抗大腸桿菌o157:h7單克隆抗體及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了抗大腸桿菌O157:H7單克隆抗體雜交瘤細胞株，解決了可靠的該菌單克隆抗體不易獲得的問題，經(jīng)多年多次傳代，能穩(wěn)定分泌單克隆抗體，它分泌的單克隆抗體，應用于液相芯片和膠體金法檢測食品中大腸桿菌O157:H7，具有良好的靈敏性、特異性、穩(wěn)定性和可重復性等優(yōu)點。病原在濃度很低的情況下也能被檢出，進一步提高檢測靈敏度和檢出率，嚴防漏檢和誤檢。
【專利說明】抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，確切地說是抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體及應用?！颈尘凹夹g】
[0002]腸出血性大腸桿菌(EnterohaemorrhagicEscherichia coli, EHEC)主要包括0157:H7, 026:H11和0111等幾種血清型，其中0157:H7是典型菌株。0157:H7感染能引起出血性結腸炎(Hemorrhagic colitis, HC)、闌尾炎、食管狹窄和結腸穿孔等嚴重胃腸道并發(fā)癥，在兒童和老年人中還可引起溶血性尿毒綜合征及血栓性血小板減少性紫癲等嚴重并發(fā)癥，重者可引起死亡。0157: H7引起的腸道感染性疾病已成為一個嚴重的全球性公共衛(wèi)生問題，在許多國家導致多起爆發(fā)流行。0157: H7可引起出血性腸炎，約有10%的患者發(fā)展為溶血性尿毒綜合征及血栓性血小板減少性紫癜，死亡率高達30%以上。世界衛(wèi)生組織(WHO)已把EHEC 0157: H7出血性腸炎列為新發(fā)傳染病。EHEC 0157:H7感染已成為全球性的公共衛(wèi)生和食品安全問題，對其進行快速、特異的檢測對于該病的早期診斷及疫情有效控制至關重要。
[0003]目前檢測EHEC 0157: H7常規(guī)采用山梨醇-麥康凱瓊脂(SMAC)培養(yǎng)基，選擇山梨醇發(fā)酵陰性的大腸桿菌，進一步用生化和血清學試驗做鑒定，需要24~48 h。采用PCR方法進行檢測需要較昂貴的儀器，費用高，不易于基層單位推廣。單克隆抗體因具有良好的特異性、穩(wěn)定性和 可重復性等優(yōu)點，但是可靠的EHEC 0157: H7的單克隆抗體雜交瘤不容易制備，目前我國一直靠進口。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是一株抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體雜交瘤及其分泌的抗體和應用。
[0005]抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體雜交瘤細胞株，它的保藏編號為=CGMCCN0.6251 ；
抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體，它是由上述的抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體雜交瘤細胞株分泌的；
一種液相芯片檢測株大腸桿菌0157:H7的試劑盒，它的檢測抗體為上述的抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體；
一種膠體金檢測大腸桿菌0157:H7的試紙條，它的檢測抗體為上述的抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體。
[0006]本發(fā)明提供了抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體雜交瘤細胞株，解決了可靠的該菌單克隆抗體不易獲得的問題，經(jīng)多年多次傳代，能穩(wěn)定分泌單克隆抗體，它分泌的單克隆抗體，應用于液相芯片和膠體金法檢測食品中大腸桿菌0157:H7，具有良好的靈敏性、特異性、穩(wěn)定性和可重復性等優(yōu)點。病原在濃度很低的情況下也能被檢出，進一步提高檢測靈敏度和檢出率，嚴防漏檢和誤檢?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0007]圖1.融合12天后倒直顯微鏡觀察結果；
圖2.大腸桿菌0157:H7單克隆抗體ProtienG柱純化結果；
圖3.單克隆抗體亞型測定結果；
圖4.BCA法測定單抗蛋白含量標準曲線；
圖5.非競爭性酶免疫法測定抗體親和力；
圖6.捕獲抗體最佳工作濃度的確定；
圖7.靈敏度檢測結果；
圖8.特異性檢測結果；
圖9特異性檢測結果；
圖10膠體金試紙條的組裝順序。
[0008]【具體實施方式】:
實施例1大腸桿菌0157:H7抗原菌液的制備和BALB/c小鼠免疫取本研究實_80°C保存的標 準大腸桿菌0157:H7 (ATCC11229)，經(jīng)肉湯培養(yǎng)后，劃線法于LB上培養(yǎng)，常規(guī)方法增菌培養(yǎng)，6000r/min離心10min，收集菌體沉淀，用滅菌生理鹽水重復離洗三次后進行菌落計數(shù)(2.0X 108CFU/mL)，加入終濃度為0.3%的甲醛4°C過夜使菌體滅活。次日將洗脫好的菌液在20KHz、150W的冰浴條件下進行超聲波使菌體細胞破碎，每次破碎10s，間隔10s，總用時20min。采用BCA蛋白測定試劑盒測定菌體蛋白含量，結果為2.636 mg/mL0
[0009]取8周齡雌性BALB/c小鼠進行免疫。首免采用上述滅活菌液(2X 108CFU/mL)與等量弗氏完全佐劑混合后腹腔注射50 μ L，皮下注射50 μ L，以后每隔2周免疫I次，換用弗氏不完全佐劑，劑量同前，共免3次。
[0010]實施例2免疫小鼠血清抗體效價的測定
3免后，小鼠斷尾采血，用常規(guī)間接ELISA方法檢測血清效價。其中，包被抗原是實施例1所制備的大腸桿菌0157:Η7菌液，稀釋度為1:50，小鼠血清濃度為200X稀釋度開始的梯度濃度，酶標二抗為HRP(辣根過氧化物酶)標記的兔抗小鼠IgG (稀釋度為1:15000)。測定結果表明，抗體效價為1:25600。
[0011]實施例3大腸桿菌0157: Η7單克隆抗體的制備 (I)雜交瘤細胞株的建立
①飼養(yǎng)細胞的制備:正常BABL/C小鼠斷頸處死，將8mL HAT培養(yǎng)液注入腹腔，輕輕搖動小鼠身體數(shù)下后抽出培養(yǎng)液，調(diào)整細胞濃度至IO5個/mL，加入96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μ L，置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜備用，此即為飼養(yǎng)細胞。
[0012]②骨髓瘤細胞的培養(yǎng)與細胞懸液的制備:融合前一周復蘇骨髓瘤細胞(SP2/0)，隔I天傳代I次，融合選在傳代后I天進行。融合前取約4瓶(25cm2) SP2/0細胞，用RPM1-1640培養(yǎng)液吹下各瓶細胞，1200r/min離心10min，重復2_3次，使用細胞計數(shù)板計數(shù)。
[0013]③脾細胞懸液的制備:免疫小鼠摘眼球采血，4°C過夜后2500r/min離心10min，取血清于-20°C保存?zhèn)溆?。小鼠處死后，常?guī)方法取脾并用RPM1-1640培養(yǎng)液制備脾細胞懸液，計數(shù)。[0014]④細胞融合:調(diào)整上述制備SP2/0細胞與脾細胞數(shù)量比為1:5。1200r/min離心lOmin，棄上清液。輕彈離心瓶底，使細胞松散。在30s內(nèi)逐滴緩慢加入37°C預熱的PEG
0.8mL，靜置60s。逐滴加入R/MINI1640培養(yǎng)液，稀釋離心瓶內(nèi)PEG濃度，逐漸加快滴加速度，共加入R/MINI1640培養(yǎng)液30mL。融合過程在8min內(nèi)完成。1200r/min離心10min，棄上清液，加入40mL預熱的HAT培養(yǎng)液，靜置15min，滴到前一天制備的飼養(yǎng)細胞板中，每孔IOOyL0置于37°C，5%的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后3-4天，在倒置顯微鏡下觀察融合成功的細胞團出現(xiàn)，計算克隆數(shù)。第3-4天，6-7天用HAT培養(yǎng)液進行半量換液，第9-10天起用HT培養(yǎng)液進行半量換液。
[0015]⑤陽性雜交瘤細胞株的篩選:待融合細胞生長至1/2視野(100倍鏡下)以上時，如圖1所示，可以進行上清效價檢測，方法為常規(guī)間接ELISA法(陰性對照用SP2/0培養(yǎng)上清)。
[0016](2)雜交瘤細胞株亞克隆及擴大培養(yǎng)
①雜交瘤細胞的亞克隆:用HT完全培養(yǎng)液將檢測陽性孔中的融合細胞輕輕吹打至1.5mL EP管中，計數(shù)細胞后取出100個細胞至IOmL HT中。將此細胞懸液滴至前一天制備的飼養(yǎng)細胞板中，每孔100 μ L。放入37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第4天起觀察細胞生長狀況及進行半量換液。第1次換液前紀錄每孔克隆數(shù)，待克隆細胞生長至1/2視野(100倍鏡下)以上時，常規(guī)間接ELISA法檢測上清抗體效價，選取單克隆陽性孔進行再次克隆，直到所有的克隆細胞孔都為陽性。
[0017]②雜交瘤細胞的擴大培養(yǎng):將進行3-4次陽性亞克隆后達到陽性率100%，長滿視野80%以上的孔中細 胞吹起，移至24孔板中，進行傳代和移至6孔板及細胞培養(yǎng)瓶中。
[0018]在眾多雜交瘤中，意外獲得的抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體雜交瘤細胞株；5C3B12F1冊D1，已于2012年06月20日送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市北辰西路I號院3號)保藏，保編號為=CGMCC N0.6251。
[0019](3)單克隆抗體的大量制備(腹水法)
接種雜交瘤細胞前一周將降植烷打入小鼠腹腔，每只0.lmL。用R/MIN1-1640培養(yǎng)液將細胞吹下，1000r/min離心10min，重懸后計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為IO6個/mL，每只鼠腹腔注射0.5mL。觀察小鼠腹腔變化，至腹部明顯明顯膨大，行動不便時，在腹部插入5mL注射器，抽取淡黃色腹水。一般可抽取2-3次。并用SP2/0細胞打入另外的小鼠腹腔制備陰性對照腹水。
[0020](4)腹水的純化與保存
①粗提腹水IgG:腹水3000r/min離心20min,吸棄表層脂肪,上層幾乎透明的液體為未純化腹水。腹水中加入4倍體積的醋酸緩沖液(0.06mol/L,pH4.0)，逐滴加入辛酸(33 μ I/mL腹水)邊加邊攪，加完后水浴震蕩lOmin，全速漩渦震蕩30s，重復3次后4°C靜止2h，6000r/min,離心30min,去沉淀。取上清加入1/10體積的PBS (0.lmol/L),依次加入終濃度為33%、50%的飽和硫酸銨，每次加完后4°C靜置2h或過夜，6000r/min，離心15min。棄上清，將沉淀溶于少量0.01mol/L PBS中。
[0021]②ProtienG柱純化腹水IgG:粗提后的腹水經(jīng)0.22 μ m過濾，使用AKTA蛋白純化系統(tǒng)進行過濾。選用IgG純化柱洗脫得到純化后的小鼠腹水IgG。用PBS對得到的單克隆抗體進行超濾離心(超濾離心管為30KD)，6000r/min，30min，重復4_5次，去除鹽離子及濃縮，收集第二峰流出液，如圖2所示。純化后的單克隆抗體中可加入終濃度0.03%疊氮納，于-20°C保存。
[0022]實施例4單克隆抗體性質的鑒定
(I)單克隆抗體效價的測定
純化濃縮后的0157:H7單克隆抗體采用間接ELISA法測定其效價，方法同實施例2。測得抗體OD值與陰性腹水OD值比較，經(jīng)AKTA純化后的腹水效價為1:512000，如表1所示。
[0023]表1大腸桿菌0157:H7單克隆抗體效價測定(0D450nm)
【權利要求】
1.抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體雜交瘤細胞株，它的保藏編號為=CGMCCN0.6251。
2.抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體，它是由權利要求1所述的抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體雜交瘤細胞株分泌的。
3.一種液相芯片檢測株大腸桿菌0157:H7的試劑盒，它的檢測抗體為權利要求2所述的抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體。
4.一種膠體金檢測大腸桿菌0157:H7的試紙條，它的檢測抗體為權利要求2所述的抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體。
【文檔編號】G01N33/577GK103898065SQ201310555729
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年11月9日 優(yōu)先權日:2013年11月9日
【發(fā)明者】孟日增, 宋戰(zhàn)昀, 蘆春梅, 劉韜, 趙慶松, 王瑋 申請人:中華人民共和國吉林出入境檢驗檢疫局