一種基于磁珠快速檢測pp65的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于磁珠快速檢測PP65的方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測HCMV?PP65抗原，利用與PP65具有特異性的適配子，構(gòu)建磁珠-適配子-抗原-單克隆抗體復(fù)合體，并優(yōu)化相關(guān)試劑體系及建立相應(yīng)操作流程，提高了PP65檢驗效率。針對傳統(tǒng)檢測方法檢測時間長、受臨床應(yīng)用限制、檢測費用高等問題，采用磁珠快速檢測PP65，能在早期預(yù)測HCMV病。本發(fā)明具有流程少、操作簡單、檢測時間短、便于普及等優(yōu)點，可為自動化檢驗提供理論及實踐基礎(chǔ)。
【專利說明】一種基于磁珠快速檢測PP65的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及人巨細胞病毒的檢測方法，尤其涉及一種基于磁珠快速檢測PP65的方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]人巨細胞病毒(hyMan cytomegalovirus, HCMV)屬于皰疫病毒科乙組皰疫亞科，是一種雙螺旋DNA病毒。HCMV呈世界性分布，在人群中廣泛傳播，病毒長期潛伏于宿主細胞，呈隱性感染。當(dāng)妊娠，易造成胎兒宮內(nèi)感染，導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎或胎兒先天畸形；當(dāng)骨髓移植，肝、腎、心臟等器官移植患者免疫功能受損時，潛伏病毒被激活、增值而發(fā)生嚴重感染，將導(dǎo)致患者器官移植失敗甚至死亡。近年來，有研究表明巨細胞病毒感染與一些炎癥性疾病和增殖性疾病有著密切的關(guān)系，包括某些心血管疾病和癌癥?，F(xiàn)今，巨細胞病毒感染已對人類健康造成極大的威脅，故對HCMV感染的早期診斷顯得尤為重要。研究表明，一旦出現(xiàn)HCMV感染的臨床癥狀，抗病毒藥物不能控制該病的病理進程，這意味著抗病毒藥物必須在HCMV感染的臨床癥狀出現(xiàn)前就使用，這就有賴于實驗室的分析。
[0003]在HCMV實驗檢測技術(shù)中，病毒分離是檢測的金標準，但耗時長，結(jié)果受標本保存時間影響大。抗體檢測需在患者感染一定時間后才可以檢出，受患者自身免疫狀態(tài)影響較大，且不能區(qū)分潛伏感染和活動性感染。抗原血癥檢測技術(shù)是一項快速、敏感的診斷技術(shù)，但是傳統(tǒng)檢測方法多以白細胞為病毒抗原檢測載體，限制了其臨床應(yīng)用。而核酸診斷其敏感性與特異性均佳，但檢測費用高且核酸提取方法還有待改進。
[0004]PP65是HCMV病毒復(fù)制的早期蛋白，它出現(xiàn)于病毒感染的早期，在細胞感染后3-4小時即開始出現(xiàn)，是HCMV病毒含量最豐富的蛋白。其功能是將病毒的DNA錨定在受感染細胞的核膜上，在胞漿的高爾基體內(nèi)合成，然后運回核內(nèi)。隨著研究的深入，HCMV-PP65抗原被認為是HCMV感染表達的早期抗原，PP65抗原分析能敏感地在早期預(yù)測HCMV病。HCMV常規(guī)病毒培養(yǎng)(CCC)往往需要4周才能獲陽性結(jié)果，對早期診斷幫助不大。HCMV特異性抗體IgM，在嚴重免疫抑制患者可不出現(xiàn)或延遲出現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種基于磁珠快速檢測PP65的方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種基于磁珠快速檢測PP65的方法，包括以下步驟:
[0007](I)在離心管中加入0.5?IyL的羧基修飾磁珠，MES清洗三次，加入80?100 μ L0.5g/L 的 EDC, 37°C活化 2 ?4 小時;
[0008](2)直接加入2?5 μ M HEX紅色熒光標記的與人巨細胞病毒ΡΡ65抗原具有特異性的適配子，室溫輕輕震蕩孵育4?6小時,磁分離后棄上清，Washing buffer清洗三次；所述適配子為SEQ ID N0.1?SEQ ID N0.6的序列之一；
[0009]
【權(quán)利要求】
1.一種基于磁珠快速檢測PP65的方法，包括以下步驟: (1)在離心管中加入0.5~I μ L的羧基修飾磁珠，MES清洗三次，加入80~100 μ L0.5g/L 的 EDC, 37°C活化 2 ~4 小時; (2)直接加入2~5μ M HEX紅色熒光標記的與人巨細胞病毒ΡΡ65抗原具有特異性的適配子，室溫輕輕震蕩孵育4~6小時,磁分離后棄上清，Washing buffer清洗三次；所述適配子為SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.6的序列之一； (3)用0.1 ~0.3% 的 BSA80 ~120 μ L37°C封閉過夜，Washing buffer 清洗三次； (4)磁分離后棄上清，加入待檢樣品，室溫輕輕震蕩孵育10~14小時； (5)磁分離后棄上清,Washingbuffer清洗三次,加入8~12ng的用Binding buffer配置的FITC綠色熒光標記的PP65單克隆抗體，室溫孵育6~10小時； (6)磁分離后棄上清,Washingbuffer清洗三次,加入30~70 μ L的Binding buffer,熒光顯微鏡下觀察；如果待檢樣品中有PP65抗原，則在顯微鏡下既能看到紅色熒光又能看到綠色熒光；如果待檢樣品中沒有PP65抗原，則在顯微鏡下只能看到紅色熒光，不能看到綠色熒光。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于磁珠快速檢測PP65的方法，其特征在于:步驟(2)中所述適配子SEQ I D N0.1~SEQ ID N0.6的二級構(gòu)象依次分別為:
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基于磁珠快速檢測ΡΡ65的方法，其特征在于:所述的 Binding buffer 為:PBS，5mM MgCl2, 0.05%tween_20，ρΗ7.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基于磁珠快速檢測PP65的方法，其特征在于:所述Washing buffer 為:PBS ，5mM MgCl2, 0.01%tween_20，ρΗ7.5。
【文檔編號】G01N33/68GK103543275SQ201310549511
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】張波, 夏宇, 王永虎 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院