定量檢測食品及中藥中亞胺硫磷含量的試劑盒及應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種定量檢測食品及中藥中亞胺硫磷含量的試劑盒：所述的試劑盒由試劑組和包被板組成，所述的試劑組包括：濃縮PBS緩沖液、底物A、底物B、濃縮洗滌液、終止液、亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液、酶標(biāo)記的亞胺硫磷抗原溶液、亞胺硫磷半抗原與辣根過氧化物酶的偶聯(lián)物，還公開了這種試劑盒的使用方法，本試劑盒具有檢測速度快，檢測準(zhǔn)確的特點(diǎn)。
【專利說明】定量檢測食品及中藥中亞胺硫磷含量的試劑盒及應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)分析【技術(shù)領(lǐng)域】的一種定量檢測農(nóng)藥亞胺硫磷含量的試劑盒及其檢測方法，涉及到有機(jī)化學(xué)合成、免疫化學(xué)、生物化學(xué)等技術(shù)，尤其適用于食品和中藥中亞胺硫磷殘留的快速檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]亞胺硫磷屬中等毒性廣譜有機(jī)磷殺蟲劑，適用于果樹、蔬菜、水稻、棉花等多種作物上的病蟲害的防治。但是亞胺硫磷的廣泛使用，已對食品、水果、水源和土壤造成了污染，對人類的健康存在著潛在的威脅，其對作物有一定的滲透力且殘效期較長。通過抑制體內(nèi)膽堿酯酶(ACh)活性，引起體內(nèi)生理效應(yīng)部位ACh大量蓄積，使膽堿能神經(jīng)持續(xù)過度興奮，表現(xiàn)毒蕈堿樣、煙堿樣和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等中毒癥狀和體征。嚴(yán)重者，常死于呼吸衰竭。所以世界各國均制定了亞胺硫磷的使用限量。美國國家環(huán)境保護(hù)局已經(jīng)禁止其在3種作物上的使用并限定其在9種作物上的使用次數(shù)。目前針對亞胺硫磷的檢測方法，主要是傳統(tǒng)的儀器檢測方法:高效液相色譜法、氣相色譜、質(zhì)譜等儀器分析方法。儀器檢測雖然可靠有效，但是儀器昂貴，對技術(shù)人員要求高，并且需要煩瑣的前處理技術(shù)，從而造成分析時間加長，同時檢測樣品量有限。
[0003]小分子化合物免疫分析技術(shù)為復(fù)雜樣本中痕量農(nóng)藥殘留的快速分析開辟了新的道路，已成為現(xiàn)今國際上農(nóng)藥殘留分析很活躍的研究領(lǐng)域之一，尤其酶聯(lián)免疫分析(ELISA)應(yīng)用方面取得較大進(jìn)展。酶聯(lián)免疫法克服了儀器檢測的缺點(diǎn)，方法簡便快捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高，樣品容量大，分析成本低廉。
[0004]酶聯(lián)免疫法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)是將農(nóng)藥小分子作為半抗原，通過一定途徑與生物大分子(如蛋白質(zhì)等)載體以共價鍵相偶聯(lián)制備人工抗原，用制備的人工抗原免疫動物，連接在載體上的農(nóng)藥分子便成為抗原決定簇，被免疫動物產(chǎn)生對該農(nóng)藥分子具有特異性的抗體，在此抗體上連接上標(biāo)記物(酶、熒光物質(zhì)、放射性同位素等)，利用抗原抗體特異性反應(yīng)和抗體上標(biāo)記物的放大作用，對樣本中微量農(nóng)藥殘留物進(jìn)行定性、定量檢測。
[0005]專利申請200810153759.8中提到了一種抗農(nóng)藥亞胺硫磷的特異性抗體,公開了這種亞胺硫磷半抗原，酶標(biāo)抗原，人工抗原，抗體的制備和應(yīng)用于亞胺硫磷的快速檢測，但是并沒有公開具體的檢測方法。
[0006]食品和中藥中農(nóng)藥亞胺硫磷的含量比較低，檢測要求要靈敏度高，檢測準(zhǔn)確，目前還缺少一種可以直接應(yīng)用的食品中，中藥中農(nóng)藥亞胺硫磷的快速檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的就是要克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一個可以定量檢測食品以及中藥中的亞胺硫磷含量的試劑盒及檢測方法。該檢測方法的靈敏度可達(dá)yg/kg級別。
[0008]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:[0009]一種定量檢測食品及中藥中亞胺硫磷含量的試劑盒由試劑組和包被板及托架組成，所述的試劑組包括:
[0010](I)濃縮PBS緩沖液:40mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，使用時用雙蒸水5倍稀釋；
[0011](2)底物A:含過氧化氫脲的乙酸鈉緩沖溶液；
[0012](3)底物B:3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺的二甲基亞砜溶液；
[0013](4)濃縮洗滌液:含1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液，使用時用雙蒸水5倍稀釋；
[0014](5)終止液:1.25M的硫酸；
[0015](6 )亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液:其亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液母液為lmg/mL，使用時用PBS緩沖溶液稀釋到100 μ g/mL后，再按1:4稀釋6個梯度；25，25/4
[0016](7)酶標(biāo)記的亞胺硫磷抗原溶液:亞胺硫磷半抗原與辣根過氧化物酶的偶聯(lián)物，使用時用PBS緩沖液稀釋10萬倍；
[0017]所述酶標(biāo)記亞胺硫磷抗原是按下述方法制備的:
[0018]①N-鄰苯二甲酰亞胺基-6-氨基己酸的合成:
[0019]稱取131mg的氨基己酸，106mg的無水Na2C03于3mL蒸懼水中，加入225mg N-鄰苯二甲酰亞胺基甲酯，室溫攪拌至完全溶解，約I小時反應(yīng)終止；過濾，濾液酸沉至沉淀完全，乙酸乙酯提取，無水Na2S04干燥，得到亞胺硫磷半抗原；
[0020]②亞胺硫磷活化酯的合成:
[0021]稱取463mg亞胺硫磷半抗原,254mg N-輕基琥拍酰亞胺溶于無水四氫呋喃中，N2保護(hù)下，滴加溶有454mgDCC的無水四氫呋喃溶液，攪拌過夜，過濾除去白色沉淀，旋除有機(jī)溶劑，經(jīng)硅膠柱純化得到白色固體的亞胺硫磷活化酯；
[0022]③酶標(biāo)記亞胺硫磷抗原合成
[0023]精確稱取0.0Olg亞胺硫磷活化酯，活化酯溶解于200 μ L N，N—二甲基甲酰胺中，IOmg HRP溶于2mL pH值為9.3的K2HP04溶液中，冰浴下，亞胺硫磷活化酯13倍過量緩慢逐滴加入酶溶液中，邊滴邊搖勻，4°C旋轉(zhuǎn)放置過夜，將反應(yīng)液裝入透析袋，于4°C條件下PBS透析三天，透析液冷凍干燥得到白色粉末，貯于-20°C下備用；
[0024]所述的包被板為96孔或48孔酶標(biāo)板，是由多克隆亞胺硫磷抗體包被于酶標(biāo)板上，多克隆亞胺硫磷抗體用pH為9.6的Na2C03——NaHC03包被緩沖溶液稀釋到I μ g/100 μ L，然后以每孔100 μ L包被于酶標(biāo)板中，4°C過夜或者37°C恒溫溫育3小時，棄去包被溶液后用洗滌液洗板三次，加入200 μ L凍干液封閉I小時，洗滌液洗板四次凍干后真空包裝，于4°C保存，凍干液為含BSA的Tris-HCl緩沖溶液。
[0025]進(jìn)一步，所述的多克隆亞胺硫磷抗體經(jīng)5次免疫制備，制備方法是:
[0026]免疫:免疫動物采用雄性新西蘭大耳白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，共進(jìn)行5次免疫，加強(qiáng)免疫分別在初次免疫后第2周，第4周和第6周進(jìn)行三次，隔一個月進(jìn)行第五次，從第3次免疫后開始采血測效價，采血時間為免疫后第10天；
[0027]初次免疫:取Img人工抗原溶于0.9%的NaCL和弗式完全佐劑等體積配制的溶液中，進(jìn)行動物免疫；
[0028]加強(qiáng)免疫:取0.5mg人工抗原溶于0.9%的NaCL和弗式不完全佐劑等體積配制的溶液中，進(jìn)行動物免疫；
[0029]抗體純化:定時檢測動物抗體效價，當(dāng)抗體對包被抗原達(dá)到適宜效價時，采集血液，并離心獲得抗血清，使用Sepharose4B-Protein A親和層析柱對抗血清進(jìn)行純化,制備抗體；
[0030]所述人工抗原用半抗原N-鄰苯二甲酰亞胺基甲酯與6-氨基己酸，以酰胺基CONH為橋梁，通過活性酯法，分別連接到卵清蛋白(ovalbumin, OVA)或血藍(lán)蛋白(keyholelimpet hemocyanin, KLH)上,合成人工抗原；具體做法是:
[0031 ] 取上述亞胺硫磷活化酯溶于DMF配成溶液A，KLH或OVA溶于磷酸緩沖溶液中配成溶液B，活化酯和蛋白的摩爾比13:1~40:1然后在冰浴下將溶液A緩慢的加入溶液B中，經(jīng)攪拌后在4°C下反應(yīng)過夜，最后將反應(yīng)液置入透析袋中，在4°C，pH=7.4的PBS溶液中透析三天，精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的體積，測定濃度和結(jié)合比，分裝，_20°C下貯藏。
[0032]本發(fā)明還公開了試劑盒的使用方法，包括如下步驟:
[0033](I)室溫下樣品的前處理，分別包括食品的前處理和中藥的前處理；
[0034](2)檢測前，將試劑盒打開，所有試劑和標(biāo)本都必須在室溫下平衡1-2小時；
[0035](3)酶標(biāo)抗原用PBS緩沖溶液稀釋10萬倍，在包被板上對亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測樣品進(jìn)行雙孔平行加樣，50 μ L/孔，同時加入稀釋后的酶標(biāo)抗原，50 μ L/孔，空白加100 μ L PBS，搖床上混勻I分鐘，37°C溫育I小時；
[0036](4)洗板4次后，每孔 中加入體積比為14.6:0.45的底物顯色液A液和B液混合液，37 °C顯色20分鐘；
[0037](5)加終止液，混勻，在雙波長方式450_650nm下用酶標(biāo)儀讀取OD值。
[0038]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
[0039]1.本發(fā)明具有高特異性、靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡單、廉價，適用范圍廣。可適用于大多數(shù)谷物、蔬菜、水果以及中藥的檢測，特別是對于成分復(fù)雜的中藥，前處理簡單，重復(fù)性好。并且抗體靈敏度高，制備的抗體和酶標(biāo)抗原穩(wěn)定，具有保藏時間長的優(yōu)點(diǎn)。
[0040]2.本發(fā)明提供的快速檢測方法簡便、高效，完成全部檢測工作只需1.5-2小時，而且精確度能達(dá)到90%以上，適合目前現(xiàn)場快速檢測的要求。由于抗體和酶標(biāo)的穩(wěn)定性好，為大規(guī)模樣品的集中檢測提供了極大的方便。
[0041]3.本發(fā)明成本低、檢測效率高、可信度好、操作簡便，具有極大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益，是一種新型的具有良好應(yīng)用前景的食品及中藥中亞胺硫磷殘留檢測的試劑盒。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1為本發(fā)明亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0043]實(shí)施例1
[0044]①N-鄰苯二甲酰亞胺基-6-氨基己酸的合成:
[0045]
【權(quán)利要求】
1.定量檢測食品及中藥中亞胺硫磷含量的試劑盒，其特征在于:所述的試劑盒由試劑組和包被板組成，所述的試劑組包括: (1)濃縮PBS緩沖液:40mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，使用時用雙蒸水5倍稀釋； (2)底物A:含過氧化氫脲的乙酸鈉緩沖溶液； (3)底物B:3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺的二甲基亞砜溶液； (4)濃縮洗滌液:含1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液，使用時用雙蒸水5倍稀釋； (5)終止液:1.25M的硫酸； (6)亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液:其亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液母液為lmg/mL，使用時用PBS緩沖溶液稀釋到100yg/mL后，再按1:4稀釋6個梯度； (7)酶標(biāo)記的亞胺硫磷抗原溶液:亞胺硫磷半抗原與辣根過氧化物酶的偶聯(lián)物，使用時用PBS緩沖液稀釋10萬倍； 所述酶標(biāo)記亞胺硫磷抗原是按下述方法制備的: ①N-鄰苯二甲酰亞胺基-6-氨基己酸的合成:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測食品及中藥中亞胺硫磷含量的試劑盒，其特征在于所述的多克隆亞胺硫磷抗體經(jīng)5次免疫制備，制備方法是: 免疫:免疫動物采用雄性新西蘭大耳白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，共進(jìn)行5次免疫，加強(qiáng)免疫分別在初次免疫后第2周，第4周和第6周進(jìn)行三次，隔一個月進(jìn)行第五次，從第3次免疫后開始采血測效價，采血時間為免疫后第10天； 初次免疫:取Img人工抗原溶于0.9%的NaCL和弗式完全佐劑等體積配制的溶液中，進(jìn)行動物免疫； 加強(qiáng)免疫:取0.5mg人工抗原溶于0.9%的NaCL和弗式不完全佐劑等體積配制的溶液中，進(jìn)行動物免疫； 抗體純化:定時檢測動物抗體效價，當(dāng)抗體對包被抗原達(dá)到適宜效價時，采集血液，并離心獲得抗血清，使用Sepharose4B-Protein A親和層析柱對抗血清進(jìn)行純化,制備抗體； 所述人工抗原用半抗原N-鄰苯二甲酰亞胺基甲酯與6-氨基己酸，以酰胺基CONH為橋梁，通過活性酯法，分別連接到卵清蛋白或血藍(lán)蛋白上，合成人工抗原；具體做法是: 取上述亞胺硫磷活化酯溶于DMF配成溶液A，KLH或OVA溶于磷酸緩沖溶液中配成溶液B，活化酯和蛋白的摩爾比13:1~40:1然后在冰浴下將溶液A緩慢的加入溶液B中，經(jīng)攪拌后在4°C下反應(yīng)過夜，最后將反應(yīng)液置入透析袋中，在4°C，pH=7.4的PBS溶液中透析三天，精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的體積，測定濃度和結(jié)合比，分裝，_20°C下貯藏。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測食品及中藥中亞胺硫磷含量的試劑盒，其特征在于:凍干液為含BSA的Tris-HCl緩沖溶液。
4.一種權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述的試劑盒的使用方法，包括如下步驟: (1)室溫下樣品的前處理，分別包括食品的前處理和中藥的前處理； (2)檢測前，將試劑盒打開，所有試劑和標(biāo)本都必須在室溫下平衡1-2小時； (3)酶標(biāo)抗原用PBS緩沖溶液稀釋10萬倍，在包被板上對亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測樣品進(jìn)行雙孔平行加樣，50 μ L/孔，同時加入稀釋后的酶標(biāo)抗原，50 μ L/孔，空白加100 μ LPBS,搖床上混勻I分鐘，37°C溫育I小時； (4)洗板4次后，每孔中加入的底物A液和底物B液混合液，混合的體積比為.14.6:0.45，37。。顯色 20 分鐘； (5)加終止液，混勻，在雙波長方式450-650nm下用酶標(biāo)儀讀取OD值。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟(4)中的底物顯色液A液和B液分別為含過氧化氫脲的乙酸鈉緩沖溶液和3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺的二甲基亞砜溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟(5)中的終止液為.1.25M的硫酸。
【文檔編號】G01N33/543GK103558373SQ201310499518
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】溫雷 申請人:天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司