本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及到一種基于超高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行擬靶標(biāo)代謝組學(xué)分析的方法。

背景技術(shù)：
代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)發(fā)展過程中繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后的又一重要分支，它致力于通過分析生物樣本中盡可能多的代謝物及其受到外界刺激后所發(fā)生的變化來研究與代謝表型相關(guān)的生物現(xiàn)象及其功能。代謝組學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于與疾病相關(guān)的研究中，用于發(fā)現(xiàn)與疾病診斷相關(guān)的代謝標(biāo)記物，研究疾病發(fā)病機(jī)理，以及用于疾病治療的手術(shù)效果及藥物療效的評價(jià)。常用的代謝組學(xué)平臺主要是基于核磁共振技術(shù)和質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)。核磁共振技術(shù)具有樣本制備簡單、通量高等優(yōu)點(diǎn)，但是其檢測靈敏度較差。而質(zhì)譜技術(shù)則具有較高的檢測靈敏度，與色譜技術(shù)聯(lián)用后更可以將復(fù)雜樣本中的代謝物先進(jìn)行色譜分離再進(jìn)行質(zhì)譜檢測，減小了基質(zhì)的干擾，有利于痕量代謝物的檢測。非靶標(biāo)分析是基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)平臺經(jīng)常采用的一種方法。它不需要預(yù)先知道樣本中含有那些代謝物，只需將樣本按照一定的步驟進(jìn)行預(yù)處理，然后利用質(zhì)譜的全掃描模式對待測樣本進(jìn)行全掃描分析。利用軟件將得到的譜圖進(jìn)行峰匹配，得到包含代謝物離子質(zhì)荷比（m/z）、保留時(shí)間（色譜-質(zhì)譜聯(lián)用平臺）及強(qiáng)度等信息的峰表。通過多變量或單變量分析方法找出各組之間的差異代謝物離子，并進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)鑒定和生物功能解釋。非靶標(biāo)分析常用的質(zhì)譜是高分辨的飛行時(shí)間質(zhì)譜、四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜、Orbitrap質(zhì)譜及FT-ICR質(zhì)譜等，具有較高的質(zhì)譜準(zhǔn)確度，有利于代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定；而且由于質(zhì)譜掃描時(shí)對代謝物沒有偏向，可以檢測出盡可能多的代謝物。但是非靶標(biāo)分析也存在一定的局限，由于同時(shí)進(jìn)行很寬范圍的掃描，質(zhì)譜的離子檢測器很容易飽和，導(dǎo)致質(zhì)譜的線性響應(yīng)范圍較窄，就難以對濃度千差萬別的不同代謝物同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確定量；由于同時(shí)對很多代謝物進(jìn)行檢測，使得每個(gè)代謝物的質(zhì)譜掃描時(shí)間有限，勢必會影響定量的準(zhǔn)確性；而且峰匹配時(shí)所能得到的代謝物離子數(shù)目受峰匹配參數(shù)影響很大，并且由于峰匹配的算法限制，會產(chǎn)生很多錯(cuò)誤匹配的結(jié)果，影響到數(shù)據(jù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，也使得不同批次數(shù)據(jù)的分析結(jié)果難以重復(fù)。另一種常見的基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)方法是靶標(biāo)分析方法，是對已知的少數(shù)代謝物進(jìn)行分析的方法。它經(jīng)常使用四極桿或三重四極桿質(zhì)譜，通過選擇離子掃描或多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行檢測。四極桿質(zhì)譜選擇離子掃描時(shí)，只選定待測代謝物的特征離子；而三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測時(shí)，在第一個(gè)四極桿中選定待測代謝物的特征母離子，在第二個(gè)四極桿中將選定的特征母離子進(jìn)行打碎，而第三個(gè)四極桿則選定待測代謝物的特征子離子。靶標(biāo)分析尤其是基于三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測的靶標(biāo)分析方法具有檢測線性范圍寬的優(yōu)點(diǎn)，可以最大程度的滿足復(fù)雜樣本中代謝物的檢測；它的重復(fù)性好，使得大量樣本分析時(shí)數(shù)據(jù)的可靠性得以保證；可以而且由于檢測的代謝物都是預(yù)設(shè)的，無需對得到的譜圖進(jìn)行峰匹配，簡化了數(shù)據(jù)處理的過程，提高了數(shù)據(jù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性以及不同批次數(shù)據(jù)分析結(jié)果的可重復(fù)性。但是代謝物靶標(biāo)分析有一個(gè)很大的局限就是它只能對少量已知的代謝物進(jìn)行分析，這和代謝組學(xué)分析盡可能多的代謝物的目標(biāo)有很大的距離。為了克服傳統(tǒng)非靶標(biāo)分析和靶標(biāo)分析的局限，我們發(fā)明了一種在三重四極桿質(zhì)譜上進(jìn)行擬靶標(biāo)分析的方法。為了分析盡可能多的代謝物，我們首先從超高效液相色譜/四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜上進(jìn)行非靶標(biāo)的自動二級質(zhì)譜分析，得到包含盡可能多代謝物的母離子、子離子及保留時(shí)間等信息；然后將這些信息整合后輸入到超高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜上進(jìn)行動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測分析，獲取待測樣本的代謝輪廓信息，建立了基于超高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測的擬靶標(biāo)代謝組學(xué)分析方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于建立一種基于超高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測（UHPLC/QQQMS-DMRM）的擬靶標(biāo)代謝組學(xué)分析新方法。相對于傳統(tǒng)的超高效液相色譜/四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UHPLC/Q-TOFMS）方法，該方法具有線性范圍寬、重復(fù)性好、無需對批量樣本進(jìn)行峰匹配、獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：1）對將進(jìn)行代謝組學(xué)分析的兩個(gè)以上生物樣本按照所需進(jìn)行分組或作為同一組不分組，對每組的樣本分別進(jìn)行等體積移?。ɑ虻荣|(zhì)量稱量）并組內(nèi)合并，其中每組樣本至少取兩個(gè)以上單個(gè)的生物樣本進(jìn)行合并，得到每組相應(yīng)的合并樣本；并將各組的合并樣本等體積（質(zhì)量）混合，得到質(zhì)量控制樣本。并根據(jù)分析目標(biāo)對各合并樣本進(jìn)行代謝物提?。ㄈ缃M織樣本采用甲醇/氯仿體系提取、血漿/血清樣本采用甲醇或乙腈體系提取等），得到可供色譜/質(zhì)譜分析的進(jìn)樣溶液。2）利用超高效液相色譜/四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜的數(shù)據(jù)依賴采集模式（DDA）自動采集各合并樣本的代謝物二級質(zhì)譜。3）通過定性分析軟件（MassHunterQualitativeAnalysis、AnalystPeakView等）提取對各合并樣本采集所得到的代謝物保留時(shí)間、母離子及其子離子信息；將母離子對應(yīng)的子離子中響應(yīng)最強(qiáng)的選為特征子離子，進(jìn)而構(gòu)成特征離子對；對各合并樣本中得到的特征離子對進(jìn)行加和，得到待測樣本的特征離子對信息。這里所稱的加和是指只要在任一合并樣本中出現(xiàn)一次的特征離子對都算作最終的特征離子對，而在多個(gè)合并樣本中均出現(xiàn)的特征離子對只算一次。4）將整合得到的代謝物特征離子的母離子、子離子和保留時(shí)間信息輸入到超高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜工作站，并優(yōu)化代謝物檢測的質(zhì)譜去簇電壓和碰撞能條件；在實(shí)際樣本中，通過動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式（DMRM）對得到的代謝物特征離子對進(jìn)行掃描，獲得相應(yīng)的譜圖；通過定量分析軟件（MassHunterQuantitativeAnalysis、AnalystMultiQuant等）對獲得的色譜峰進(jìn)行面積積分，得到待測樣本所含的代謝物及其含量信息。5）將質(zhì)量控制樣本進(jìn)行6次以上的平行處理分析，計(jì)算所測代謝物在多次平行處理分析時(shí)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，用于評價(jià)方法的重復(fù)性。6）對常規(guī)分析濃度的樣本進(jìn)行系列稀釋或濃縮，并進(jìn)行分析，將得到的質(zhì)譜響應(yīng)與樣本代謝物相對濃度進(jìn)行線性相關(guān)性分析，用于評價(jià)方法的響應(yīng)線性。由于上述技術(shù)方案的采用，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：1）方法具有檢測線性范圍寬的優(yōu)點(diǎn)，可以最大程度的滿足復(fù)雜樣本中代謝物的檢測。2）方法的重復(fù)性好，使得大量樣本分析時(shí)數(shù)據(jù)的可靠性得以保證。3）可針對每個(gè)待測代謝物分別優(yōu)化其質(zhì)譜條件，使得其在最合適條件下被檢測。4）由于待測的代謝物都是預(yù)設(shè)的，無需對得到的譜圖進(jìn)行峰匹配，簡化了數(shù)據(jù)處理的過程，提高了數(shù)據(jù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性以及不同批次數(shù)據(jù)分析結(jié)果的可重復(fù)性。相對于傳統(tǒng)的UHPLC/Q-TOFMS方法，本方法可針對每個(gè)待測代謝物分別優(yōu)化其質(zhì)譜條件，具有更好的檢測重復(fù)性和響應(yīng)線性，并且不需要對批量樣本進(jìn)行色譜峰匹配。建立的基于UHPLC/QQQMS-DMRM的擬靶標(biāo)代謝組學(xué)方法可用于實(shí)際樣本代謝組學(xué)分析。附圖說明圖1基于UHPLC/QQQMS-DMRM的血清擬靶標(biāo)代謝組學(xué)分析方法建立流程圖；圖2MRM離子對信息獲取具體過程示意圖（以母離子m/z424.34為例）；圖3基于UHPLC/Q-TOFMS的非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析（A）和基于UHPLC/QQQMS-DMRM的擬靶標(biāo)代謝組學(xué)分析（B）的典型色譜-質(zhì)譜圖；圖4UHPLC/Q-TOFMS和UHPLC/QQQMS-DMRM平臺用于代謝組學(xué)分析的方法重復(fù)性比較；圖5UHPLC/Q-TOFMS和UHPLC/QQQMS-DMRM平臺用于代謝組學(xué)分析的響應(yīng)線性比較。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：基于UHPLC/QQQMS-DMRM的血清擬靶標(biāo)代謝組學(xué)分析方法的建立基于UHPLC/QQQMS-DMRM的血清擬靶標(biāo)代謝組學(xué)分析方法建立的流程如附圖1所示，具體實(shí)施步驟如下：1.合并樣本制作及預(yù)處理等量移取29例肝癌病人血清各50μL并合并，同時(shí)等量移取30例正常人血清各50μL并合并。分別移取200μL肝癌病人和正常人的合并血清，均分別加入800μL乙腈去分別蛋白，并分別移取800μL上清液凍干。凍干物復(fù)溶于100μL純水中，用于進(jìn)樣分析。2.代謝物自動二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集超高效液相色譜（Agilent1200RRLC）/四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（Agilent6510Q-TOFMS）用于代謝物二級質(zhì)譜采集。色譜柱為UPLCACQUITYT3柱（2.1mm×100mm×1.8μm），柱溫為35℃。流動相A為0.1%甲酸/水溶液，流動相B為0.1%甲酸/乙腈，流速為0.3mL/min。洗脫梯度為：1%B起始并保持1min，1至5min線性升至40%B，5至8min線性升至50%B，8至10min線性升至65%B，10至16min線性升至76%B，16至20min線性升至100%B，在100%B保持5min，然后降至1%B并保持5min。質(zhì)譜采用正離子模式，毛細(xì)管電壓為4000V，去簇電壓為175V，N2霧化氣壓為45psi，N2干燥氣流速為9L/min，干燥氣溫度為350℃，一級質(zhì)譜掃描范圍為m/z100～1000（非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析時(shí)采取以上色譜-質(zhì)譜條件）。二級質(zhì)譜掃描范圍為m/z40～800，并分別在碰撞能為10V、20V和40V的條件下進(jìn)行自動二級質(zhì)譜掃描，采集肝癌病人合并血清和正常人合并血清所含代謝物的二級質(zhì)譜。3.特征離子對信息提取通過定性分析軟件（MassHunterQualitativeAnalysis）提取代謝物的母離子、子離子及保留時(shí)間信息，將母離子對應(yīng)的子離子中響應(yīng)最強(qiáng)的選為特征子離子。離子對選擇的具體過程如圖2所示。并將在肝癌病人合并血清及正常人合并血清中得到的特征離子對進(jìn)行加和，這里所稱的加和是指只要在肝癌病人合并血清或正常人合并血清中出現(xiàn)一次的特征離子對都算作最終的特征離子對，而在兩者中均出現(xiàn)的特征離子對只算一次。共得到518個(gè)特征離子對。4.基于UHPLC/QQQMS-DMRM的擬靶標(biāo)代謝組學(xué)分析方法建立將上述特征離子對的母離子、子離子、保留時(shí)間、去簇電壓、碰撞能等信息輸入到超高效液相色譜（Agilent1290UHPLC）/三重四極桿質(zhì)譜（Agilent6460QQQMS）儀器工作站，同時(shí)根據(jù)質(zhì)譜響應(yīng)優(yōu)化各代謝物的去簇電壓和碰撞能條件，使其響應(yīng)達(dá)到最大。除洗脫梯度外（見表1），其余色譜條件與上述條件一致。將優(yōu)化好的條件輸入到儀器工作站，在實(shí)際樣本中對518對特征離子對進(jìn)行動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測掃描，獲得相應(yīng)的譜圖，然后通過定量分析軟件（MassHunterQuantitativeAnalysis）對色譜峰進(jìn)行面積積分，得到待測樣本所含的代謝物及其含量信息，建立基于UHPLC/QQQMS-DMRM的擬靶標(biāo)代謝組學(xué)分析方法。圖3為基于UHPLC/Q-TOFMS的非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析（A）和基于UHPLC/QQQMS-DMRM的擬靶標(biāo)代謝組學(xué)分析（B）的典型色譜-質(zhì)譜圖。從圖中可以看出，二者得到的譜圖結(jié)果很相似，但基于UHPLC/QQQMS-DMRM的擬靶標(biāo)代謝組學(xué)分析的色譜峰型得到了改善。附表表1超高效液相色譜1290UHPLC線性洗脫梯度實(shí)施例2：基于UHPLC/QQQMS-DMRM的血清擬靶標(biāo)代謝組學(xué)分析的方法學(xué)考察將上述正常人合并血清和肝癌病人合并血清等體積混合成質(zhì)量控制（QC）樣本，按下述不同考察對象分別進(jìn)行預(yù)處理。1.分析方法的重復(fù)性考察移取100μLQC血清，加入400μL乙腈去蛋白，移取400μL上清液凍干。凍干物復(fù)溶于100μL純水中，用于進(jìn)樣分析。平行做10個(gè)QC血清樣本的重復(fù)處理。將這10個(gè)QC樣本分別在UHPLC/Q-TOFMS和UHPLC/QQQMS-DMRM平臺上進(jìn)行代謝組學(xué)分析。對UHPLC/Q-TOFMS平臺測得的數(shù)據(jù)利用XCMS軟件進(jìn)行峰匹配，得到與UHPLC/QQQMS-DMRM平臺測得的相同的峰有318個(gè)。利用這318個(gè)峰進(jìn)行這兩個(gè)平臺的重復(fù)性比較。如圖4所示，在UHPLC/QQQMS-DMRM平臺上34%的峰其面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%，而在UHPLC/Q-TOFMS平臺上僅有1%的峰其面積RSD小于5%。另外，在UHPLC/QQQMS-DMRM平臺上76%的峰其面積RSD小于10%，而在UHPLC/Q-TOFMS平臺上僅有44%的峰其面積RSD小于10%。從這個(gè)比較可以看出，基于UHPLC/QQQMS-DMRM平臺的擬靶標(biāo)代謝組學(xué)方法具有更好的重復(fù)性。2.分析方法的線性考察移取20、50、100、200和400μLQC血清，分別加入80、200、400、800和1600μL乙腈去蛋白，移取80、200、400、800和1600μL上清液凍干。凍干物復(fù)溶于100μL純水中，用于進(jìn)樣分析。每個(gè)濃度點(diǎn)做3個(gè)重復(fù)樣本處理，每個(gè)樣本做3次重復(fù)分析。將這些樣本分別在UHPLC/Q-TOFMS和UHPLC/QQQMS-DMRM平臺上進(jìn)行代謝組學(xué)分析。對UHPLC/Q-TOFMS平臺測得的數(shù)據(jù)利用XCMS軟件進(jìn)行峰匹配，得到與UHPLC/QQQMS-DMRM平臺測得的相同的峰有318個(gè)。利用這318個(gè)峰進(jìn)行這兩個(gè)平臺的線性比較。以皮爾森（Pearson）相關(guān)系數(shù)來評價(jià)質(zhì)譜響應(yīng)與血清濃度的線性關(guān)系。如圖5所示，在UHPLC/QQQMS-DMRM平臺上13%的峰其質(zhì)譜響應(yīng)與濃度相關(guān)系數(shù)大于0.99，而在UHPLC/Q-TOFMS平臺上沒有峰的質(zhì)譜響應(yīng)與濃度相關(guān)系數(shù)大于0.99。在UHPLC/QQQMS-DMRM平臺上49%的峰其質(zhì)譜響應(yīng)與濃度相關(guān)系數(shù)大于0.95，而在UHPLC/Q-TOFMS平臺上僅有14%的峰其質(zhì)譜響應(yīng)與濃度相關(guān)系數(shù)大于0.95。另外，在UHPLC/QQQMS-DMRM和UHPLC/Q-TOFMS平臺上分別有68%和44%的峰其質(zhì)譜響應(yīng)與濃度相關(guān)系數(shù)大于0.9。從這個(gè)比較可以看出，基于UHPLC/QQQMS-DMRM平臺的擬靶標(biāo)代謝組學(xué)方法具有更寬的線性范圍。發(fā)明效果總結(jié)：本發(fā)明公開了一種基于超高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測（UHPLC/QQQMS-DMRM）進(jìn)行擬靶標(biāo)代謝組學(xué)分析的方法。與傳統(tǒng)的基于超高效液相色譜/全掃描質(zhì)譜進(jìn)行代謝組學(xué)分析的方法不同，本發(fā)明首先采用超高效液相色譜/全掃描質(zhì)譜采集各組的合并樣本的非靶標(biāo)二級質(zhì)譜，通過定量分析軟件提取得到代謝物的保留時(shí)間、母離子及其子離子信息，根據(jù)子離子響應(yīng)篩選出代謝物的特征離子對信息，并將各組的合并樣本得到的特征離子對信息進(jìn)行匯總整合，在待測樣本中通過動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式對得到的代謝物特征離子對進(jìn)行掃描，獲得相應(yīng)的譜圖，然后通過定量分析軟件進(jìn)行積分，得到待測樣本所含的代謝物及其含量信息，建立基于超高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測的擬靶標(biāo)代謝組學(xué)分析方法。采用本發(fā)明方法比傳統(tǒng)的基于超高效液相色譜/全掃描質(zhì)譜的代謝組學(xué)方法有更好的重復(fù)性、更寬的線性范圍、且無需復(fù)雜的峰匹配過程，提高了數(shù)據(jù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性以及不同批次數(shù)據(jù)分析結(jié)果的可重復(fù)性。