一種肌紅蛋白定量檢測(cè)的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種肌紅蛋白定量檢測(cè)的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，能夠在數(shù)分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品中肌紅蛋白的定量檢測(cè)，該檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，低成本等特點(diǎn)。
技術(shù)背景
[0002]肌紅蛋白(myoglobin，MYO, Mb)是由一條肽鏈和一個(gè)血紅素輔基組成的結(jié)合蛋白，是肌肉內(nèi)儲(chǔ)存氧的蛋白質(zhì)，它的氧飽和曲線為雙曲線型。肌肉中運(yùn)載氧的蛋白質(zhì)，由153個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為16.7KD，含有血紅素，和血紅蛋白同源，與氧的結(jié)合能力介于血紅蛋白和細(xì)胞色素氧化酶之間，可幫助肌細(xì)胞將氧轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體。肌紅蛋白是組成骨骼肌和心肌的主要蛋白質(zhì)，當(dāng)肌肉損傷時(shí)，可以從肌肉組織中漏到循環(huán)血液中，使血清肌紅蛋白濃度增加。因此，該指標(biāo)用于判斷是否發(fā)生肌肉損傷。在健康人體內(nèi)，正常值，男性20?80 μ g/L ;女性10?70 μ g/L ;急性心肌梗死早期、急性肌損傷、肌營(yíng)養(yǎng)不良、肌萎縮、多發(fā)性肌炎、急性或慢性腎功能衰竭、嚴(yán)重充血性心力衰竭和長(zhǎng)期休克等都可能導(dǎo)致肌紅蛋白含量升高。測(cè)定血清肌紅蛋白可作為急性心肌梗死(AMI)診斷的早期最靈敏的指標(biāo)。但特異性差，骨骼肌損傷、創(chuàng)傷、腎功能衰竭等疾病，都可導(dǎo)致其升高。Myo陽性雖不能確診AMIdS可用于早期排除AMI診斷的重要指標(biāo)。
[0003]目前用于檢測(cè)肌紅蛋白的主要方法為酶聯(lián)免疫法(enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)和化學(xué)發(fā)光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay,CLIAhELISA則由于方法間差異較大，導(dǎo)致結(jié)果不均一，且線性范圍較窄，操作復(fù)雜，不適于做單人份或少量標(biāo)本的檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)興起于上個(gè)世紀(jì)80年代是繼酶聯(lián)免疫技術(shù)和放免技術(shù)之后發(fā)展起來的新興技術(shù)，由于其高靈敏度、高特異性，同時(shí)方法簡(jiǎn)便、快速，標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定，無放射性同位素?fù)p傷和污染等特點(diǎn)，在近些年得到了飛速發(fā)展。中國(guó)專利(CN103033627 A)，公開了一種人肌紅蛋白酶促化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法，具體做法為:在固定有抗人肌紅蛋白單克隆抗體的聚苯乙烯微孔板上，加入待檢測(cè)樣本和辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人肌紅蛋白單克隆抗體，孵育一定時(shí)間，經(jīng)過洗滌，再加入發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定發(fā)光值，根據(jù)抗原濃度和發(fā)光強(qiáng)度間的關(guān)系，得出待檢樣品中肌紅蛋白的含量。本方法用于肌紅蛋白的定量檢測(cè)靈敏度高，穩(wěn)定性好，但檢測(cè)時(shí)操作步驟繁瑣，需要專業(yè)人員操作，不適合中小醫(yī)院和基層醫(yī)療單位，同時(shí)檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不能用于及時(shí)快速診斷。
[0004]近年來，生物分析技術(shù)領(lǐng)域得到了快速的發(fā)展，出現(xiàn)了很多重要的研究方向。微流控芯片分析技術(shù)是其中最活躍的一支，在科研和實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域都獲得了廣泛的重視。微流控芯片作為一種新型的分析檢測(cè)平臺(tái)，具有高通量、集成化、便攜式、易操作、低成本等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在眾多領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是在免疫分析領(lǐng)域已嶄露頭角。
[0005]表面功能化的磁性微球作為固相載體，可以用來有效地捕獲核酸、蛋白分子、病毒顆粒甚至細(xì)胞，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于各種生化指標(biāo)的臨床診斷等領(lǐng)域。而微流控芯片系統(tǒng)具有快速、高效、集成化等特點(diǎn)，兩者相結(jié)合，將成為一種新型的高性能檢測(cè)方法，以解決當(dāng)前檢測(cè)方法中存在的靈敏度低，檢測(cè)過程復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)微量樣本檢測(cè)的問題，有望進(jìn)一步推動(dòng)臨床檢測(cè)儀器向便攜化和微型化發(fā)展。
[0006]免疫磁珠的生物微流控芯片是將磁顆粒技術(shù)，免疫分析集成到微流控芯片上的一種分析檢測(cè)方法，目前這種綜合性的檢測(cè)方法的主要難點(diǎn)表現(xiàn)為:1)液體在芯片內(nèi)部微流動(dòng)的智能控制，目前常采用的方法是在芯片內(nèi)部設(shè)置多個(gè)微栗和微閥，使得微流控體系變得更加復(fù)雜化；2)反應(yīng)體系的混合不充分，導(dǎo)致反應(yīng)不充分；3)集成化程度不高，導(dǎo)致非特異性背景高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種肌紅蛋白定量檢測(cè)的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，臨床檢驗(yàn)人員只需經(jīng)過簡(jiǎn)單操作，即可在數(shù)分鐘內(nèi)快速實(shí)現(xiàn)樣品中肌紅蛋白濃度的定量檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，成本低。
[0008]本發(fā)明涉及的技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下為:
[0009]一種肌紅蛋白定量檢測(cè)的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片結(jié)構(gòu)主要包括蓋片(I)和底片(11)，其中蓋片(I)上空氣栗(3)，氣流微通道(5)，加樣口(2)，樣本液流通道￠)，第一生物標(biāo)記物存儲(chǔ)池(4)，微混合器(7)以及過渡區(qū)(10)依次連接；底片(11)上過濾器(12)，反應(yīng)池(13)，清洗池(14)，檢測(cè)池(15)，溶液釋放通道(18)依次連接；底片(11)上檢測(cè)池(15)通過溶液釋放通道(18)與清洗液存儲(chǔ)池(16)和發(fā)光液存儲(chǔ)池(17)連接；
[0010]所述第一生物標(biāo)記物存儲(chǔ)池(4)存儲(chǔ)預(yù)封裝酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗肌紅蛋白抗體溶液；所述反應(yīng)池(13)存儲(chǔ)預(yù)封裝磁顆粒標(biāo)記抗肌紅蛋白抗體；所述清洗液存儲(chǔ)池(14)和和發(fā)光液存儲(chǔ)池(17)分別存儲(chǔ)預(yù)封裝清洗液和發(fā)光液；所述蓋片(I)和底片(11)用膠帶(20和22)密封；所述微流控芯片測(cè)試流程中，用磁鐵操控磁顆粒移動(dòng)或聚集。
[0011]具體地，本發(fā)明所述第一生物標(biāo)記物存儲(chǔ)池(4)、清洗液存儲(chǔ)池(14)和發(fā)光液存儲(chǔ)池(17)體積為10?500 μ L，優(yōu)選10?300 μ L，為液囊或腔體；所述微流控芯片的微混合器是寬度為20?300 μ m，深度為10?100 μ m的蛇形，折線形或方形結(jié)構(gòu)；所述微流控芯片的過濾器由腔體和濾血膜組成。
[0012]優(yōu)選地，所述微流控芯片的微混合器寬度為150 μm，深度為50 μm的方形結(jié)構(gòu)，在外部壓力作用下，可使樣本和試劑充分混合，提高反應(yīng)效率。
[0013]優(yōu)選地，所述微流控芯片的過濾器的腔體體積為樣本體積的3?10倍，優(yōu)選腔體體積為樣本體積的4?6倍。
[0014]具體地，所述微流控芯片底片中過濾器內(nèi)的濾血膜材質(zhì)可以為玻璃纖維膜，聚酯纖維膜或CytoSep膜等，優(yōu)選地，以玻璃纖維膜作為濾血膜。
[0015]具體地，本發(fā)明所述微流控芯片的過濾器具有濾除樣本雜質(zhì)的功能外，還可以將液體引導(dǎo)進(jìn)入下一級(jí)微結(jié)構(gòu)和微通道。
[0016]具體地，本發(fā)明所述微流控芯片的反應(yīng)池為一毛細(xì)管微通道，該毛細(xì)管微通道為管狀通道或矩形通道，允許微液體流進(jìn)或通過。
[0017]優(yōu)選地，所述反應(yīng)池為管狀通道，直徑為0.5?1mm ;更優(yōu)選微通道的直徑為5mm，進(jìn)一步優(yōu)選2mm或1mm。
[0018]優(yōu)選地，所述反應(yīng)池為矩形通道，寬為0.1?5mm，深度為0.01?2mm，長(zhǎng)為5?40mmo
[0019]具體地，本發(fā)明所述毛細(xì)管通道的體積小于150 μ 1，作為優(yōu)選，毛細(xì)管通道的體積小于100 μ 1，進(jìn)一步優(yōu)選，毛細(xì)管通道體積小于50 μ 1，低于30 μ I甚至更好，低于20 μ I甚至更好，如小于15 μ 1，小于10 μ I甚至小于5 μ I。
[0020]具體地，本發(fā)明所述磁顆粒標(biāo)記抗肌紅蛋白抗體使用的磁顆粒為超順磁性顆粒，可為順磁性的Fe3O4或γ -Fe 203化合物，優(yōu)選Fe 304化合物，磁顆粒粒徑為0.1?10 μ m。優(yōu)選磁顆粒粒徑為I?3 μ m，更優(yōu)選粒徑為2.0 μ m的磁顆粒。
[0021]具體地，本發(fā)明所述微流控芯片蓋片和底片內(nèi)除上述主要微通道和微結(jié)構(gòu)外還有許多透氣孔和用于組裝固定的讓位孔和立柱。
[0022]具體地，所述微流控芯片蓋片上的空氣栗(3)主要是通過氣流通道(5)傳遞壓力，主要作用是用于樣本和第一生物標(biāo)記物的混合，提高一級(jí)孵育效果。
[0023]具體地，本發(fā)明所述微流控芯片的氣流通道尺寸為0.1?100 μ m，進(jìn)一步優(yōu)選2?50 μ m0
[0024]具體地，本發(fā)明所述微流控芯片蓋片的過渡區(qū)是蓋片和底片連接的樞紐，一級(jí)反應(yīng)混合物經(jīng)過渡區(qū)流入過濾器，實(shí)現(xiàn)了液體在微流控芯片的上下片層間的流動(dòng)。
[0025]本發(fā)明所述微流控芯片的反應(yīng)池內(nèi)部需進(jìn)行一定的表面改性處理，所述表面改性處理方法可為化學(xué)反應(yīng)，表面涂層，等離子處理等，從而獲得良好的親水性，促使液體樣本在毛細(xì)管作用力下流動(dòng)，快速填充微通道。
[0026]本發(fā)明中所述酶，包含但不限定于過氧化氫酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)。發(fā)光基底液為酶對(duì)應(yīng)的發(fā)光底物(如魯米諾或金剛烷)和發(fā)光增強(qiáng)液(如苯衍生物等增強(qiáng)劑)，其中發(fā)光底物和發(fā)光增強(qiáng)液可合并，如圖2所示混合均勻后注入一個(gè)發(fā)光基底液存儲(chǔ)池
(17);但當(dāng)混合液保質(zhì)期少于I年時(shí)應(yīng)分開，如圖4所示分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(17)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(24)，通過預(yù)混合通道(23)混合均勻。
[0027]本發(fā)明所述微流控芯片的組裝，蓋片和底片通過密封膠帶進(jìn)行黏合，密封膠帶可為普通雙面膠，熱敏膠和壓敏膠等，作為優(yōu)選密封膠帶為熱敏膠或壓敏膠。
[0028]具體地，本發(fā)明所述清洗液，用于清洗磁顆粒，去除未參與反應(yīng)的雜質(zhì)物質(zhì)。清洗液主要包含緩沖體系、蛋白質(zhì)、表面活性劑和防腐劑，其中緩沖體系包含但不限于硼酸鹽、磷酸鹽、Tris-HCl和醋酸鹽等。其中蛋白質(zhì)包含但不限于牛血清白蛋白、酪蛋白等；其中表面