專利名稱：甘露醇在制備抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甘露醇的新用途，尤其是甘露醇在制備抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，在抗腫瘤研究中，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡是一個(gè)重要的途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡可達(dá)到腫瘤縮小，癌癥消退的目的，如傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物順鉬、美法倫等均能刺激細(xì)胞線粒體凋亡途徑，引發(fā)凋亡。此種方式比采用殺傷腫瘤細(xì)胞的治療方式有明顯的優(yōu)越性，因?yàn)榭鼓[瘤藥物若能大量的誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡，激活其自身的程序性死亡過(guò)程，將會(huì)避免因大量細(xì)胞壞死而釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)引起的各種副作用，減輕化療對(duì)正常細(xì)胞的損傷，延長(zhǎng)患者的生存期。然而，至今尚未篩選出能誘發(fā)腫瘤細(xì)胞大量凋亡的抗腫瘤藥。中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡多為體外實(shí)驗(yàn)研究，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)較少，基本上處于初級(jí)研究階段。研究表明與細(xì)胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基因都參與對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控，其中研究較多的有Bcl-2家族、細(xì) 胞色素C、抑癌基因p53、Ice蛋白酶以及Fas/ΑΡΟ-Ι等。因此，以上述細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因?yàn)榘谢?，尋找在引發(fā)細(xì)胞凋亡作用中具有區(qū)別腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞(即能引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)反應(yīng))能力的藥物是近年來(lái)各國(guó)科學(xué)家努力的方向和抗腫瘤藥物研究的新売點(diǎn)。在傳統(tǒng)的非抗癌藥物中，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)其中有一些具有可引起細(xì)胞凋亡的作用，這可能成為研發(fā)新的抗腫瘤藥物的途徑。然而，已發(fā)現(xiàn)的具有引起細(xì)胞凋亡作用的非抗癌藥物，僅僅在實(shí)驗(yàn)室中得到證實(shí)，且尚不能誘發(fā)大量腫瘤細(xì)胞的凋亡，在臨床上尚未真正用于治療腫瘤。甘露醇(Mannitol)是一種己六醇，傳統(tǒng)醫(yī)藥用作良好的利尿劑，也是降低顱內(nèi)壓、眼內(nèi)壓及治療腎病的藥物。常用制劑甘露醇注射液作為高滲透降壓藥，是臨床搶救特別是腦部疾患搶救常用的一種藥物，具有降低顱內(nèi)壓藥物所要求的降壓快、療效準(zhǔn)確的特點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)甘露醇是否具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡作用的報(bào)道，也沒(méi)有將甘露醇用于抗腫瘤治療的臨床應(yīng)用先例。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種甘露醇在制備抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用，特別是使用特定濃度的甘露醇注射液治療乳腺癌。為解決上述技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明采用如下技術(shù)方案甘露醇在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。上述腫瘤是肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、胃腺癌。肺癌是肺鱗癌、肺腺癌。上述抗腫瘤藥物為甘露醇注射液。上述甘露醇注射液的質(zhì)量濃度為10% 19%。上述甘露醇注射液的質(zhì)量濃度為13% 17%。
發(fā)明人通過(guò)科學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘露醇具有抗腫瘤活性，尤其是特定濃度的甘露醇注射液具有明顯引起細(xì)胞凋亡的作用。通過(guò)采用多項(xiàng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)及檢測(cè)凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax，證實(shí)特定濃度甘露醇可誘導(dǎo)人多種癌細(xì)胞株明顯癌細(xì)胞凋亡，并掌握了其與濃度、時(shí)間的效應(yīng)關(guān)系，初步闡明其可能機(jī)理，而且，發(fā)明人已將研究結(jié)果用于腫瘤病人治療并取得明顯的療效，這些為甘露醇在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用及其臨床推廣提供了理論依據(jù)和實(shí)際病例。同時(shí)，本發(fā)明為科學(xué)廉價(jià)地尋找高效低毒的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物開(kāi)辟了新的思路，極具科研意義。


圖1是48小時(shí)MTT濃度-抑制率曲線圖。圖2 是 7 天 MTT 時(shí)間-抑制率曲線圖，圖中120ug/ul，240ug/ul，360ug/ul，480ug/ul,5 lOOug/ul,6 120ug/ul。圖3是7天MTT濃度-抑制率曲線圖，圖中1 一天，2 二天，3三天，4四天，5五天，6六天,7七天。圖4是7天化學(xué)發(fā)光時(shí)間-抑制率曲線圖。圖5是對(duì)照組透射電鏡圖。圖6是對(duì)照組透射電鏡圖。圖7是24小時(shí)組透射電鏡圖。圖8是24小時(shí)組透射電鏡圖。圖9是48小時(shí)組透射電鏡圖。圖10是48小時(shí)組透射電鏡圖。圖11是H1299細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果對(duì)照I組圖。圖12是H1299細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果對(duì)照2組圖。圖13是H1299細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果對(duì)照3組圖。圖14是H1299細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果0%組圖。圖15是H1299細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果5%組圖。圖16是H1299細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果9%組圖。圖17是H1299細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果13%組圖。圖18是H1299細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果17%組圖。圖19是H1299細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果20%組圖。圖20是早期+晚期凋亡細(xì)胞與劑量關(guān)系圖。圖21是晚期凋亡和壞死細(xì)胞與劑量關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1甘露醇抗腫瘤的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究(肺癌)1實(shí)驗(yàn)材料1.1 材料1.1.1細(xì)胞株SPC-A-1人肺癌細(xì)胞系引自上海腫瘤研究所。1.1. 2試劑=RPMI 1640、胰蛋白酶購(gòu)自Gibcol BRL公司；新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；碳酸氫鈉(分析純)為河北磁州制藥廠生產(chǎn)；青霉素鈉和硫酸鏈霉素為哈藥集團(tuán)制藥總廠生產(chǎn)；噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司產(chǎn)品；ATP試劑盒(ATP提取液、熒光素-熒光酶、稀釋液等)為德國(guó)DCS公司產(chǎn)品；檸檬酸鈉為廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；碘化丙啶(PI)、RnaseA為Sigma公司產(chǎn)品；甘露醇注射液購(gòu)自廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司。1. 1.3器材C02培養(yǎng)箱(日本HERAEUS);倒置顯微鏡(日本NIKON);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(芬蘭DENLEY DRAGON MK-2型)；自發(fā)光板式分析儀(德國(guó)BETH0LD);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BECKMAN);透射電鏡。2實(shí)驗(yàn)方法及觀察指標(biāo)2.1細(xì)胞培養(yǎng)5%C02培養(yǎng)箱，用含10%新生牛血清，青霉素、鏈霉素各IX 105U/L及NaHCO3調(diào)PH值至7. 2-7. 4的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2. 2采用MTT法測(cè)定細(xì)胞抑制率將濃度為2X 104/ml的細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔體積100 μ L。細(xì)胞貼壁后，分別加入1-150 μ g/μ I濃度的甘露醇，對(duì)照組不加藥，只加相應(yīng)體積的培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)復(fù)孔，37°C、5%C02條件下培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入20 μ I ΜΤΤ，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，加入100 μ I DMS0，振蕩混勻，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀比色，492nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度A值，計(jì)算平均值，并按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照組A-實(shí)驗(yàn)組A)/對(duì)照組A X 100% ;同方法取20、40、60、80、100、120 μ g/μ I濃度的甘露醇，對(duì)照組不加藥，只加相應(yīng)體積的培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)7天，計(jì)算出每天不同濃度的抑制率。2. 3采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定細(xì)胞抑制率將濃度為2 X 104/ml的細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔體積100 μ I。細(xì)胞貼壁后，加入48小時(shí)MTT結(jié)果中半數(shù)抑制濃度(IC50)的甘露醇，對(duì)照組不加藥，只加相應(yīng)體積的培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)復(fù)孔，37°C、5%C02條件下培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7天，每孔加入5(^1八了？提取液，充分混勻，每孔吸出100 μ I混合液加入另一個(gè)96孔板相應(yīng)的孔中，新板的每孔中加入20 μ I熒光素-熒光酶，振蕩混勻，用自發(fā)光板式分析儀檢測(cè)每孔的值，然后計(jì)算平均值，并按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(％)=(對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組)/ (對(duì)照組-空白組)X 100%。2. 4流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期2. 4.1PI染液的配制高精度天平上精確稱取PI 5mg、RnaseA 10mg、枸櫞酸鈉
O.lg，溶解于IOOml滅菌生理鹽水中。精確吸取NP-40 O. 3ml加入上液中，搖勻，4°C下避光保存。2. 4. 2流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期方法收集培養(yǎng)細(xì)胞，于PBS中洗兩次，然后按(1-2) XlOfVml加入70%冰乙醇并混勻，于4°C下固定過(guò)夜。檢測(cè)時(shí)標(biāo)本以1000r/min離5min, 3mlPBS重懸5min,以300目篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液以除去粘連成團(tuán)的細(xì)胞群，再于1000r/min下離心5min,棄去上清液,加入PI染液Iml/管，4°C下避光30min。取48小時(shí)MTT結(jié)果中的半數(shù)抑制濃度(IC50),分為24、48小時(shí)兩組和對(duì)照組，共三組，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析，收集數(shù)據(jù)，在MultiCycle分析軟件進(jìn)行細(xì)胞周期的分析，分別計(jì)算G1' S、G2/M期的相對(duì)比例。2. 5透射電鏡檢測(cè)收集培養(yǎng)細(xì)胞，少量PBS混懸后移入塑料錐形離心管中，在1000-1500r/min離心5_10min，棄去上清液，加入新生牛血清1_2滴，然后用吸管吹散離心物使其混合，離心3-5min后，盡量吸棄上層多余的新生牛血清；沿管壁緩慢加入戊二醛固定液，4°C下預(yù)固定30min，用細(xì)針沿管壁在標(biāo)本周圍輕輕劃一圈，使固定液充分滲入底部，并繼續(xù)固定至少2小時(shí)，取48小時(shí)MTT結(jié)果中的半數(shù)抑制濃度(IC5tl),分為24、48小時(shí)兩組和對(duì)照組，共三組，按常規(guī)電鏡包埋步驟處理。2. 6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS10. O軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用X 2檢驗(yàn)。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1采用MTT法測(cè)定細(xì)胞抑制率結(jié)果顯示48小時(shí)內(nèi)，在1-150 μ g/μ I濃度范圍時(shí)甘露醇可抑制肺癌細(xì)胞的增殖活性，其抑制作用隨濃度的增高而增強(qiáng)，7天內(nèi)，隨著濃度和時(shí)間的增長(zhǎng)，抑制率也不斷增加。見(jiàn)圖1、2、3。3. 2采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定細(xì)胞抑制率結(jié)果顯示取48小時(shí)MTT結(jié)果中的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)時(shí)，作用7天，甘露醇可抑制肺癌細(xì)胞的增殖活性，并且抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，見(jiàn)圖4。3. 3流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期結(jié)果顯示取48小時(shí)MTT結(jié)果中的半數(shù)抑制濃度(IC50)時(shí)，作用24、48、72小時(shí)組細(xì)胞周期停止在G2+M期的較對(duì)照組明顯增多，見(jiàn)表I。表I甘露醇不同處理時(shí)間對(duì)細(xì)胞周期的影響
權(quán)利要求
1.甘露醇在制備抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為甘露醇注射液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述甘露醇注射液的質(zhì)量濃度為10% 19%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述甘露醇注射液的質(zhì)量濃度為13% 17%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了甘露醇在制備抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用，特別是使用特定濃度(10%～19%)的甘露醇注射液治療乳腺癌。傳統(tǒng)上甘露醇僅作為利尿劑、高滲透降壓藥等，發(fā)明人通過(guò)科學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘露醇具有抗腫瘤活性，通過(guò)采用多項(xiàng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)及檢測(cè)凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax，證實(shí)特定濃度甘露醇可誘導(dǎo)人多種癌細(xì)胞株明顯癌細(xì)胞凋亡，并掌握了與濃度、時(shí)間的效應(yīng)關(guān)系，初步闡明其可能機(jī)理，而且，發(fā)明人已將研究結(jié)果用于腫瘤病人治療并取得明顯的療效，這些為甘露醇在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用及其臨床推廣提供了理論依據(jù)和實(shí)際病例。
文檔編號(hào)A61K9/08GK103006626SQ20121059066
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月18日
發(fā)明者黃鼎銘, 劉德森, 黎樂(lè)群, 黃亞銘, 張力圖, 曹驥, 黃其春, 吳軍, 岳惠芬, 李黃羿, 潘琪, 黎斌, 楊立, 黃亞芬, 茅乃權(quán), 左傳田, 謝彤, 潘泓, 黃耀元, 歐超, 梁新強(qiáng), 崔英 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所