專利名稱：植物中丹皮酚檢測用樣品制備方法和丹皮酚檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是涉及一種植物中丹皮酚檢測用樣品制備方法、丹皮酚檢測方法。
背景技術(shù)：
常用中藥牡丹皮為多年生落葉小灌木牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)的干燥根皮，味苦、辛，性微寒，具有清熱涼血、活血散瘀的功能。牡丹中次生代謝物丹皮酚是牡丹皮的主要活性成分，也是《中國藥典》(2010版)中規(guī)定的評價牡丹皮質(zhì)量的定性與定量指標(biāo)。丹皮酚(paeonol，簡稱Pae)，又稱牡丹酚，是一種小分子的酚類化合物，白色或微黃色帶有光澤的針狀結(jié)晶，氣特異，味微辣；易溶于乙醇，甲醇，在熱水中溶解，在冷水中不溶；值得一提的是丹皮酚具有自發(fā)熒光的特點。組織化學(xué)是建立在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)之上的的邊緣學(xué)科，是研究細胞和組織中的化學(xué)組成、定位和定量以及代謝狀態(tài)的科學(xué)，其根本的目的是聯(lián)系形態(tài)、化學(xué)成分、功能來了解細胞或組織的代謝變化。組織化學(xué)的研究方法主要有化學(xué)方法、類化學(xué)方法、物理學(xué)方法、顯微燒灰法等。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些先進的儀器設(shè)備，如激光共聚焦顯微鏡、原子力學(xué)顯微鏡等也滲透到組織化學(xué)的研究中。在經(jīng)歷了解釋生物界中生理現(xiàn)象的生理組織學(xué)階段后，組織化學(xué)進入到顯微化學(xué)階段，現(xiàn)今又步入到酶組織化學(xué)、電鏡組織化學(xué)、定量組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)等階段?；瘜W(xué)成分是藥材防病與治病的物質(zhì)基礎(chǔ)，而這些成分是貯藏在特定的組織和細胞結(jié)構(gòu)之中。中草藥包括植物藥、動物藥和礦物藥三類藥材，其中植物藥占到中草藥資源的約百分之八十。因此，運用組織化學(xué)方法，明確藥用植物的藥用部位的組織結(jié)構(gòu)，研究藥用成分及其積累與藥用植物的結(jié)構(gòu)、發(fā)育等的關(guān)系，具有十分重要的理論與實踐意義。目前丹皮酚提取與分析方法主要有水蒸氣蒸餾法、有機溶劑浸出法、超臨界流體萃取法(但在一般的實驗性提取中較少應(yīng)用)以及高效液相色譜法、薄層掃描法、化學(xué)發(fā)光法、氣相色譜法等等；中國發(fā)明專利(申請?zhí)?200910175425)通過將展開的丹皮酚斑點與增熒光劑三氯化鋁反應(yīng)而用于丹皮酚的定量測定。但這些方法在確定丹皮酚在器官、組織和細胞中的細微含量、存在部位及分布狀態(tài)方面卻無能為力，而這恰恰是組織化學(xué)的優(yōu)勢。迄今為止，對牡丹中丹皮酚成分只是進行定量研究，沒有在組織細胞水平上進行定位研究。丹皮酚具有自發(fā)熒光特性為利用組織化學(xué)方法進行研究提供了非常便利的條件和科學(xué)保障。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種植物中丹皮酚檢測用樣品制備方法、丹皮酚檢測方法。制備方法無需經(jīng)過繁雜的化學(xué)成分提取、染色等過程，同時避免了丹皮酚的流失與彌散，而且保持了組織細胞結(jié)構(gòu)和成分的原貌，在原植物正常生長的前提下即可明確牡丹中的藥效成分丹皮酚在組織細胞水平上的存在部位與相對定量，不僅直觀、快捷、準確，而且得到的實驗結(jié)果可以幫助指導(dǎo)中藥材規(guī)范化生產(chǎn)與深加工、完善現(xiàn)有丹皮酚的提取工藝，更好地節(jié)約并利用藥用資源，為生產(chǎn)實踐服務(wù)。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:—種植物中丹皮酚檢測用樣品制備方法，包括以下步驟:A、清除植株器官樣品明顯的污物，再用冷水輕輕擦拭直至樣品表面清潔；冷水溫度為0°C -5°c,為減小水溫變化,優(yōu)選使用冰水混合物；B、清潔后的樣品放入裝有碎冰的保溫盒中保存并盡快進行冰凍切片；樣品冰凍切片的厚度為25-30 μ m，粘片后(TC _5°C低溫保藏。一種植物中丹皮酚檢測方法，使用上述制備方法制備的樣品進行檢測，使用激光共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡、雙光子激光掃描共聚焦顯微鏡進行顯微觀察并進行圖像采集，觀察記錄所采集圖像中熒光的存在部位并使用圖像分析軟件測定不同部位熒光強度，對植物中丹皮酚進行定位和相對定量檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明充分利用丹皮酚的理化性質(zhì)，通過低溫冰水處理后進行冰凍切片，制備的切片使用熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡、雙光子激光共聚焦顯微鏡等觀察并進行丹皮酚的定位與相對定量。本發(fā)明方法無需經(jīng)過繁雜的化學(xué)成分提取、染色等過程，最大限度地避免了丹皮酚的流失與彌散，保持了組織細胞結(jié)構(gòu)和成分的原貌，在不影響原植物正常生長的前提下即可明確牡丹中的藥效成分丹皮酚在組織細胞水平上的存在部位與相對定量，不僅直觀、快捷、準確，而且研究結(jié)果可以指導(dǎo)中藥材規(guī)范化生產(chǎn)與深加工、完善現(xiàn)有丹皮酚的提取工藝，更好地節(jié)約并利用藥用資源，為生產(chǎn)實踐服務(wù)。


附圖為牡丹根結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為周皮，2為皮層，3為韌皮部，4為木質(zhì)部。
具體實施例方式實施例1:一種植物中丹皮酚檢測用樣品制備方法，包括以下步驟:1、使用制冰機制備顆粒細小、質(zhì)地松軟的碎冰，同時融化為冰水混合物備用；2、用紗布等輕輕擦拭新鮮牡丹植株根部器官樣品表面明顯的污物，再在冰水混合物中用毛筆輕拂直至根樣表面清潔；3、清潔后的樣品用鋁箔紙包裹后裝入塑封袋，放入裝有碎冰的保溫盒中保存并盡快采用低溫恒冷箱冰凍切片法進行冰凍切片，樣品冰凍切片的厚度為25 μ m，粘片后0°C低溫保藏；一種植物中丹皮酚檢測方法，使用上述制備方法制備的樣品進行檢測，在雙光子激光掃描共聚焦顯微鏡下，選擇激發(fā)波長700nm觀察所制備切片進行圖像采集，觀察所采集圖像中熒光的存在部位并使用圖像分析軟件測定不同部位熒光強度，明確丹皮酚的定位和相對定量并進行統(tǒng)計分析。實施例1對新鮮牡丹植株根部器官中丹皮酚的定位和相對定量檢測結(jié)果如下:丹皮酚分布于牡丹根的周皮木栓層細胞的細胞壁、皮層細胞的細胞質(zhì)，木質(zhì)部細胞的細胞壁，其含量(熒光平均強度“觀察平均值土標(biāo)準差，單位:像素?zé)晒鈴姸?Pixelintensity ) ”)分別是:周皮 68.036±18.120、皮層 18.772±7.207、韌皮部 0.166±0.143、木質(zhì)部56.929±16.112 ;研究結(jié)果表明牡丹周皮、木質(zhì)部的丹皮酚含量較高，皮層中丹皮酚含量較低，韌皮部丹皮酚含量最低。這個結(jié)果也從組織化學(xué)的角度佐證了生產(chǎn)實踐中采用牡丹皮入藥的科學(xué)性。實施例2除制備的樣品使用熒光顯微鏡觀察外，其余同實施例1。實施例3除制備的樣品使用激光共聚焦顯微鏡觀察外，其余同實施例1。
權(quán)利要求
1.一種植物中丹皮酚檢測用樣品制備方法，包括以下步驟: A、清除植株器官樣品明顯的污物，再用冷水輕輕擦拭直至樣品表面清潔； B、清潔后的樣品放入裝有碎冰的保溫盒中保存并盡快進行冰凍切片。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟A中冷水溫度為0°C_5°C。
3.一種植物中丹皮酚檢測方法，使用上述制備方法制備的樣品進行檢測。
4.如權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于:檢測使用激光共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡、雙光子激光掃描共聚焦顯微鏡進行顯微觀察并進行圖像采集，觀察記錄所采集圖像中熒光的存在部位并使用圖像分析軟件測定不同部位熒光強度，對植物中丹皮酚進行定位和相對定量檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物中丹皮酚檢測用樣品制備方法、丹皮酚檢測方法，樣品制備方法包括以下步驟冷水清洗、低溫保存、冰凍切片；檢測方法使用熒光顯微技術(shù)進行檢測，對植物中丹皮酚進行定位和相對定量檢測。本發(fā)明制備方法無需經(jīng)過繁雜的化學(xué)成分提取、染色等過程，不僅避免了丹皮酚的流失與彌散，而且保持了組織細胞結(jié)構(gòu)和成分的原貌，在原植物正常生長的前提下即可明確牡丹中的藥效成分丹皮酚在組織細胞水平上的存在部位與相對定量。
文檔編號G01N1/42GK103196712SQ20131005742
公開日2013年7月10日 申請日期2013年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月23日
發(fā)明者鄭艷, 張倩, 閆浩, 楊耿 申請人:安徽師范大學(xué)