一種癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于試劑盒【技術(shù)領(lǐng)域】。所述癌胚抗原磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒，包括癌胚抗原校準(zhǔn)品、抗癌胚抗原抗體包被的磁珠、酶標(biāo)記的單克隆抗體、酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物以及濃縮洗滌液。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒利用磁分離以及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法的優(yōu)勢(shì)，使檢測(cè)過程簡(jiǎn)單、易于操作、便于自動(dòng)化；同時(shí)本發(fā)明檢測(cè)試劑盒還具有靈敏度高、特異性好、檢測(cè)限低以及穩(wěn)定性好等特性，能滿足各種癌癥臨床輔助診斷或檢測(cè)的需要。
【專利說明】一種癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于試劑盒【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種癌胚抗原磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]癌胚抗原(CEA)是在1965年由Gold和Freedman首先從胎兒及結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)的，是一種分子量為22ku的多糖蛋白復(fù)合物，45%為蛋白質(zhì)。一般情況下，CEA是由胎兒胃腸道上皮組織、胰和肝細(xì)胞所合成，通常在妊娠6個(gè)月內(nèi)CEA含量增高，出生后血清中含量已經(jīng)很低下，健康成年人血清中CEA濃度小于5μ IU/mL。
[0003]CEA屬于非器官特異性腫瘤相關(guān)抗原，分泌CEA的腫瘤大多位于空腔臟器，如胃腸道、呼吸道、泌尿道等。正常情況下，CEA經(jīng)胃腸道代謝，而腫瘤狀態(tài)時(shí)的CEA則進(jìn)入血和淋巴循環(huán)，引起血清CEA異常增高，使上述各種腫瘤患者的血清CEA均有增高。
[0004]癌胚抗原(CEA)廣泛存在于內(nèi)胚葉起源的消化系統(tǒng)癌癥中，如:胃癌、肝癌、胰腺癌以及大腸癌等癌癥中，同時(shí)在小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等癌癥中也有明確的升高，因此，檢測(cè)血清中CEA含量對(duì)各種癌癥的輔助診斷具有明確的意義。
[0005]目前樣本中癌胚抗原的檢測(cè)方法主要包括:酶聯(lián)免疫法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、時(shí)間分辨免疫熒光法、膠體金免疫層析法以及化學(xué)發(fā)光法等多種方法。這些方法的檢測(cè)試劑盒都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)如:酶聯(lián)免疫法檢測(cè)限低，線性范圍較寬，但該檢測(cè)試劑盒操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，自動(dòng)化程度低，受人為因素影響較大；放射免疫法也有檢測(cè)限低的優(yōu)勢(shì)，但是由于其檢測(cè)過程中需要用到放射性標(biāo)記物，對(duì)操作人員的身體健康存在不良影響，同時(shí)對(duì)環(huán)境也有一定程度的污染，該檢測(cè)方法目前已經(jīng)逐步被其他的技術(shù)所替代；膠體金免疫層析法具有檢測(cè)迅速，操作方便等優(yōu)勢(shì)，利于病人自行對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，適用于居家檢測(cè)，但該檢測(cè)方法不能定量檢測(cè)，判讀結(jié)果有一定的誤差；化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是進(jìn)幾年新興的檢測(cè)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高，檢測(cè)線性范圍寬，檢測(cè)限低等諸多優(yōu)良的特性，是未來生化檢測(cè)領(lǐng)域里面技術(shù)發(fā)展的大趨勢(shì)。由于化學(xué)發(fā)光技術(shù)是新興技術(shù)，現(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒在技術(shù)上面存在一些明顯的缺陷和不足:該試劑盒在癌胚抗原檢測(cè)過程中檢測(cè)的線性范圍很窄、準(zhǔn)確性很低、重現(xiàn)性較差，從而對(duì)其應(yīng)用以及檢測(cè)帶來不良影響，限制了該技術(shù)的推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是為解決上述問題而提供了一種檢測(cè)過程簡(jiǎn)單、易于操作、自動(dòng)化程度高、檢測(cè)線性范圍廣、準(zhǔn)確性好、重現(xiàn)性好的癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
[0007]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0008]一種癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒，包括癌胚抗原校準(zhǔn)品、抗癌胚抗原抗體包被的磁珠、酶標(biāo)記的單克隆抗體、酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物以及濃縮洗滌液。
[0009]優(yōu)選地，所述癌胚抗原是重組的癌胚抗原或天然的癌胚抗原。
[0010]進(jìn)一步地，所述癌胚抗原校準(zhǔn)品的制備方法包括以下步驟:
[0011](I)制備去激素人血清；
[0012](2)將癌胚抗原用去激素人血清配制成濃度為80ng/mL校準(zhǔn)品，并將此校準(zhǔn)品用去激素人血清稀釋得到濃度分別為40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL的校準(zhǔn)品，等量分裝成濃度分別為0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL和80ng/mL的癌胚抗原校準(zhǔn)
品O
[0013]進(jìn)一步地，所述抗癌胚抗原抗體包被磁微粒的制備方法包括以下步驟:
[0014](I)磁珠的分散:將磁珠用緩沖液分散；
[0015](2)磁珠的清洗:用緩沖液清洗磁珠后，再用緩沖液重新分散磁珠；
[0016](3)磁珠的活化與連接:取EDC和NHS溶解于步驟(2)所得的磁珠溶液中，攪拌反應(yīng)后再向反應(yīng)體系中加入癌胚抗原抗體溶液，攪拌混勻，室溫下攪拌過夜；
[0017](4)磁珠的清洗及封閉:將磁珠與反應(yīng)體系分離后，用緩沖液洗滌磁珠再用緩沖液重新分散磁珠；向重新分散后的磁珠溶液中加入封閉液封閉，將磁珠與反應(yīng)體系分離；用緩沖液清洗磁珠后再用緩沖液分散磁珠，得到所述抗癌胚抗原抗體包被磁微。
[0018]進(jìn)一步地，所述步驟(I)中的磁珠用緩沖液分散，使磁珠的終濃度為60?90mg/mL ;所述步驟(2)中用三倍磁珠溶液體積的緩沖液清洗磁珠兩次后，再用緩沖液重新分散磁珠，使磁珠的終濃度為12?24mg/mL ;所述步驟(4)中將磁珠與反應(yīng)體系分離后用緩沖液洗滌磁珠兩次，再用緩沖液重新分散磁珠，磁珠的終濃度為20?50mg/mL ；向重新分散后的磁珠溶液中加入1%BSA封閉液，室溫封閉3?6小時(shí)，將磁珠與反應(yīng)體系分離；再用pH7.4的Tris-HCl緩沖液清洗磁珠兩次后用pH7.4的Tris-HCl緩沖液分散磁珠，使磁珠的終濃度為5?20mg/mL。
[0019]優(yōu)選地，所述磁珠的粒徑為0.3?1.0 μ m，所述磁珠為氧化鐵為內(nèi)核、聚苯乙烯表面包裹帶羧基活性基團(tuán)的聚合物，所述緩沖液選自適合生化試驗(yàn)的多種緩沖液，優(yōu)選為MES緩沖液。
[0020]進(jìn)一步地，所述酶為辣根過氧化物酶，因?yàn)槔备^氧化物酶性質(zhì)穩(wěn)定且適用于多種生化檢測(cè)試驗(yàn)，所述酶標(biāo)記的單克隆抗體的制備方法包括步驟如下:
[0021](I)將辣根過氧化物酶溶解于蒸餾水中；
[0022](2)向所述步驟(I)得到的溶液中加入0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌，得到混合溶液；
[0023](3)將所述步驟(2)得到的混合溶液裝入透析袋中用醋酸鈉緩沖液透析過夜；
[0024](4)向所述步驟(3)得到的透析液中加入碳酸鹽緩沖液至pH值為9.0?9.5，加入癌胚抗原單克隆抗體，混勻，室溫下避光攪拌反應(yīng)；
[0025](5)向所述步驟(4)得到的反應(yīng)產(chǎn)物中加入NaBH4溶液,混勻,靜置反應(yīng)；
[0026](6)將所述步驟(5)得到的反應(yīng)產(chǎn)物裝入透析袋中于PBS緩沖液中攪拌過夜；
[0027](7)取出透析袋中的液體，在攪拌下逐滴加入等體積的飽和硫酸銨溶液，靜置；
[0028](8)將所述步驟(7)得到的溶液離心，棄上清；將沉淀物用半飽和硫酸銨洗滌后，將沉淀物溶于PBS緩沖液中；[0029](9)將所述步驟(8)得到的溶液裝入透析袋中透析去除銨離子后，將溶液離心，去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，加入等體積甘油后混勻分裝，冰凍保存。
[0030]進(jìn)一步地，所述的化學(xué)發(fā)光底物由兩種彼此獨(dú)立分裝的A液和B液組成；所述A液為IOmM pH7.0磷酸鹽緩沖溶液，含有2mM H202、lg/L脫脂奶粉、0.5g/L卵白蛋白和0.1%吐溫20 ；B液為IOOmM ρΗΙΟ.0硼酸-硼砂緩沖液，含有IOmM魯米諾、0.3mM4-羥基聯(lián)苯。
[0031]進(jìn)一步地，所述濃縮洗滌液為含有吐溫20和氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液，該溶液中的氯化鈉的含量為I?5g/L、吐溫20的含量為0.5%-3%，濃縮洗滌液的pH值為7.0?8.0。該濃縮洗滌液可有效縮小整個(gè)試劑盒的體積，便于存儲(chǔ)和運(yùn)輸，同時(shí)也可以適當(dāng)?shù)墓?jié)約生產(chǎn)成本。
[0032]一種癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0033](I)取10 μ L待檢測(cè)樣本于反應(yīng)杯中，后加入140 μ L辣根過氧化物酶標(biāo)記癌胚抗原單克隆抗體，充分混勻，并于37°C溫育lOmin，同時(shí)準(zhǔn)備校準(zhǔn)樣板和空白樣本；
[0034](2)向反應(yīng)體系中加入50μ L磁微粒試劑，充分混勻，并于37°C溫育lOmin，后清洗分離磁珠；向磁珠中加入100 μ L發(fā)光底物A液和B液的混合溶液，反應(yīng)并測(cè)定各管的光強(qiáng)度；
[0035](3)根據(jù)校準(zhǔn)品的濃度與光強(qiáng)度的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，樣本光強(qiáng)度在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上相對(duì)應(yīng)的濃度值即為待測(cè)樣品的測(cè)定濃度。
[0036]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0037]利用發(fā)明得到的癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒，可以克服現(xiàn)有的酶聯(lián)免疫法以及放射免疫法的技術(shù)缺陷；同時(shí)采用本發(fā)明所得到的檢測(cè)試劑盒能克服現(xiàn)有的癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)線性范圍、準(zhǔn)確性或重現(xiàn)性等方面的技術(shù)缺陷，保證檢測(cè)結(jié)果的有效性及準(zhǔn)確性，為癌胚抗原含量檢測(cè)提供一種非常好的檢測(cè)工具。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為本發(fā)明實(shí)施例2與酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒測(cè)值相關(guān)性結(jié)果的曲線圖；
[0039]圖2為本發(fā)明實(shí)施I與對(duì)比實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例2比較的工作曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面結(jié)合附圖和實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0041]實(shí)施例1
[0042]本實(shí)施例中檢測(cè)試劑盒的制備:
[0043]1.癌胚抗原校準(zhǔn)品的配制
[0044]①去激素人血清的制備:取20mL的正常人血清與離心管中，再向血清中加入8.0g活性炭，將離心管置于漩渦混合器上混合均勻，振蕩5小時(shí)，以SOOOrpm離心30分鐘，將上清液過濾，向?yàn)V液中加入體積百分比濃度為千分之一的疊氮化鈉，混勻之后冷凍保存。
[0045]②取一定量的癌胚抗原蛋白(購(gòu)自美國(guó)Bioss公司)并用上述的去激素人血清配制成濃度為80ng/mL的校準(zhǔn)品溶液，并將此校準(zhǔn)品用去激素人血清稀釋得到濃度分別為40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL的校準(zhǔn)品，等量分裝成濃度分別為0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL 和 80ng/mL 的癌胚抗原校準(zhǔn)品。
[0046]2.抗癌胚抗原單克隆抗體包被磁珠的制備
[0047]①磁珠的分散:取80mg粒徑為0.3 μ m的磁珠(購(gòu)自德國(guó)merck公司)，用ImL的MES緩沖液分散磁珠，使磁珠的終濃度為80mg/mL ；
[0048]②磁珠的清洗:用3mL的MES緩沖液清洗磁珠兩次，后用5mL的MES緩沖液重新分散磁珠，使磁珠的終濃度為16mg/mL ；
[0049]③磁珠的活化:取0.1mg的EDC和0.3mg的NHS溶解于ImL的MES緩沖液中，后將該緩沖液逐滴緩慢加入②步所得的磁珠溶液中，攪拌混勻，30°C下攪拌反應(yīng)I小時(shí)。
[0050]④抗體溶液的配制及與磁珠的鏈接:取Img抗癌胚抗原單克隆抗體(購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司)并用去ImL離子水配制成濃度為lmg/mL的抗癌胚抗原抗體溶液，后取500μ Llmg/mL抗體溶液，加入③步反應(yīng)終止的磁珠溶液中，30°C下攪拌過夜；
[0051]⑤磁珠的清洗及封閉:利用磁場(chǎng)將磁珠與反應(yīng)體系分離，用15mL MES緩沖液洗滌磁珠2次，后用2mL MES緩沖液分散磁珠，使磁珠的終濃度為40mg/mL，再向磁珠溶液中加入2mLl%濃度的BSA溶液，攪拌混勻，30攝氏度下靜置4小時(shí)，然后利用磁場(chǎng)將磁珠與反應(yīng)體系分離，并用15mLpH7.4的Tris-HCl緩沖液清洗磁珠兩次，最后用5mL pH7.4的Tris-HCl緩沖液分散磁珠，磁珠的終濃度為16mg/mL。
[0052]3.辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗癌胚抗原單克隆抗體的制備
[0053]①稱取IOmg的辣根過氧化物酶溶解于2mL蒸餾水中，其終濃度為5mg/mL;
[0054]②向①步所得溶液中加入0.5mL新配置的0.1M Na104溶液，攪拌混勻，于30°C下避光攪拌30分鐘；
[0055]③將上述溶液于ImM pH4.4的醋酸鈉緩沖液中4°C透析過夜；
[0056]④向上述溶液中加入50μ L ρΗ9.5的碳酸鈉緩沖液，后向反應(yīng)體系中加入，25mg抗癌胚抗原單克隆抗體，混勻，并于30°C下避光輕輕攪拌反應(yīng)2小時(shí)，后加入0.2mL新配的4mg/mL NaBH4液,混勻，置于4°C靜置反應(yīng)2小時(shí)；
[0057]⑤將上述反應(yīng)體系于0.15M pH為7.4的PBS緩沖液中，4°C條件下攪拌過夜；
[0058]⑥取出透析袋中的液體，在攪拌下逐滴加入等體積的飽和硫酸銨溶液，后置于4°C靜置I小時(shí)；后于3000離心30min，棄上清；用飽和硫酸銨溶液洗滌沉淀兩次，后將沉淀物用 0.5mL0.15M ρΗ7.4 的 PBS 溶液溶解；
[0059]⑦將上述溶液裝入透析袋中，于0.15Μ ρΗ7.4的PBS緩沖液中透析，以去除銨離子，后將溶液置于IOOOOrpm離心30min，去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，加入等體積甘油混勻后分裝，冰凍保存。
[0060]4.化學(xué)發(fā)光底物A液和B液的配制
[0061]A液為IOmM pH7.0磷酸鹽緩沖溶液，其中包括2mM H202、lg/L脫脂奶粉、0.5g/L卵白蛋白和0.1%吐溫20 ；
[0062]B液為IOOmM ρΗΙΟ.0硼酸-硼砂緩沖液，其中包括IOmM魯米諾、0.3mM4-羥基聯(lián)苯。
[0063]5.濃縮洗滌液的配制
[0064]準(zhǔn)確稱取232g十二水合磷酸氫二鈉、23.8g 二水合磷酸二氫鈉、6.8g氯化鈉，并加Λ 3L的去離子水?dāng)嚢枋垢鹘M分充分溶解后向溶液中加入40mL的吐溫20，攪拌混勻，然后用去離子水將反應(yīng)體系定容至4L，即得20倍濃縮洗滌液。
[0065]6.將上述校準(zhǔn)品、抗癌胚抗原單克隆抗體包被的磁珠、酶標(biāo)記抗癌胚抗原單克隆抗體、化學(xué)發(fā)光底物和濃縮洗滌液分裝并密封保存，即得癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒。
[0066]實(shí)施例2
[0067]本實(shí)施例與實(shí)施例1不同的是，抗癌胚抗原單克隆抗體包被磁珠的制備過程中采用的磁珠粒徑為Ι.Ομηι (購(gòu)自德國(guó)merck公司)。
[0068]實(shí)施例3
[0069]本實(shí)施例與實(shí)施例1不同的是，抗癌胚抗原單克隆抗體包被磁珠的制備過程中采用的磁珠粒徑為0.6μηι (購(gòu)自德國(guó)merck公司)。
[0070]實(shí)施例4
[0071]1.癌胚抗原校準(zhǔn)品的配制與實(shí)施例1相同。
[0072]2.抗癌胚抗原單克隆抗體包被磁珠的制備
[0073]①磁珠的分散:取70mg粒徑為0.8 μ m的磁珠(購(gòu)自德國(guó)merck公司),用ImL的MES緩沖液分散磁珠，使磁珠的終濃度為70mg/mL ；
[0074]②磁珠的清洗:用3mL的MES緩沖液清洗磁珠兩次，后用5mL的MES緩沖液重新分散磁珠，使磁珠的終濃度為14mg/mL ；
[0075]③磁珠的活化:取0.2mg的EDC和0.4mg的NHS溶解于ImL的MES緩沖液中，后將該緩沖液逐滴緩慢加入②步所得的磁珠溶液中，攪拌混勻，30°C下攪拌反應(yīng)I小時(shí)。
[0076]④抗體溶液的配制及與磁珠的鏈接:取Img抗癌胚抗原單克隆抗體(購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司)并用去ImL離子水配制成濃度為lmg/mL的抗癌胚抗原抗體溶液，后取400μ Llmg/mL抗體溶液，加入③步反應(yīng)終止的磁珠溶液中，30°C下攪拌過夜；
[0077]⑤磁珠的清洗及封閉:利用磁場(chǎng)將磁珠與反應(yīng)體系分離，用IOmL MES緩沖液洗滌磁珠2次，后用2mL MES緩沖液分散磁珠，使磁珠的終濃度為35mg/mL，再向磁珠溶液中加入
1.5mLl%濃度的BSA溶液，攪拌混勻，30°C下靜置4小時(shí)，然后利用磁場(chǎng)將磁珠與反應(yīng)體系分離，并用IOmL pH7.4的Tris-HCl緩沖液清洗磁珠兩次，最后用5mL pH7.4的Tris-HCl緩沖液分散磁珠，磁珠的終濃度為14mg/mL。
[0078]3.辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗癌胚抗原單克隆抗體的制備
[0079]①稱取8mg的辣根過氧化物酶溶解于2mL蒸餾水中，其終濃度為4mg/mL;
[0080]②向①步所得溶液中加入0.5mL新配置的0.1M NaIO4溶液，攪拌混勻，于30°C下避光攪拌30分鐘；
[0081]③將上述溶液于ImM pH4.4的醋酸鈉緩沖液中4°C透析過夜；
[0082]④向上述溶液中加入30μ L ρΗ9.5的碳酸鈉緩沖液，后向反應(yīng)體系中加入，15mg抗癌胚抗原單克隆抗體，混勻，并于30°C下避光輕輕攪拌反應(yīng)2小時(shí)，后加入0.1mL新配的4mg/mL NaBH4液,混勻，置于4°C靜置反應(yīng)2小時(shí)；
[0083]⑤將上述反應(yīng)體系于0.15M pH為7.4的PBS緩沖液中，4°C條件下攪拌過夜；
[0084]⑥取出透析袋中的液體，在攪拌下逐滴加入等體積的飽和硫酸銨溶液，后置于4°C靜置I小時(shí)；后于3000離心30min，棄上清；用飽和硫酸銨溶液洗滌沉淀兩次，后將沉淀物用 0.5mL0.15M ρΗ7.4 的 PBS 溶液溶解；
[0085]⑦將上述溶液裝入透析袋中，于0.15Μ ρΗ7.4的PBS緩沖液中透析，以去除銨離子，后將溶液置于IOOOOrpm離心30min，去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，加入等體積甘油混勻后分裝，冰凍保存。
[0086]4.化學(xué)發(fā)光底物A液和B液的配制與實(shí)施例1相同。
[0087]5.濃縮洗滌液的配制與實(shí)施例1相同。
[0088]6.將上述校準(zhǔn)品、抗癌胚抗原單克隆抗體包被的磁珠、酶標(biāo)記抗癌胚抗原單克隆抗體、化學(xué)發(fā)光底物和濃縮洗滌液分裝并密封保存，即得癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒。
[0089]為了方便對(duì)實(shí)施例進(jìn)行分析和觀察，提供了對(duì)比實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例2。對(duì)比實(shí)施例I與實(shí)施例1不同的是，抗癌胚抗原單克隆抗體包被磁珠的制備過程中采用的磁珠粒徑為0.2 μ m (購(gòu)自德國(guó)merck公司)。對(duì)比實(shí)施例2與實(shí)施例1不同的是，抗癌胚抗原單克隆抗體包被磁珠的制備過程中采用的磁珠粒徑為L(zhǎng)lym (購(gòu)自德國(guó)merck公司)。
[0090]A.實(shí)施例試劑盒的方法學(xué)鑒定
[0091]按照本領(lǐng)域中常規(guī)的檢定規(guī)程對(duì)實(shí)施例1至4所制備的癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢定，檢定結(jié)果見表1。
[0092]表1實(shí)施例1至4所制備的癌胚抗原磁微粒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢定結(jié)果對(duì)比
[0093]
【權(quán)利要求】
1.一種癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括癌胚抗原校準(zhǔn)品、抗癌胚抗原抗體包被的磁珠、酶標(biāo)記的單克隆抗體、酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物以及濃縮洗漆液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述癌胚抗原是重組的癌胚抗原或天然的癌胚抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述癌胚抗原校準(zhǔn)品的制備方法包括以下步驟: (1)制備去激素人血清； (2)將癌胚抗原用去激素人血清配制成濃度為80ng/mL校準(zhǔn)品，并將此校準(zhǔn)品用去激素人血清稀釋得到濃度分別為40ng/mL、20ng/mL、IOng/mL、5ng/mL的校準(zhǔn)品，等量分裝成濃度分別為 0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL 和 80ng/mL 的癌胚抗原校準(zhǔn)品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述抗癌胚抗原抗體包被磁微粒的制備方法包括以下步驟: (1)將磁珠用緩沖液分散； (2)用緩沖液清洗磁珠后，再用緩沖液重新分散磁珠； (3)取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺溶解于步驟(2)所得的磁珠溶液中，攪拌反應(yīng)后再向反應(yīng)體系中加入癌胚抗原抗體溶液，攪拌混勻，室溫下攪拌過夜； (4)將磁珠與反應(yīng)體系分離后，用緩沖液洗滌磁珠再用緩沖液重新分散磁珠；向重新分散后的磁珠溶液中加入封閉液封閉，將磁珠與反應(yīng)體系分離；用緩沖液清洗磁珠后再用緩沖液分散磁珠，得到所述抗癌胚抗原抗體包被磁微。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述步驟(I)中的磁珠用緩沖液分散，使磁珠的終濃度為60~90mg/mL ;所述步驟(2)中用三倍磁珠溶液體積的緩沖液清洗磁珠兩次后，再用緩沖液重新分散磁珠，使磁珠的終濃度為12~24mg/mL ;所述步驟(4)中將磁珠與反應(yīng)體系分離后用緩沖液洗滌磁珠兩次，再用緩沖液重新分散磁珠，磁珠的終濃度為20~50mg/mL ;向重新分散后的磁珠溶液中加入1%BSA封閉液，室溫封閉3~6小時(shí)，將磁珠與反應(yīng)體系分離；再用pH7.4的Tris-HCl緩沖液清洗磁珠兩次后用PH7.4的Tris-HCl緩沖液分散磁珠，使磁珠的終濃度為5~20mg/mL。
6.按照權(quán)利要求4或5所述的癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述磁珠的粒徑為0.3~1.0 μ m，所述磁珠為氧化鐵為內(nèi)核、聚苯乙烯表面包裹帶羧基活性基團(tuán)的聚合物，所述緩沖液為MES緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的癌胚抗原磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述酶為辣根過氧化物酶，所述酶標(biāo)記的單克隆抗體的制備方法包括步驟如下: (1)將辣根過氧化物酶溶解于蒸餾水中； (2)向所述步驟(1)得到的溶液中加入0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌，得到混合溶液； (3)將所述步驟(2)得到的混合溶液裝入透析袋中用醋酸鈉緩沖液透析過夜； (4)向所述步驟(3)得到的透析液中加入碳酸鹽緩沖液至pH值為9.0~9.5，加入癌胚抗原單克隆抗體，混勻，室溫下避光攪拌反應(yīng)；(5)向所述步驟(4)得到的反應(yīng)產(chǎn)物中加入NaBH4溶液，混勻，靜置反應(yīng)； (6)將所述步驟(5)得到的反應(yīng)產(chǎn)物裝入透析袋中于PBS緩沖液中攪拌過夜； (7)取出透析袋中的液體，在攪拌下逐滴加入等體積的飽和硫酸銨溶液，靜置； (8)將所述步驟(7)得到的溶液離心，棄上清；將沉淀物用半飽和硫酸銨洗滌后，將沉淀物溶于PBS緩沖液中； (9)將所述步驟(8)得到的溶液裝入透析袋中透析去除銨離子后，將溶液離心，去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，加入等體積甘油后混勻分裝，冰凍保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的化學(xué)發(fā)光底物由兩種彼此獨(dú)立分裝的A液和B液組成；所述A液為IOmM pH7.0磷酸鹽緩沖溶液，含有2mM H2O2'lg/L脫脂奶粉、0.5g/L卵白蛋白和0.1%吐溫20 ；B液為IOOmM ρΗΙΟ.0硼酸-硼砂緩沖 液，含有IOmM魯米諾、0.3mM4-羥基聯(lián)苯。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的癌胚抗原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液為含有吐溫20和氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液，該溶液中的氯化鈉的含量為I~5g/L、吐溫20的含量為0.5%-3%，濃縮洗滌液的pH值為7.0~8.0。
10.一種權(quán)利要求1所述的癌胚抗原磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)取10μ L待檢測(cè)樣本于反應(yīng)杯中，后加入140 μ L辣根過氧化物酶標(biāo)記癌胚抗原單克隆抗體，充分混勻，并于37°C溫育IOmin,同時(shí)準(zhǔn)備校準(zhǔn)樣板和空白樣本； (2)向反應(yīng)體系中加入50μ L磁微粒試劑，充分混勻，并于37°C溫育lOmin，后清洗分離磁珠；向磁珠中加入100 μ L發(fā)光底物A液和B液的混合溶液，反應(yīng)并測(cè)定各管的光強(qiáng)度； (3)根據(jù)校準(zhǔn)品的濃度與光強(qiáng)度的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，樣本光強(qiáng)度在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上相對(duì)應(yīng)的濃度值即為待測(cè)樣品的測(cè)定濃度。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK103472229SQ201310428782
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:武漢生之源生物科技有限公司