葉酸-多孔鉑-氧化石墨烯復合納米材料及其檢測腫瘤細胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種葉酸-多孔鉑-氧化石墨烯復合納米材料及其檢測腫瘤細胞，所述是葉酸-多孔鉑-氧化石墨烯復合納米材料以氧化石墨烯為基底，通過酰胺化反應交聯(lián)葉酸分子，原位合成具有多孔結構的鉑納米粒子，制備一種葉酸-多孔鉑-氧化石墨烯復合納米材料。葉酸-多孔鉑-氧化石墨烯復合納米材料可特異識別細胞表面葉酸受體，同時具有模擬過氧化物酶特性，可催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色。利用顯色反應可快速靈敏地檢測腫瘤細胞數(shù)量，最低可檢測至30個MCF-7細胞。也可催化二氨基聯(lián)苯胺在細胞表面產生紅棕色沉淀物，以實現(xiàn)靶向定位檢測。
【專利說明】葉酸-多孔鉑-氧化石墨烯復合納米材料及其檢測腫瘤細胞
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料的制備，及其用于快速靈敏地檢測腫瘤細胞的方法，屬于納米技術和醫(yī)學檢驗領域。
【背景技術】
[0002]盡管醫(yī)學技術不斷進步，癌癥仍是世界上致死率最高的疾病。傳統(tǒng)的對腫瘤的檢測和定位，由于缺乏實現(xiàn)靶向定位的方式，很難達到預期的檢測效果。用于癌癥的早期診斷的新方法的研發(fā)對于成功治療癌癥和增加病人存活率具有關鍵性的作用。
[0003]葉酸是一種小分子維生素，自1986年科學家發(fā)現(xiàn)葉酸是由受體介導的內吞途徑進入細胞以來，人們開始對葉酸作為靶向載體進行深入研究?，F(xiàn)已證實在卵巢癌、子宮內膜癌、間皮組織癌、腎癌、頭頸部腫瘤、肺癌、乳腺癌、結直腸癌等惡性上皮組織來源腫瘤、關節(jié)炎部位有過表達的葉酸受體。因此，將葉酸及其類似物與標記物(如放射性核素、染料等)偶聯(lián)形成示蹤劑，一旦注入人體內，就能與葉酸受體特異性結合，選擇性濃集于葉酸受體表達豐富的組織，即各種腫瘤中。由于葉酸受體在靶組織和非靶組織分布的顯著性差異，葉酸受體介導的顯影劑可獲得靶組織與正常組織高對比度的圖像，故能對病變進行診斷、定位及治療效果評價。與其他靶向分子如單克隆抗體相比，葉酸相對分子質量小、無免疫原性、價廉易得、穩(wěn)定性好、與藥物或載體之間的化學鍵合簡單易行。
[0004]本發(fā)明提供了一種利用酰胺化反應將葉酸分子與氧化石墨烯共價結合，并原位還原負載多孔鉬納米粒子，制備葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料。該復合納米材料具有模擬過氧化物酶活性并能與葉酸受體特異性結合，可用于快速靈敏地檢測腫瘤細胞數(shù)量和進行腫瘤細胞定位。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料及其以氧化石墨烯為基底，通過酰胺化反應交聯(lián)葉酸分子，并原位合成具有多孔結構的鉬納米粒子的制備葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料的方法。該復合納米材料具有模擬過氧化物酶活性并能與葉酸受體特異性結合，可用于快速靈敏地檢測腫瘤細胞數(shù)量和進行腫瘤細胞定位。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案:
本發(fā)明所述的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料，由以下方法制備而成:1)配制氧化石墨烯水溶液0.5 mg/mL，加入聚烯丙基胺鹽酸鹽和氫氧化鉀，混勻后置于70°C水浴加熱24小時，將溶液收集再離心洗滌，去除多余的聚烯丙基胺鹽酸鹽和氫氧化鉀；2)使用1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)為交聯(lián)劑，葉酸上的羧基與聚烯丙基胺鹽酸鹽修飾氧化石墨烯上的氨基通過酰胺化交聯(lián)，在室溫下反應24小時后，將溶液收集再離心洗滌，去除多余的交聯(lián)劑和葉酸，得到的葉酸功能化氧化石墨烯水溶液；3)將所得到的葉酸功能化氧化石墨烯水溶液與7.9 mmol/L的氯鉬酸水溶液以體積比為10:1混合均勻，80°C水浴加熱24小時，得到的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯水
溶液呈黑色，4 °C保存。
[0007]所使用的基底氧化石墨稀的制備方法為:稱取325目鱗片石墨1.2 g，加入到144mL濃度為18 mol/L的濃硫酸和16 mL濃度為15 mol/L的磷酸的混合溶液中；充分攪拌后，置于在0°C冰浴中；將7.2 g高錳酸鉀以少量多次方式緩慢加入到以上混合溶液中；保持(TC冰浴，磁力攪拌3小時后，將所得墨綠混懸液轉移至50°C溫水浴中，控溫12小時，得到的紫黑色混懸液緩慢加入到160 mL冰水混合物中，劇烈攪拌I小時；繼而往溶液中逐滴滴加
4mL質量濃度為30%的過氧化氫溶液，溶液顏色突變?yōu)榱咙S色，所得溶液經(jīng)孔徑為20-30微米的Gl砂芯漏斗過濾，繼而4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液；加入80 mL雙蒸水充分振蕩洗滌，4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀顏色呈土黃色；再加入80 mL質量濃度為30%的鹽酸充分振蕩洗滌，經(jīng)為孔徑20-30微米的Gl砂芯漏斗過濾去除不溶顆粒，濾液4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀顏色繼續(xù)加深；接著多次用無水乙醇將沉淀物洗至PH值為中性，4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀呈棕黃色；最后用乙醚沖洗沉淀，經(jīng)孔徑為1.5-2.5微米的G5砂芯漏斗過濾，獲得濾餅，濾餅在室溫下過夜晾干，得到棕色的氧化石墨；取50 mg棕色的氧化石墨溶解于100 mL雙蒸水，常溫下超聲3小時，充分剝離后得到0.5 mg/mL透明澄清的棕黃色氧化石墨烯水溶液。
[0008]本發(fā)明所述的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料模擬過氧化物酶，催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色，并識別細胞膜表面葉酸受體。
[0009]在3.290 mLpH為5、濃度為20 mmol/L的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液中依次加入0.5 mL濃度為4 mol/L的過氧化氫、0.2 mL濃度為16 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽，再加入10 μ L濃度為0.67 mg/mL的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料水溶液，混合后30 °C溫浴10分鐘，溶液由無色變?yōu)樗{色，在652 nm處有吸收峰，加硫酸終止反應，溶液變?yōu)辄S色，在450nm處有吸收峰。
[0010]葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料與MCF-7 (人乳腺癌細胞)、SGC_7901 (人胃癌細胞)細胞膜上過度表達的葉酸受體特異性識別并結合形成結合體，而不與低表達葉酸受體的正常細胞HUVEC (人臍帶靜脈內皮細胞)結合，所述結合體通過催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽生成藍色產物，該產物在652 nm處有最大吸收峰，區(qū)別腫瘤細胞和正常細胞。
[0011]葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料與經(jīng)過葉酸飽和的MCF-7 (人乳腺癌細胞)極少量結合，3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽無明顯顏色變化。
[0012]將MCF-7配制成不同梯度濃度的細胞懸液，利用葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料與其結合檢測腫瘤細胞數(shù)量，肉眼可見顏色變化，經(jīng)硫酸終止反應后，目視觀察檢測限為125個MCF-7細胞；利用酶標儀測定每個細胞孔在450 nm處的吸光值，吸光度值隨細胞數(shù)量增加而增大，檢測限為30個MCF-7細胞。
[0013]8、根據(jù)權利要求3所述的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料模擬過氧化物酶，其特征是葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料與腫瘤細胞表面過度表達的葉酸受體特異性識別并結合，在過氧化氫存在的情況下，使生色底物二氨基聯(lián)苯胺失去電子形成紅棕色不溶物，定位腫瘤細胞。[0014]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用具體技術方案為:
(一)氧化石墨烯的制備:
稱取325目鱗片石墨，加入到體積比為9:1的濃硫酸和磷酸混合溶液中。充分攪拌后，置于在(TC冰浴中。將高錳酸鉀少量多次，緩慢加入到以上混合溶液中。保持(TC冰浴，磁力攪拌3小時后，將所得墨綠色混懸液轉移至50°C溫水浴中，控溫12小時。得到的紫黑色混懸液緩慢加入到冰水混合物中，劇烈攪拌I小時。繼而往溶液中逐滴滴加30%過氧化氫溶液，至溶液顏色突變?yōu)榱咙S色。所得溶液經(jīng)Gl砂芯漏斗(孔徑20-30微米)過濾，濾液4000轉每分鐘離心30分鐘，分別經(jīng)過水洗一次，酸洗一次，醇洗至中性，最后用乙醚沖洗后經(jīng)G5砂芯漏斗(孔徑1.5-2.5微米)過濾。濾餅在室溫下過夜晾干，得到氧化石墨。氧化石墨溶解于雙蒸水，常溫下超聲3小時，充分剝離后既得氧化石墨烯水溶液。
[0015](二)葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料的制備:
配制0.5 mg/mL氧化石墨烯水溶液，加入一定量的聚烯丙基胺鹽酸鹽和氫氧化鉀，混勻后置于70°C水浴加熱24小時。將溶液收集再超濾離心洗滌，去除多余的聚烯丙基胺鹽酸鹽和氫氧化鉀。使用1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)交聯(lián)劑，葉酸上的羧基與聚烯丙基胺鹽酸鹽修飾氧化石墨烯上的氨基通過酰胺化交聯(lián)。在室溫下反應24小時后，將溶液收集再超濾離心洗滌，去除多余的交聯(lián)劑和葉酸。最后，所得到的葉酸修飾氧化石墨烯水溶液與7.9 mmol/L的氯鉬酸水溶液以體積比10:1混合均勻，80°C水浴加熱24小時。得到的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯水溶液呈黑色，4 V保存，能保持2個月以上的相對穩(wěn)定。以上過程中使用的所有玻璃器皿均經(jīng)過王水浸泡，并用雙蒸水徹底清洗，晾干。
[0016](三)葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料模擬過氧化物酶活性:
通過葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料催化過氧化物酶底物3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽產生藍色底物，驗證和比較其過氧化物酶活性。在磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液中依次加入過氧化氫、3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽和葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料水溶液，混合后溫浴10分鐘，肉眼觀察顏色的變化或測定652 nm波長處的吸光度值。根據(jù)溶液顏色或通過吸光度值標準曲線進行比較過氧化酶活性。
[0017](四)基于葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料比色法檢測腫瘤細胞數(shù)量: 細胞膜表面高表達葉酸受體的癌細胞為實驗組:MCF-7 (人乳腺癌細胞)、SGC-7901 (人
胃癌細胞)。細胞膜表面低表達葉酸受體的癌細胞為陰性對照組:HUVEC(人臍帶靜脈內皮細胞)。待不同數(shù)量的細胞在96孔板內完全貼壁后，每孔各加入5 μ g葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料與細胞孵育1.5小時。之后每個反應孔用磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液輕輕吹打沖洗3次，以去除非未結合的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料。顯色過程:每孔依次加入磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液、過氧化氫和3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽，充分振蕩混勻后，室溫下反應15分鐘。待反應結束，立刻加入2 mol/L濃硫酸終止反應，溶液顏色由藍色變?yōu)辄S色。利用酶標儀測定每個反應孔在450 nm處的吸光值，根據(jù)顏色深淺或吸光值對腫瘤細胞進行定量。
[0018](五)葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料定位腫瘤細胞
將細胞膜表面高表達葉酸受體的MCF-7 (人乳腺癌細胞)在96孔板內完全貼壁后，每孔各加入5 μ g葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料與細胞孵育1.5小時。之后每個反應孔用磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液輕輕吹打沖洗3次，以去除非未結合的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料。定位過程:每孔依次加入二氨基聯(lián)苯胺和過氧化氫。反應十分鐘后，顯微鏡下可見細胞表面出現(xiàn)紅褐色沉淀物，表明葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料與細胞膜上的葉酸受體特異結合，可定位腫瘤細胞。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點:
(I)本發(fā)明提出了葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料的綠色制備方法。
[0020](2)本發(fā)明葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料具有良好的過氧化物酶活性。
[0021](3)本發(fā)明葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料能特異性結合腫瘤細胞表達的葉酸受體，通過顯色反應定位腫瘤細胞。
[0022](4)本發(fā)明葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料模擬過氧化物酶，利用顯色反應快速靈敏地檢測腫瘤細胞數(shù)量，最低可檢測125個癌細胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為氧化石墨烯和葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料水溶液外觀圖，圖中:透明澄清的棕黃色氧化石墨烯水溶液，葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料水溶液顏色是棕黑色。
[0024]圖2為葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系的外觀圖，從左到右顏色變化為:溶液由無色(左)變?yōu)樗{色(中)，在652 nm處有吸收峰，加硫酸終止反應，溶液變?yōu)辄S色(右)。
[0025]圖3為葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯納米復合材料催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系的紫外吸收光譜圖。
[0026]圖4為不同比色條件下的吸收值對比:a)葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯納米復合材料與無細胞的培養(yǎng)基山)葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯納米復合材料與MCF-7 ；c)葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯納米復合材料與SGC-7901 ；d)葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯納米復合材料與HUVEC ;e)葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯納米復合材料與葉酸封閉后的MCF-7 ;f)多孔鉬-氧化石墨烯納米復合材料與MCF-7。
[0027]圖5為葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯納米復合材料與不同數(shù)量MCF-7和HUVEC作用后，硫酸終止后的顏色對比圖，圖中:上方為:每孔依次加入140 μ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(20 mmol/L, pH 5),50 μ L 過氧化氫(4 mol/L)和 10 μ L 3，3，，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(16 mmol/L)，充分振蕩混勻后，室溫下反應15分鐘，溶液呈不同深淺的藍色。圖中:下方為:反應結束，立刻加入50 μ L 2 mol/L濃硫酸終止反應，溶液顏色由藍色變?yōu)辄S色，目視觀察檢測限為125個MCF-7細胞。
[0028]圖5-1為葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯納米復合材料與不同數(shù)量MCF-7和HUVEC作用后，硫酸終止后的顏色對比和吸收值對比圖。
[0029]圖6為葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯納米復合材料與MCF-7作用后，催化二氨基聯(lián)苯胺原位染色的顯微圖。
【具體實施方式】
[0030]實例1: 稱取325目鱗片石墨1.2 g，加入到144 mL濃度為18 mol/L的濃硫酸和16 mL濃度為15 mol/L的磷酸的混合溶液中。充分攪拌后，置于在0°C冰浴中。將7.2 g高錳酸鉀少量多次，緩慢加入到以上混合溶液中。保持(TC冰浴，磁力攪拌3小時后，將所得墨綠色混懸液轉移至50°C溫水浴中，控溫12小時。得到的紫黑色混懸液緩慢加入到160 mL冰水混合物中，劇烈攪拌I小時。繼而往溶液中逐滴滴加4 mL 30% (質量濃度)過氧化氫溶液，溶液顏色突變?yōu)榱咙S色。所得溶液經(jīng)Gl砂芯漏斗(孔徑20-30微米)過濾，濾液4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液；加入80 mL雙蒸水充分振蕩洗滌，4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀顏色呈土黃色；再加入80 mL 30%(質量濃度)鹽酸充分振蕩洗滌，經(jīng)Gl砂芯漏斗(孔徑20-30微米)過濾去除不溶顆粒，濾液4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀顏色繼續(xù)加深；接著多次用無水乙醇將沉淀物洗至PH值為中性，4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀呈棕黃色；最后用乙醚沖洗沉淀，經(jīng)G5砂芯漏斗(孔徑1.5-2.5微米)過濾。濾餅在室溫下過夜晾干，得到棕色的氧化石墨，稱取質量。取50 mg上述棕色的氧化石墨溶解于100 mL雙蒸水，常溫下超聲3小時，充分剝離后既得0.5 mg/mL透明澄清的棕黃色氧化石墨烯水溶液。
[0031]實例2:
160 mg聚烯丙基胺鹽酸鹽和160 mg氫氧化鉀依次加入至80 mL 0.5 mg/mL氧化石墨烯水溶液中，混合物置于70°C水浴中磁力攪拌24小時。將溶液收集再離心，雙蒸水洗滌至中性，去除多余的聚烯丙基胺鹽酸鹽和氫氧化鉀。將得到的產物用雙蒸水補足至80 mL，充分溶解。
[0032]實例3:
40 mg的葉酸先溶于16 mL磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 5，20 mmol/L)，完全溶解后得到的0.0227 mmol/L葉酸溶液，將其與8 mL 1_乙基_3_ (3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺水溶液(0.068 mmol/L)和N-羥基琥珀酰亞胺(0.068 mmol/L)混合水溶液相混合，在室溫下避光放置過夜得以活化。繼而與實例2得到的80 mL聚烯丙基胺鹽酸鹽修飾后的氧化石墨烯水溶液充分混合，在室溫下磁力攪拌24小時。反應結束后將溶液收集再超濾離心，雙蒸水洗滌至中性，去除未結合的葉酸和未反應的交聯(lián)劑。將得到的產物用雙蒸水補足至80 mL,充分溶解，得到葉酸-氧化石墨烯水溶液。
[0033]實例4:
往實例3得到的80 mL葉酸-氧化石墨烯水溶液中加入8 ml 7.9 mmol/L氯鉬酸溶液，混勻后水浴80°C下反應24小時，所得的水溶液為葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料水溶液(見圖1)。冷凍干燥后得到葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料粉末。
[0034]實例5:
在3.290 mL磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 5，20 mmol/L)中依次加入0.5 mL濃度為4 mol/L的過氧化氫、0.2 mL濃度為16 mmol/L的3, 3’，5, 5’ -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽，再加入10 μ L濃度為0.67 mg/mL的實例4制得的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料水溶液，混合后30 °C溫浴10分鐘，溶液由無色變?yōu)樗{色，在652 nm處有吸收峰，加硫酸終止反應，溶液變?yōu)辄S色，在450nm處有吸收峰(見圖2，3)。
[0035]實例6:
空白組使用6% (質量濃度)胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基，不含細胞，培養(yǎng)環(huán)境為恒溫37°C的5% (體積百分數(shù))二氧化碳培養(yǎng)箱。將培養(yǎng)基以每孔200 μ L加入至96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。每個培養(yǎng)基孔依次加入含5 μ g實例4制得的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料水溶液，培養(yǎng)箱中孵育1.5小時。之后每個培養(yǎng)基孔孔用200 μ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(10 mmol/L, pH 7.4)輕輕吹打沖洗3次，以去除未結合的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料。顯色過程，每孔加入140 μ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(20 mmol/L,pH 5)后,再依次加入50 μ L過氧化氫(4 mol/L)和10 μ L 3,3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(16 mmol/L),充分振蕩混勻后，室溫下反應15分鐘，溶液顏色無明顯變化。待反應結束，立刻加入50 μ L 2 mol/L濃硫酸終止反應。利用酶標儀測定每個反應孔在450 nm處的吸光值(見圖4中的a柱)。
[0036]實例7:
MCF-7 (人乳腺癌細胞)的培養(yǎng)基為含6% (質量濃度)胎牛血清的RPM1-1640，培養(yǎng)環(huán)境為恒溫37°C的5% (體積百分數(shù))二氧化碳培養(yǎng)箱。將貼壁的MCF-7用胰酶消化，加培養(yǎng)基吹打混勻，計算細胞數(shù)量。稀釋成10000個/mL的細胞懸液，以每孔200 μ L加入至96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時待完全貼壁。每個MCF-7孔依次加入含5 μ g葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料水溶液，培養(yǎng)箱中孵育1.5小時。之后每個MCF-7孔用200 μ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(10 mmol/L,pH 7.4)輕輕吹打沖洗3次，以去除非未結合的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料。顯色過程:每孔再依次加入140 μ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(20 mmol/L,pH 5),50 μ L 過氧化氫(4 mol/L)和 10 μ L 3,3，，5,5’ -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(16 mmol/L)，充分振蕩混勻后，室溫下反應15分鐘，溶液逐漸呈藍色。待反應結束，立刻加入50 μ L 2 mol/L濃硫酸終止反應，溶液顏色由藍色變?yōu)辄S色。利用酶標儀測定每個反應孔在450 nm處的吸光值(見圖4中的b柱)。
[0037]實例8:
SGC-7901 (人胃癌細胞)的培養(yǎng)基為含6% (質量濃度)胎牛血清的RPM1-1640，培養(yǎng)環(huán)境為恒溫37°C的5% (體積百分數(shù))二氧化碳培養(yǎng)箱。將貼壁的SGC-7901用胰酶消化，加培養(yǎng)基吹打混勻，計算細胞數(shù)量。稀釋成10000個/mL的細胞懸液，以每孔200 μ L加入至96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時待完全貼壁。每個SGC-7901孔依次加入含5 μ g葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料水溶液，培養(yǎng)箱中孵育1.5小時。之后每個SGC-7901孔用200 μ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(10 mmol/L, pH 7.4)輕輕吹打沖洗3次，以去除非未結合的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料。顯色過程，每孔依次加入140 μ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(20 mmol/L,pH 5),50 μ L過氧化氫(4 mol/L)和10 μ L3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(16 mmol/L),充分振蕩混勻后，室溫下反應15分鐘，溶液逐漸呈藍色。待反應結束，立刻加入50 μ L 2 mol/L濃硫酸終止反應,溶液顏色由藍色變?yōu)辄S色。利用酶標儀測定每個反應孔在450 nm處的吸光值(見圖4中的c柱)。
[0038]實例9:
HUVEC (人臍帶靜脈內皮細胞)的培養(yǎng)基為含6% (質量濃度)胎牛血清的RPM1-1640，培養(yǎng)環(huán)境為恒溫37°C的5% (體積百分數(shù))二氧化碳培養(yǎng)箱。將貼壁的HUVEC用胰酶消化，力口培養(yǎng)基吹打混勻，計算細胞數(shù)量。稀釋成10000個/mL的細胞懸液，以每孔200 μ L加入至96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時待完全貼壁。每個HUVEC孔依次加入含5 μ g葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料水溶液，培養(yǎng)箱中孵育1.5小時。之后每個HUVEC孔用200μ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(10 mmol/L, pH 7.4)輕輕吹打沖洗3次，以去除非未結合的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料。顯色過程，每孔依次加入140 μ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(20 mmol/L, pH 5),50 μ L過氧化氫(4 mol/L)和10 μ L 3,3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(16 mmol/L),充分振蕩混勻后，室溫下反應15分鐘，溶液顏色無明顯變化。待反應結束，立刻加入50 μ L 2 mol/L濃硫酸終止反應。利用酶標儀測定每個反應孔在450 nm處的吸光值(見圖4中的d柱)。
[0039]實例10:
將MCF-7配成10000個/mL的細胞懸液，以每孔200 μ L加入至96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時待完全貼壁。每個MCF-7孔先加入含葉酸的水溶液，培養(yǎng)箱中孵育0.5小時，將培養(yǎng)基棄去以去除未結合的葉酸，再加入200 μ L新的1640培養(yǎng)基。依次加入含
5μ g B十酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料水溶液，繼續(xù)培養(yǎng)箱中孵育1.5小時。之后每個MCF-7孔用200 μ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(10 mmol/L, pH 7.4)輕輕吹打沖洗3次，以去除非未結合的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料。顯色過程，每孔依次加入140 μ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(20 mmol/L, pH 5),50 μ L過氧化氫(4mol/L)和10 yL 3，3’，5，5’_四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(16 mmol/L)，充分振蕩混勻后，室溫下反應15分鐘，溶液顏色無明顯變化。待反應結束，立刻加入50 μ L 2 mol/L濃硫酸終止反應。利用酶標儀測定每個反應孔在450 nm處的吸光值(見圖4中的e柱)。
[0040]實例11:
將MCF-7配成10000個/mL的細胞懸液，以每孔200 μ L加入至96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時待完全貼壁。每個MCF-7孔依次加入含5 μ g多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料水溶液，繼續(xù)培養(yǎng)箱中孵育1.5小時。之后每個MCF-7孔用200 μ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(10 mmol/L,pH 7.4)輕輕吹打沖洗3次，以去除非未結合的多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料。顯色過程，每孔依次加入140 μ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(20 mmol/L, pH 5),50 μ L 過氧化氫(4 mol/L)和 10 μ L 3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(16 mmol/L)，充分振蕩混勻后，室溫下反應15分鐘，溶液顏色無明顯變化。待反應結束，立刻加入50 UL 2 mol/L濃硫酸終止反應。利用酶標儀測定每個細胞孔在450 nm處的吸光值(見圖4中的f柱)。
[0041]實例12:
將MCF-7配制成不同梯度濃度的細胞懸液，以每孔200 μ L (細胞個數(shù)125-8000個)加入至96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時待完全貼壁。每個MCF-7孔依次加入含5 μ g葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料水溶液，培養(yǎng)箱中孵育1.5小時。之后每個MCF-7孔用200 μ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(10 mmol/L, pH 7.4)輕輕吹打沖洗3次，以去除非未結合的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料。顯色過程，每孔依次加入140μ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(20 mmol/L, pH 5),50 yL過氧化氫(4 mol/L)和10UL 3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(16 mmol/L)，充分振蕩混勻后，室溫下反應15分鐘，溶液呈不同深淺的藍色。待反應結束，立刻加入50 μ L 2 mol/L濃硫酸終止反應，溶液顏色由藍色變?yōu)辄S色，目視觀察檢測限為125個MCF-7細胞(見圖5)。利用酶標儀測定每個細胞孔在450 nm處的吸光值，吸光度值隨細胞數(shù)量增加而增大，檢測限為30個MCF-7細胞(見圖5-1)。[0042]實例13:
將MCF-7配成10000個/mL的細胞懸液，以每孔200 μ L加入至96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時待完全貼壁。每個MCF-7孔依次加入含5 μ g多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料水溶液，繼續(xù)培養(yǎng)箱中孵育1.5小時。之后每個MCF-7孔用200 μ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(10 mmol/L,pH 7.4)輕輕吹打沖洗3次，以去除非未結合的多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料。顯色過程，每孔依次加入190 μ L二氨基聯(lián)苯胺顯色液(0.5 mg/mL)和10 μ L過氧化氫(4 mmol/L)。反應10分鐘后，顯微鏡下可見細胞表面出現(xiàn)紅褐色沉淀物(見圖6)。
[0043]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改，等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料，由以下方法制備而成:1)配制氧化石墨烯水溶液0.5 mg/mL，加入聚烯丙基胺鹽酸鹽和氫氧化鉀，混勻后置于70°C水浴加熱24小時，將溶液收集再離心洗滌，去除多余的聚烯丙基胺鹽酸鹽和氫氧化鉀；2)使用1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)為交聯(lián)劑，葉酸上的羧基與聚烯丙基胺鹽酸鹽修飾氧化石墨烯上的氨基通過酰胺化交聯(lián)，在室溫下反應24小時后，將溶液收集再離心洗滌，去除多余的交聯(lián)劑和葉酸，得到的葉酸功能化氧化石墨烯水溶液；3)將所得到的葉酸功能化氧化石墨烯水溶液與7.9 mmol/L的氯鉬酸水溶液以體積比為10:1混合均勻，80°C水浴加熱24小時，得到的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯水溶液呈黑色，4 °C保存。
2.根據(jù)權利要求1所述的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料，其特征是所使用的基底氧化石墨烯的制備方法為:稱取325目鱗片石墨1.2 g，加入到144 mL濃度為18mol/L的濃硫酸和16 mL濃度為15 mol/L的磷酸的混合溶液中；充分攪拌后，置于在0°C冰浴中；將7.2 g高錳酸鉀以少量多次方式緩慢加入到以上混合溶液中；保持0°C冰浴，磁力攪拌3小時后，將所得墨綠混懸液轉移至50°C溫水浴中，控溫12小時，得到的紫黑色混懸液緩慢加入到160 mL冰水混合物中，劇烈攪拌I小時；繼而往溶液中逐滴滴加4 mL質量濃度為30%的過氧化氫溶液，溶液顏色突變?yōu)榱咙S色，所得溶液經(jīng)孔徑為20-30微米的Gl砂芯漏斗過濾，繼而4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液；加入80 mL雙蒸水充分振蕩洗滌，4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀顏色呈土黃色；再加入80 mL質量濃度為30%的鹽酸充分振蕩洗滌， 經(jīng)為孔徑20-30微米的Gl砂芯漏斗過濾去除不溶顆粒，濾液4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀顏色繼續(xù)加深；接著多次用無水乙醇將沉淀物洗至pH值為中性，4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀呈棕黃色；最后用乙醚沖洗沉淀，經(jīng)孔徑為1.5-2.5微米的G5砂芯漏斗過濾，獲得濾餅，濾餅在室溫下過夜晾干，得到棕色的氧化石墨；取50 mg棕色的氧化石墨溶解于100 mL雙蒸水，常溫下超聲3小時，充分剝離后得到0.5 mg/mL透明澄清的棕黃色氧化石墨烯水溶液。
3.權利要求1或2所述的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料模擬過氧化物酶，催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色，并識別細胞膜表面葉酸受體。
4.根據(jù)權利要求3所述的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料模擬過氧化物酶，其特征是在3.290 mLpH為5、濃度為20 mmol/L的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液中依次加入0.5 mL濃度為4 mol/L的過氧化氫、0.2 mL濃度為16 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽，再加入10 μ L濃度為0.67 mg/mL的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料水溶液，混合后30 °C溫浴10分鐘，溶液由無色變?yōu)樗{色，在652 nm處有吸收峰，加硫酸終止反應，溶液變?yōu)辄S色，在450nm處有吸收峰。
5.根據(jù)權利要求3所述的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料模擬過氧化物酶，其特征是葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料與MCF-7 (人乳腺癌細胞)、SGC-7901 (人胃癌細胞)細胞膜上過度表達的葉酸受體特異性識別并結合形成結合體，而不與低表達葉酸受體的正常細胞HUVEC (人臍帶靜脈內皮細胞)結合，所述結合體通過催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽生成藍色產物，該產物在652 nm處有最大吸收峰，區(qū)別腫瘤細胞和正常細胞。
6.根據(jù)權利要求3所述的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料模擬過氧化物酶，其特征是葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料與經(jīng)過葉酸飽和的MCF-7 (人乳腺癌細胞)極少量結合，3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽無明顯顏色變化。
7.根據(jù)權利要求3所述的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料模擬過氧化物酶，其特征是將MCF-7配制成不同梯度濃度的細胞懸液，利用葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料與其結合檢測腫瘤細胞數(shù)量，肉眼可見顏色變化，經(jīng)硫酸終止反應后，目視觀察檢測限為125個MCF-7細胞；利用酶標儀測定每個細胞孔在450 nm處的吸光值，吸光度值隨細胞數(shù)量增加而增大，檢測限為30個MCF-7細胞。
8.根據(jù)權利要求3所述的葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料模擬過氧化物酶，其特征是葉酸-多孔鉬-氧化石墨烯復合納米材料與腫瘤細胞表面過度表達的葉酸受體特異性識別并結合，在過氧化氫存在的情況下，使生色底物二氨基聯(lián)苯胺失去電子形成紅棕色不溶物，定位腫瘤細胞。`
【文檔編號】G01N33/558GK103558170SQ201310557873
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權日:2013年11月11日
【發(fā)明者】陳偉, 張靈娜, 鄧豪華, 許雄偉, 李光文 申請人:福建醫(yī)科大學