含血液成分的試樣的處理方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抑制對(duì)血液中存在的血細(xì)胞以外的細(xì)胞的損壞、并對(duì)紅細(xì)胞和白細(xì)胞產(chǎn)生損壞的簡(jiǎn)便的處理方法。在一種實(shí)施方式中，涉及一種含有血液成分的試樣的處理方法，包括混合含有血液成分的試樣與含有表面活性劑A的液體，所述表面活性劑A為通式R1-O-（EO）n-R2（I）所表示的非離子性表面活性劑。在其他的方式中，涉及一種含血液成分的試樣的處理方法，包括混合含有血液成分的試樣與含有表面活性劑A和表面活性劑B的液體、或者含有表面活性劑A的液體及含有表面活性劑B的液體，所述表面活性劑A為通式R1-O-（EO）n-R2（I）表示的非離子性表面活性劑，所述表面活性劑B對(duì)紅細(xì)胞的溶解性高于所述表面活性劑A對(duì)紅細(xì)胞的溶解性。
【專利說(shuō)明】含血液成分的試樣的處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本公開涉及含血液的試樣的處理方法、分離含血液的試樣中的稀少細(xì)胞以及核酸的方法、CTC數(shù)測(cè)定方法、以及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]血液的細(xì)胞成分為紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板，但是血液中也稀少地存在除此以外的細(xì)胞。作為其中一個(gè)例子，可以舉出血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞/CTC (Circulating Tumor Cell)。認(rèn)為癌的轉(zhuǎn)移是由于癌細(xì)胞通過(guò)血管、淋巴管運(yùn)送到體內(nèi)的其他部位并增殖而引起的。并且，報(bào)告了血液中的CTC數(shù)與癌的轉(zhuǎn)移的可能性以及預(yù)后是相關(guān)的，并且已知為了作為癌(尤其是乳癌等轉(zhuǎn)移性癌)的診斷、預(yù)后診斷、以及治療效果的預(yù)測(cè)或判定的指標(biāo)，而測(cè)定血液中的 CTC 數(shù)的計(jì)數(shù)、CTC 的核酸(Circulating Tumor cell ；Evolving Evidence andFuture Challenges.The oncologist2009 ;14 ;1070_1082)。
[0003]作為血液中的CTC的分離、檢測(cè)技術(shù)，有如下方法:通過(guò)針對(duì)CTC特異性表面抗原的抗體來(lái)捕捉分離血液中的CTC的方法(特許3834326號(hào)、特開2007-178193)、利用了粘附的分離方法(W02005/043121、W02006/078994 )、利用密度梯度的分離方法(特開2010 — 075073、W095/20429)、利用過(guò)濾器的分離方法(W02006/116327、W02008/155398)、測(cè)定CTC的端粒酶活性的方法(W02010/071114)、通過(guò)使用了低滲溶液的溶血的分離方法(W02004/056978)、利用了流式細(xì)胞儀的方法(W02008/057437)等。為了檢測(cè)、定量、計(jì)數(shù)用上述分離的物質(zhì)，進(jìn)行PCR、利用了有親和性的物質(zhì)的核酸的測(cè)定，另外，進(jìn)行組合了抗體、熒光染料的光學(xué)CTC的測(cè)定是一般的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明要解決的問(wèn)題
[0005]為了在含血液成分的試樣中的稀少細(xì)胞活著的情況下分析，或者分離并培養(yǎng)，需要在不對(duì)所述稀少細(xì)胞產(chǎn)生大的損壞的情況下，高效地去除血液中的細(xì)胞成分(尤其是紅細(xì)胞及白細(xì)胞)。
[0006]因此，本公開提供一種抑制對(duì)含血液成分的試樣中的血細(xì)胞以外的細(xì)胞的損壞、并可迅速排除血細(xì)胞的簡(jiǎn)便的處理方法。另外，提供一種通過(guò)去除血細(xì)胞等來(lái)提高CTC的純度從而可抑制CTC的計(jì)數(shù)、核酸測(cè)定時(shí)的噪聲、并可進(jìn)行CTC的檢測(cè)的簡(jiǎn)便的處理方法、或者分離或檢測(cè)方法。
[0007]用于解決問(wèn)題的手段
[0008]本公開在一個(gè)方式中，涉及一種含血液成分的試樣的處理方法，包括混合含血液成分的試樣與含有表面活性劑A的液體，不使用固定劑，所述表面活性劑A為下述通式(I)表示的非離子性表面活性劑。
[0009]R1-O- (EO) n-R2 (I)
[0010][所述式(I)中，R1為具有分支鏈的碳數(shù)為12?40的烴基，EO表示氧乙烯基，η為EO的平均附加摩爾數(shù),為23?50, R2為氫原子或碳數(shù)為I?3的烴基。]
[0011]本公開在又一方式中，涉及一種含血液成分的試樣的處理方法，包括:混合含有血液成分的試樣與含有表面活性劑A及表面活性劑B的液體、或含有表面活性劑A的液體及含有表面活性劑B的液體，所述表面活性劑A為下述通式(I)表示的非離子性表面活性劑，所述表面活性劑B對(duì)紅細(xì)胞的溶解性高于所述表面活性劑A對(duì)紅細(xì)胞的溶解性。
[0012]R1-O- (EO) n-R2 (I)
[0013][所述式(I)中，R1為具有分支鏈的碳數(shù)為12?40的烴基，EO表示氧乙烯基，η為EO的平均附加摩爾數(shù),為23?50, R2為氫原子或碳數(shù)為I?3的烴基。]
[0014]本公開在又一方式中，涉及一種含血液成分的試樣的處理方法，包括:混合含有血液成分的試樣與含有表面活性劑A及表面活性劑B的液體、或含有表面活性劑A的液體及含有表面活性劑B的液體，所述表面活性劑A為聚氧乙烯辛基十二烷基醚(Ε0=23?50)，所述表面活性劑B為對(duì)紅細(xì)胞的溶解性高于所述表面活性劑A對(duì)紅細(xì)胞的溶解性的非離子性表面活性劑，并且為從聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯辛基十二烷基醚(Ε0=8?22)、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、以及它們的組合所組成的組中選擇的非離子性表面活性劑。
[0015]本公開在又一方式中，涉及一種分離或檢測(cè)含血液成分的試樣中的稀少細(xì)胞或核酸的方法，包括:通過(guò)本公開涉及的處理方法處理含有血液成分的試樣；以及從處理后的試樣中分離或檢測(cè)稀少細(xì)胞或核酸。
[0016]本公開在又一方式中，涉及一種測(cè)定含血液成分的試樣中的CTC (循環(huán)腫瘤細(xì)胞)數(shù)或CTC的核酸的方法，包括:通過(guò)本公開涉及的處理方法來(lái)處理含有血液成分的試樣；或者通過(guò)本公開涉及的分離或檢測(cè)方法分離或檢測(cè)血液成分中的稀少細(xì)胞或核酸。
[0017]本公開在又一方式中，涉及一種含血液成分的試樣中的稀少細(xì)胞的分析方法，包括:在通過(guò)本公開涉及的處理方法處理含有血液成分的試樣之后，通過(guò)包括細(xì)胞的動(dòng)態(tài)觀察或活性測(cè)定的方法進(jìn)行分析。
[0018]本公開在又一方式中，涉及一種試劑盒，用于本公開涉及的處理方法、本公開涉及的分離或檢測(cè)方法、本公開涉及的CTC數(shù)或CTC的核酸的測(cè)定方法、和/或本公開涉及的分析方法，所述試劑盒包含所述表面活性劑A和/或所述表面活性劑B。
[0019]發(fā)明效果
[0020]根據(jù)本公開，能夠抑制對(duì)含有血液的試樣中存在的血細(xì)胞以外的細(xì)胞的損壞，并溶解紅細(xì)胞、對(duì)白細(xì)胞產(chǎn)生損壞。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1是示出表面活性劑N0.2和表面活性劑N0.1的混合物的混合比與癌細(xì)胞的生存率之間的關(guān)系的曲線圖的一個(gè)例子；
[0022]圖2是示出表面活性劑N0.3和表面活性劑N0.1的混合物的混合比與癌細(xì)胞的生存率之間的關(guān)系的曲線圖的一個(gè)例子；
[0023]圖3是對(duì)表面活性劑混合物的處理之后用離心分離回收的癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的結(jié)果的顯微鏡觀察照片的一個(gè)例子；
[0024]圖4是顯微鏡觀察對(duì)沒(méi)有進(jìn)行表面活性劑混合物的處理的(A)試樣以及進(jìn)行了表面活性劑混合物的處理的(B)試樣進(jìn)行過(guò)濾處理之后的試樣的照片的一個(gè)例子；
[0025]圖5是對(duì)含有經(jīng)綠色熒光染色的癌細(xì)胞(SNU-1)和經(jīng)藍(lán)色熒光染色的白細(xì)胞的含癌細(xì)胞的血液試樣進(jìn)行了表面活性劑混合物的處理之后的熒光顯微鏡觀察的結(jié)果的一個(gè)例子；
[0026]圖6是對(duì)含有癌細(xì)胞(SNU-1)懸浮液或白細(xì)胞的含血液成分的試樣進(jìn)行了表面活性劑混合物的處理之后(A)的試樣以及未進(jìn)行表面活性劑混合物的處理(B)的試樣進(jìn)行庫(kù)爾特式的流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果的一個(gè)例子；
[0027]圖7是對(duì)含有癌細(xì)胞(SNU-1)和白細(xì)胞的含有血液成分的試樣進(jìn)行了表面活性劑混合物的處理之后(A)的試樣以及未進(jìn)行表面活性劑混合物的處理(B)的試樣用庫(kù)爾特式的流式細(xì)胞儀分析后的結(jié)果的一個(gè)例子；
[0028]圖8是示出對(duì)懸浮在生理鹽水中的含癌細(xì)胞(SNU-1)或含有白細(xì)胞的含血液成分的試樣用各種PH的表面活性劑混合物進(jìn)行處理之后的生存率的曲線圖的一個(gè)例子。
【具體實(shí)施方式】
[0029]預(yù)計(jì)今后循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cell:CTC)等血液中的稀少細(xì)胞的分析會(huì)更加盛行，并需求更簡(jiǎn)便、損耗少的方法。IOml的血液中通常含有數(shù)百億個(gè)紅細(xì)胞、數(shù)千萬(wàn)個(gè)白細(xì)胞，CTC為O?數(shù)千個(gè)左右。因此，直接分析CTC時(shí)的技術(shù)問(wèn)題很多，例如需要分離、濃縮等處理。因此，期待開發(fā)從血液中更高效和/或簡(jiǎn)便地濃縮分離CTC的技術(shù)。
[0030]利用了抗原抗體反應(yīng)的分離方法中，存在使用附加了抗體的磁性顆粒和磁場(chǎng)來(lái)從血液中濃縮細(xì)胞的方法(特許3834326號(hào)、特開2007-178193)。但是，血液中密集存在阻礙抗體與目標(biāo)細(xì)胞接觸的血細(xì)胞，需要反應(yīng)時(shí)間、細(xì)胞的回收時(shí)間。而且在血細(xì)胞的存在下，反應(yīng)體積變大，每體積的試劑量也增加，因此花費(fèi)成本。另外，在使用顆粒濃縮時(shí)，由于大量裹入血細(xì)胞因此純度變低導(dǎo)致假陽(yáng)性。并且在反復(fù)進(jìn)行去除血細(xì)胞的洗浄時(shí)，有可能損失目標(biāo)細(xì)胞。
[0031 ] 利用粘附的分離方法(W02005/043121、W02006/078994 )在血液存在下，血細(xì)胞、血
小板堆積在一般的細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)皿或載體的底面上，因此，癌細(xì)胞不能與培養(yǎng)皿粘附不能分離癌細(xì)胞。因此，有將抗體等親和性高的物質(zhì)固定在培養(yǎng)皿或載體上來(lái)使細(xì)胞粘附的方法，但是這也同樣需要細(xì)胞和具有親和性的物質(zhì)在底面接觸，血細(xì)胞成了阻礙。因此，為了增加接觸次數(shù)需要在載體側(cè)的結(jié)構(gòu)上下工夫并需要攪拌，結(jié)構(gòu)上下的工夫、攪拌方法等增加了復(fù)雜性。
[0032]離心分離法中，血液中離心后從下面開始按紅細(xì)胞層、白細(xì)胞層的順序形成細(xì)胞層。很多癌細(xì)胞由于具有與白細(xì)胞密度和尺寸近似的密度和尺寸，因此多數(shù)白細(xì)胞混入癌細(xì)胞中，離心分離的純度受到影響，導(dǎo)致假陽(yáng)性。另外，由于各層非常接近，因此混入大量紅細(xì)胞得不到高回收率和純度。
[0033]通過(guò)密度梯度離心法進(jìn)行的分離(特開2010-075073、W095/20429)作為從血液中回收細(xì)胞的方法被通用。但是，利用了細(xì)胞密度的分離中，由于癌細(xì)胞和白細(xì)胞的單核細(xì)胞的大小和密度接近，因此單核細(xì)胞大量混入，導(dǎo)致假陽(yáng)性。密度分離離心法過(guò)程繁雜，例如分離后必須在不擾亂液面的情況下回收細(xì)胞的層，以使分離后各層不混亂。
[0034]使用了過(guò)濾器的分離(W02006/116327、W02008/155398)是使用了稀少細(xì)胞的大小之差和血細(xì)胞的變形能力的分離，用于分離血細(xì)胞和癌細(xì)胞。大多數(shù)紅細(xì)胞、白細(xì)胞通過(guò)過(guò)濾器，但是部分紅細(xì)胞、白細(xì)胞殘留在膜片上。另外，如果使用孔大小小于8 μ m的膜片的孔，則容易產(chǎn)生堵塞，相反為了提高血細(xì)胞通過(guò)過(guò)濾器的效率而增加濾過(guò)時(shí)的壓力時(shí)，流速變大稀少細(xì)胞受到損壞，或者稀少細(xì)胞通過(guò)孔，從而回收率也下降。
[0035]血液I μ L中存在數(shù)百萬(wàn)個(gè)紅細(xì)胞、數(shù)千?I萬(wàn)個(gè)左右的白細(xì)胞，因此流式細(xì)胞儀一般不能直接計(jì)數(shù)。因此，需要添加去除紅細(xì)胞的溶血?jiǎng)?，并且測(cè)定時(shí)為了檢測(cè)各細(xì)胞而需要稀釋。稀釋IOmL的血液，從數(shù)百億個(gè)紅細(xì)胞、數(shù)億?數(shù)千個(gè)白細(xì)胞中對(duì)各細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，分離癌細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)是非常難的。至于電阻式，由于存在與癌細(xì)胞同等程度大小的白細(xì)胞，因此分離后混入大量白細(xì)胞，導(dǎo)致假陽(yáng)性。
[0036]如此，對(duì)于檢測(cè)、分離稀少細(xì)胞來(lái)說(shuō)，現(xiàn)有的分離濃縮技術(shù)可以說(shuō)由于血細(xì)胞的殘留，在必要的靈敏度、效率和特異性方面不足。如果能進(jìn)行試樣中的血細(xì)胞的處理(分離、去除、排除等)，則在使用了抗原抗體反應(yīng)的分離中，能夠在溶解后離心，在重新懸濁的少量體積的溶液中反應(yīng)，由此縮短試劑成本和反應(yīng)時(shí)間。另外，在利用了粘附的分離中，也能夠使用培養(yǎng)用的培養(yǎng)皿，進(jìn)行培養(yǎng)和粘附分離。另外，在使用了離心分離、密度梯度離心法的分離中，稀少細(xì)胞的回收變得容易。另外，在使用了過(guò)濾器的情況下，能夠使分析容易。即，通過(guò)處理含有血液的試樣中的血細(xì)胞，能夠減少稀少細(xì)胞的計(jì)數(shù)和定量中的誤差因素(假陽(yáng)性)，迅速進(jìn)行測(cè)定。
[0037]另外，如果能夠在含有血液的試樣中的稀少細(xì)胞存活的情況下進(jìn)行分析，或者分離培養(yǎng)，則能夠更詳細(xì)地分析、解析稀少細(xì)胞。另外，一般，在血細(xì)胞去除中用作溶血試劑的非離子表面活性劑的皂苷或Triton會(huì)破壞細(xì)胞，也會(huì)對(duì)癌細(xì)胞等稀少細(xì)胞產(chǎn)生損壞甚至致死，并且細(xì)胞被破壞。因此，一般在使用表面活性劑解析目標(biāo)細(xì)胞的情況下，如W02010/071114中所述，預(yù)先用甲醛、多聚甲醛之類的交聯(lián)試劑(固定試劑)固定含有血液的試樣中的稀少細(xì)胞之后再與溶血試劑反應(yīng)。前述那樣的甲醛、多聚甲醛之類的交聯(lián)試劑通常經(jīng)由游離的氨基形成分子間交聯(lián)，由此來(lái)維持細(xì)胞膜、細(xì)胞結(jié)構(gòu)。但是，雖然能夠期待維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，但是通過(guò)該固定化操作而產(chǎn)生的稀少細(xì)胞的分離培養(yǎng)、觀察、活性測(cè)定、藥效評(píng)價(jià)等進(jìn)一步的解析是困難的。
[0038]另外，W02010/071114中記載的表面活性劑的濃度下不能直接溶解血液，會(huì)對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生損壞。另外，很多白細(xì)胞也生存著。
[0039]在使用溶血試劑的情況下一般同時(shí)使用的固定劑即甲醛、多聚甲醛是劇毒物，因此有可能會(huì)對(duì)使用者的健康產(chǎn)生影響。雖存在W02010/071114、W02004/056978中記載的那樣的通過(guò)氯化銨鹽或低滲溶液去除血細(xì)胞的方法，但是這些方法由于反應(yīng)條件中需要較大的稀釋倍率，因此存在反應(yīng)槽變大的問(wèn)題。另外，由于沒(méi)有表面活性劑等那樣的溶解力，因此容易得到細(xì)胞片等凝集物。
[0040]本公開基于以下知識(shí):在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)使用對(duì)紅細(xì)胞的溶解性和對(duì)細(xì)胞的損壞低的表面活性劑A，溶解紅細(xì)胞并且能夠抑制對(duì)血液中存在的稀少細(xì)胞的損壞。另外，本公開基于以下知識(shí):在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)組合對(duì)紅細(xì)胞的溶解性和對(duì)細(xì)胞的損壞高的表面活性劑B、以及對(duì)紅細(xì)胞的溶解性和對(duì)細(xì)胞的損壞低的表面活性劑A來(lái)處理血液試樣時(shí)，能夠溶解紅細(xì)胞并對(duì)白細(xì)胞產(chǎn)生損壞并且能夠抑制對(duì)血液中存在的稀少細(xì)胞的損壞。另外，這些處理具有能夠低成本進(jìn)行的優(yōu)點(diǎn)。[0041]通過(guò)表面活性劑A抑制對(duì)血液中的稀少細(xì)胞的損壞并能夠排除血細(xì)胞的詳細(xì)機(jī)理并不清楚，但是可以如下考慮。從細(xì)胞的觀點(diǎn)來(lái)看，細(xì)胞的骨格、膜的差異是重要因素。在體內(nèi)循環(huán)的血細(xì)胞由于通過(guò)毛細(xì)血管等細(xì)胞的骨格容易變形，另外，細(xì)胞膜的磷脂雙層的流動(dòng)性大，磷脂的各疏水部之間的相互作用弱。因此當(dāng)受到表面活性劑的作用時(shí)容易破壞。另一方面考慮稀少細(xì)胞與細(xì)胞角蛋白等特征性細(xì)絲狀結(jié)構(gòu)遍布細(xì)胞內(nèi)并結(jié)合在細(xì)胞膜等上，另外，與血細(xì)胞相比脂質(zhì)雙層的流動(dòng)性也小并且難以被破壞。另外，考慮從表面活性劑的觀點(diǎn)看，表面活性劑與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)、膽固醇、磷脂相互作用，溶解細(xì)胞。表面活性劑A優(yōu)選與磷脂的疏水基的結(jié)構(gòu)接近，帶有分支鏈的分子結(jié)構(gòu)，另外，以疏水基和親水基、例如烷基和環(huán)氧乙烷的附加數(shù)的平衡，來(lái)控制由于溶解力和親水基對(duì)立體抑制的影響，由此在不破壞稀少細(xì)胞的情況下溶解血細(xì)胞。但是，本公開也可以不限定于這些機(jī)理地進(jìn)行解釋。
[0042]通過(guò)表面活性劑A和B的組合來(lái)抑制對(duì)血液中的稀少細(xì)胞的損壞并能夠排除血細(xì)胞的詳細(xì)機(jī)理并不清楚，但是可以如下考慮。通過(guò)在表面活性劑A中組合對(duì)血細(xì)胞溶解性高的表面活性劑B，表面活性劑A和B形成混合膠束，該混合膠束以一定比例在不干擾表面活性劑A對(duì)血細(xì)胞的選擇性的情況下與血細(xì)胞選擇性作用，通過(guò)表面活性劑B高的溶解性來(lái)迅速溶解接觸的血細(xì)胞。即，考慮能夠快速排除血細(xì)胞，由此進(jìn)一步抑制對(duì)癌細(xì)胞的損壞。但是，本公開也可以不限定于這些機(jī)理地進(jìn)行解釋。
[0043]根據(jù)本公開的處理方法，能夠抑制對(duì)含有血液的試樣中的血細(xì)胞以外的細(xì)胞的損壞并簡(jiǎn)便地排除血細(xì)胞。因此，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)進(jìn)行本公開的處理方法，例如，能夠簡(jiǎn)便地進(jìn)行血液中的稀少細(xì)胞、特別是CTC (循環(huán)腫瘤細(xì)胞)的分離、濃縮、測(cè)定、和/或培養(yǎng)、分析。另外，例如即使在進(jìn)行CTC的染色、標(biāo)記的情況下白細(xì)胞被染色，通過(guò)本公開的處理方法進(jìn)行處理之后，白細(xì)胞也成了死細(xì)胞，或者由于受到損壞染色物等漏出到外面，降低了來(lái)自白細(xì)胞的信號(hào)(噪聲)。因此，即使是使用了蓄積在細(xì)胞內(nèi)的熒光物質(zhì)、或利用代謝轉(zhuǎn)變成突光物質(zhì)的物質(zhì)、例如使用CellTracker (Green CMFDA/C7025invitrogen)的非特異性的染色方法，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)進(jìn)行本公開的處理方法，也能夠抑制CTC的檢測(cè)、測(cè)定、觀察等的假陽(yáng)性。
[0044][含血液成分的試樣]
[0045]在本說(shuō)明書中，“含有血液成分的試樣”也可稱為“含血液成分的試樣”，是可應(yīng)用本公開的處理方法的試樣,可以舉出血液、含有紅細(xì)胞成分的血液來(lái)源物、血液或血液來(lái)源物混合存在的體液、以及由它們制備的試樣等?！绑w液”在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可包括血液、淋巴液、腹水、胸膜液、髄液、唾液、尿、以及母乳。作為血液，可以舉出從生物體采集的血液，作為所述生物體，可舉出人或人以外的動(dòng)物(例如，哺乳類)。作為含有紅細(xì)胞成分的血液來(lái)源物，可以舉出從血液分離或制備并含有紅細(xì)胞成分的物質(zhì)或者它們的稀釋/濃縮物，例如含有去除了血漿的血細(xì)胞組分、血細(xì)胞濃縮物、血液或血細(xì)胞的凍干物、對(duì)全血進(jìn)行了溶血處理的溶血試樣、離心分離血液、自然沉降血液、洗浄血細(xì)胞、特定的組分等。它們當(dāng)中，在不限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，從簡(jiǎn)便且迅速的處理的觀點(diǎn)以及抑制對(duì)血液中的稀少細(xì)胞的損壞的觀點(diǎn)來(lái)說(shuō)，優(yōu)選血液或含有血細(xì)胞成分的源自血液的血細(xì)胞作為含有所述血液的試樣。
[0046]在本說(shuō)明書中，“血液中的稀少細(xì)胞”或“含有血液成分的試樣中的稀少細(xì)胞”是指人或人以外的動(dòng)物的血液中可含有的細(xì)胞成分(紅細(xì)胞、白細(xì)胞、以及血小板)以外的細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞和/或癌細(xì)胞。一般將血液中循環(huán)的腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞稱為CTC。作為血液中的稀少細(xì)胞數(shù)，一般在血液IOml中含有O?數(shù)千個(gè)?！把褐械南∩偌?xì)胞”或“含有血液成分的試樣中的稀少細(xì)胞”在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，是指選自癌細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞、癌干細(xì)胞、上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間葉干細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、以及它們的組合所組成的組的細(xì)胞。另外，在本說(shuō)明書中，作為分離或檢測(cè)對(duì)象的“核酸”在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，是選自血液成分中的RNA和DNA、癌細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞、癌干細(xì)胞、上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞、葉間干細(xì)胞、胎兒細(xì)胞的RNA和DNA、以及它們的組合所組成的組的核酸。
[0047]在本說(shuō)明書中，“血細(xì)胞的排除”是指紅細(xì)胞的溶血、和/或、白細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。紅細(xì)胞的溶解和白細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制例如能夠用實(shí)施例的方法來(lái)確認(rèn)。此外，在本說(shuō)明書中，“白細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制”可包括白細(xì)胞的消滅(降低生存率)、溶解、和/或白細(xì)胞的增殖抑制。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，在含有血液的試樣中，紅細(xì)胞的溶血能夠通過(guò)測(cè)定濁度的變化來(lái)觀察。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，值會(huì)根據(jù)測(cè)定池的大小或多或少發(fā)生變化，但是也可以將值從初始濁度起達(dá)到1/2以下作為溶血的基準(zhǔn)。具體地，將含有血液的試樣30 μ I與試劑30 μ I混合，能夠使用微孔板檢測(cè)儀通過(guò)測(cè)定確認(rèn)。例如，對(duì)于在所述條件下混合了血液和PBS或蒸餾水的溶液而言，以波長(zhǎng)650nm的吸光度值計(jì)，初始濁度為2?1.5，溶血發(fā)生包括0.8以下、0.6以下或0.5以下。另外，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，在含有血液的試樣中，白細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制包括將白細(xì)胞的生存率設(shè)定為50%以下、不足50%、40%以下、不足40%、或30%以下。
[0048]含有所述表面活性劑A的液體優(yōu)選具有下述(I)的血細(xì)胞去除效果。
[0049](I)用蒸餾水稀釋規(guī)定量的血液，以使用微孔板檢測(cè)儀和600nm以上的波長(zhǎng)的光用吸光光度法測(cè)定的吸光度值為I以上且小于2，由此制備基準(zhǔn)樣品，
[0050]替代所述基準(zhǔn)樣品中的蒸餾水，使用含有2.5?5w/v%的所述表面活性劑A的液體來(lái)制備被檢樣品，
[0051]使用600nm以上的波長(zhǎng)的光通過(guò)吸光光度法測(cè)定的所述被檢樣品的吸光度值達(dá)到所述基準(zhǔn)樣品的吸光度值的二分之一的時(shí)間為I小時(shí)以內(nèi)。
[0052]此外，對(duì)于含有所述表面活性劑A的液體而言，關(guān)于上述(I)的血細(xì)胞去除效果，使用600nm以上的波長(zhǎng)的光通過(guò)吸光光度法測(cè)定的所述被檢樣品的吸光度值達(dá)到所述基準(zhǔn)樣品的吸光度值的二分之一的時(shí)間優(yōu)選為60分鐘以內(nèi)，更優(yōu)選40分鐘以內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選30分鐘以內(nèi)。
[0053]含有所述表面活性劑A和表面活性劑B的液體、或者、含有表面活性劑A的液體和表面活性劑B的液體或者這兩種液體的混合物優(yōu)選具有下述(2)的血細(xì)胞去除效果。
[0054](2)用蒸餾水稀釋規(guī)定量的血液，以使用微孔板檢測(cè)儀和600nm以上的波長(zhǎng)的光用吸光光度法測(cè)定的吸光度值為I以上且小于2，由此制備基準(zhǔn)樣品，
[0055]替代所述基準(zhǔn)樣品中的蒸餾水，使用含有2.5?5w/v%的所述表面活性劑A和表面活性劑B的液體來(lái)制備被檢樣品，
[0056]使用600nm以上的波長(zhǎng)的光通過(guò)吸光光度法測(cè)定了的所述被檢樣品的吸光度值為所述基準(zhǔn)樣品的吸光度值的二分之一的時(shí)間為0.5小時(shí)以內(nèi)。
[0057]此外,對(duì)于含有所述表面活性劑A和表面活性劑B的液、含有表面活性劑A的液體和含有表面活性劑B的液體或者這兩種液體的混合物而言，關(guān)于上述(2)的血細(xì)胞去除效果，使用600nm以上的波長(zhǎng)的光通過(guò)吸光光度法測(cè)定了的所述被檢樣品的吸光度值變?yōu)樗龌鶞?zhǔn)樣品的吸光度值的二分之一的時(shí)間優(yōu)選在30分鐘以內(nèi)，更優(yōu)選在20分鐘以內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選為15分鐘以內(nèi)。
[0058]此外，關(guān)于用于評(píng)價(jià)所述血細(xì)胞去除效果的所述被檢樣品，含有所述表面活性劑A的液體中的所述表面活性劑A的濃度例如為0.001w/v%~10w/v%。另外，含有所述表面活性劑A和表面活性劑B的液中的、所述表面活性劑A和所述表面活性劑B的總濃度例如為0.001w/v% ~IOw/v%。
[0059]在本說(shuō)明書中，由η個(gè)要素組成的組的“它們的組合”可以包括所述群中2~η個(gè)要素的組合。
[0060][表面活性劑Α]
[0061]本公開的處理方法中使用的表面活性劑A為下述式(I)表示的非離子性表面活性劑。表面活性劑A單獨(dú)、或者通過(guò)與對(duì)紅細(xì)胞的溶解性更高的表面活性劑B組合，能夠在維持對(duì)紅細(xì)胞和白細(xì)胞的損壞的同時(shí)，抑制由表面活性劑B對(duì)血液中的稀少細(xì)胞的損壞。從縮短處理時(shí)間、進(jìn)一步抑制對(duì)稀少細(xì)胞的損壞的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選組合表面活性劑A和對(duì)紅細(xì)胞溶解性更高的表面活性劑B (后述)。
[0062]R1-O- (EO) n-R2 (I)
[0063][所述式(I)中，R1為具有分支鏈的碳數(shù)為12~40的烴基，EO表示氧乙烯基，η為EO的平均附加摩爾數(shù),為23~50, R2為氫原子或碳數(shù)為I~3的烴基。]
[0064]所述式(I)的R1從抑制對(duì)血液中的稀少細(xì)胞的損壞并進(jìn)行血細(xì)胞的排除的觀點(diǎn)來(lái)看，為具有分支鏈的碳數(shù)為12~40的烴基，優(yōu)選的是具有分支鏈的碳數(shù)為12~30的烷基。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，所述烴基和烷基的碳數(shù)從抑制對(duì)血液中的稀少細(xì)胞的損壞并進(jìn)行血細(xì)胞的排除的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選12~28，更優(yōu)選的是14~26、進(jìn)一步優(yōu)選的是16~24、更進(jìn)一步優(yōu)選的是18~22、更進(jìn)一步優(yōu)選的是20。作為所述式(I)的R1的優(yōu)選的實(shí)施方式，有異己基、異壬基、異癸基、異十二烷基、異十六烷基、己基癸基、己基十二烷基、己基十六烷基、辛基癸基、辛基十二烷基、辛基十六烷基、壬基癸基、壬基十二烷基、壬基十六烷基，從同樣的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選辛基十二烷基。所述式(I)的R2為氫原子或碳數(shù)為I~3的烴基，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，從抑制對(duì)血液中的稀少細(xì)胞的損壞并進(jìn)行血細(xì)胞的排除的觀點(diǎn)來(lái)看，為氫原子或碳數(shù)為I~3的烷基，所述烷基在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，為甲基、乙基、丙基或異丙基。從抑制對(duì)血液中的稀少細(xì)胞的損壞并進(jìn)行血細(xì)胞的排除的觀點(diǎn)來(lái)看，更優(yōu)選下述式(II)作為所述式(I)。
[0065]
【權(quán)利要求】
1.一種含血液成分的試樣的處理方法，包括: 混合含血液成分的試樣與含有表面活性劑A及表面活性劑B的液體、或者含有表面活性劑A的液體及含有表面活性劑B的液體； 所述表面活性劑A為下述通式(I)所示的非離子性表面活性劑，所述表面活性劑B對(duì)紅細(xì)胞的溶解性高于所述表面活性劑A對(duì)紅細(xì)胞的溶解性，
R1-O- (EO) n-R2 (I) 所述式(I)中，R1表示具有支鏈的碳數(shù)為12~40的烴基，EO表示氧乙烯基，η為EO的平均附加摩爾數(shù)，為23~50, R2為氫原子或碳數(shù)為I~3的烴基。
2.一種含血液成分的試樣的處理方法,包括:混合含有血液成分的試樣與含表面活性劑A的液體， 不使用固定劑， 所述表面活性劑A為下述通式(I)表示的非離子性表面活性劑，
R1-O- (EO) n-R2 (I) 所述式(I)中，R1表示具有支鏈的碳數(shù)為12~40的烴基，EO表示氧乙烯基，η為EO的平均附加摩爾數(shù)，為23~50, R2為氫原子或碳數(shù)為I~3的烴基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的含血液成分的試樣的處理方法，其中，所述表面活性劑A為聚氧乙烯亞烷基醚(Ε0=23~50)。
4.權(quán)利要求1或3所述的含血液成分的試樣的處理方法，其中， 所述表面活性劑B為從聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚、聚氧乙烯亞烷基醚(Ε0=8~22)、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、以及它們的組合所組成的組中選擇的非離子性表面活性劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、3和4中任一項(xiàng)所述的含血液成分的試樣的處理方法，其中，所述表面活性劑B為下述通式(III)表示的非離子性表面活性劑，
R3-O- (AO) m/ (EO) n-R4 (III) 所述式(III)中，R3為碳數(shù)為I~24的烷基，R4為氫原子或碳數(shù)為I~3的烷基，AO表示碳數(shù)為3~6的氧化烯基，EO表示氧乙烯基，m和η分別為AO及EO的平均附加摩爾數(shù)，m為I~100的數(shù)，η為O~50的數(shù)，“/”表示AO基和EO基也能夠不論順序地以隨機(jī)或嵌段中的任一種方式附加。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、3至5中任一項(xiàng)所述的含血液成分的試樣的處理方法，其中，所述表面活性劑B為下述式(IV)表示的非離子性表面活性劑，
R5-O- (EO) n-R6 (IV) R5表示碳數(shù)為12~40的烴基，EO表示氧乙烯基，η為EO的平均附加摩爾數(shù)，為8~22,R6為氫原子或碳數(shù)為I~3的烴基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、3至6中任一項(xiàng)所述的含血液成分的試樣的處理方法，所述表面活性劑B為下述式(VI)表示的非離子性表面活性劑，
R7-COO- (EO) n-R8 (VI) 所述式(VI)中，R7表示碳數(shù)為10~40的烴基，EO表示氧乙烯基，η為EO的平均附加摩爾數(shù)，為6~160, R8為氫原子或碳數(shù)為I~3的烴基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、3至7中任一項(xiàng)所述的含血液成分的試樣的處理方法，所述表面活性劑B為具有糖殘基作為親水性部分、并具有脂肪鏈或烷基鏈作為疏水性部分的表面活性劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、3至8中任一項(xiàng)所述的含血液成分的試樣的處理方法，其中，所述表面活性劑B為蔗糖月桂酸酯。
10.一種含血液成分的試樣的處理方法，包括: 混合含有血液成分的試樣與含有表面活性劑A及表面活性劑B的液體、或含有表面活性劑A的液體及含有表面活性劑B的液體， 所述表面活性劑A為聚氧乙烯辛基十二烷基醚(EO=23~50)， 所述表面活性劑B為對(duì)紅細(xì)胞的溶解性高于所述表面活性劑A對(duì)紅細(xì)胞的溶解性的非離子性表面活性劑，并且為從聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯辛基十二烷基醚(EO=8~22)、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、以及它們的組合所組成的組中選擇的非離子性表面活性劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求1和3至10中任一項(xiàng)所述的含血液成分的試樣的處理方法，其中，所述表面活性劑A和所述表面活性劑B的混合的量比(A/B)(重量比)為50/50以上且低于100/0。
12.根據(jù)權(quán)利要求2至11中任一項(xiàng)所述的含血液成分的試樣的處理方法，其中，含有所述表面活性劑A的液體具有下述(I)的血細(xì)胞去除效果: (1)用蒸餾水稀釋規(guī)定量的 血液，以使使用微孔板檢測(cè)儀和600nm以上的波長(zhǎng)的光通過(guò)吸光光度法測(cè)定的吸光度值為I以上且低于2，由此制備基準(zhǔn)樣品， 替代所述基準(zhǔn)樣品中的蒸餾水，使用含有2.5~5w/v%的所述表面活性劑A的液體來(lái)制備被檢樣品， 使用600nm以上的波長(zhǎng)的光通過(guò)吸光光度法測(cè)定的所述被檢樣品的吸光度值達(dá)到所述基準(zhǔn)樣品的吸光度值的二分之一的時(shí)間為I小時(shí)以內(nèi)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的含血液成分的試樣的處理方法， 含有所述表面活性劑A和表面活性劑B的液體、或者含有表面活性劑A的液體和含有表面活性劑B的液體具有下述(2)的血細(xì)胞去除效果: (2)用蒸餾水稀釋規(guī)定量的血液，以使使用微孔板檢測(cè)儀和600nm以上的波長(zhǎng)的光通過(guò)吸光光度法測(cè)定的吸光度值為I以上且低于2，由此制備基準(zhǔn)樣品， 替代所述基準(zhǔn)樣品中的蒸餾水，使用含有2.5~5w/v%的所述表面活性劑A和表面活性劑B的液體來(lái)制備被檢樣品， 使用600nm以上的波長(zhǎng)的光通過(guò)吸光光度法測(cè)定的所述被檢樣品的吸光度值達(dá)到所述基準(zhǔn)樣品的吸光度值的二分之一的時(shí)間為0.5小時(shí)以內(nèi)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的含血液成分的試樣的處理方法，其中，所述含血液成分的試樣的處理方法是抑制所述試樣可含有的稀少細(xì)胞的生存率降低并溶解紅細(xì)胞，并且/或者降低白細(xì)胞的生存率的方法。
15.一種分離或檢測(cè)含血液成分的試樣中的稀少細(xì)胞或核酸的方法，包括:通過(guò)權(quán)利要求I至14中任一項(xiàng)所述的處理方法處理含有血液成分的試樣；以及從處理后的試樣中分離或檢測(cè)稀少細(xì)胞或核酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分離或檢測(cè)含血液成分的試樣中的稀少細(xì)胞或核酸的方法，其中，所述稀少細(xì)胞或核酸的分離或檢測(cè)包括:通過(guò)從使用親和性的分離、密度分離、離心分離、粘附分離、大小分離、流式細(xì)胞儀、電分離、磁性分離、播種至培養(yǎng)基、以及它們的組合所組成的組中選擇的方法進(jìn)行。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的分離或檢測(cè)含血液成分的試樣中的稀少細(xì)胞或核酸的方法， 所述稀少細(xì)胞是從癌細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞、癌干細(xì)胞、上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間葉干細(xì)胞、胎兒細(xì)胞以及它們的組合所組成的組中選擇的細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)所述的分離或檢測(cè)含血液成分的試樣中的稀少細(xì)胞或核酸的方法， 所述核酸為從血液成分中的RNA及DNA、癌細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞、癌干細(xì)胞、上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間葉干細(xì)胞、胎兒細(xì)胞的RNA及DNA、以及它們的組合所組成的組中選擇的核酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述的分離或檢測(cè)含血液成分的試樣中的稀少細(xì)胞的方法，包括: 針對(duì)所述稀少細(xì)胞，使用下述檢測(cè)方法中附隨的標(biāo)記方法來(lái)標(biāo)記，所述檢測(cè)方法是從利用了放射性物質(zhì)的檢測(cè)方法、利用了發(fā)光現(xiàn)象的檢測(cè)方法、使用了色素的檢測(cè)方法、利用了磁性的檢測(cè)方法、電檢測(cè)方法、光學(xué)檢測(cè)方法、以及它們的組合所組成的組中選擇的方法。
20.一種測(cè)定含血液成分的試樣中的CTC (循環(huán)腫瘤細(xì)胞)數(shù)或CTC的核酸的方法，包括:通過(guò)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的處理方法處理含有血液成分的試樣；或者通過(guò)權(quán)利要求15至19中任一項(xiàng)所述的分`離或檢測(cè)方法從含有血液成分的試樣中分離或檢測(cè)稀少細(xì)胞或核酸。
21.一種含血液成分的試樣中的稀少細(xì)胞的分析方法，包括:在通過(guò)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的處理方法處理含有血液成分的試樣之后，通過(guò)包括細(xì)胞的動(dòng)態(tài)觀察或活性測(cè)定的方法進(jìn)行分析。
22.—種試劑盒,包含用于權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的處理方法、權(quán)利要求15至19中任一項(xiàng)所述的分離或檢測(cè)方法、權(quán)利要求20所述的CTC數(shù)測(cè)定方法、和/或權(quán)利要求21所述的分析方法的、所述表面活性劑A和所述表面活性劑B。
23.—種試劑盒，包含用于權(quán)利要求2至14中任一項(xiàng)所述的處理方法、權(quán)利要求15至19中任一項(xiàng)所述的分離或檢測(cè)方法、權(quán)利要求20所述的CTC數(shù)測(cè)定方法、和/或權(quán)利要求21所述的分析方法的、所述表面活性劑A。
【文檔編號(hào)】G01N33/48GK103513021SQ201310247504
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月20日
【發(fā)明者】高木英紀(jì) 申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社