，分別標(biāo)記HRP，并配對(duì)。以CGMCC?No.7209為包被抗體和CGMCC?No.7211為酶標(biāo)抗體，以重組表達(dá)的大腸桿菌β-葡萄糖苷酸酶為標(biāo)準(zhǔn)品建立夾心ELISA分析方法。本法通過裂解大腸桿菌ATCC25922檢測(cè)胞內(nèi)β-葡萄糖苷酸酶，實(shí)現(xiàn)大腸桿菌檢測(cè)，LOD為3.27*10^4cfu/mL。本法首次制備了大腸桿菌的標(biāo)志物β-葡萄糖苷酸酶的單抗并建立了檢測(cè)大腸桿菌的雙抗夾心法，本法與沙門氏菌、E.coli、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌無交叉反應(yīng)，為食品中大腸桿菌的檢測(cè)提供了新的檢測(cè)手段。
【專利說明】—種檢測(cè)食品中大腸桿菌胞內(nèi)β-葡萄糖苷酸酶的雙抗體夾心法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及了一種基于單克隆抗體的檢測(cè)食品中大腸桿菌胞內(nèi)β-葡萄糖苷酸酶的雙抗體夾心法，屬于免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌(Escherichiacoli, Ε.coli), 1885 年由 Escherich 發(fā)現(xiàn),分布在自然界，主要附生在人或動(dòng)物的腸道里，為正常菌群，少數(shù)的大腸桿菌具有毒性，可引起疾病。
[0003]E.coli常隨糞便散布在環(huán)境中，作為溫血?jiǎng)游锬c道細(xì)菌的代表，大腸桿菌常作為飲水和食物(或藥物)的衛(wèi)生學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。若在水和食品中檢出此菌，可認(rèn)為是被糞便污染的指標(biāo)，從而可能有腸道病原菌的存在。大腸桿菌葡萄糖苷酸酶是位于大腸桿菌胞質(zhì)空間和表面的一種分子量為68KDa的酶。因此，β_葡萄糖苷酸酶是Elisa檢測(cè)大腸埃希氏菌Ε.coli的理想檢測(cè)對(duì)象。
[0004]目前，檢測(cè)E.coli的方法有培養(yǎng)法、酶底物法、PCR方法等。培養(yǎng)法是檢測(cè)E.coli的國(guó)標(biāo)方法，盡管權(quán)威可靠，但一般需要10天得到結(jié)果，且操作過程繁瑣，不能適應(yīng)快速檢測(cè)的要求；酶底物法多利用E.coli屬特異性的β -堿性磷酸酯酶或者β -D-葡萄糖苷酸酶的酶學(xué)活性催化底物產(chǎn)生熒光，從而在24h內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)E.coli的檢測(cè)，優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是酶活性質(zhì)易受溫度、pH、離子強(qiáng)度的影響，國(guó)外產(chǎn)品質(zhì)量較為穩(wěn)定，但相對(duì)比較昂貴；PCR方法，檢測(cè)E.coli屬特異性的DNA片段，具有靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短的特點(diǎn)，缺點(diǎn)是成本較高、需要較高的操作技術(shù)，且不能避免增菌過程。
[0005]盡管食源性致病菌檢測(cè)方法不斷發(fā)展，Elisa憑借其快速、靈敏、特異性好、高通量、不需要大型儀器，易于推廣的特點(diǎn)成為目前檢測(cè)微生物的常用方法。直接檢測(cè)微生物的Elisa試劑盒檢測(cè)抗原通常為菌體的表面抗原，檢測(cè)抗體一般有多克隆抗體及單克隆抗體兩種。由于單克隆抗體具有理化性質(zhì)單一、特異性好、親和力高并可以無限生產(chǎn)的特點(diǎn)，比多克隆抗體具有更大的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明首次通過制備單克隆抗體并建立起檢測(cè)大腸桿菌分泌的β -葡萄糖苷酸酶的雙抗體夾心法來實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)，為食品中大腸埃希氏菌的快速檢測(cè)提供了新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006](一)要解決的技術(shù)問題
Ε.coli的血清型繁多，如何實(shí)現(xiàn)對(duì)絕大多數(shù)Ε.coli的檢測(cè)是目前仍需要解決的問題。本發(fā)明的目的在于建立一種具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作方法簡(jiǎn)單的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法，通過檢測(cè)大腸桿菌胞內(nèi)β -葡萄糖苷酸酶從而實(shí)現(xiàn)食品中大腸桿菌的批量、快速檢測(cè)。
[0007](二)技術(shù)方案
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案:一種基于單克隆抗體的檢測(cè)食品中大腸桿菌胞內(nèi)β-葡萄糖苷酸酶的雙抗體夾心法。本發(fā)明還包括對(duì)方法的優(yōu)化。
[0008]大腸桿菌胞內(nèi)β -葡萄糖苷酸酶作為大腸桿菌ELISA檢測(cè)抗原的發(fā)現(xiàn)及證明。
[0009]通過文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)大腸桿菌胞內(nèi)葡萄糖苷酸酶是廣泛作為大腸桿菌標(biāo)志物的一種酶，在飲用水、食品樣品大腸桿菌的檢測(cè)中作為大腸桿菌的檢測(cè)目標(biāo)。97%的大腸桿菌可以正常分泌葡萄糖苷酸酶。但以往的研究一般均采用顯色平板或者分子生物學(xué)方法檢測(cè)葡萄糖苷酸酶的基因MUG來檢測(cè)大腸桿菌。本發(fā)明首次在蛋白水平實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌胞內(nèi)葡萄糖苷酸酶的檢測(cè)，從而間接檢測(cè)大腸桿菌，本方法為大腸桿菌的檢測(cè)提供了新的選擇。
[0010](I)單克隆抗體的制備
以重組表達(dá)的大腸桿菌β-葡萄糖苷酸酶為免疫原，免疫7周齡的BALB/c小鼠，進(jìn)行免疫、融合、篩選，共篩選到10個(gè)細(xì)胞株；免疫程序如下:第一周進(jìn)行首免，100 μ g/只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第四周進(jìn)行二免，100 μ g/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第六周進(jìn)行三免，50 μ g/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第七周尾部采血測(cè)效價(jià)，選擇效價(jià)最高的老鼠；第八周進(jìn)行沖刺免疫，20 μ g/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺免疫3天后眼眶采血后進(jìn)行融合；篩選采用間接Elisa進(jìn)行，共篩選到10個(gè)細(xì)胞株;
重組表達(dá)的大腸桿菌β -葡萄糖苷酸酶，購(gòu)自愛爾蘭megazyme公司，貨號(hào)120501 ;購(gòu)買證明見證明文件I。
[0011](2)單克隆抗體的配對(duì)篩選
將純化后的10株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行夾心法配對(duì)；配對(duì)參數(shù)如下:包被抗體5 μ g/mL ;包被液為pH9.6,0.01M的碳酸鹽緩沖液；以重組表達(dá)的大腸桿菌葡萄糖苷酸酶為標(biāo)品，濃度為10ng/mL;標(biāo)品稀釋液為pH7.2,0.01M的PBS ;酶標(biāo)抗體稀釋1000倍使用；在此條件下，實(shí)驗(yàn)成功得到了 9對(duì)P/N值>5的配對(duì)；
(3)夾心法的建立
選擇檢測(cè)限穩(wěn)定、靈敏的配對(duì)，即分別以10B6即細(xì)胞株9號(hào)CGMCC N0.7209單抗為包被抗體和4F2即細(xì)胞株11號(hào)CGMCC N0.7211單抗為酶標(biāo)抗體建立夾心法；具體參數(shù)如下:抗體包被濃度:5 μ g/mL,
包被液:pH9.6、0.01M的碳酸鹽緩沖液，
標(biāo)品稀釋液:pH7.2、0.01M 的 PBS+0.1% Tween,
檢測(cè)抗體濃度:1.6 μ g/mL,
反應(yīng)時(shí)間:包被、封閉:37°C、2h ;標(biāo)準(zhǔn)品:37°C、lh ;檢測(cè)抗體:37°C、lh ;顯色I(xiàn)Omin ； 優(yōu)化后大腸桿菌胞內(nèi)β -葡萄糖苷酸酶夾心法LOD:0.012ng/mL ；
(4)大腸桿菌裂解過程
裂解液配制:0.1M 磷酸鹽緩沖液，0.01% Triton 100，0.05% EDTA, ρΗ7.2 ；
裂解液采用溫和的非離子表面活性劑裂解菌體，優(yōu)化后效果較好。
[0012]裂解過程:大腸桿菌ATCC 25922 (見證明文件2)經(jīng)EC肉湯增菌，取增菌后的液體樣品以液體樣品:裂解液體積比1: 9的比例加入到裂解液中，在室溫下振蕩15min，取100 μ L裂解后的樣品進(jìn)行大腸桿菌β -葡萄糖苷酸酶夾心法檢測(cè)；本方法檢測(cè)大腸桿菌的LOD為3.27*10~4cfu/mL。
[0013]其中，單克隆抗體是采用重組的大腸桿菌β -葡萄糖苷酸酶經(jīng)過特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)融合、篩選得到的。
[0014]其中，用于配對(duì)的抗體是通過優(yōu)化參數(shù)下夾心法配對(duì)，并通過多次試驗(yàn)篩選確定的，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高的特點(diǎn)。
[0015]其中，建立的夾心法優(yōu)化了包被抗體的濃度，包被液，封閉液，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，酶標(biāo)抗體稀釋液，酶標(biāo)抗體稀釋濃度。LOD達(dá)到0.012ng/mL, R2為0.997。
[0016]本發(fā)明方法的檢測(cè)分析原理是:
酶標(biāo)板上包被了捕獲抗體10B6 (細(xì)胞株9號(hào)CGMCC N0.7209)，合適的濃度下可以最大限度捕獲大腸桿菌胞內(nèi)β -葡萄糖苷酸酶；洗板3次，洗去未結(jié)合的抗體，加入封閉液220 μ L封閉板孔上多余結(jié)合位點(diǎn)；洗板3次，加入樣品和對(duì)照，37°C孵育Ih ;洗板3次，加入酶標(biāo)抗體4F2 (細(xì)胞株11號(hào)CGMCC N0.7211) -HRP，37°C孵育Ih ;洗板4次，加入顯色液顯色12min。如果樣品有足夠的大腸桿菌胞內(nèi)葡萄糖苷酸酶，那么大腸桿菌胞內(nèi)葡萄糖苷酸酶被捕獲抗體捕獲并與酶標(biāo)抗體4F2-HRP結(jié)合，并催化底物在450nm產(chǎn)生吸收值(P/N ^ 2.1)，并被判定為陽性；如果樣品大腸桿菌胞內(nèi)β_葡萄糖苷酸酶濃度太低(P/N< 2.1)那么樣品不被捕獲或者捕獲數(shù)量太小不足以引起足夠的信號(hào)，被判定為陰性。
[0017](三)有益效果
本發(fā)明提供的大腸桿菌β-葡萄糖苷酸酶雙抗體夾心法提供了一種通過檢測(cè)大腸桿菌胞內(nèi)保守蛋白的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)。該方法對(duì)大腸桿菌β_葡萄糖苷酸酶標(biāo)品以及大腸桿菌菌體的LOD分別為0.012ng/mL和3.27*10~4cfu/mL。
[0018]生物材料樣品保減:
單克隆細(xì)胞株9號(hào)(10B6)，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)CGMCC N0.7209，保藏日期2013年I月23日。
[0019]單克隆細(xì)胞株11號(hào)(4F2)，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)CGMCC N0.7211，保藏日期2013年I月23日。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1大腸桿菌β -葡萄糖苷酸酶雙抗體夾心法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0021]圖2大腸桿菌β -葡萄糖苷酸酶雙抗體夾心法檢測(cè)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方案
[0022]以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0023]一、儀器:
TGL - 40Β臺(tái)式低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠
KFLOff純水機(jī)，凱佛隆公司
ZD - 9556水平搖床，太倉(cāng)科教器材廠
96孔8Χ 12可拆酶標(biāo)板，廈門怡佳美實(shí)驗(yàn)器材有限公司 MuLtiska Mks 酶標(biāo)儀，Thermo Labsystems 公司 可調(diào)試移液器，Thermo Labsystems公司 渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠
二、試劑:
四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，上海晶純實(shí)業(yè)有限公司 其他試劑均為分析純?cè)噭?br> 三、步驟
1.單克隆抗體的制備
Cl)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選5只7周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫；
(2)抗原配置:將重組表達(dá)的大腸桿菌胞內(nèi)β_葡萄糖苷酸酶用生理鹽水稀釋，渦旋混合均勻；
(3)乳化:將上述溶液與等量完全或不完全福氏佐劑用混合攪拌法將其乳化，乳化完全后皮下多點(diǎn)注射小鼠；
免疫方法:按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用間接競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定效價(jià)，效價(jià)達(dá)到要求后，進(jìn)行沖刺免疫；沖免3天后眼眶采血后進(jìn)行融合；
(4)采血:第三次免疫后I周進(jìn)行斷尾采血，采用間接非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法測(cè)定抗血清效
價(jià)；
(5)融合、篩選:采用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行融合，采用間接ELISA篩選陽性細(xì)胞孔，采用有限稀釋法對(duì)陽性孔進(jìn)行亞克隆:
(6)抗體的純化和保存:采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水，透析后得到單克隆抗體，采用微量紫外方法測(cè)定其濃度后分裝后放入-20°C保存。
[0024]2、ELISA 反應(yīng)過程:
抗體效價(jià)測(cè)定步驟:
(1)將包被原用包被緩沖液作系列稀釋包被96孔酶標(biāo)板，100μ L/孔，于4°C冰箱過夜。次日取出酶標(biāo)板回至室溫，每孔注入200 UL PBST溶液，搖床上振蕩3 min，用力甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，繼續(xù)洗滌2次。以下洗滌方法相同；
(2)充分洗滌后，用封閉緩沖液封閉酶標(biāo)板，200yL/孔，于37 °C溫育箱內(nèi)溫育2h后取出烘干待用；
(3)將陽性血清系列稀釋對(duì)應(yīng)加入到酶標(biāo)板的前7行列，第8行加入陰性血清，100μ L/孔，37 °C孵育I h后洗滌、拍干；
(4)每孔加入100μ L、1:3000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 °C孵育I h后洗滌、拍干;
(5)每孔加入100μ L顯色液(TMB與底物液比例為1:5)，暗處37°C反應(yīng)15 min，取出后每孔加入100 μ L終止液(2 mol/L的硫酸)，用酶標(biāo)僅測(cè)定吸光值A(chǔ)45。。
[0025]大腸桿菌胞內(nèi)β -葡萄糖苷酸酶雙抗體夾心法測(cè)定步驟:
a、包被:用5μ g/mL的10B6 (細(xì)胞株9號(hào)CGMCC N0.7209)包被酶標(biāo)板，100 μ L /孔，4°C過夜；
b、洗滌:用PBST洗滌反應(yīng)板三次，每次3min，200μ L/孔，然后甩干反應(yīng)板；
C、封閉:含0.2%明膠的CBS, 200 μ L /孔，37°C封閉2h ； d、洗漆:同b;
e、樣品:用PBST將重組表達(dá)的大腸桿菌β-葡萄糖苷酸酶稀釋成8、2、1、0.5、0.25、0.125,0.0625,0.03125,0.0156 ng/mL系列濃度，另設(shè)一個(gè)PBST空白對(duì)照。每孔加入100 μ L樣品，于37°C溫育Ih ；
f、洗漆:同b;
g、加酶標(biāo)抗體(4F2-HRP，2yg/mL)，IOOyL / 孔，37 C 反應(yīng) Ih ;
h、洗漆:同b;
1、顯色:加底物TMB100 μ L /孔，顯色I(xiàn)Omin ； j、終止:加終止液50 μ L /孔；
k、測(cè)定:用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD45(lnm。
[0026]3、交叉率的測(cè)定
將沙門氏菌、E.col1、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌精確稀釋成IO8cfu/mL>107 cfu/mL、106 cfu/mL、105cfu/mL,在建立的大腸桿菌胞內(nèi)β-葡萄糖苷酸酶雙抗體夾心法體系中檢測(cè)吸光值，并設(shè)空白孔和大腸桿菌胞內(nèi)β_葡萄糖苷酸酶陽性對(duì)照，每個(gè)濃度做6次測(cè)定平均值，做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
[0027]試驗(yàn)結(jié)果如下:
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線:本方法對(duì)β -葡萄糖苷酸酶的檢測(cè)線性范圍是0.0156?Ing/mL,R2=0.997，對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)范圍為5.49X 10~4cfu/mL。具體請(qǐng)見說明書附圖。
[0028]2、LOD:L0D是空白的平均吸收值加3倍的空白吸收值的標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)應(yīng)的抗原濃度。本方法對(duì)葡萄糖苷酸酶的LOD為0.012ng/mL。檢測(cè)大腸桿菌的LOD為
3.27*10~4cfu/mL。
[0029]3、交叉反應(yīng)率(CR%)
結(jié)果:大腸桿菌胞內(nèi)β-葡萄糖苷酸酶正常顯色，而IO8 Cfu/mL以及以下濃度的其它測(cè)試菌株均不顯色(0D〈 0.15)。說明建立的大腸桿菌胞內(nèi)β-葡萄糖苷酸酶夾心法與沙門氏菌、Ε.col1、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌無交叉反應(yīng)，特異性良好。
【權(quán)利要求】
1.一種基于單克隆抗體的檢測(cè)食品中大腸桿菌胞內(nèi)β-葡萄糖苷酸酶的雙抗體夾心法，其特征在于 (1)單克隆抗體的制備 以重組表達(dá)的大腸桿菌β-葡萄糖苷酸酶為免疫原，免疫7周齡的BALB/c小鼠，進(jìn)行免疫、融合、篩選，共篩選到10個(gè)細(xì)胞株； 重組表達(dá)的大腸桿菌β -葡萄糖苷酸酶，購(gòu)自愛爾蘭Megazyme公司，貨號(hào)120501 ； (2)單克隆抗體的配對(duì)篩選 將純化后的10株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行夾心法配對(duì)；配對(duì)參數(shù)如下:包被抗體5μ g/mL ;包被液為pH9.6,0.01M的碳酸鹽緩沖液；以重組表達(dá)的大腸桿菌葡萄糖苷酸酶為標(biāo)品，濃度為10ng/mL;標(biāo)品稀釋液為pH7.2,0.01M的PBS ;酶標(biāo)抗體稀釋1000倍使用；在此條件下，實(shí)驗(yàn)成功得到了 9對(duì)P/N值>5的配對(duì)； (3)夾心法的建立 選擇檢測(cè)限穩(wěn)定、靈敏的配對(duì)，即分別以10B6即細(xì)胞株9號(hào)CGMCC N0.7209單抗為包被抗體和4F2即細(xì)胞株11號(hào)CGMCC N0.7211單抗為酶標(biāo)抗體建立夾心法；具體參數(shù)如下:抗體包被濃度:5 μ g/mL, 包被液:pH9.6、0.01M的碳酸鹽緩沖液，
標(biāo)品稀釋液:pH7.2、0.01M 的 PBS+0.1% Tween,` 檢測(cè)抗體濃度:1.6 μ g/mL, 反應(yīng)時(shí)間:包被、封閉:37°C、2h ;標(biāo)準(zhǔn)品:37°C、lh ;檢測(cè)抗體:37°C、lh ;顯色I(xiàn)Omin ； 優(yōu)化后大腸桿菌胞內(nèi)β -葡萄糖苷酸酶夾心法LOD:0.012ng/mL ； (4)大腸桿菌裂解過程 裂解液配制:0.1M 磷酸鹽緩沖液，0.01% Triton 100，0.05% EDTA, ρΗ7.2 ； 裂解過程:大腸桿菌經(jīng)EC肉湯增菌，取增菌后的液體樣品以液體樣品:裂解液體積比I: 9的比例加入到裂解液中，在室溫下振蕩15min，取IOOyL裂解后的樣品進(jìn)行大腸桿菌β-葡萄糖苷酸酶夾心法檢測(cè)； 本方法檢測(cè)大腸桿菌的LOD為3.27*10~4cfu/mL。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103698521SQ201310691119
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月17日
【發(fā)明者】匡華, 胥傳來, 王文彬, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 胡擁明 申請(qǐng)人:江南大學(xué)