活性劑包含但不限于吐溫20、吐溫80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮等。
[0029]本發(fā)明提供一種使用上述微流控芯片對待測樣本進行檢測的方法，具體操作步驟包括:
[0030]步驟I)從加樣口加入樣本，將微流控芯片放入配套儀器中，從第一生物標記物存儲池釋放酶或發(fā)光劑標記抗肌紅蛋白抗體溶液后，按壓空氣栗，氣流通過氣流微通道推進樣本流經樣本液流通道，在微混合器與酶或發(fā)光劑標記抗肌紅蛋白抗體溶液混合均勻反應，形成一種免疫復合物，然后流入過渡區(qū)進入底板過濾器中；
[0031]步驟2)樣本經過濾器后，到達反應池，復溶包被在該區(qū)域的磁顆粒標記抗肌紅蛋白抗體，且與之發(fā)生反應，接著磁鐵收集磁顆粒并移動至清洗池，從清洗液存儲池釋放清洗液，磁顆粒經充分洗滌后，在磁鐵作用下移至檢測池，從發(fā)光液存儲池釋放發(fā)光基底液，根據相對發(fā)光強度(RLU)與肌紅蛋白抗原濃度間的比例關系，檢測系統(tǒng)可自動換算，可快速報告測試結果，從而實現肌紅蛋白的定量檢測。
[0032]具體地，本發(fā)明所用的檢測樣品包括來自人體的全血，血清和血漿，所用樣本體積為5?200 μ L，優(yōu)選150 μ L，進一步優(yōu)選50 μ L0
[0033]具體地，所述配套儀器為小型便攜設備，所述設備主要包括控制裝置和檢測裝置。
[0034]具體地，所述配套小型便攜設備的控制裝置主要作用為對放置其內部的微流控芯片可實施包含控制液體流動，樣本混合，釋放存儲池內試劑，磁鐵移動，檢測裝置的主要作用為采集發(fā)光信號并對其進行分析，最終顯示檢測結果。
[0035]具體地，所述磁鐵運動為相對于反應池的勾速直線運動或加速運動或減速運動，勾速運動的速度為lmm/s?50mm/s，優(yōu)選磁鐵運動速度為2mm/s?30mm/s。
[0036]具體地，本發(fā)明所述便攜設備的控制裝置主要作用為對微流控芯片實施擠壓空氣栗實現樣本和生物標記物的混合，控制磁鐵的運動實現磁性微球標記抗體和一級反應物的充分混合和磁珠的收集，控制磁鐵的運動實現反應混合物依次在反應池，清洗池，檢測池間的移動，有效降低非特異性干擾。
[0037]本發(fā)明所述微流控芯片的制備方法如下:
[0038]步驟I)酶或發(fā)光劑標記抗肌紅蛋白抗體，磁顆粒標記抗肌紅蛋白抗體，這兩種標記抗體可為同一種抗體或不同抗體；
[0039]步驟2)將酶或發(fā)光劑標記抗體溶液放入蓋片的標記抗體存儲池中，密封，將磁顆粒標記抗體溶液放入底片的反應池中，干燥，將清洗液和發(fā)光基底液分別注入清洗液存儲池和發(fā)光基底液存儲池中，密封，用膠帶(20和22)密封蓋片和底片，并組裝形成一個完整的微流控芯片。
[0040]本發(fā)明與現有技術相比，所獲得的有益效果為:
[0041]I)測試前無需對樣本進行復雜的預處理工作，且對樣本類型無局限性，全血，血清，血楽都在本方法中適用；
[0042]2)將磁免疫技術集成到微流控芯片上，綜合了兩種技術的優(yōu)勢，使整個檢測過程具有操作簡單，結果準確可靠，靈敏度高的特點。
[0043]3)配合小型檢測設備和芯片內部的簡單處理，無需復雜的栗閥和電場就能夠有效地在微流控芯片內部實現液流的智能控制。
[0044]4)具有多步混合功能，在一定程度上可提高免疫反應效率。
[0045]5)在微流控芯片上的各種反應、清洗和檢測過程分區(qū)域進行，集成化程度高，可有效降低非特異性干擾，提高檢測的靈敏度。
[0046]6)采用本發(fā)明所涉及微流控芯片進行檢測，能夠快速報告檢測結果，可進一步用于床旁檢測和各種便攜設備。
[0047]本發(fā)明的核心技術是將磁微粒技術、化學發(fā)光免疫檢測技術和微流控芯片技術三者相結合，其中磁顆粒的種類、大小、通道形狀、大小等參數的細微改變都會極大影響檢測結果的準確性。本發(fā)明通過微流控芯片的精細設計和加工，并配合小型便攜設備，成功實現了微流體在微流控芯片內部的智能控制，通過磁鐵的作用使得磁微粒能夠在微流控芯片內部實現可控的運動，混合，收集和清洗，提高反應效率，降低了非特異性干擾，從而增強了檢測信號，提高了檢測靈敏度。本發(fā)明的技術并非三者的簡單疊加，而是集成了三者的優(yōu)勢，在現有技術基礎上進行了完善和改進的一種新的用于肌紅蛋白快速定量的方法。
【附圖說明】
[0048]圖1為微流控芯片的蓋片結構示意圖，其中2為加樣口，3為空氣栗，4為第一生物標記物存儲池，5為氣流通道，6為樣本液流通道，7為微混合器，8為儲液池讓位孔，9為磁鐵運動滑槽，10為過渡區(qū)。
[0049]圖2為微流控芯片的底片結構示意圖，其中12為過濾器，13為反應池，14為清洗池，15為檢測池，16為清洗液存儲池，17為發(fā)光液存儲池，18為清洗液和發(fā)光試劑釋放通道，19為廢液回收池。
[0050]圖3為微流控芯片的完整結構示意圖，其中I為蓋片，11為底片，20為頂部膠帶，22為底部膠帶。
[0051]圖4為三個液體存儲池的底片結構示意圖，其中16為清洗液存儲池，17和24為發(fā)光液存儲池，18為清洗液，23為發(fā)光液釋放通道。
【具體實施方式】
:
[0052]本發(fā)明公開了一種C反應蛋白定量檢測的磁微?；瘜W發(fā)光微流控芯片，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內容】
、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發(fā)明技術。
[0053]為了使本領域的技術人員更好地理解本發(fā)明的技術方案，下面對照附圖并結合優(yōu)選【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細的闡述。
[0054]實施例1:辣根過氧化物酶-魯米諾(HRP-1uminol)系統(tǒng)用于肌紅蛋白的檢測
[0055]1.微流控芯片的制作
[0056]I)抗體標記:i)酶標抗體:稱取5mg HRP溶解于Iml蒸饋水中；于上液中加入0.2ml新配的0.1M Na1 4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘；將上述溶液裝入透析袋中，對ImM pH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜；加20 μ I 0.2Μ ρΗ9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0?9.5，然后立即加入1mg肌紅蛋白抗體，在Iml 0.0lM碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時；加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4°C 2小時；將上述液裝入透析袋中，對0.15M pH7.4 PBS透析，4°C過夜；在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C I小時；3000rpm離心半小時，棄上清；沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的PBS中；將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M pH7.4的PBS緩沖液透析，去除銨離子后，10, OOOrpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，2-4°C保存。ii)磁標抗體:準確移取30 μ I濃度為lmg/ml的鏈霉親和素標記磁珠，其中該功能化磁顆粒是以Fe3O4為核，聚苯乙烯為殼，粒徑為2.0 μπι，于2ml離心管中，渦旋震蕩30min。再加入30 μ I濃度為10 μ g/ml的生物素標記的人肌紅蛋白二抗，室溫下孵育2小時。磁性分離器除去磁珠中的液體，用0.0lM PBS(含0.01% BSA/0.2% NaN3 pH 7.4)清洗3次，將磁珠懸浮于0.0lM PBS,孵育過夜，重復上述分離，清洗步驟，最終稀釋至指定濃度。
[0057]2)磁標抗體的包被:采用點樣儀或噴點儀將10 μ I磁性微球點樣在微流控芯片的反應池中，室溫干燥30分鐘以上。
[0058]3)微流控芯片的組裝:將10 μ I濃度為3 μ g/ml的HRP，300 μ I清洗液，200 μ I發(fā)光試劑分別封裝在試劑卡的各存儲池內，同時將芯片卡其他部件進行組裝，形成一張完整的微流控芯片。
[0059]4)存儲:4°C，濕度為50%條件下保存。
[0060]2.肌紅蛋白的定量檢測
[0061]I)標準曲線的制作:將肌紅蛋白標準品用小牛血清稀釋，配成濃度為Ong/mL，10ng/mL，25ng/mL，50ng/mL，150ng/mL，400ng/mL 的肌紅蛋白標準品各 150 μ 1，取 30u μ I 加入本發(fā)明實施例中制備的微流控芯片的加樣口，蓋上血液蓋，將試劑盒置于配套的設備中，放置15min。每個樣本分別重復測定3次。讀取器自動顯示肌紅蛋白含量，根據肌紅蛋白的濃度及相應的發(fā)光強度，取三次測定平均值，繪制標準曲線。
[0062]2)取待檢樣本200 μ 1，置于本發(fā)明實施例中所制作的微流控芯片中進行檢測，每次取樣30 μ 1，重復測定3次，根據I)中繪制的標準曲線獲得待檢樣品中肌紅蛋白的濃度。
[0063]3)結果表明:采用本發(fā)明所述方法，得出的檢出限為lng/ml，檢測范圍為0.5ng/ml-1000ng/ml，批間CV小于10%，批內CV小于5% ο
[0064]實施例2:堿性磷酸酶-金剛烷(ALP-AMPPD)系統(tǒng)用于肌紅蛋白的檢測
[0065]1.微流控芯片的制作