一種誘導細胞線粒體途徑凋亡中篩選聲敏劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種誘導細胞線粒體途徑凋亡中篩選聲敏劑的方法，包括步驟為：（1）對細胞裝載具有聲敏性的藥物或者聲敏性的藥物的前體，待聲敏劑被細胞吸收或者轉化后，給予超聲輻照；（2）檢測聲敏劑與TSPO的結合能力，篩選誘導細胞線粒體途徑凋亡的聲敏劑。本發(fā)明提供了一個篩選聲敏劑的靶點，用來篩選可以誘導細胞線粒體途徑凋亡的聲敏劑，并且為聲敏劑藥物的篩選提供了一種有效的方法，有利于聲敏劑藥物的研究和開發(fā)，有助于推動聲動力治療的理論研究和臨床應用。
【專利說明】一種誘導細胞線粒體途徑凋亡中篩選聲敏劑的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種誘導細胞線粒體途徑凋亡中篩選聲敏劑的方法，具體涉及一種聲動力治療誘導細胞線粒體途徑凋亡中篩選有效的聲敏劑的方法，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]聲動力治療(sonodynamic therapy, SDT)是超聲結合臨床實踐產(chǎn)生的一種新型抗腫瘤方法，它是借助超聲激活癌細胞內富集并長時間滯留的聲敏劑如血卟啉(HP)及其衍生物，殺傷腫瘤細胞的一種治療癌癥和其他增生性疾病的新方法。由于SDT具有不良反應小，且無創(chuàng)的優(yōu)點，一經(jīng)提出立刻受到全世界學者的高度重視。聲動力治療是借助超聲和聲敏劑的協(xié)同作用，誘導靶細胞死亡的方法。聲敏劑的選擇已成為當前SDT領域中最為關鍵的問題，聲敏劑的選擇直接影響聲動力作用的靶點和靶細胞的死亡途徑和細胞死亡后的局部炎癥反應。聲敏劑的研發(fā)直接影響到SDT能否在臨床廣泛推廣和應用。目前已報道的聲敏劑有卟啉及其衍生物、抗癌藥物和非留體類抗炎藥等。
[0003]凋亡是細胞的程序性死亡，與細胞壞死相比，細胞凋亡不會引起炎癥反應。在腫瘤或其他增生、炎癥性疾病中，如果能誘導細胞凋亡則能即達到誘導細胞死亡的目的，又避免了加重局部炎癥的副作用。而在聲動力治療中，損傷細胞的死亡方式與聲敏劑的定位，作用方式有很大的關系。
[0004]已有研究表明線粒體膜上的外周型苯二氮卓受體轉運蛋白(the mitochondrial18 kDa translocator protein, TSP0)處產(chǎn)生活性氧,可以誘導細胞發(fā)生線粒體凋亡。由于空間位置上的接近，線粒體膜轉運蛋白(TSPO)位置產(chǎn)生的活性氧，能夠氧化與其鄰近蛋白，引起細胞色素C釋放，誘導細胞的線粒體途徑凋亡。聲動力治療，作為一種誘導細胞凋亡的有效方法，已經(jīng)在治療腫瘤，動脈粥樣硬化等疾病的研究中取得了良好的研究成果，能夠有效的誘導腫瘤細胞或巨噬細胞的凋亡，在這個過程中，我們希望細胞可以走向線粒體途徑的凋亡。已經(jīng)有研究表明線粒體`途徑的凋亡能夠促進凋亡細胞被有效吞噬。

【發(fā)明內容】

[0005]為達到上述目的，本發(fā)明提供了一種誘導細胞線粒體途徑凋亡中篩選聲敏劑的方法。
[0006]一種聲敏劑在聲動力治療中誘導細胞走向何種途徑的凋亡或死亡，其在細胞中結合的位點是很關鍵的。我們通過檢測聲敏劑與TSPO的結合能力，可以篩選出有可能誘導細胞線粒體途徑凋亡的聲敏劑。
[0007]本發(fā)明的技術方案如下:
[0008]1、首先對細胞裝載具有聲敏性的藥物或者聲敏性的藥物的前體，待聲敏劑被細胞吸收或者轉化后，給予超聲輻照，聲敏劑在超聲能量的激發(fā)下，發(fā)生能級躍遷，產(chǎn)生活性氧；
[0009]2、檢測聲敏劑與TSPO的結合能力，篩選出誘導細胞線粒體途徑凋亡的聲敏劑。[0010]細胞線粒體內的TSPO對作為聲敏劑的原卟啉IX (PpIX)具有較強的親和力，所以，TSPO對PpIX有一定的蓄積作用，這部分聲敏劑在超聲的激發(fā)下產(chǎn)生活性氧引起細胞線粒體內膜上的細胞色素C (cyt C)經(jīng)過線粒體通透性轉化孔(mPTP)釋放到線粒體外，細胞色素C的釋放會引起細胞線粒體途徑的凋亡，如圖1所示?；钚匝跣再|活躍，僅能對與其位置接近的目標發(fā)揮作用，比如鄰近TSPO的心磷脂。
[0011]本發(fā)明的有益效果如下:
[0012]本發(fā)明提供了一個篩選聲敏劑的靶點，用來篩選可以誘導細胞線粒體途徑凋亡的聲敏劑，并且為聲敏劑藥物的篩選提供了一種有效的方法，有利于聲敏劑藥物的研究和開發(fā)，有助于推動聲動力治療的理論研究和臨床應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為聲動力在TSPO產(chǎn)生活性氧誘導細胞色素C釋放圖；
[0014]圖2為PK11195抑制細胞內PpIX熒光圖；
[0015]圖3為PKl 1195抑制SDT后細胞線粒體膜電位降低圖；
[0016]圖4為PK11195抑制SDT誘導的巨噬細胞凋亡圖。
【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替`換均落入本發(fā)明的保護范圍內。
[0018]實施例1誘導細胞線粒體途徑凋亡中篩選聲敏劑的方法
[0019]首先對細胞裝載具有聲敏性的藥物或者聲敏性的藥物的前體藥物之后，進行超聲輻照，產(chǎn)生聲動力作用，觀察各不同處理的實驗分組的不同反應，推斷TSPO及心磷脂氧化在聲動力誘導的細胞線粒體途徑凋亡中所發(fā)揮的作用。
[0020]具體步驟如下:
[0021]細胞采用THP-1細胞系(ATCC)佛波酯誘導72小時后分化為巨噬細胞
[0022]聲敏劑采用5-氨基酮戊酸(ALA)，ALA在體內代謝成具有聲敏性的PpIX發(fā)揮作用。
[0023]以下實例中，ALA的藥物濃度為ImM，PpIX的藥物濃度為20 μ g/ml。
[0024]聲動力治療組在巨噬細胞加入ImM的ALA，37°C，5%C02孵育3小時，給予超聲輻照，超聲參數(shù)為頻率1MHz，能量0.84ff/cm2,占空比10%，輻照時間為5min。用PK11195作為PpIX與TSPO結合的特異性抑制劑，在聲動力作用前12小時將PK11195與細胞共同孵育，PKl1195 的濃度為 50ymol/Lo
[0025]1、TSPO蛋白對PpIX特異親和性的檢測
[0026]實驗分為四組，ALA,組給予ImMALA孵育3小時，PK11195+ALA組，PKl1195孵育12小時后，給予相同濃度(ImM) ALA同樣孵育3小時后，檢測細胞內藥物熒光，比較兩組間PpIX熒光強度。PpIX組，給予20 μ g/ml的PpIX孵育3小時，PK11195+PpIX組為預給予ΡΚ1119512小時后，給予相同濃度(20 μ g/ml)的PpIX3小時后觀察藥物熒光。[0027]在熒光顯微鏡下可以觀察到細胞內的藥物熒光，熒光強度可以反映出細胞內可以發(fā)熒光的聲敏劑的量。如圖2所示，PKl1195作為TSPO的配體，對PpIX結合在TSPO上產(chǎn)生了競爭性結合的抑制作用，使得孵育相同時間后，PK11195組較未加抑制劑組熒光強度明顯下降，ALA組和PpIX組分別下降了 24%(P〈0.05)和28%(P〈0.001)。檢測結果顯示，TSPO對PpIX具有親和性，并且可以被PKl 1195抑制。
[0028]2、與TSPO結合的PpIX在聲動力引起的細胞線粒體膜電位降低中的作用檢測
[0029]確定了 PpIX與TSPO的特異性結合，進一步用TSPO的抑制劑來驗證PpIX-SDT對線粒體膜電位的影響，在其后誘導細胞凋亡中的作用。 [0030]實驗分為3組，分別為對照組，聲動力治療組，Pkll95聲動力治療組。其中對照組不做任何處理；聲動力治療組ImM的ALA，37°C，5%C02孵育3小時，給予超聲輻照，超聲參數(shù)為頻率1MHz，能量0.84ff/cm2,占空比10%，輻照時間為5min ;PK11195聲動力治療組，Pkll95孵育12小時候，給予和聲動力組相同處理。
[0031]聲動力治療3小時后，用線粒體膜電位檢測試劑盒染色，并用流式細胞儀觀察，結果與對照組相比聲動力治療使細胞線粒體膜電位明顯下降，而給予PKl 1195抑制聲敏劑和TSPO結合后，聲動力使線粒體膜電位下降的程度降低約43%，如圖3所示。線粒體膜電位降低是細胞發(fā)生線粒體途徑凋亡的重要早期表現(xiàn)，可見與TSPO結合的PpIX在聲動力引起的細胞線粒體膜電位降低中起重要作用。
[0032]3、與TSPO結合的PpIX在聲動力誘導的細胞凋亡中作用的檢測
[0033]實驗分為3組，分別為對照組，聲動力治療組，Pkll95聲動力治療組。其中對照組不做任何處理；聲動力治療組ImM的ALA，37°C，5%C02孵育3小時，給予超聲輻照，超聲參數(shù)為頻率1MHz，能量0.84ff/cm2,占空比10%，輻照時間為5min ;PK11195聲動力治療組，Pkll95孵育12小時候，給予和聲動力組相同處理。
[0034]聲動力治療3小時后對巨噬細胞進行Annexin V/PI雙染，并用流式細胞儀分析，結果如圖4所示，對照組細胞早期凋亡率為13%，聲動力治療組為39%，而Pkll95組為19%。分析上述結果，聲動力治療能夠誘導細胞凋亡，而這種凋亡能被PK11195抑制，也就是說，部分抑制聲敏劑與TSPO蛋白的結合，可以對聲動力治療引起的凋亡起抑制作用，可見TSPO結合的聲敏劑在聲動力治療誘導細胞凋亡中起重要作用。
【權利要求】
1.一種誘導細胞線粒體途徑凋亡中篩選聲敏劑的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)對細胞裝載具有聲敏性的藥物或者聲敏性的藥物的前體，待聲敏劑被細胞吸收或者轉化后，給予超聲輻照； (2)檢測聲敏劑與TSPO的結合能力，篩選誘導細胞線粒體途徑凋亡的聲敏劑。
2.TSPO在篩 選誘導細胞線粒體途徑凋亡的聲敏劑中的應用。
【文檔編號】G01N33/68GK103550774SQ201310516615
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權日:2013年10月28日
【發(fā)明者】田野, 孫鑫, 郭淑媛, 程佳麗 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學