一種檢測超低含量黃曲霉毒素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測超低含量黃曲霉毒素的方法，該方法包括以下步驟：準(zhǔn)備玻碳電極，在玻碳電極上采用化學(xué)法修飾一層單壁碳納米管，利用連接劑共價鍵合；牛血清蛋白-黃曲霉毒素偶聯(lián)形成抗原AFB1-BSA；抗原AFB1-BSA與單壁碳納米管上的活化羧基反應(yīng)連接；采用夾心法競爭法利用抗原抗體反應(yīng)與同時加入的黃曲霉毒素單體來競爭吸附一抗，獲得二抗；性磷酸酶標(biāo)記二抗；測定堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗電化學(xué)信號，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到實(shí)測樣品黃曲霉毒素濃度。本發(fā)明提供的檢測超低含量黃曲霉毒素的方法操作簡單、選擇性高、特異性高，能簡單快速的檢測含量黃曲霉毒素，所需設(shè)備簡易，成本低，具有極大的實(shí)際使用價值和良好的發(fā)展空間。
【專利說明】一種檢測超低含量黃曲霉毒素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于黃曲霉毒素檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測超低含量黃曲霉毒素的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]黃曲霉毒素(aflatoxin, AFT)主要是由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素分為BI,B2,Gl,G2以及Ml，M2幾個亞型，其中AFBl被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為I級致癌劑，毒性最大，是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，低劑量長期攝入或大劑量一次暴露均可引發(fā)多種動物肝臟發(fā)生癌變或急性中毒。低劑量長期攝入或大劑量一次暴露均可引發(fā)多種動物肝臟發(fā)生癌變或急性中毒。
[0003]AFBl的理化性質(zhì)非常穩(wěn)定，在高溫268?269 °C時才分解，高壓
0.103MPa(120°C ) 4h處理毒性才降低一半，分子質(zhì)量為312.06u。AFBl可以通過食物鏈富集到人體，危害人體健康，因而世界各國都將AFBl作為強(qiáng)制性監(jiān)控指標(biāo)。
[0004]目前黃曲霉毒素的檢測方法主要有:
[0005]1、生物鑒定法(利用黃曲霉毒素能影響微生物、水生動物、家禽等生物體的細(xì)胞代謝來鑒定黃曲霉毒素的存在。該方法專一性差、靈敏度低，一般只作為化學(xué)分析法的佐證，其特點(diǎn)是待檢樣品不需很純，主要用于定性)；
[0006]I1、化學(xué)分析法(最常用的為薄層層析法(TLC)，主要是半定量)；
[0007]II1、儀器分析法(高效液相色譜法(HPLC)和毛細(xì)管電泳技術(shù)，具有自動化、高分離效能、高檢測效能，缺點(diǎn)是需要昂貴的儀器設(shè)備，操作復(fù)雜)；
[0008]IV、免疫分析法(放射免疫法、親和層析法、酶聯(lián)免疫法和免疫膠體金技術(shù)，具有操作簡單、高選擇、高特異性等特點(diǎn)，是較成熟的快速診斷方法，但是有時檢測靈敏度不十分理想。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種檢測超低含量黃曲霉毒素的方法，旨在解決目前檢測黃曲霉毒素的方法靈敏度不高、檢測范圍比較窄的問題。
[0010]本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種檢測超低含量黃曲霉毒素的方法，該方法包括以下步驟:
[0011]準(zhǔn)備玻碳電極，在玻碳電極上采用化學(xué)法修飾一層單壁碳納米管，利用連接劑共價鍵合；
[0012]牛血清蛋白-黃曲霉毒素偶聯(lián)形成抗原AFBl-BSA ；
[0013]抗原AFBl-BSA與單壁碳納米管上的活化羧基反應(yīng)連接；
[0014]采用夾心法競爭法利用抗原抗體反應(yīng)與同時加入的黃曲霉毒素單體來競爭吸附一抗，獲得二抗；
[0015]堿性磷酸酶標(biāo)記二抗；
[0016]測定堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗電化學(xué)信號，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到實(shí)測樣品黃曲霉毒素濃度。
[0017]進(jìn)一步，利用連接劑共價鍵合的方法為:利用3-二甲基氨基丙基亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)連接劑共價鍵合法。
[0018]進(jìn)一步，抗原AFBl-BSA與單壁碳納米管上的活化羧基反應(yīng)連接的方法為:
[0019]抗原AFBl-BSA通過蛋白質(zhì)氨基端與單壁碳納米管上的活化羧基反應(yīng)連接。
[0020]進(jìn)一步，標(biāo)記二抗的堿性磷酸酶可采用(EC3.1.3.1):戊二醛交聯(lián)標(biāo)記法
[0021]本發(fā)明提供的檢測超低含量黃曲霉毒素的方法操作簡單、選擇性高、特異性高，能簡單快速的檢測含量黃曲霉毒素，所需設(shè)備簡易，成本低，具有極大的實(shí)際使用價值和良好的發(fā)展空間。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測超低含量黃曲霉毒素的方法流程圖。
[0023]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測超低含量黃曲霉毒素的化學(xué)反應(yīng)過程示意圖；
[0024]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的黃曲霉毒素BI含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0026]圖1示出了本發(fā)明提供的檢測超低含量黃曲霉毒素的方法的流程。為了便于說明，僅僅不出了與本發(fā)明相關(guān)的部分。
[0027]如圖1所示，本發(fā)明的實(shí)施例提供的檢測超低含量黃曲霉毒素的方法包括以下步驟:
[0028]準(zhǔn)備玻碳電極，在玻碳電極上采用化學(xué)法修飾一層單壁碳納米管，利用連接劑共價鍵合；
[0029]牛血清蛋白-黃曲霉毒素偶聯(lián)形成抗原AFBl-BSA ；
[0030]抗原AFBl-BSA與單壁碳納米管上的活化羧基反應(yīng)連接；
[0031]采用夾心法競爭法利用抗原抗體反應(yīng)與同時加入的黃曲霉毒素單體來競爭吸附一抗，獲得二抗；
[0032]堿性磷酸酶標(biāo)記二抗；
[0033]測定堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗電化學(xué)信號，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到實(shí)測樣品黃曲霉毒素濃度。
[0034]作為本發(fā)明實(shí)施例的一優(yōu)化方案，利用連接劑共價鍵合的方法為:利用3- 二甲基氨基丙基亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)連接劑共價鍵合法。
[0035]作為本發(fā)明實(shí)施例的一優(yōu)化方案，抗原AFBl-BSA與單壁碳納米管上的活化羧基反應(yīng)連接的方法為:
[0036]抗原AFBl-BSA通過蛋白質(zhì)氨基端與單壁碳納米管上的活化羧基反應(yīng)連接。
[0037]作為本發(fā)明實(shí)施例的一優(yōu)化方案，標(biāo)記二抗的堿性磷酸酶可采用:戊二醛交聯(lián)標(biāo)記法。
[0038]表1花生加標(biāo)回收率測定
[0039]

【權(quán)利要求】
1.一種檢測超低含量黃曲霉毒素的方法，其特征在于，該檢測超低含量黃曲霉毒素的方法包括以下步驟: 準(zhǔn)備玻碳電極，在玻碳電極上采用化學(xué)法修飾一層單壁碳納米管，利用連接劑共價鍵合； 牛血清蛋白-黃曲霉毒素偶聯(lián)形成抗原AFBl-BSA ； 抗原AFBl-BSA與單壁碳納米管上的活化羧基反應(yīng)連接； 采用夾心法競爭法利用抗原抗體反應(yīng)與同時加入的黃曲霉毒素單體來競爭吸附一抗，獲得二抗； 堿性磷酸酶標(biāo)記二抗； 測定堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗電化學(xué)信號，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到實(shí)測樣品黃曲霉毒素濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測超低含量黃曲霉毒素的方法，其特征在于，利用連接劑共價鍵合的方法為:利用3-二甲基氨基丙基亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺連接劑共價鍵合法。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測超低含量黃曲霉毒素的方法，其特征在于，抗原AFBl-BSA與單壁碳納米管上的活化羧基反應(yīng)連接的方法為: 抗原AFBl-BSA通過蛋白質(zhì)氨基端與單壁碳納米管上的活化羧基反應(yīng)連接。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測超低含量黃曲霉毒素的方法，其特征在于，標(biāo)記二抗的堿性磷酸酶(EC3.1.3.1)可采用:戊二醛交聯(lián)標(biāo)記法。
【文檔編號】G01N33/551GK104181294SQ201310626655
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】李朝睿, 張弦, 邱景富 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)